CN105219806B

CN105219806B - 酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法

Info

Publication number: CN105219806B
Application number: CN201510595543.7A
Authority: CN
Inventors: 赵丽青
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Youge Tiancheng Biotechnology (Yiwu) Co., Ltd.
Priority date: 2015-09-17
Filing date: 2015-09-17
Publication date: 2018-10-23
Anticipated expiration: 2035-09-17
Also published as: CN105219806A

Abstract

本发明公开了一种酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，包括：S1、构建用于生产异丁香酚单加氧酶的酵母菌；S2、将构建的所述酵母菌接种至YPD液体培养基中振荡培养；S3、离心收集菌体，生理盐水洗涤，转入MGY液体培养基中振荡培养；S4、离心收集菌体，生理盐水洗涤，转入MM液体培养基中使OD600>6，振荡培养3‑5天；每天补加甲醇，并用氨水调节pH，得到发酵液；选择性地将所述发酵液离心以收集上清液；S5、按异丁香酚：所述上清液或所述发酵液：缓冲液＝0.1‑0.6g：9‑18mL：9‑18mL加入反应容器中，在20‑30℃下振摇转化12‑48h，得到香兰素。本发明实现采用酵母菌工业化生产香兰素，适用于食品领域等，满足需求，安全。

Description

酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法

技术领域

本发明涉及生物转化技术领域，尤其涉及一种酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法。

背景技术

香兰素是工业中应用最广泛的香料之一，大量用于食品工业，可作为香气修饰和定香的主要原料用于食品、牙膏、香皂、烟草中；在医药化工中作为重要的原料或中间体，可用于制造治疗高血压、心脏病、皮肤病及消除口臭、利尿的常用药物；在化学工业中可作为化学助剂，用于塑料制品的抗硬化剂以及Ni、Cr、Cd等金属的电镀光亮剂；在农业生产上，香兰素可作为作物增产剂和催熟剂，并用之制备除草剂和昆虫引诱剂等，需求量很大。香兰素目前主要由化学方法制备，但用化学合成法制得的香兰素不是天然香料。天然香兰素可以从香子兰的花荚中提取，但用植物组织提取的方法生产的天然香兰素量少而价高，不能满足日益增长的需求。

随着世界各国对食品安全越来越重视，对天然香兰素的需求越来越大。天然香料是指由动植物材料经物理(包括蒸馏、溶剂萃取)方法、酶法或微生物方法得到的，可通过传统的食品加工方法(包括干燥、焙烤、发酵)加工后用于人类消费的物质。根据欧洲和美国立法，利用动植物资源通过物理方法、酶法或微生物法得到的物质才能称为天然物质(MuheimAndrea.US6,235,507.2001)。用生物法生产的香兰素，属天然产品，可以生物降解，符合消费者追求天然产品的消费心理。因此，利用生物转化技术生产生物香兰素，是一种有效的、很有前途的替代方法。

在过去的十年里报道了许多用微生物法或酶法生产香兰素的方法，一般都是通过微生物或酶将合适的前体转化为香兰素。目前，尚未有酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的任何公开及报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有相关的上述缺陷，提供一种实现采用酵母菌工业化生产香兰素的酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，包括以下步骤：

S1、构建用于生产异丁香酚单加氧酶的酵母菌；

S2、将构建的所述酵母菌接种至YPD液体培养基中，于30-35℃振荡培养18-36小时；

S3、离心收集菌体，生理盐水洗涤，转入MGY液体培养基中；于30-35℃振荡培养36-60小时；

S4、离心收集菌体，生理盐水洗涤，转入MM液体培养基中使OD600>6，于30-35℃振荡培养3-5天；每天补加甲醇，并用氨水调节pH，得到发酵液；选择性地将所述发酵液离心以收集上清液；

S5、按异丁香酚：发酵液或上清液：缓冲液＝0.1-0.6g：9-18mL：9-18mL加入反应容器中，在20-30℃下振摇转化12-48h，得到香兰素；所述缓冲液为pH8-10.4的甘氨酸的NaOH水溶液(简称甘氨酸/NaOH缓冲液)。

优选地，所述步骤S1包括以下步骤：

S1-1、提取土壤的全基因组DNA；

S1-2、根据异丁香酚单加氧酶的基因序列，设计简并PCR引物；

S1-3、以所述全基因组DNA为模板，用所述简并PCR引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

S1-4、将所述PCR扩增产物测序，以获得异丁香酚单加氧酶基因序列；

S1-5、根据所述异丁香酚单加氧酶基因序列，设计包含酶切位点的特异性引物，所述特异性引物包括上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2；

