CN101649310B - 一种β-葡萄糖苷酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种β-葡萄糖苷酶的制备方法，其以天然纤维素类物质作为碳源制作固体发酵培养基，通过机械搅拌接种、固体盘式发酵得到β-葡萄糖苷酶；所述固体发酵培养基按重量份计包括：天然纤维素类物质160份，麸皮140份，硫酸铵30-50份，尿素10-30份，硫酸镁0.2-0.5份，磷酸二氢钾0.05-0.1份，水550-650份。本发明的固体盘式发酵替代固体发酵罐发酵，消毒灭菌彻底，局部染菌易处理，减小染菌带来的损失，有利于规模化生产；发酵期间，前期发酵产热很快，可利用这一特点控制产热，以供生长需要的热量，节约电耗；本发明生产的β-葡萄糖苷酶的酶活为1200IU/g左右，经成本核算可以进行大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及微生物生产制造领域，特别地，涉及一种β-葡萄糖苷酶的制备方法。
背景技术
β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21)，属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶，是纤维素复合酶系中的一种。它属于纤维素酶类，能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖。β-葡萄糖苷酶在秸秆酒精等工业中应用较广，其作用是降解秸秆在纤维素酶作用下产生的纤维二糖，纤维二糖是纤维素酶活力的抑制物，随着纤维二糖的减少，纤维素酶水解效率得以提高。能够被β-葡萄糖苷酶水解的底物还有很多，如大豆苷、苦杏苷，可被广泛应用于食品药品行业以及生物质产业。其研究有助于我国非粮食能源领域迅速发展，解决目前世界粮食短缺、能源危机的重大国际问题。
发明内容
本发明的目的是解决目前非粮食能源项目因成本较高难以大规模投入生产的问题，提供一种利用微生物生产出β-葡萄糖苷酶。
本发明提供一种β-葡萄糖苷酶的制备方法，其以天然纤维素类物质作为碳源制作固体发酵培养基，通过机械搅拌接种、固体盘式发酵得到β-葡萄糖苷酶；所述固体发酵培养基按重量份计包括：天然纤维素类物质150-300份，麸皮90-160份，硫酸铵30-50份，尿素10-30份，硫酸镁0.2-0.5份，磷酸二氢钾0.05-0.1份，水550-650份；按固体发酵培养基重量的2％-3％的接种量接种霉菌孢子，温度控制在25～35 ℃之间，培养4～6天。
优选地，所述固体发酵培养基按重量份计包括：天然纤维素类物质160份，麸皮140份，硫酸铵50份，尿素20份，硫酸镁0.5份，磷酸二氢钾0.1份，水630份；按固体发酵培养基重量的2％的接种量接种霉菌孢子。
所述天然纤维素类物质选自麦秸秆、稻草、玉米杆或玉米芯中的一种或多种。
所述霉菌为黑曲霉菌。
接种用的霉菌孢子是用PDA培养基试管斜面上的孢子接1000ml三角瓶扩培一次，用400ml无菌水洗后即得；三角瓶装量为每瓶150g固体发酵培养基，温度控制在28～32℃之间，静置培养6～8天。
所述的固体盘式发酵所用的方盘规格为1m(长)×1m(宽)×0.1m(高)的不锈钢方盘。方盘的装量为每盘7-8kg。
本发明β-葡萄糖苷酶的制备方法具有以下有益效果：
1)机械搅拌接种替代手工接种大大节省人力既低成本又提高混合均匀度；
2)固体盘式发酵替代固体发酵罐发酵，消毒灭菌彻底，局部染菌易处理，减小染菌带来的损失，有利于规模化生产；
3)发酵期间，前期发酵产热很快，可利用这一特点控制产热，以供生长需要的热量，节约电耗；
4)本发明生产的β-葡萄糖苷酶的酶活为1200IU/g左右，经成本核算可以进行大规模工业化生产。
5)本发明生产的β-葡萄糖苷酶的酶活为1200IU/g左右，比目前国内现有技术生产的β-葡萄糖苷酶的酶活高出1.2倍，而且酶解效果更佳，酶活力稳定性高。
附图说明
图1本发明方法的工艺流程。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
黑曲霉菌种为β-葡萄糖苷酶工业化生产菌，市购获得。
实施例1
