CN101434943B - 一种α-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达 - Google Patents

Abstract

α-葡萄糖苷酶(简称AGLU酶)基因的克隆与表达，属于酶基因工程和酶工程领域。本发明由黑曲霉(A.niger)WX-07总DNA获得aglu基因SEQ IDNO：1，aglu的cDNA以质粒pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母(P.pastoris)为表达宿主，实现aglu基因在胞外的可溶性表达；该aglu的cDNA全长2880个核苷酸，编码960个氨基酸，构建了真核表达质粒，转化Pichia pastoris KM71表达AGLU酶。重组酶具有转苷活性，能将麦芽糖转糖苷生成低聚异麦芽糖。此酶适合食品、饲料、医药等工业应用的需要，能用于低聚异麦芽糖的工业生产。

Description

一种α-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达

技术领域

一种α-葡萄糖苷酶(简称AGLU酶)基因的克隆与表达，本发明属于酶基因工程和酶工程领域。具体地说涉及一种编码黑曲霉(Aspergillus niger)WX-07AGLU酶的DNA序列及其表达。

背景技术

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，简称AGLU酶，EC 3.2.1.20)，又名α-D-葡萄糖苷水解酶，它可以从低聚糖的非还原末端切割α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖，并将游离的葡萄糖基以α-1，6糖苷键形式转移到其他糖底物上，形成具有非发酵性的功能性低聚糖——低聚异麦芽糖(简称IMOs，主要包括异麦芽糖，潘糖，异麦芽三糖等)。低聚异麦芽糖是一类含有至少一个α-(1，6)糖苷键的低聚糖，主要是异麦芽糖，潘糖，异麦芽三糖，天然少量存在于酱油，蜂蜜中，它已经慢慢被用来替代传统的蔗糖作为食品添加剂。它被摄入人体后不会被消化道吸收，也不能被有害菌利用，但可以被肠道的益生菌如双歧杆菌作为碳源利用，故其具有良好的双歧因子作用，可以改善人体肠道的功能。此外，由于低聚异麦芽糖的甜度只有普通糖的一半，可以有效防止儿童龋齿，适宜糖尿病人食用，可以作为饮料糖果和保健品的添加剂。在饲料工业中，低聚异麦芽糖被认为可以在提高家禽存活率的同时，又不会存在合成饲料带来对人体的副作用，据报道，日本50％左右的饲料中都含有低聚异麦芽糖。目前，低聚异麦芽糖已经在食品、医药和饲料加工行业有了很广泛的应用。

生产AGLU酶的微生物种类有细菌、曲霉、古细菌等。现在工业上生产环糊精所使用的AGLU酶主要来自黑曲霉。

目前，黑曲霉的AGLU酶的编码基因(aglu基因)得到了克隆，但是成功的都是采用曲霉属作为宿主。由于能分泌AGLU酶的野生菌株的生产能力普遍较低，为了克服野生菌株的低生产能力，国内外研究者通过构建基因工程菌生产重组AGLU酶。在国内，对α-葡萄糖苷酶的研究还主要在α-葡萄糖苷酶的生产菌种选育和酶学性质方面，虽然有通过RT-PCR方法扩增得到A.nigerα-葡萄糖苷酶cDNA，构建重组质粒并尝试在大肠杆菌中表达，但酶表达量偏低，而且重组蛋白是胞内酶，分离纯化的成本相对高。

迄今为止，国内生产低聚异麦芽糖用α-葡萄糖苷酶主要依赖日本进口，为了降低低聚异麦芽糖的商业成本，首先必须降低α-葡萄糖苷酶的生产成本。Aspergillus niger是最常用的α-葡萄糖苷酶的生产菌株，但同样存在生产能力较低的缺陷。在国内的报道中，重组α-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中一般定位于胞内形成包涵体或存在于周质中，不利于重组α-葡萄糖苷酶的回收与使用。因此，构建重组菌大规模生产胞外α-葡萄糖苷酶，对降低α-葡萄糖苷酶的生产成本显得非常重要。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种α-葡萄糖苷酶，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明的另一个目的是提供一种编码该α-葡萄糖苷酶的DNA分子，所述的DNA分子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明的再一个目的是提供包含本发明基因的表达宿主细胞。

本发明的技术方案：一种α-葡萄糖苷酶，缩写为AGLU酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的α-葡萄糖苷酶的基因，缩写为aglu基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

所述的aglu基因的表达方法：由黑曲霉(Aspergillus niger)WX-07总DNA获得aglu的cDNA SEQ ID NO：1，aglu基因以质粒pPIC 9K为表达载体，以毕赤酵母KM 71为表达宿主，实现aglu基因的可溶性表达；

