CN103214593B - β-葡聚糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种β-葡聚糖的制备方法，包括：a)将蘑菇菌液置入含有培养液与搅拌装置的容器，并通过该搅拌装置搅拌培养该蘑菇菌液；b)将步骤a)所培养的蘑菇菌液转移置入含有生产培养基的聚碳酸树脂容器，且通过回转式摇摆机，旋转该聚碳酸树脂容器而震荡培养该蘑菇菌液；及c)自步骤b)震荡培养的蘑菇菌液分离或纯化β-葡聚糖。

Description

β-葡聚糖的制备方法

本申请是申请号为200810187740.5，申请日为2008年12月31日，发明名称为“β-葡聚糖的制备方法与制备系统”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及β-葡聚糖的制备方法，更特别地，本发明涉及利用新颖的蘑菇培养方法与培养系统以制备β-葡聚糖。

背景技术

近年来有许多研究发现蘑菇菌丝体或子实体中含有相当多的生理活性成分，如β-葡聚糖(β-Glucan)、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)、三萜类(Triterpenoids)等物质，具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等作用。而其中研究最深入且最具潜力的抗肿瘤及免疫调节物质为多糖体。

已知β-葡聚糖为一种良好的免疫促进剂，可有效刺激免疫细胞，不仅能增强生物体特异性免疫反应，同时也提高了非特异性免疫反应。此外，β-葡聚糖能使生物体抵抗细菌、真菌、病毒及寄生虫的感染，并且抑制肿瘤的生长。近年来蘑菇多糖体（mushroom β-glucan）逐渐受到重视，主要原因在于蘑菇多糖体的分支度、分子量、水溶性以及结构稳定性都较酵母菌多糖体高出许多，具有较高的免疫促进能力。

然而，蘑菇类的成分复杂，如多糖、蛋白质、多肽类、三萜类、多种氨基酸、生物碱、酯类和有机酸等，所以萃取蘑菇多糖体物需经繁琐的步骤，如热萃取、碱萃取、酸萃取等方式，因此，易残留有机溶剂、氨基酸与蛋白质，此等残留皆可能产生刺激性免疫反应。

一般培养蘑菇的子实体，需要二至三个月，培养至采收耗时耗力，若蘑菇来源是从野外取得则更为困难；因此，目前多利用液态发酵培养蘑菇菌丝体。目前以深层培养(submerged culture)方式制造蘑菇菌丝体及其代谢产物最多；菌丝体经初步培养后，经由小、中及大型发酵槽依序连续培养，藉此大量生产。公知技术中，蘑菇培养设备需用到大小不同的不锈钢材质的发酵槽串联，加上管路及大型锅炉连结，设备繁复并且成本很高；然而，制备过程中除了发酵槽设备相当昂贵的外，发酵期间若有污染(contamination)的情形发生，往往造成严重的损失。一般而言，蘑菇在液态发酵时菌丝体的生长速率较慢，过程中遭到污染的机会也相对提高，因此，通常使用较高的接种量，约10%-30%。体积越大的发酵槽，除了混合效果不佳以外，还会造成温度、pH及营养的梯度问题，并造成发酵不均匀的状况，故公知技术为尽量避免上述问题，势必要增加前置培养的设备。

再者，对于蘑菇的深层培养，需要考虑培养基的组成、pH值、温度、通气、和搅拌等条件，以制造菌丝体或其代谢物。深层培养的特色在于发酵过程中并无孢子形成(sporulation)期，所产生的菌丝体在发酵时会纠结在一起而形成菌球，若菌球愈大，其中心部分的菌丝体会因氧气及养分输送上的限制，造成饥饿的情形，对菌丝体增殖与代谢产物生成非常不利；这也使得培养液中营养源及氧气的传送程度较一般低等真菌或酵母菌的液体培养更为复杂。因此，在发酵期间，须控制发酵过程中的切应力、搅拌转数及溶氧程度等因素，以缩小菌丝体形成球状物的体积。

蘑菇液态发酵时，培养基中碳源、氮源及生长因子，是多糖体产率的关键之一，大多数的制造方法会寻找较便宜的生产物料，或者为提高产率而添加一些特殊化合物，如此却衍生出更多纯化的步骤，造成成本提高、设备增加及废弃物处理的问题。并且以目前惯用的发酵槽进行大量的蘑菇液态发酵，自发酵液萃取所得的β-葡聚糖浓度仍然偏低，一般低于10重量%。