PDA斜面培养基配制：200g去皮马铃薯，切碎加1000ml水煮沸30min，滤去马铃薯渣，滤液加蔗糖20g，溶解后定容至1000ml，再加20g琼脂，煮沸溶解，分装到试管里，棉塞塞口，7个一组，用牛皮纸包扎好，121℃，消毒20min，待60-70℃左右，摆成斜面冷却凝固后放入30℃培养箱中24小时，检查不染菌即可使用。
从冷藏黑曲霉菌种试管中取一环，涂到PDA试管斜面上，置30℃恒温培养箱中，培养7-8天，放入4℃冰箱冷藏，即可作为斜面种子。
实施例2
本发明方法所用的固体发酵培养基为每千克含：玉米芯180g，麸皮120g，硫酸铵50g，尿素20g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.1g，水630g，混合均匀。
将上述所得到的培养基按每瓶120g装入1000ml三角瓶中，棉塞封口，用牛皮纸扎口，121℃消毒60min。用PDA培养基试管斜面上孢子取一环接种，30℃静态培养4-6天。待麸曲长满黑褐色霉菌孢子成熟后备用。
实施例3
固体发酵培养基为每千克含：玉米芯180g，麸皮120g，硫酸铵50g，尿素20g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.1g，水630g，混合均匀。
将固体发酵培养基用1m×1m×0.1m的大方盘装料10kg，盖盖子，121℃消毒60min，晾凉后用三角瓶中霉菌黑孢子接种，按固体培养基重的2％的接种量用混合机混合接种，然后分装每盘6kg，30℃下培养。第一天给培养基浇水保湿，此后继续静态3-4天，将培养好的酶在50℃下烘干粉碎过200目筛即可制成酶粉。
实施例4
固体发酵培养基为每千克含：麦秸秆180g，麸皮120g，硫酸铵50g，尿素20g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.1g，水630g，混合均匀。
将固体发酵培养基用1m×1m×0.1m的大方盘装料10kg，盖盖子，121℃消毒60min，晾凉后用三角瓶中霉菌黑孢子接种，按固体培养基重的2％的接种量用混合机混合接种，然后分装每盘5kg，30℃下培养。第一天给培养基浇水保湿，此后继续静态3-4天，将培养好的酶在50℃下烘干粉碎过200目筛即可制成酶粉。
实施例5
固体发酵培养基为每千克含：按稻草粉80g，玉米芯100g，麸皮120g，硫酸铵50g，尿素20g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.1g，水630g，混合均匀。
将固体发酵培养基用1m×1m×0.1m的大方盘装料10kg，盖盖子，121℃消毒60min，晾凉后用三角瓶中霉菌黑孢子接种，按固体培养基重的2％的接种量用混合机混合接种，然后分装每盘5kg，30℃下培养。第一天给培养基浇水保湿，此后继续静态3-4天，将培养好的酶在50℃下烘干粉碎过200目筛即可制成酶粉。
实施例6
固体发酵培养基为每千克含：玉米芯160g，麸皮140g，硫酸铵50g，尿素20g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.1g，水630g，混合均匀。
将固体发酵培养基用1m×1m×0.1m的大方盘装料10kg，盖盖子，121℃消毒60min，晾凉后用三角瓶中霉菌黑孢子接种，按固体培养基重的2％的接种量用混合机混合接种，然后分装每盘6kg，30℃下培养。第一天给培养基浇水保湿，此后继续静态3-4天，将培养好的酶在50℃下烘干粉碎过200目筛即可制成酶粉。
实施例7
固体发酵培养基为每千克含：按麦秸秆200g，玉米芯100g，麸皮 90g，硫酸铵30g，尿素30g，硫酸镁0.2g，磷酸二氢钾0.1g，水550g，混合均匀。
将固体发酵培养基用1m×1m×0.1m的大方盘装料10kg，盖盖子，121℃消毒60min，晾凉后用三角瓶中霉菌黑孢子接种，按固体培养基重的2％的接种量用混合机混合接种，然后分装每盘5kg，30℃下培养。第一天给培养基浇水保湿，此后继续静态3-4天，将培养好的酶在50℃下烘干粉碎过200目筛即可制成酶粉。
实施例8