(1)黑曲霉(Aspergillus niger)WX-07总DNA的提取：

黑曲霉WX-07菌株在YPD液体培养基中培养2天，菌丝体过滤，再用无菌水冲洗三次，用无菌滤纸吸干水分，将菌丝体转入研钵内，加液氮研磨得菌粉，将菌粉放入事先称重的50mL离心管中，称量1g菌粉，将由8.1816gNaCl、2g十二烷基磺酸钠、10mL 500mmoL/L EDTA、5mL 1mol/L Tris-HCl缓冲液加水定容到100mL组成的抽提缓冲液在65℃水浴中预热，按3mL/g菌粉加入抽提缓冲液，用封口膜封住，65℃放置1h，得菌液；吸取1.5mL菌液于灭菌的1.5mL离心管中，平行2管，10000r/min离心5min，吸上清0.75mL至新的1.5mL离心管中，加入0.75mL由50mL 10％CTAB、5.844gNaCl、10mL500mmol/LEDTA、25mL 1mol/L Tris-HCl定容到100mL的5×CTAB溶液，然后再每管分成两管，每管取0.6mL，分别加入0.6mL的酚/氯仿/异戊醇体积比25∶24∶1混合溶液，混匀，10000r/min离心10min；上清液吸入另一批新的离心管中，弃下层油相及中层蛋白；在这批离心管中分别加入等体积，0.4mL氯仿/异戊醇体积比24∶1混合溶液，颠倒混匀，10000r/min离心10min，吸取上清，重复以上步骤，直至无蛋白；加入等体积0.3mL异丙醇至上清液中，充分混匀，-20℃过夜，第二天，10000r/min，弃上清；用现配的70％的乙醇洗沉淀2次，倒掉乙醇，用无水乙醇洗沉淀1次，倒掉乙醇，室温干燥20-30min；加50μL无菌水溶解沉淀，-20℃冻存；

(2)α-葡萄糖苷酶编码基因的克隆：

以黑曲霉WX-07总DNA为模版，由于aglu基因是有四个外显子和三个内含子，所以通过PCR和over-lap PCR扩增出aglu基因，以下列八个核苷酸序列作为引物，下划线为酶切位点Not I：

引物1：5’-ATTAATGCGGCCGCGTCCACCACTGCCCCTTCG-3’

引物2：5’-CCGTAGAGGTTTTGGTCAATAGGTGTTC-3’

引物3：5’-ACCTATTGACCAAAACCTCTACGGCCA-3’

引物4：5’-TCAATATCGGTCCAGATATATTCCAAC-3’

引物5：5’-GAATATATCTGGACCGATATTGACTACATGCACG-3’

引物6：5’-CGTAGCGTAGGCATCAGAGGCATTTTC-3’

引物7：5’-GCCTCTGATGCCTACGCTACGTATGACA-3’

引物8：5’-AGCACTAGCGGCCGCCCATTCCAATACCCAGTTTTCC-3’

第一轮PCR：

以黑曲霉WX-07总DNA为模板，分别以P1、P2；P3、P4；P5、P6；P7、P8为上下游引物，扩增出exon 1，exon 2，exon 3，exon 4；

PCR反应在50μL体系中进行：5×PCR缓冲液10μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，模板DNA 1μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；

PCR反应条件为：在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃分别延伸1min、1min、1min和3min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；

第二轮PCR：

以exon 2和exon 3为模板，以P3、P6为上下游引物，扩增得到exon 2-3；

PCR反应在50μL体系中进行：5×PCR缓冲液10μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，exon 2和exon 3各1μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；

PCR反应条件为：在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；

第三轮PCR：

以exon 2-3和exon 4为模板，以P3、P8为上下游引物，扩增得到exon 2-3-4；

PCR反应在50μL体系中进行：5×PCR缓冲液10μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，exon 2-3和exon 4各1μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；

PCR反应条件为：在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；

第四轮PCR：

以exon 1和exon 2-3-4为模板，以P1、P8为上下游引物，扩增得到exon1-2-3-4；

PCR反应在50μL体系中进行：5×PCR缓冲液10μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，exon 1和exon 2-3-4各1μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；

PCR反应条件为：在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸4min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到全基因exon 1-2-3-4片段2880bp，割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，命名为aglu/pMD18-T simple，将此质粒进行序列测定；

(3)aglu基因在表达载体上的构建：

用于构建表达载体的质粒是pPIC 9K，带有α-Factor信号肽，将pPIC 9K质粒和扩增的aglu基因进行Not I酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的aglu/pPIC 9K质粒；

(4)毕赤酵母菌KM71转化和筛选重组菌：

将表达载体aglu/pPIC 9K 17μL，10×H buffer 2μL，Bgl II 1μL，37℃酶切1.5h后回收含有目的基因的条带，溶于20μL无菌水中，得到线性化的DNA；

在80μL毕赤酵母KM71感受态细胞中加入2μL线性化的DNA，混匀，转入1mm预冷的电转杯中，将电转化仪调至毕赤酵母档，电激，转化物中加入1mL1mol/L的山梨醇，30℃温育1h，取200μL的山梨醇重悬液涂布MD平板，30℃培养72小时；挑取回复突变菌株接种于YPD/G418平板上，30℃培养48h至长出单菌落，为获得多拷贝的aglu基因的菌株，G418浓度筛选梯度依次为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL；

pPIC 9K空质粒同上处理，所得转化菌作为阴性对照；

(5)重组毕赤酵母KM 71/pPIC9K-aglu的PCR鉴定：

选取含4mg/mL G418的YPD/G418上单菌落，以引物1，引物8作为引物，用前述的PCR方法，检验是否能够扩增得到全长exon 1-2-3-4片段；重组毕赤酵母KM 71/pPIC9K的PCR鉴定作为对照；鉴定后获得正确的重组毕赤酵母KM71/aglu/pPIC 9K用于后续实验；

