CN105886408B - 海洋裂褶菌菌株的筛选及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株来源于海洋近海滩涂的大型真菌白参，经过鉴定该大型海洋真菌为裂褶菌，能够在高盐培养基中生长，并能够产生裂褶菌素。本发明采用沿海及滨海湿地腐木为样本，利用天然海水配制限制性培养基进行海洋裂褶菌的筛选；并通过对裂褶菌的液体发酵，获得了海洋裂褶菌素。本发明所生产的裂褶菌素化学成分为β‑1,3/1,6‑葡聚糖，来源于海洋裂褶菌，可应用于食品、化妆品和医药领域，适合工业化生产，具有极大的应用推广价值。

Description

海洋裂褶菌菌株的筛选及其应用

技术领域

本发明涉及海洋微生物及其天然产物领域，具体涉及海洋白参真菌的筛选和培养，及其所产裂褶菌素的提取纯化，裂褶菌素的定性定量分析。

背景技术

海洋生物资源由于深海中水体压力更大，缺氧甚至无氧，持续低温，偶有高温或冷泉，其中的极地海洋环境更是具有异常极端，寒冷、高盐和强辐射的特征。在如此极端的海洋环境中生存繁衍的海洋生物，必须具备适应极端生存环境的生命系统。因此，极端环境海洋生物不仅种类独特，而且含有很多极具潜力的活性物质和基因资源，具有巨大的科研和商业开发前景。海洋生物活性物质是指海洋生物体内所含有的对生命现象具有影响的微量或少量物质，主要包括海洋药用物质、生物信息物质、海洋生物毒素产生物和功能材料等海洋生物体内的天然产物，以萜类、皂苷、甾类、多肽、多糖、蛋白质等结构类型存在。

白参又称为树花，分类命名为裂褶菌(Schizophyllum commune)，属于真菌门，担子菌亚门，层菌纲，非褶菌目，裂褶菌科，裂褶菌属。广泛分布于世界各地，主要腐生在土壤、腐木、枯枝落叶层上，大多在阔叶林下生长，少数在针叶及竹叶林下生长。目前还没有在海洋资源中发现裂褶菌菌株生长的报道。

发明内容

本发明从海洋滩涂腐朽树木杂草为海洋微生物资源，进行了海洋大型真菌的筛选，获得了一株能够在高盐浓度条件下生长，并且随着盐浓度降低，能够高产裂褶菌素的海洋来源的裂褶菌菌株。

一种海洋裂褶菌，其分类命名为裂褶菌(Schizophylum commune.)，此菌株已于2016年1月18日保存在位于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC M2016055。本发明海洋裂褶菌属真菌门、层菌纲、伞菌目、裂褶菌科、裂褶菌属。

本发明进一步提供上述利用筛选得到的海洋裂褶菌生产裂褶菌素的方法，该方法包括以下步骤：以5～10％的接种比例将裂褶菌接种到发酵培养基，23-27℃，160-180rpm下摇瓶培养24～36小时；然后对裂褶菌发酵培养液进行提取、纯化，得裂褶菌素。

所述发酵培养基配方为：葡萄糖30.0g/L，酵母粉5.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.3g/L。

经过鉴定，本发明生产得到的裂褶菌素为β-1,3/1,6-葡聚糖，分子量在60-120KD之间，结构式如下：

本发明得到的裂褶菌素分子量在60-120KD之间，能够完全水溶，对人体皮肤吸收来说非常好，保湿性能突出，可应用于食品、化妆品和医药领域，适合工业化生产，具有极大的应用推广价值。

附图说明

图1所示的是本发明实施例2中rDNA-ITS扩增的琼脂糖凝胶电泳图；

图2所示的是本发明实施例3中所得裂褶菌素的凝胶层析洗脱液吸收峰图；

图3所示的是本发明实施例3中所得裂褶菌素的高效液相色谱图；

图4所示的是本发明实施例3中所得裂褶菌素的紫外吸收光谱图；

图5所示的是本发明实施例3中所得裂褶菌素的红外吸收光谱图；

图6所示的是本发明实施例3中所得裂褶菌素的凝胶渗透色谱洗脱曲线；

图7所示的是本发明实施例2中裂褶菌菌株的系统发育树。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

实施例1：海洋来源的白参菌株的筛选

1.培养基的配制

利用自然海水或人工配制的海水配制改良PDA培养基：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15～20克，海水或人造海水1000毫升，自然PH。其做法是先洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加海水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即煮马铃薯块)，用八层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加1-20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足海水或人造海水分至1000毫升，分装锥形瓶，加塞、包扎，(121℃)灭菌20分钟左右后取出摇匀，冷却到60℃左右，配制平板，凝固后4℃冰箱贮存备用。

