MD4388C1 - Procedeu de obţinere a unui preparat enzimatic cu activitate b-glucozidazică - Google Patents

Procedeu de obţinere a unui preparat enzimatic cu activitate b-glucozidazică Download PDF

Info

Publication number
MD4388C1
MD4388C1 MDA20140079A MD20140079A MD4388C1 MD 4388 C1 MD4388 C1 MD 4388C1 MD A20140079 A MDA20140079 A MD A20140079A MD 20140079 A MD20140079 A MD 20140079A MD 4388 C1 MD4388 C1 MD 4388C1
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
temperature
separated
enzymatic preparation
glucosidase activity
cnmn
Prior art date
Application number
MDA20140079A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Other versions
MD4388B1 (ro
Inventor
Александра ДЕСЯТНИК-ЧИЛОЧЬ
Жанетта ТЮРИНА
Стелиана КЛАПКО
Светлана ЛАБЛЮК
Чезара БИВОЛ
Мария ГРУМЕЗА
Original Assignee
Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы filed Critical Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы
Priority to MDA20140079A priority Critical patent/MD4388C1/ro
Publication of MD4388B1 publication Critical patent/MD4388B1/ro
Publication of MD4388C1 publication Critical patent/MD4388C1/ro

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Invenţia se referă la biotehnologie, şi anume la un procedeu de obţinere a unui preparat enzimatic cu activitate β-glucozidazică.Procedeul, conform invenţiei, prevede însămânţarea suspensiei de spori ai tulpinii Aspergillus niger CNMN-FD-10 în cantitate de 5,0% vol. pe un mediu de cultură cu următorul raport al componentelor, g/L: borhot de sfeclă - 25,0, tărâţe de grâu - 20,0, NaNO3 - 3,0, KH2PO4 - 1,0, KCl - 0,1, CaCl2 · 2H2O - 0,1, MgSO4 · 7H2O - 0,3 şi apă până la 1,0 L, la un pH 5,5…6,0 şi cultivarea submersă la temperatura de 28…30 °C cu agitare continuă, în decurs de 7 zile, apoi lichidul de cultură se separă de biomasă, se acidulează până la valoarea pH 3,0, se tratează cu alcool etilic rectificat răcit până la temperatura de -10…-12°C, în raport de respectiv 1:2, după care se separă preparatul enzimatic prin centrifugare.