(6)重组毕赤酵母的培养：

将鉴定正确的单菌落KM 71/aglu/pPIC 9K接种至10mL YPD培养基，30℃培养24h，1mL培养液接入50mL BMGY，30℃培养24h，至OD为4.0，离心收集菌体，用25mL BMMY培养基重悬培养，甲醇诱导表达，分别于24h、48h、72h和96h取样，每次取样200μL，离心收集上清，并补加250μL甲醇至终浓度1％；阴性对照重组毕赤酵母KM 71/pPIC9K培养方法同上；

(7)重组α-葡萄糖苷酶的检测

SDS-PAGE检测表达产物在98和33kDa有条带，收集毕赤酵母发酵培养的上清液，硫酸铵沉淀，透析，制成粗酶液，测定酶活方法如下：用pH 5的醋酸钠缓冲液配制10％的麦芽糖溶液10mL，50μL粗制的浓缩酶液，60℃反应24h，然后煮沸2min，微孔过滤，HPLC检测产物，与市售的低聚异麦芽糖产品IMO-900比较各成分组成；液相检测显示有转糖苷产物异麦芽糖、潘糖生成。

本发明的有益效果：本发明提供了aglu基因的高效表达方法。提取A.nigerWX-07总DNA，设计引物PCR和overlap PCR得到编码AGLU酶的基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，全长2880bp个核苷酸，编码960个氨基酸。以质粒pPIC 9K为表达载体整合到表达宿主毕赤酵母KM 71，可实现aglu基因的胞外表达，重组酶具有转糖苷活性。

附图说明

图1PCR和overlap-PCR的过程。

图2重组AGLU酶SDS-PAGE图谱。

具体实施方式

实施例1

本实施例说明黑曲霉(Aspergillusniger)WX-07总DNA的提取：

黑曲霉WX-07菌株在YPD液体培养基中培养2天，菌丝体过滤，再用无菌水冲洗三次，用无菌滤纸吸干水分，将菌丝体转入研钵内，加液氮研磨得菌粉，将菌粉放入事先称重的50mL离心管中，称量1g菌粉，将由8.1816gNaCl、2g十二烷基磺酸钠、10mL 500mmoL/L EDTA、5mL 1mol/L Tris-HCl缓冲液加水定容到100mL组成的抽提缓冲液在65℃水浴中预热，按3mL/g菌粉加入抽提缓冲液，用封口膜封住，65℃放置1h，得菌液；吸取1.5mL菌液于灭菌的1.5mL离心管中，平行2管，10000r/min离心5min，吸上清0.75mL至新的1.5mL离心管中，加入0.75mL由50mL 10％CTAB、5.844gNaCl、10mL500mmol/LEDTA、25mL 1mol/L Tris-HCl定容到100mL的5×CTAB溶液，然后再每管分成两管，每管取0.6mL，分别加入0.6mL的酚/氯仿/异戊醇体积比25∶24∶1混合溶液，混匀，10000r/min离心10min；上清液吸入另一批新的离心管中，弃下层油相及中层蛋白；在这批离心管中分别加入等体积，0.4mL氯仿/异戊醇体积比24∶1混合溶液，颠倒混匀，10000r/min离心10min，吸取上清，重复以上步骤，直至无蛋白；加入等体积0.3mL异丙醇至上清液中，充分混匀，-20℃过夜，第二天，10000r/min，弃上清；用现配的70％的乙醇洗沉淀2次，倒掉乙醇，用无水乙醇洗沉淀1次，倒掉乙醇，室温干燥20-30min；加50μL无菌水溶解沉淀，-20℃冻存；

实施例2

本实施例说明AGLU酶编码基因的克隆程序。

以黑曲霉WX-07总DNA为模版，由于aglu基因是有四个外显子和三个内含子，所以通过PCR和over-lap PCR扩增出aglu基因，以下列八个核苷酸序列作为引物，下划线为酶切位点Not I：

引物1：5’ATTAATGCGGCCGCGTCCACCACTGCCCCTTCG-3’

引物2：5’-CCGTAGAGGTTTTGGTCAATAGGTGTTC-3’

引物3：5’-ACCTATTGACCAAAACCTCTACGGCCA-3’

引物4：5’-TCAATATCGGTCCAGATATATTCCAAC-3’

引物5：5’-GAATATATCTGGACCGATATTGACTACATGCACG-3’

引物6：5’-CGTAGCGTAGGCATCAGAGGCATTTTC-3’

引物7：5’-GCCTCTGATGCCTACGCTACGTATGACA-3’

引物8：5’-AGCACTAGCGGCCGCCCATTCCAATACCCAGTTTTCC-3’

第一轮PCR：

以黑曲霉WX-07总DNA为模板，分别以P1、P2；P3、P4；P5、P6；P7、P8为上下游引物，扩增出exon 1，exon 2，exon 3，exon 4；