2.白参菌株的筛选

将从浙江省宁波市象山县周围海洋滩涂所取腐木样品用无菌海水或人造海水搅拌3-6h后，取样涂布于改良PDA平板。26℃倒置培养3-7天。在获得单菌落后，提取单菌落接种于液体改良PDA培养基，26℃，180rpm/min培养。

实施例2：白参菌株的鉴定

1.真菌DNA基因组提取

取实施例1得到的菌株培养液，离心后沉淀加适量dH₂O充分研磨破碎，选用TaKaRa的商品化真菌核酸提取试剂盒进行DNA提取。

2.核酸纯度与浓度测定

取一定量的DNA提取液进行一定倍数的稀释后，在260、280与320nm下分别测定OD值，以(OD260-OD320)/(OD280-OD320)计算核酸纯度，自然界核酸纯度范围为116～210，一般以118±012为宜；核酸浓度(ng/μL)≈50×(OD260-OD320)/L×D(L为光径长度cm,D为稀释倍数)，据结果将核酸浓度稀释至适合的PCR用模板浓度100～300ng/μL。

3.rDNA-ITS扩增

以表1所示的PCR反应组成，按反应条件(94℃2min；94℃30s，59℃30s，72℃90s，35Cycles；72℃7min)扩增全长序列的ITS。将PCR产物用1％凝胶进行电泳30min(100V)，使用015μg/MlEB或3×GelRed进行后染30min，然后在凝胶成像仪上进行显影成像，观察是否扩增出目的条带，结果如图1所示。

表1

4.rDNA-ITS测序与分析

将扩增出来的目的核酸片段送上海生工生物工程技术服务有限公司纯化后进行测序，基因序列如SEQ ID NO:1所示。将测得的序列提交美国NCBI的GENBANK获取对比指标靠前的20个相似序列，通过BLAST工具和DNAMAN软件进行比对分析并以Neighbor-Joining方法构建系统发育树，如图7所示。

通过系统发育树发现该菌株与Schizophyllum commune DP61等具有极高的亲缘性，因此可确定为一株海洋来源的裂褶菌，能够在高盐环境条件下生长，我们将其命名为Schizophyllum commune XNY-20151228。

实施例3：裂褶菌素的生产

1.裂褶菌的发酵培养

以5～10％的接种比例将裂褶菌接种到发酵培养基，25-27℃，160-180rpm下摇瓶培养24～36小时。发酵培养基配方为：葡萄糖30.0g/L，酵母粉5.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.3g/L。

2.裂褶菌素的提取与纯化

以裂褶菌发酵培养物为材料，收集发酵液，8 000r/min离心20min，弃沉淀。上清液中加入粉末状活性炭，水浴，加热搅拌15min，抽滤得粘稠、透明状液体。脱色后的发酵液用Sevag法除蛋白，重复5次后，向已脱蛋白的发酵液中加入2.5倍体积的95％乙醇，出现大量白色絮状沉淀，摇匀，4℃静置过夜，6 000r/min离心20min，收集沉淀，冷冻干燥，得裂褶菌素粗品。

SephadexG-100凝胶柱层析对裂褶菌素粗品进行柱层析分离、纯化。选取SephadexG-100为填料装填于1.6cm×100cm层析柱中，0.9％氯化钠溶液洗脱，流速控制在大约0.3mL/min，每管收集3mL，分步收集，每管取少量收集液，苯酚-硫酸法检测，490nm测其OD值。将最大峰处的洗脱液合并，减压浓缩，冷冻干燥，得到多糖纯品。

3.所得裂褶菌素纯品的结构分析

3.1酶解反应：淀粉酶0.1mL溶于30mL蒸馏水中。蜗牛酶以pH7.4磷酸缓冲液配制，终浓度为3％。两者中均加入裂褶菌素30mg，40℃，反应3d，用DNS法测定水解产物。

3.2高碘酸氧化：200mg裂褶菌素溶于100mL 0.25mol/L NaIO4中于暗处，12℃，间隔12h取样，稀释，在223nm测定高碘酸消耗量，将溶液中加入乙二醇放置10min，以终止反应，还原剩余的高碘酸，用溴甲酚紫为指示剂，用0.01mol/LNaOH滴定甲酸释放量。

结果显示：该裂褶菌素不能被α-淀粉酶，纤维素酶水解，提示无α-(1～4)及β-(1～4)连接的糖苷键。但能被蜗牛酶水解，表明含有有β-(1-3)糖苷键。

经高碘酸钠氧化，108h反应完成，平均每摩示已糖消耗高碘酸盐l.05mol，产生甲酸0.47mol，高碘酸的消耗是甲酸生成的2倍，说明多糖中只有(1～6)糖苷键。