S1-6、以所述全基因组DNA为模板，用所述特异性引物进行PCR扩增，得到大小为1438bp的目标基因SEQ ID NO.3，其5’和3’端分别连接6bp和8bp的酶切位点；

S1-7、将所述目标基因SEQ ID NO.3插入毕赤酵母表达载体pPIC9K的EcoRI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒pPIC9K-IEM；

S1-8、将所述重组质粒pPIC9K-IEM转化毕赤酵母GS115，得到所述酵母菌。

步骤S1-1中，优选采取被不同香料包括异丁香酚、薄荷油、山苍子油等香料微污染的土壤，以 Spin Kit for Soil(土壤基因组DNA提取试剂盒)提取土壤的全基因组DNA。

构建的所述酵母菌命名为GS115IEM-PP。

优选地，所述步骤S1-3、S1-6中，PCR扩增方法如下：

5*FastPfu缓冲液10μL、模板DNA 0.5μL、引物SEQ ID NO.1为1μL、SEQ ID NO.2为1μL、dNTPS 1.25μL、Transtart FastPfu DNA聚合酶1μL、ddH2O 35.3μL，共50μL。PCR程序：①95℃2min；②95℃20s；③55℃20s；④72℃40s；⑤72℃5min；⑥4℃10min；⑦Cycle*30从②到④，得到PCR扩增产物，经测序获得基因的核苷酸序列。

优选地，所述步骤S1-5中：

SEQ ID NO.1的序列如下：5’-gaattcatgctacatatggcaacgtttgaccgcaat-3’

SEQ ID NO.2的序列如下：5’-gcggccgccttatctctcgaggttcttagactgccaac-3’。

优选地，所述步骤S5中，所述甘氨酸的NaOH水溶液中甘氨酸的浓度为50-200mM。

优选地，所述步骤S3中，所述菌体采用生理盐水洗涤2次。

所述步骤S4中，所述菌体采用生理盐水洗涤2次。

优选地，所述步骤S2中，以180-220r/min振荡培养；优选200r/min。

所述步骤S3中，以180-220r/min振荡培养；优选200r/min。

所述步骤S4中，以180-220r/min振荡培养；优选200r/min。

所述步骤S4中，补加甲醇5-20g/L，采用纯氨水调节pH至5-7。甲醇优选10g/L。

优选地，所述步骤S2中，所述YPD液体培养基包括组分及其质量百分比如下：1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖，其余为水。

所述步骤S3中，所述MGY液体培养基包括组分及其质量百分比如下：1.34％YNB(无氨基酵母氮源)、1％甘油、4×10^–5％生物素，其余为水。

所述步骤S4中，所述MM液体培养基包括组分及其质量百分比如下：1.34％YNB、4×10^–5％生物素、0.5％甲醇，其余为水。

优选地，所述步骤S5中，在所述反应容器中，还添加DMSO(二甲基亚砜)、离子液体及香兰素吸附剂中的至少一种。

每0.1-0.6g异丁香酚中：所述DMSO的加入量≤1mL，所述离子液体的加入量≤200μL，所述香兰素吸附剂的加入量≤0.5g。

优选地，所述香兰素吸附剂为吸附树脂及壳聚糖膜中的至少一种。

本发明的酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，实现采用酵母菌工业化生产香兰素(生物法制香精香料)，适用于食品领域等领域，满足需求，安全。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为是从常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明的酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，具体如下：

一、工程菌的构建(构建用于生产异丁香酚单加氧酶的酵母菌)

1、采取含有异丁香酚单加氧酶基因的土壤作为土样。采样时，可采取被不同香料微污染的土壤，所述的香料包括异丁香酚、薄荷油、山苍子油等香料；由于所述香料可诱导异丁香酚单加氧酶，因此土壤被其微污染后的微生物带有异丁香酚单加氧酶基因。

本发明中采取深圳大学化学与化工学院附近受各种香料微污染的土样，以 Spin Kit for Soil(土壤基因组DNA提取试剂盒)提取土壤的全基因组DNA。由于土样中微生物受异丁香酚等香料微污染后富集，提取的土壤的全基因组DNA含有异丁香酚单加氧酶基因。

2、根据Genbank数据库中异丁香酚单加氧酶的相关基因序列，设计简并引物。

3、以全基因组DNA为模板，用设计的简并引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，经测序获得异丁香酚单加氧酶基因序列。