PCR反应在50μL体系中进行：5×PCR缓冲液10μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，模板DNA 1μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；

PCR反应条件为：在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃分别延伸1min、1min、1min和3min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；

第二轮PCR：

以exon 2和exon 3为模板，以P3、P6为上下游引物，扩增得到exon 2-3；

PCR反应在50μL体系中进行：5×PCR缓冲液10μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，exon 2和exon 3各1μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；

PCR反应条件为：在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；

第三轮PCR：

以exon 2-3和exon 4为模板，以P3、P8为上下游引物，扩增得到exon 2-3-4；

PCR反应在50μL体系中进行：5×PCR缓冲液10μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，exon 2-3和exon 4各1μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；

PCR反应条件为：在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；

第四轮PCR：

以exon 1和exon 2-3-4为模板，以P1、P8为上下游引物，扩增得到exon1-2-3-4；

PCR反应在50μL体系中进行：5×PCR缓冲液10μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，exon 1和exon 2-3-4各1μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；

PCR反应条件为：在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸4min，共35个循环后，再于72℃延伸10mmin，扩增得到全基因exon 1-2-3-4片段2880bp，割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，命名为aglu/pMD18-T simple，将此质粒进行序列测定；

将此质粒进行序列测定，结果表明插入片段含有一个长2880bp的开放阅读框(ORF)，编码一个由960个氨基酸编码的蛋白质。

实施例3

本实施例说明aglu基因在表达载体上的构建程序。

用于构建表达载体的质粒是pPIC 9K，带有α-Factor信号肽，将pPIC 9K质粒和扩增的aglu基因进行Not I酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的aglu/pPIC 9K质粒；

实施例4

本实施例说明毕赤酵母宿主转化和筛选重组菌的程序。

将表达载体aglu/pPIC 9K 17μL，10×H buffer 2μL，Bgl II 1μL，37℃酶切1.5h后回收含有目的基因的条带，溶于20μL无菌水中，得到线性化的DNA；

在80μL毕赤酵母KM71感受态细胞中加入2μL线性化的DNA，混匀，转入1mm预冷的电转杯中，将电转化仪调至毕赤酵母档，电激，转化物中加入1mL1mol/L的山梨醇，30℃温育1h，取200μL的山梨醇重悬液涂布MD平板，30℃培养72小时；挑取回复突变菌株接种于YPD/G418平板上，30℃培养48h至长出单菌落，为获得多拷贝的aglu基因的菌株，G418浓度筛选梯度依次为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL；

pPIC 9K空质粒同上处理，所得转化菌作为阴性对照；

实施例5

本实施例说明AGLU酶的转糖苷活性。

将上述AGLU酶发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体；上清液中加入70％固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用适量pH 5的醋酸缓冲液溶解，并在缓冲液中透析过夜，制成粗酶液。SDS-PAGE检验表达产物，结果如图2。

用pH 5的醋酸缓冲液配制10％的麦芽糖溶液，加入0.5％粗制的浓缩酶液，60℃下反应24h然后煮沸5min，微孔过滤，HPLC检测产物。

高效液相色谱分析的条件：示差折光检测器，色谱柱(I)：钙型强碱性离子交换树脂Sugar Pakl 1300mm×6.5mm；柱温：85℃；池温(检测器)：30℃；流动相：水；流速：0.5mL/min；进样量：10μL。色谱柱(II)：Hypersil NH2，250mm×4.6mm；柱温：30℃；池温(检测器)：30℃；流动相：乙腈/水(75/25V/V)；流速：1mL/min；进样量：10μL。

表1重组AGLU酶的转糖苷反应产物

1、低聚异麦芽糖(IMO-900)；

2、重组酶的转糖苷产物；G，M，I₂，P，I₃，I₄分别代表葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖和四糖以上低聚异麦芽糖。