Description

Invenţia se referă la biotehnologie, şi anume la un procedeu de obţinere a unui preparat enzimatic cu activitate β-glucozidazică.
Preparatul enzimatic hidrolitic obţinut din tulpina de micromicete Aspergillus niger CNMN-FD-10 conţine în calitate de componentă de bază enzima β-glucozidază cu activitate înaltă de scindare a legăturii β-glucozidice din aril β-D-glucozide şi din dizaharide, în principal din celobioză, şi poate fi utilizat în oenologie, pentru amplificarea aromei de soi a vinurilor de calitate, de asemenea în industriile eterooleaginoasă, farmaceutică, cosmetică, de fabricare a sucurilor, alte ramuri industriale, pentru eliberarea substanţelor aromatice care se găsesc în materia primă vegetală (struguri, pomuşoare, biomasă de plante eterooleaginoase, sucuri etc.) în stare legată în formă de glucozide.
Conţinutul redus al componentelor enzimatice satelite (celobiohidrolaze, endoglucanaze, xilanaze) nu diminuează valoarea practică a preparatului, astfel asigură hidroliza polizaharidelor structurale ale peretelui celular al materiei vegetale, contribuid la creşterea randamentului produsului final, favorizând activitatea β-glucozidazelor.
Se ştie că tulpinile de micromicete din genurile Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Aspergilus sunt principalii producători de hidrolaze exocelulare, inclusiv celulaze şi xilanaze, la nivel industrial.
De asemenea este bine cunoscut că nu toate microorganismele producătoare de enzime celulozolitice au capacitatea de a produce şi β-glucozidaze - componentă a complexului celulazic, spre exemplu unele tulpini din genul Trichoderma - cunoscute ca producătoare de celulaze, fapt ce diminuează valoarea lor industrială [1].
La numărul producătorilor activi de β-glucozidaze pot fi raportate speciile genului Aspergillus, în particular tulpina Aspergillus niger CNMN-FD-10, procedeul care prevede cultivarea submersă pe un mediu cu următoarea compoziţie (g/L): borhot de sfeclă - 20, tărâţe de grâu -20, NaNO3 - 2,5, KH2PO4 - 1,0, KCl - 0,1, CaCl2 ·2H2O - 0,1, MgSO4·7H2O - 0,3, apă până la 1L, pH-ul iniţial 6,0, durata cultivării de 8 zile, şi sedimentarea complexului enzimatic în condiţii clasice (pH-ul nativ al lichidului cultural 7,5...8,0 şi raportul V/V al lichidului cultural : alcool etilic (LC:AE) 1:4), asigură obţinerea preparatului enzimatic ce conţine 4 componente: celobiohidrolaze - 12...15 u/g, endoglucanaze - 450...480 u/g, xilanaze - 2800...3200 u/g, β-glucozidaze - 240...270 u/g [2].
Dezavantajul celei mai apropiate soluţii constă în faptul că în condiţiile menţionate tulpina nu realizează la maximum capacitatea de biosinteză a β-glucozidazelor.
Problema pe care o soluţionează invenţia propusă constă în crearea condiţiilor pentru intensificarea bioseintezei β-glucozidazelor de tulpina Aspergillus niger CNMN FD 10 prin elaborarea a noi regimuri de cultivare dirijată şi selectarea condiţiilor favorabile de sedimentare a complexului enzimatic din lichidul cultural, orientate spre păstrărea nivelului înalt al activităţii β-glucozidazelor.
Procedeul de obţinere a unui preparat enzimatic cu activitate β-glucozidazică prevede însămânţarea suspensiei de spori de (2,5…3,0) x (106…107) spori/mL ai tulpinii Aspergillus niger CNMN-FD-10 în cantitate de 5,0% vol. pe un mediu de cultură cu următorul raport al componentelor, g/L: borhot de sfeclă - 25,0, tărâţe de grâu - 20,0, NaNO3 - 3,0, KH2PO4 - 1,0, KCl - 0,1, CaCl2 · 2H2O - 0,1, MgSO4 · 7H2O - 0,3 şi apă până la 1,0 L, la un pH 5,5…6,0 şi cultivarea submersă la temperatura de 28…30 °C cu agitare continuă, în decurs de 7 zile, apoi lichidul de cultură se separă de biomasă, se acidulează până la valoarea pH 3,0, se tratează cu alcool etilic rectificat răcit până la temperatura de -10…-12°C, în raport de respectiv 1:2, după care se separă preparatul enzimatic prin centrifugare.
Rezultatul constă în obţinerea preparatului enzimatic parţial purificat, cu nivel înalt al activităţii β-glucozidazelor, de cel puţin 1525 u/g, ce depăşeşte de 5,6...6,3 ori nivelul din cea mai apropiată soluţie şi în cantităţi reduse a restului componentelor complexului enzimatic: celobiohidrolaze - 4,1 u/g, endoglucanaze - 64,0 u/g, xilanaze - 1022 u/g, destinat utilizării în oenologie, pentru amplificarea aromei de soi a vinurilor de calitate, în industriile eterooleaginoasă, farmaceutică, cosmetică, de fabricare a sucurilor.