PCR扩增采用常规的方法：5*FastPfu缓冲液10μL、模板DNA 0.5μL、引物SEQ IDNO.1为1μL、SEQ ID NO.2为1μL、dNTPS 1.25μL、Transtart FastPfu DNA聚合酶1μL、ddH₂O35.3μL，共50μL。PCR程序：①95℃、2min；②95℃、20s；③55℃、20s；④72℃、40s；⑤72℃、5min；⑥4℃、10min；⑦Cycle*30从②到④。

4、根据异丁香酚单加氧酶基因序列，设计包含酶切位点的特异性引物，包括上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2。

SEQ ID NO.1的序列如下：5’-gaattcatgctacatatggcaacgtttgaccgcaat-3’

SEQ ID NO.2的序列如下：5’-gcggccgccttatctctcgaggttcttagactgccaac-3’

5、以全基因组DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增(PCR方法同3)，得到大小为1438bp的目标基因(SEQ ID NO.3)，其5’和3’端分别连接6bp和8bp的酶切位点。

SEQ ID NO.3的序列如下：

6、将5中的目标基因(SEQ ID NO.3)插入毕赤酵母表达载体pPIC9K的EcoRI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒pPIC9K-IEM。

7、将重组质粒转化毕赤酵母GS115，得到一株重组菌(工程菌)，该重组菌的生理生化性质与毕赤酵母一样，命名为GS115IEM-PP。

二、培养基的制备

原材料制备：

10*YNB(13.4％酵母氮源基础培养基，含硫酸铵不含氨基酸)：将134g含硫酸铵的YNB溶解于1000ml的水中，加热溶液使YNB完全溶解于水中，过滤灭菌，在4℃冰箱储存。

500*B(0.02％生物素)：将20mg生物素溶解于100ml水中，过滤灭菌，在4℃冰箱储存。

10*D(20％葡萄糖)：将200g D-葡萄糖溶解于1000ml水中，使用高压灭菌锅灭菌15min或者过滤灭菌。

10*M(5％甲醇)：将5ml甲醇与95ml水混合，过滤灭菌，在4℃冰箱储存。

1、YPD液体培养基(1升)(包括：1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)的制备：

将10g酵母提取物和20g蛋白胨溶解于900ml水中。(如果需要做成斜面或者平板，应再加入20g琼脂)，高压湿热灭菌20min，加入100ml10*D。

2、MGY液体培养基(1升)(包括：1.34％YNB、1％甘油、4×10^–5％生物素)的制备：

无菌环境下，将800ml灭菌水,100ml10*YNB，2ml500*B和100ml 10*甘油混合。

3、MM液体培养基(1升)(包括：1.34％YNB、4×10^–5％生物素、0.5％甲醇)的制备：

800ml水高压湿热灭菌20min，冷却到60℃，加入100ml10*YNB，2ml 500*B和100ml10*M。

三、菌种发酵培养

1、将构建的酵母菌接种至接种于YPD液体培养基，30℃、200r/min振荡培养36小时。

2、离心收集菌体，生理盐水洗涤2次，转入MGY液体培养基中；30℃、200r/min振荡培养36小时。

3、离心收集菌体，生理盐水洗涤2次，转入MM液体培养基中使OD600>6；30℃、200r/min振荡培养3天；每天补加甲醇10g/L，并用氨水调节pH至初始值(pH5-7)，得到发酵液。调节pH的目的主要为了保证菌体的正常生长。

4、将发酵液离心(12000r/min，5min)，收集上清液，可用于转化。

四、生产香兰素

实施例1：

在50mL的锥形瓶中，加入0.6g异丁香酚，发酵液10mL，加入10mL的pH10.4的甘氨酸浓度为200mM的甘氨酸/NaOH缓冲液，以两层纱布覆口，在30℃、200rpm下摇床振摇转化48h，测定最终反应液中香兰素的浓度为3.5g/L。

实施例2：

在50mL的锥形瓶中，加入0.5g异丁香酚，发酵液10mL，加入10mL的pH10.4的甘氨酸浓度为200mM的甘氨酸/NaOH缓冲液，以两层纱布覆口，在30℃、200rpm下摇床振摇转化48h，测定最终反应液中香兰素的浓度为3.25g/L。

实施例3：

在50mL的锥形瓶中，加入0.1g异丁香酚，发酵液10mL，加入10mL的pH10.4的甘氨酸浓度为200mM的甘氨酸/NaOH缓冲液，以两层纱布覆口，在30℃、200rpm下摇床振摇转化48h，测定最终反应液中香兰素的浓度为0.4g/L。