序列表

<210>SEQ ID NO：1

<211>2880

<212>DNA

<213>黑曲霉(Aspergillus niger)WX-07

<400>1

tccaccactg ccccttcgtc cgcagtttac cattcctgct tccgcagatg tcggtgcgca    60

gctgattgcc aacatcgatg atcctcaggc tgccgacgcg cagtcggttt gtccgggcta   120

caaggcttca aaagtgcagc acaattcacg tgggttcact gccagtcttc agctcgcggg   180

caggccatgt aacgtatacg gcacagatgt tgagtccttg acactgtctg tggagtacca   240

ggattcggat cgactgaata ttcagattct ccccactcat gttgactcca caaacgcttc   300

ttggtacttt ctttcggaaa acctggtccc cagacccaag gcttccctca atgcatctgt   360

atcccagagc ggcctttttg tgtcatggtc aaatgagccg tcgttcaatt tcaaggtgat   420

ccgaaaggct acaggcgacg cgcttttcag tacagaaggc actgtgctcg tatatgagaa   480

tcaattcatc gaatttgtga ccgcgctccc tgaagaatat aacttgtatg gccttgggga   540

gcatatcacg caattccgcc tccagagaaa tgctaatctg accatatatc cttcggatga   600

tggaacacct attgaccaaa acctctacgg ccaacatccc ttctatctgg atacaagata   660

ttacaaagga gataggcaga atgggtctta tattcccgtc aaaagcagcg aggctgatgc   720

ctcgcaagat tatatctccc tctctcatgg cgtgtttctg aggaactctc atggacttga   780

gatactcctc cggtctcaaa aattgatctg gcggacccta ggtggaggaa tcgatctcac   840

cttctactca ggccccgccc cggccgatgt taccaggcaa tatcttacca gcactgtggg   900

attaccggcc atgcagcaat acaacactct tggattccac caatgtcgtt ggggctacaa   960

caactggtcg gatctggcgg acgttgttgc gaattttgag aagtttgaga tcccgttgga  1020

atatatctgg accgatattg actacatgca cggatatcgc aactttgaca acgatcaaca  1080

tcgcttttcc tacagtgagg gcgatgaatt tctcagcaag ctacatgaga gtggacgcta  1140

ctatgtatcc attgttgatg cggcgctcta cattcctaat cccgaaaatg cctctgatgc  1200

ctacgctacg tatgacagag gagcggcgga cgacgtcttc ctcaagaatc ccgatggtag  1260

cctctatatt ggagccgttt ggccaggata tacagtcttc cccgattggc atcatcccaa  1320

ggcggttgac ttctgggcta acgagcttgt tatctggtcg aagaaagtgg cgttcgatgg  1380

tgtgtggtac gacatgtctg aagtttcatc cttctgtgtc gggagctgtg gcacaggtaa  1440

cctgactctg aacccggcac acccatcgtt tcttctcccc ggtgagcctg gtgatatcat  1500

atatgattac ccagaggctt tcaatatcac caacgctata gaggcggcgt cagcttcggc  1560

gggagcttcc agtcaggctg cagcaaccgc gaccaccacg tcgacttcgg tatcatatct  1620

gcggacaacg cccacgcctg gtgtccgcaa tgttgagcac ccaccctatg tgatcaacca  1680

tgaccaagaa ggccatgatc tcagtgtcca tgcggtgtcg ccgaatgcaa cgcatgttga  1740

tggtgttgag gagtatgatg tgcacggtct ctacggacat caaggattga acgctaccta  1800

ccaaggtctg cttgaggtct ggtctcataa gcggcggcca tttattattg gccgctcaac  1860

cttcgctggc tctggcaaat gggcaggcca ctggggcggc gacaactatt ccaaatggtg  1920

gtccatgtac tactccatct cgcgagccct ctccttctca cttttcggca ttccgatgtt  1980

tggtgcggac acctgtgggt ttaacggaaa ctccgatgag gagctctgca accgatggat  2040

gcaactgtcc gcattcttcc cattctaccg aaaccacaat gagctctcca caatcccaca  2100

ggagccttat cggtgggctt ctgttattga agcaaccaag tccgccatga gaattcggta  2160

cgccatccta ccttactttt atacgttgtt tgacctggcc cacaccacgg gctccactgt   2220

aatgcgcgca ctttcctggg aattccctaa tgacccaaca ttggctgcag ttgagactca   2280

attcatggtt gggccggcca tcatggtggt cccggtattg gagcctctgg tcaatacggt   2340

caagggcgta ttcccaggag ttggacatgg cgaagtgtgg tacgattggt acacccaggc   2400

tgcagttgat gcgaagcccg gggtcaacac gaccatttcg gcaccattgg gccacatccc   2460

agtttatgta cgaggtggaa acatcttgcc gatgcaagag ccggcattga ccactcgtga   2520

agcccggcaa accccgtggg ctttgctagc tgcactagga agcaatggaa ccgcgtcggg   2580

gcagctctgt ctcgatgatg gagagagcat ctactccaat gccaccctcc atgtggactc   2640

acggcatcgc ggtcaagcct gcgctcgtcg gctcaaggaa gatggaaaga gaggaacccg   2700

cttgctaatg tgacggtgct cggagtgaac aaggagccct ctgcggtgac cctgaatgga   2760

caggccgtat ttcccgggtc tgtcacgtac aattctacgt cccaggttct ctttgttggg   2820

gggctgcaaa acttgacgaa gggcggcgca tgggcggaaa actgggtatt ggaatggtag   2880

<210>SEQ ID NO：2

<211>960

<212>PRT

<213>黑曲霉(Aspergillus niger)WX-07

<400>2

Ser Thr Thr Ala Pro Ser Gln Pro Gln Phe Thr Ile Pro Ala Ser

                  5                  10                  15

Ala Asp Val Gly Ala Gln Leu Ile Ala Asn Ile Asp Asp Pro Gln

                 20                  25                  30

Ala Ala Asp Ala Gln Ser Val Cys Pro Gly Tyr Lys Ala Ser Lys

                 35                  40                  45

Val Gln His Asn Ser Arg Gly Phe Thr Ala Ser Leu Gln Leu Ala