Rezultatul se datorează faptului că procedeul se efectuează în două etape.
I. Cultivarea submersă în sistem discontinuu a tulpinii de micromicete Aspergillus niger CNMN-FD-10 timp de 7 zile, în condiţii de agitare continuă la temperatura de 28...30°C, pe mediul selectat cu următoarea compoziţie (g/L): borhot de sfeclă - 25,0, tărâţe de grâu - 20, NaNO3 - 3,0, şi restul sărurilor minerale în raport nemodificat - KH2PO4 - 1,0, KCl - 0,1, CaCl2 2H2O - 0,1, MgSO4·7H2O - 0,3, apă până la 1L, cu pH-ul iniţial de 5,5...6,0.
II. Separarea preparatului enzimatic de lichidul cultural prin sedimentare cu alcool etilic care include acţiunile:
- filtrarea mecanică şi centrifugarea lichidului cultural de biomasă;
- acidifierea filtratului de lichid cultural până la pH-ul 3,0;
- sedimentarea complexului enzimatic din lichidul cultural cu alcool etilic de 96°, preventiv răcit (-10... -12° C), respectând raportul LC:AE 1:2.
Avantajele procedeului:
- activitatea β-glucozidazelor înaltă datorită condiţiilor special selectate de cultivare şi de sedimentare din lichidul cultural, ce depăşeşte cea mai apropiată soluţie de 5,6...6,3 ori;
- reducerea duratei de cultivare cu 24 ore;
- reducerea volumului de etanol de 2 ori la recuperarea complexului enzimatic din filtratul de cultură.
Exemplul 1
I. Tulpina de micromicete Aspergillus niger CNMN-FD-10 se cultivă pe mediul optimizat, cu următoarea compoziţie (g/L): borhot de sfeclă - 25,0, tărâţe de grâu - 20,0, NaNO3 - 3,0, KH2PO4 - 1,0, KCl - 0,1, CaCl2 ·2H2O - 0,1, MgSO4·7H2O - 0,3 şi apă până la 1L cu pH iniţial 5,5. Mediul se repartizează câte 0,2 L în vase Erlenmayer cu capacitatea de 1L şi după sterilizare prin autoclavare la 120°C, timp de 1 oră, şi răcire până la 30°C se inoculează cu 5 % v/v de suspensie de spori (2,5...3,0 x106…107 spori/mL) a culturii de 10…12 zile, crescută pe suprafeţe înclinate de malţ-agar. Retortele se montează pe un agitator cu viteza de rotaţie de 200 rot/min. Cultivarea se realizează în încăpere cu termostatare la temperatura de 30°C, timp de 168 ore.
II. După cultivare lichidul cultural se separă de biomasă prin filtrare mecanică sau centrifugare. Complexul enzimatic se separă din filtratul de cultură prealabil acidulat până la pH-ul 3,0 prin sedimentare cu alcool etilic rectificat, luate în raportul LC:AE de 1:2, şi centrifugare la 6000 rot/min, timp de 10 min. Ulterior în preparatul obţinut se determină activităţile enzimatice: β-glucozidazică, celobiohidrolazică, endoglucanazică şi xilanazică, după acţiunea asupra substraturilor specifice, respectiv - n-nitrofenil-β-D-glucopiranozid, hârtie de filtru, Na-carboximetilceluloză, şi dozarea zaharurilor reducătoare, prin metoda Somogy-Nelson. În condiţiile menţionate aceste activităţi constituie (u/g): β-glucozidazică - 1545, celobiohidrolazică - 4,05, endoglucanazică - 63,8 şi xilanazică - 1020.
Exemplul 2
Se repetă procedura ca în exemplul 1. Mediul nutritiv şi temperatura cultivării se modifică.
I. Tulpina de micromicete Aspergillus niger CNMN-FD-10 se cultivă pe mediul cu următoarea compoziţie (g/L): borhot de sfeclă - 25,0, tărâţe de grâu - 20,0, NaNO3 - 3,0, KH2PO4- 1,0, KCl - 0,1, CaCl2 ·2H2O - 0,1, MgSO4·7H2O - 0,3 şi apă până la 1L, la un pH iniţial de 6,0.
Cultivarea se efectuează în vase Erlenmayer cu capacitatea de 1 L câte 0,2 L mediu, pe un agitator cu viteza de rotaţie de 200 rot/min, în termostate la temperatura de 28°C, timp de 168 ore, în rest condiţiile sunt identice ca în ex.1.
II. Condiţiile de recuperare a complexului enzimatic din filtratul de cultură sunt identice celor din ex.1: ajustarea prealabilă a pH-lui la valoarea 3,0; raportul LC:AE 1:2.
Preparatul enzimatic obţinut prezintă următoarele activităţi (u/g): β-glucozidazică - 1528, celobiohidrolazică - 4,07, endoglucanazică - 62,7, xilanazică - 1018.
1. Микробные ферменты и биотехнология. Москва, Агропромиздат, 1986, р. 154-155
2. MD 4072 B1 2010.10.31