固体发酵培养基为每千克含：稻草50g，玉米杆50g或玉米芯50g，麸皮160g，硫酸铵30g，尿素10g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.1g，水650g，混合均匀。
将固体发酵培养基用1m×1m×0.1m的大方盘装料10kg，盖盖子，121℃消毒60min，晾凉后用三角瓶中霉菌黑孢子接种，按固体培养基重的2％的接种量用混合机混合接种，然后分装每盘6kg，30℃下培养。第一天给培养基浇水保湿，此后继续静态3-4天，将培养好的酶在50℃下烘干粉碎过200目筛即可制成酶粉。
实施例9
扩大生产时将玉米天然纤维素类物质如玉米芯、稻草、麦秸秆、玉米秸秆等用粉碎机粉碎过3.5mm孔径筛子作为碳源，配制的固体发酵培养基为每千克含：天然纤维素类物质160g，麸皮140g，硫酸铵50g，尿素20g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.1g，水630g，混合均匀。
将固体发酵培养基用1m×1m×0.1m的大方盘装料10kg，盖盖子，121℃消毒60min，晾凉后用三角瓶中霉菌黑孢子接种，按固体培养基重的2％的接种量用混合机混合接种，然后分装每盘5kg，30℃下培养。期间在培养至20小时用无菌水喷洒浇水一次，水湿透培养基为宜，在培养期间待培养基即将发热即停止加热，使其自然生长。待两天后，保温30℃继续培养1-2天即可。将培养好的酶在50℃下烘干粉碎过200 目筛子即可制成酶粉。
实验例β-葡萄糖苷酶的测定
柠檬酸缓冲液为含10.5g/l无水柠檬酸、3.9g/l的氢氧化钠的缓冲液，pH为4.8。发酵好的酶用柠檬酸缓冲液以一定的稀释倍数稀释浸泡过夜即得粗酶液。
用0.5g纤维二糖作为底物，加0.9mlpH4.8柠檬酸缓冲液，再加0.1ml粗酶稀释液，50℃恒温水浴摇床反应30min，用3，5-二硝基水杨酸法测定生成的还原糖，以葡萄糖为标准糖，以每分钟生成2μmol葡萄糖作为一个酶活力单位IU。
上述各实施例得到的β-葡萄糖苷酶的酶活参见下表：
实施例3-9得到的β-葡萄糖苷酶的酶活力
| 实施例 | 酶活力(IU/g) |
| 3 | 1060 |
| 4 | 1080 |
| 5 | 1080 |
| 6 | 1250 |
| 7 | 1090 |
| 8 | 1100 |
| 9 | 1200 |
| 现有技术得到的酶粉 | 500左右 |
Claims (4)
1.一种β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，其以天然纤维素类物质作为碳源制作固体发酵培养基，通过机械搅拌接种、固体盘式发酵得到β-葡萄糖苷酶；所述固体发酵培养基按重量份计包括：天然纤维素类物质150-300份，麸皮90-160份，硫酸铵30-50份，尿素10-30份，硫酸镁0.2-0.5份，磷酸二氢钾0.05-0.1份，水550-650份；按固体发酵培养基重量的2%-3%的接种量接种霉菌孢子，温度控制在25~35℃之间，培养4~6天；所述天然纤维素类物质选自麦秸秆、稻草、玉米杆或玉米芯中的一种或多种；所述霉菌为黑曲霉菌。
2.根据权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，所述固体发酵培养基按重量份计包括：天然纤维素类物质160份，麸皮140份，硫酸铵50份，尿素20份，硫酸镁0.5份，磷酸二氢钾0.1份，水630份；按固体发酵培养基重量的2%的接种量接种霉菌孢子。
3.根据权利要求1或2所述的β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，接种用的霉菌孢子是用PDA培养基试管斜面上的孢子接1000ml三角瓶扩培一次，用400ml无菌水洗后即得；三角瓶装量为每瓶150g固体发酵培养基，温度控制在28~32℃之间，静置培养6~8天。
4.根据权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，所述的固体盘式发酵所用的方盘不锈钢方盘，方盘的装量为每盘7-8kg。
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