                 50                  55                  60

Gly Arg Pro Cys Asn Val Tyr Gly Thr Asp Val Glu Ser Leu Thr

                 65                  70                  75

Leu Ser Val Glu Tyr Gln Asp Ser Asp Arg Leu Asn Ile Gln Ile

                 80                  85                  90

Leu Pro Thr His Val Asp Ser Thr Asn Ala Ser Trp Tyr Phe Leu

                 95                 100                 105

Ser Glu Asn Leu Val Pro Arg Pro Lys Ala Ser Leu Asn Ala Ser

                110                 115                 120

Val Ser Gln Ser Gly Leu Phe Val Ser Trp Ser Asn Glu Pro Ser

                125                 130                 135

Phe Asn Phe Lys Val Ile Arg Lys Ala Thr Gly Asp Ala Leu Phe

                140                 145                 150

Ser Thr Glu Gly Thr Val Leu Val Tyr Glu Asn Gln Phe Ile Glu

                155                 160                 165

Phe Val Thr Ala Leu Pro Glu Glu Tyr Asn Leu Tyr Gly Leu Gly

                170                 175                 180

Glu His Ile Thr Gln Phe Arg Leu Gln Arg Asn Ala Asn Leu Thr

                185                 190                 195

Ile Tyr Pro Ser Asp Asp Gly Thr Pro Ile Asp Gln Asn Leu Tyr

                200                 205                 210

Gly Gln His Pro Phe Tyr Leu Asp Thr Arg Tyr Tyr Lys Gly Asp

                215                 220                 225

Arg Gln Asn Gly Ser Tyr Ile Pro Val Lys Ser Ser Glu Ala Asp

                230                 235                 240

Ala Ser Gln Asp Tyr Ile Ser Leu Ser His Gly Val Phe Leu Arg

                245                 250                 255

Asn Ser His Gly Leu Glu Ile Leu Leu Arg Ser Gln Lys Leu Ile

                260                 265                 270

Trp Arg Thr Leu Gly Gly Gly Ile Asp Leu Thr Phe Tyr Ser Gly

                275                 280                 285

Pro Ala Pro Ala Asp Val Thr Arg Gln Tyr Leu Thr Ser Thr Val

                290                 295                 300

Gly Leu Pro Ala Met Gln Gln Tyr Asn Thr Leu Gly Phe His Gln

                305                 310                 315

Cys Arg Trp Gly Tyr Asn Asn Trp Ser Asp Leu Ala Asp Val Val

                320                 325                 330

Ala Asn Phe Glu Lys Phe Glu Ile Pro Leu Glu Tyr Ile Trp Thr

                335                 340                 345

Asp Ile Asp Tyr Met His Gly Tyr Arg Asn Phe Asp Asn Asp Gln

                350                 355                 360

His Arg Phe Ser Tyr Ser Glu Gly Asp Glu Phe Leu Ser Lys Leu

                365                 370                 375

His Glu Ser Gly Arg Tyr Tyr Val Ser Ile Val Asp Ala Ala Leu

                380                 385                 390

Tyr Ile Pro Asn Pro Glu Asn Ala Ser Asp Ala Tyr Ala Thr Tyr

                395                 400                 405

Asp Arg Gly Ala Ala Asp Asp Val Phe Leu Lys Asn Pro Asp Gly

                410                 415                 420

Ser Leu Tyr Ile Gly Ala Val Trp Pro Gly Tyr Thr Val Phe Pro

                425                 430                 435

Asp Trp His His Pro Lys Ala Val Asp Phe Trp Ala Asn Glu Leu

                440                 445                 450

Val Ile Trp Ser Lys Lys Val Ala Phe Asp Gly Val Trp Tyr Asp

                455                 460                 465

Met Ser Glu Val Ser Ser Phe Cys Val Gly Ser Cys Gly Thr Gly

                470                 475                 480

Asn Leu Thr Leu Asn Pro Ala His Pro Ser Phe Leu Leu Pro Gly

                485                 490                 495

Glu Pro Gly Asp Ile Ile Tyr Asp Tyr Pro Glu Ala Phe Asn Ile

                500                 505                 510

Thr Asn Ala Ile Glu Ala Ala Ser Ala Ser Ala Gly Ala Ser Ser

                515                 520                 525

Gln Ala Ala Ala Thr Ala Thr Thr Thr Ser Thr Ser Val Ser Tyr

                530                 535                 540

Leu Arg Thr Thr Pro Thr Pro Gly Val Arg Asn Val Glu His Pro

                545                 550                 555

Pro Tyr Val Ile Asn His Asp Gln Glu Gly His Asp Leu Ser Val