Claims (1)

  1. Procedeu de obţinere a unui preparat enzimatic cu activitate β-glucozidazică, care prevede însămânţarea suspensiei de spori de (2,5…3,0) x (106…107) spori/mL ai tulpinii Aspergillus niger CNMN-FD-10 în cantitate de 5,0% vol. pe un mediu de cultură cu următorul raport al componentelor, g/L: borhot de sfeclă - 25,0, tărâţe de grâu - 20,0, NaNO3 - 3,0, KH2PO4 - 1,0, KCl - 0,1, CaCl2 · 2H2O - 0,1, MgSO4 · 7H2O - 0,3 şi apă până la 1,0 L, la un pH 5,5…6,0 şi cultivarea submersă la temperatura de 28…30 °C cu agitare continuă, în decurs de 7 zile, apoi lichidul de cultură se separă de biomasă, se acidulează până la valoarea pH 3,0, se tratează cu alcool etilic rectificat răcit până la temperatura de -10…-12°C, în raport de respectiv 1:2, după care se separă preparatul enzimatic prin centrifugare.
MDA20140079A 2014-08-01 2014-08-01 Procedeu de obţinere a unui preparat enzimatic cu activitate b-glucozidazică MD4388C1 (ro)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MDA20140079A MD4388C1 (ro) 2014-08-01 2014-08-01 Procedeu de obţinere a unui preparat enzimatic cu activitate b-glucozidazică

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MDA20140079A MD4388C1 (ro) 2014-08-01 2014-08-01 Procedeu de obţinere a unui preparat enzimatic cu activitate b-glucozidazică

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MD4388B1 MD4388B1 (ro) 2015-12-31
MD4388C1 true MD4388C1 (ro) 2016-07-31

Family

ID=55068708

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDA20140079A MD4388C1 (ro) 2014-08-01 2014-08-01 Procedeu de obţinere a unui preparat enzimatic cu activitate b-glucozidazică

Country Status (1)

Country Link
MD (1) MD4388C1 (ro)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BG29659A1 (en) * 1978-08-09 1981-01-15 Ljuckanov Method of obtaining of ensime pectinesterase substances
DD219504A1 (de) * 1983-12-01 1985-03-06 Adw Ddr Gewinnung pektinolytischer enzyme unter einsatz traegerfixierter schimmelpilze
RO100892A2 (ro) * 1988-06-30 1991-03-13 Institutul De Cercetari Si Proiectari Pentru Valorificarea Si Industrializarea Legumelor Si Fructelor, Bucuresti; Ro Procedeu de obtinere a unei enzime pectolitice
CZ159796A3 (en) * 1996-05-31 1997-10-15 Mikrobiologicky Ustav Av Cr Process of fermentation industrial production of enzyme preparation phytase
CN101649310A (zh) * 2009-09-15 2010-02-17 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 一种β-葡萄糖苷酶的制备方法
MD4072B1 (ro) * 2010-03-12 2010-10-29 Institutul De Microbiologie Si Biotehnologie Al Academiei De Stiinte A Moldovei Tulpina de fungi Aspergillus niger - producatoare de enzime cu activitate celulozolitica si xilanazica
CN102154249A (zh) * 2011-04-25 2011-08-17 中国科学院微生物研究所 一种生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法
MD4121C1 (ro) * 2010-09-16 2012-02-29 Inst De Microbiologie Si Biotehnologie Al Academiei De Stiinte A Moldovei Procedeu de obţinere a complexului celulazo-amilazic
MD4186C1 (ro) * 2012-02-20 2013-06-30 Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы Tulpină de fungi Fusarium gibbosum - producătoare de proteaze acide şi neutre, xilanaze şi b-glucozidaze