采用上述方法进一步测定发现该裂褶菌素以β-1、3糖苷键为主链(66％)，少量β-1、6糖苷键为侧链(33％)。

3.3高效液相色谱：Waters244型高效液相色谱仪，糖柱，Waters410视差检测器，流动相为水，流速0.9，柱温50℃。SPG水解液的Rf(9.808)与葡萄糖标准品的Rf(9.835)一致，表明该裂褶菌素是一种葡萄糖多聚物，即为葡聚糖。高效液相图谱如图3所示。

3.4紫外吸收光谱：

裂褶菌素溶液从200nm～600nm进行全波长扫描，分析其末端吸收峰。

紫外扫描在260nm和280nm未见特征吸收峰，说明SPG中不含蛋白成分。

紫外吸收光谱图如图4所示。

3.5红外光谱分析：

2mg干燥的裂褶菌素样品，与100～200mg经干燥的KBr粉末在瑙研钵中研磨均匀，压片机压成薄片后在4000～500cm^-1进行扫描。红外吸收光谱图如图5所示。

SPG在3600～3200cm^-1的宽峰是O-H的伸缩振动。没有氢键的二级O-H其吸收峰一般在3630cm^-1附近，分子内的氢键在3560cm^-1附近，分子间的氢键在3400cm^-1以下。3395cm^-1的强吸收峰说明存在分子间的氢键。3000～2800cm^-1的一组较弱的峰是糖类C-H的伸缩振动,该区域的吸收峰是糖类的特征吸收峰。1400～1200cm^-1的弱吸收带是C-H的面外弯曲振动。1200～1000cm^-1的强吸收峰由两种C-O伸缩振动所产生，其中一种属于C-O-H，另外一种是糖环的C-0-C。890cm^-1处吸收峰是吡喃糖β型C－H面内弯曲振动的特征吸收峰。红外光谱进一步表明SPG是一种β型葡聚糖。

3.6分子量测定：

凝胶珠色谱分析经过精制的树花多糖在GPC上的洗脱曲线见图6，利用随机的Breeze软件计算得数均分子量Mn＝0.8×107，重均分子量Mw＝1.6×107。Mw/Mn＝2.0，表明样品分子量分布较分散。

综合以上分析，可以确定该裂褶菌素为来源于海洋裂褶菌的β-1,3/1,6-葡聚糖。相对 于传统酵母，燕麦来源的β-葡聚糖以β-1、4糖苷键为主，水溶性不足的缺点，该海洋白参所产裂褶菌素完全水溶，保湿性能更突出，更适合作为化妆品添加剂。

本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合微生物领域的市售产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

SEQ ID NO:1：

TTCTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGAATCAAACAAGTTCATCTTGTTCTGATCCTGTGCACCTTATGTAGTCCCAAAGCCTTCACGGGCGGCGGTTGACTACGTCTACCTCACACCTTAAAGTATGTTAACGAATGTAATCATGGTCTTGACAGACCCTAAAAAGTTAATACAACTTTCGACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCTTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATACCATCAACCCTCTTTTGACTTCGGTCTCGAGAGTGGCTTGGAAGTGGAGGTCTGCTGGAGCCTAACGGAGCCAGCTCCTCTTAAATGTATTAGCGGATTTCCCTTGCGGGATCGCGTCTCCGATGTGATAATTTCTACGTCGTTGACCATCTCGGGGCTGACCTAGTCAGTTTCAATAGGAGTCTGCTTCTAACCGTCTCTTGACCGAGACTAGCGAACTTGTGCGCTAACTTTTGACTGACCTCAAATC。

Claims (4)

1.一种海洋裂褶菌(Schizophyllum commune Fr.)，其特征在于：它的保藏编号为CCTCC NO: M 2016055，分类命名为裂褶菌。

2.利用权利要求1所述的海洋裂褶菌生产裂褶菌素的方法，其特征在于，包括以下步骤：以5～10％的接种比例将裂褶菌接种到发酵培养基，23-27℃，160-180rpm下摇瓶培养24-36小时；然后对裂褶菌发酵培养液进行提取、纯化，得裂褶菌素；所述发酵培养基配方为：葡萄糖30.0g/L，酵母粉5.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.3g/L。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，得到的裂褶菌素为β-1,3/1,6-葡聚糖，分子量在60KD-120KD之间，结构式为

。

4.利用权利要求2所述方法制备得到的裂褶菌素在制备食品、化妆品和药品中的应用。