                560                 565                 570

His Ala Val Ser Pro Asn Ala Thr His Val Asp Gly Val Glu Glu

                575                 580                 585

Tyr Asp Val His Gly Leu Tyr Gly His Gln Gly Leu Asn Ala Thr

                590                 595                 600

Tyr Gln Gly Leu Leu Glu Val Trp Ser His Lys Arg Arg Pro Phe

                605                 610                 615

Ile Ile Gly Arg Ser Thr Phe Ala Gly Ser Gly Lys Trp Ala Gly

                620                 625                 630

His Trp Gly Gly Asp Asn Tyr Ser Lys Trp Trp Ser Met Tyr Tyr

                635                 640                 645

Ser Ile Ser Arg Ala Leu Ser Phe Ser Leu Phe Gly Ile Pro Met

                650                 655                 660

Phe Gly Ala Asp Thr Cys Gly Phe Asn Gly Asn Ser Asp Glu Glu

                665                 670                 675

Leu Cys Asn Arg Trp Met Gln Leu Ser Ala Phe Phe Pro Phe Tyr

                680                 685                 690

Arg Asn His Asn Glu Leu Ser Thr Ile Pro Gln Glu Pro Tyr Arg

                695                 700                 705

Trp Ala Ser Val Ile Glu Ala Thr Lys Ser Ala Met Arg Ile Arg

                710                 715                 720

Tyr Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Tyr Thr Leu Phe Asp Leu Ala His

                725                 730                 735

Thr Thr Gly Ser Thr Val Met Arg Ala Leu Ser Trp Glu Phe Pro

                740                 745                 750

Asn Asp Pro Thr Leu Ala Ala Val Glu Thr Gln Phe Met Val Gly

                755                 760                 765

Pro Ala Ile Met Val Val Pro Val Leu Glu Pro Leu Val Asn Thr

                770                 775                 780

Val Lys Gly Val Phe Pro Gly Val Gly His Gly Glu Val Trp Tyr

                785                 790                 795

Asp Trp Tyr Thr Gln Ala Ala Val Asp Ala Lys Pro Gly Val Asn

                800                 805                 810

Thr Thr Ile Ser Ala Pro Leu Gly His Ile Pro Val Tyr Val Arg

                815                 820                 825

Gly Gly Asn Ile Leu Pro Met Gln Glu Pro Ala Leu Thr Thr Arg

                830                 835                 840

Glu Ala Arg Gln Thr Pro Trp Ala Leu Leu Ala Ala Leu Gly Ser

                845                 850                 855

Asn Gly Thr Ala Ser Gly Gln Leu Cys Leu Asp Asp Gly Glu Ser

                860                 865                 870

Ile Tyr Ser Asn Ala Thr Leu His Val Asp Phe Thr Ala Ser Arg

                875                 880                 885

Ser Ser Leu Arg Ser Ser Ala Gln Gly Arg Trp Lys Glu Arg Asn

                890                 895                 900

Pro Leu Ala Asn Val Thr Val Leu Gly Val Asn Lys Glu Pro Ser

                905                 910                 915

Ala Val Thr Leu Asn Gly Gln Ala Val Phe Pro Gly Ser Val Thr

                920                 925                 930

Tyr Asn Ser Thr Ser Gln Val Leu Phe Val Gly Gly Leu Gln Asn

                935                 940                 945

Leu Thr Lys Gly Gly Ala Trp Ala Glu Asn Trp Val Leu Glu Trp

                950                 955                 960

Claims (1)

1.一种α-葡萄糖苷酶基因的表达方法，其特征是由黑曲霉WX-07总DNA获得aglu的cDNA SEQ ID NO：1，aglu基因以质粒pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母KM71为表达宿主，实现aglu基因的可溶性表达；

(1)黑曲霉WX-07总DNA的提取：

黑曲霉WX-07菌株在YPD液体培养基中培养2天，菌丝体过滤，再用无菌水冲洗三次，用无菌滤纸吸干水分，将菌丝体转入研钵内，加液氮研磨得菌粉，将菌粉放入事先称重的50mL离心管中，称量1g菌粉，将由8.1816gNaCl、2g十二烷基磺酸钠、10mL 500mmoL/L EDTA、5mL 1mol/L Tris-HCl缓冲液加水定容到100mL组成的抽提缓冲液在65℃水浴中预热，按3mL/g菌粉加入抽提缓冲液，用封口膜封住，65℃放置1h，得菌液；吸取1.5mL菌液于灭菌的1.5mL离心管中，平行2管，10000r/min离心5min，吸上清0.75mL至新的1.5mL离心管中，加入0.75mL由50mL 10％CTAB、5.844gNaCl、10mL500mmol/LEDTA、25mL 1mol/L Tris-HCl定容到100mL的5×CTAB溶液，然后再每管分成两管，每管取0.6mL，分别加入0.6mL的酚/氯仿/异戊醇体积比25∶24∶1混合溶液，混匀，10000r/min离心10min；上清液吸入另一批新的离心管中，弃下层油相及中层蛋白；在这批离心管中分别加入等体积、0.4mL氯仿/异戊醇体积比24∶1混合溶液，颠倒混匀，10000r/min离心10min，吸取上清，重复以上步骤，直至无蛋白；加入等体积0.3mL异丙醇至上清液中，充分混匀，-20℃过夜，第二天，10000r/min，弃上清；用现配的70％的乙醇洗沉淀2次，倒掉乙醇，用无水乙醇洗沉淀1次，倒掉乙醇，室温干燥20-30min；加50μL无菌水溶解沉淀，-20℃冻存；