上述实施例1-3中香兰素的测定方法：

以高效液相色谱法(HPLC)测定香兰素和异丁香酚。

样品处理：反应液加入与反应液同体积的乙醇，沉淀蛋白，并溶解底物(异丁香酚)和产物(香兰素)，10000r/min离心5min，再以乙醇稀释10-50倍(本实施例中稀释20倍)，滤膜过滤，待测。

色谱柱：GL Science Inertsil ODS-SP柱(150mm×4.6mm×5μm)；

流动相：甲醇和0.01％(体积分数)冰醋酸水溶液，0-5min 20-60％；5-10min60％,10-15min 60-20％。

流速1mL/min，波长280nm处紫外检测，进样量20μL。其中香兰素和异丁香酚的出峰时间分别为6.5min和11.5min左右。

实施例4：

在50mL的锥形瓶中，加入0.6g异丁香酚，上清液10mL，加入10mL的pH10.4的200mM甘氨酸/NaoH缓冲液，壳聚糖膜0.3g，以两层纱布覆口，30℃、200rpm摇床振摇转化48h，反应结束将样品瓶中的膜取出，以10mL的去离子水冲洗，再加入30mL的17.6％(体积分数)的盐酸洗脱10h。测定洗脱液中香兰素的浓度为4.9g/L。(该实施例中香兰素的测定条件同上)

该实施例中的壳聚糖膜的制备如下：

1.称取3g的壳聚糖粉末溶于150mL 2％(体积分数)的醋酸溶液中，室温下磁力搅拌5-6h充分溶解，得到明黄色的粘稠状胶体。

2.用注射器将步骤1获得的胶体挤入并平铺于圆形的塑料培养皿中(每盘约12mL胶体)，-80℃冰箱中预冻12h，于冻干机中冻干24h。

3.将冻干的壳聚糖膜剪成小块(每块0.1g)；在3％(质量分数)的NaOH溶液中浸泡8h后以去离子水洗至中性，平摊于两层纱布上，室温风干，样品袋中密封干燥保存，备用。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、构建用于生产异丁香酚单加氧酶的酵母菌；

所述步骤S1包括以下步骤：

S1-1、提取土壤的全基因组DNA；所述土壤含有异丁香酚单加氧酶基因；

S1-2、根据异丁香酚单加氧酶的基因序列，设计简并PCR引物；

S1-8、将所述重组质粒pPIC9K-IEM转化毕赤酵母GS115，得到所述酵母菌；

S2、将构建的所述酵母菌接种至YPD液体培养基中，于30℃振荡培养36小时；

S3、离心收集菌体，生理盐水洗涤，转入MGY液体培养基中；于30℃振荡培养36小时；

S4、离心收集菌体，生理盐水洗涤，转入MM液体培养基中使OD600>6，于30℃振荡培养3天；每天补加甲醇10g/L，并用氨水调节pH至5-7，得到发酵液；选择性地将所述发酵液离心以收集上清液；

S5、按异丁香酚：发酵液或上清液：缓冲液＝0.1-0.6g：9-18mL：9-18mL加入反应容器中，在20-30℃下振摇转化12-48h，得到香兰素；所述缓冲液为pH8-10.4的甘氨酸的NaOH水溶液；

所述步骤S5中，在所述反应容器中，还添加DMSO、离子液体及香兰素吸附剂中的至少一种；

每0.1-0.6g异丁香酚中：所述DMSO的加入量≤1mL，所述离子液体的加入量≤200μL，所述香兰素吸附剂的加入量≤0.5g；所述香兰素吸附剂为吸附树脂及壳聚糖膜中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，其特征在于，所述步骤S1-5中：

SEQ ID NO.1的序列如下：5’-gaattcatgctacatatggcaacgtttgaccgcaat-3’

3.根据权利要求1所述的酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，其特征在于，所述步骤S5中，所述甘氨酸的NaOH水溶液中甘氨酸的浓度为50-200mM。

4.根据权利要求1所述的酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述菌体采用生理盐水洗涤2次；

所述步骤S4中，所述菌体采用生理盐水洗涤2次。

5.根据权利要求1所述的酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，其特征在于，所述步骤S2中，以180-220r/min振荡培养；

所述步骤S3中，以180-220r/min振荡培养；

所述步骤S4中，以180-220r/min振荡培养。

6.根据权利要求1所述的酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，其特征在于，所述步骤S4中，补加甲醇5-20g/L，采用纯氨水调节pH至5-7。

7.根据权利要求1所述的酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述YPD液体培养基包括组分及其质量百分比如下：1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖，其余为水；

所述步骤S3中，所述MGY液体培养基包括组分及其质量百分比如下：1.34％YNB、1％甘油、4×10^–5％生物素，其余为水；