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BG29659A1 (en) * 1978-08-09 1981-01-15 Ljuckanov Method of obtaining of ensime pectinesterase substances
DD219504A1 (de) * 1983-12-01 1985-03-06 Adw Ddr Gewinnung pektinolytischer enzyme unter einsatz traegerfixierter schimmelpilze
RO100892A2 (ro) * 1988-06-30 1991-03-13 Institutul De Cercetari Si Proiectari Pentru Valorificarea Si Industrializarea Legumelor Si Fructelor, Bucuresti; Ro Procedeu de obtinere a unei enzime pectolitice
CZ159796A3 (en) * 1996-05-31 1997-10-15 Mikrobiologicky Ustav Av Cr Process of fermentation industrial production of enzyme preparation phytase
CN101649310A (zh) * 2009-09-15 2010-02-17 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 一种β-葡萄糖苷酶的制备方法
MD4072B1 (ro) * 2010-03-12 2010-10-29 Institutul De Microbiologie Si Biotehnologie Al Academiei De Stiinte A Moldovei Tulpina de fungi Aspergillus niger - producatoare de enzime cu activitate celulozolitica si xilanazica
MD4121C1 (ro) * 2010-09-16 2012-02-29 Inst De Microbiologie Si Biotehnologie Al Academiei De Stiinte A Moldovei Procedeu de obţinere a complexului celulazo-amilazic
CN102154249A (zh) * 2011-04-25 2011-08-17 中国科学院微生物研究所 一种生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法
MD4186C1 (ro) * 2012-02-20 2013-06-30 Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы Tulpină de fungi Fusarium gibbosum - producătoare de proteaze acide şi neutre, xilanaze şi b-glucozidaze

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Микробные ферменты и биотехнология. Москва, Агропромиздат, 1986, р. 154-155 *

Also Published As

Publication number Publication date
MD4388B1 (ro) 2015-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shrestha et al. New insights in pectinase production development and industrial applications
Sohail et al. Cellulase production from Aspergillus niger MS82: effect of temperature and pH
Ang et al. Production of cellulases and xylanase by Aspergillus fumigatus SK1 using untreated oil palm trunk through solid state fermentation
Reddy et al. Cellulase production by Aspergillus niger on different natural lignocellulosic substrates
Nandimath et al. Optimization of cellulase production for Bacillus sp. and Pseudomonas sp. soil isolates
Sajith et al. Production and partial purification of cellulase from a novel fungus, Aspergillus flavus BS1
Abubakar et al. Production and activity of cellulase from Aspergillus niger using rice bran and orange peel as substrates
de Carvalho Silva et al. Optimized production of Aspergillus aculeatus URM4953 polygalacturonases for pectin hydrolysis in hog plum (Spondias mombin L.) juice
Iqbal et al. Media optimization for hyper-production of carboxymethyl cellulase using proximally analyzed agroindustrial residue with Trichoderma harzianum under SSF
US20130344576A1 (en) Extraction of scenedesmus cell components
Singhal et al. Cellulases through thermophilic microorganisms: Production, characterization, and applications
Zoppas et al. Alternatives for cellulase production in submerged fermentation with agroindustrial wastes
Chiwetalu et al. An enhanced fat extraction from Pycnanthus angolensis (African nutmeg) seeds using cellulase from Aspergillus niger strain BC23
Ubalua Sweet potato starch as a carbon source for growth and glucoamylase production from Aspergillus niger
Afifi Effective technological pectinase and cellulase by Saccharomyces cervisiae utilizing food wastes for citric acid production
Nwodo et al. Xylanase Production of Aspergillus niger and Penicillium chrysogenun from
MD4388C1 (ro) Procedeu de obţinere a unui preparat enzimatic cu activitate b-glucozidazică
KR101856849B1 (ko) 배추 폐기물로부터 포도당을 생산하는 방법 및 포도당을 포함하는 미세조류 배양액
WO2012089843A2 (en) Extraction of scenedesmus cell components
Gori et al. Production of carboxymethyl cellulase from local isolate of Aspergillus species
Buenrostro-Figueroa et al. Juice extraction from mango pulp using an enzymatic complex of Trichoderma sp. produced by solid-state fermentation
Bano et al. Advancements in bioprocess technology for cellulase production
Shahzadi et al. Optimization of physical and nutritional factors for induced production of cellulase by co-culture solid-state bio-processing of corn stover
Kirn et al. Optimized production of cellulase (CMCase)
Yasin et al. Pectinolytic potential of indigenous Trichoderma strains originated from the north western regions of Pakistan

Legal Events

Date Code Title Description
FG4A Patent for invention issued
KA4A Patent for invention lapsed due to non-payment of fees (with right of restoration)
MM4A Patent for invention definitely lapsed due to non-payment of fees