(2)α-葡萄糖苷酶编码基因的克隆：

以黑曲霉WX-07总DNA为模板，由于aglu基因是有四个外显子和三个内含子，所以通过PCR和over-lap PCR扩增出aglu基因，以下列八个核苷酸序列作为引物，下划线为酶切位点Not I：

引物1：5’-ATTAATGCGGCCGCGTCCACCACTGCCCCTTCG-3’

引物2：5’-CCGTAGAGGTTTTGGTCAATAGGTGTTC-3’

引物3：5’-ACCTATTGACCAAAACCTCTACGGCCA-3’

引物4：5’-TCAATATCGGTCCAGATATATTCCAAC-3’

引物5：5’-GAATATATCTGGACCGATATTGACTACATGCACG-3’

引物6：5’-CGTAGCGTAGGCATCAGAGGCATTTTC-3’

引物7：5’-GCCTCTGATGCCTACGCTACGTATGACA-3’

引物8：5’-AGCACTAGCGGCCGCCCATTCCAATACCCAGTTTTCC-3’ 

第一轮PCR：

以黑曲霉WX-07总DNA为模板，分别以P1、P2；P3、P4；P5、P6；P7、P8为上下游引物，扩增出exon 1，exon 2，exon 3，exon 4；

PCR反应在50μL体系中进行：5×PCR缓冲液10μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，模板DNA 1μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；

PCR反应条件为：在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃分别延伸1min、1min、1min和3min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；

第二轮PCR：

以exon 2和exon 3为模板，以P3、P6为上下游引物，扩增得到exon 2-3；

PCR反应在50μL体系中进行：5×PCR缓冲液10μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，exon 2和exon 3各1μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；

PCR反应条件为：在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；

第三轮PCR：

以exon 2-3和exon 4为模板，以P3、P8为上下游引物，扩增得到exon 2-3-4；

PCR反应在50μL体系中进行：5×PCR缓冲液10μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，exon 2-3和exon 4各1μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；

PCR反应条件为：在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；

第四轮PCR： 

以exon 1和exon 2-3-4为模板，以P1、P8为上下游引物，扩增得到exon1-2-3-4；

PCR反应在50μL体系中进行：5×PCR缓冲液10μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，exon 1和exon 2-3-4各1μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；

PCR反应条件为：在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸4min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到全基因exon 1-2-3-4片段2880bp，割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，命名为aglu/pMD18-T simple，将此质粒进行序列测定；

(3)aglu基因在表达载体上的构建：

用于构建表达载体的质粒是pPIC 9K，带有α-Factor信号肽，将pPIC 9K质粒和扩增的aglu基因进行Not I酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的aglu/pPIC 9K质粒；

(4)毕赤酵母菌KM71转化和筛选重组菌：

将表达载体aglu/pPIC 9K 17μL，10×H buffer 2μL，Bgl II 1μL，37℃酶切1.5h后回收含有目的基因的条带，溶于20μL无菌水中，得到线性化的DNA；

在80μL毕赤酵母KM71感受态细胞中加入2μL线性化的DNA，混匀，转入1mm预冷的电转杯中，将电转化仪调至毕赤酵母档，电激，转化物中加入1mL1mol/L的山梨醇，30℃温育1h，取200μL的山梨醇重悬液涂布MD平板，30℃培养72小时；挑取回复突变菌株接种于YPD/G418平板上，30℃培养48h至长出单菌落，为获得多拷贝的aglu基因的菌株，G418浓度筛选梯度依次为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL；

pPIC 9K空质粒同上处理，所得转化菌作为阴性对照；

(5)重组毕赤酵母KM 71/aglu/pPIC 9K的PCR鉴定：

选取含4mg/mL G418的YPD/G418上单菌落，以引物1，引物8作为引物，用前述的PCR方法，检验是否能够扩增得到全长exon 1-2-3-4片段；重组毕赤酵母KM 71/pPIC9K的PCR鉴定作为对照；鉴定后获得正确的重组毕赤酵母KM71/aglu/pPIC 9K用于后续实验；

(6)重组毕赤酵母的培养：

将鉴定正确的单菌落KM 71/aglu/pPIC 9K接种至10mL YPD培养基，30℃培养24h，1mL培养液接入50mL BMGY，30℃培养24h，至OD为4.0，离 心收集菌体，用25mL BMMY培养基重悬培养，甲醇诱导表达，分别于24h、48h、72h和96h取样，每次取样200μL，离心收集上清，并补加250μL甲醇至终浓度1％；阴性对照重组毕赤酵母KM 71/pPIC9K培养方法同上；

(7)重组α-葡萄糖苷酶的检测：

SDS-PAGE检测表达产物在98kDa和33kDa有条带，收集毕赤酵母发酵培养的上清液，硫酸铵沉淀，透析，制成粗酶液，测定酶活方法如下：用pH 5的醋酸钠缓冲液配制10％的麦芽糖溶液10mL，加50μL粗制的浓缩酶液，60℃反应24h，然后煮沸2min，微孔过滤，HPLC检测产物，与市售的低聚异麦芽糖产品IMO-900比较各成分组成；液相检测显示有转糖苷产物异麦芽糖、潘糖生成。 

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