为解决上述问题，本发明提供了制备蘑菇β-葡聚糖的方法与新颖的蘑菇培养系统。

发明内容

由于上述公知技术的缺陷，本发明的主要目的是提供β-葡聚糖的制备方法与制备系统，利用含有简单成分的培养基及价格低廉的设备，提供良好的蘑菇液态培养环境，即可成功制造菌丝体及多糖体等代谢物，并克服了溶氧或菌体体积过大的问题，可作为蘑菇液态培养及其他领域的液态发酵的应用。

为达上述与其他目的，本发明提供一种制备β-葡聚糖的方法，包括：(a)将蘑菇菌液置入含有培养液与搅拌装置的容器，并通过该搅拌装置搅拌培养该蘑菇菌液；(b)将步骤(a)所培养的蘑菇菌液置入含有生产培养基的聚碳酸树脂容器，且通过回转式摇摆机，旋转该聚碳酸树脂容器而震荡培养该蘑菇菌液；及(c)自步骤(b)震荡培养的蘑菇菌液分离或纯化β-葡聚糖。

在本发明制备β-葡聚糖的方法中，步骤(a)的容器为具有硅胶透气瓶塞的血清瓶，且搅拌装置是磁石棒，提供转速以控制溶氧量、菌丝体体积、及/或菌丝体生长速度。

根据本发明，制备β-葡聚糖的方法进一步包含提供用于蘑菇菌种培养的T型培养盒，用以迅速筛选所欲发酵的蘑菇菌种。

根据本发明，该生产培养基采用食品级原料，仅包括葡萄糖与酵母菌萃取物，其中培养基成分以重量百分比表示，优选为1-10％葡萄糖与0.1-1％酵母菌萃取物，更优选为4％葡萄糖与0.5％酵母菌萃取物。经过实验测试，本发明的生产培养基可适用于各类型蘑菇生长，而多糖体产率也良好；可适用的蘑菇包括所有食用蘑菇类与医药用蘑菇类，举例但非限制，裂褶菌(Schizophyllum commue)、巴西蘑菇（Agaricsblaze）、冬虫夏草（Cordyceps sinensis）、灵芝(Ganoderma lucidum)、云芝(Coriolus versicolor)、樟芝（Anthodia camphorate）、桑黄（Phellinuslinteus）、珊瑚菇（Pleurotus citrinopileatus）、香菇(Lentinula edodes)、田头菇属（Agrocybe sp.）如柳松菇（Agrocybe aegerita）、猴头菇（Hericiumerinaceus）、杏鲍菇（Pleurotus eryngiig）、花瓣茸（Sparrasis crispa）、木茸（Auricularia auricula）、金针菇（Flammulina velutipes）等。

这种分离或纯化β-葡聚糖的方法可以一般公知方法进行，在优选实施例中，本发明分离或纯化β-葡聚糖的方法包括：将经前置培养与大量发酵所得的蘑菇菌液粉碎、离心并收取上清液、用乙醇沉淀上清液而得沉淀物、用水溶解沉淀物，并以薄膜进行分离而获得β-葡聚糖。

本发明的另一方面提供制备β-葡聚糖的培养液态蘑菇系统，包括：内含搅拌装置的玻璃容器，用于前置发酵液态蘑菇；聚碳酸树脂容器，用于放大培养前置发酵的液态蘑菇；以及回转式摇摆机，用于承载并旋转该聚碳酸树脂容器，藉以震荡方式放大培养该液态蘑菇。此培养系统可用以实施本发明制备β-葡聚糖的方法。

在上述液态蘑菇培养系统中，该玻璃容器是具有硅胶透气瓶塞的血清瓶，该血清瓶的搅拌装置是磁石棒。搅拌装置提供转速以控制溶氧量、菌丝体体积、及/或菌丝体生长速度。利用玻璃血清瓶盖上的硅胶透气塞提供前蘑菇前置发酵所需气体，利用磁石搅拌培养，促进蘑菇胞外多糖体的生成、抑制菌丝体结成团块、并可增加溶氧及物质交换的速率。

本发明用于培养制备β-葡聚糖的液态蘑菇系统，本发明进一步包括用于菌种培养与快速筛选菌种的T型培养盒，该培养盒有助于快速筛选所欲发酵的蘑菇菌种。

附图说明

图1是本发明用于前置发酵的容器及磁石搅拌机的概示图。

图2是本发明用于液态蘑菇培养的聚碳酸树脂容器及回转摇摆机的概示图。

图3是根据本发明的实施例，用以说明分离与纯化β-葡聚糖的流程图。

主要元件符号说明

11玻璃容器

12多孔硅胶塞

13磁石搅拌子

14磁石搅拌机

21聚碳酸树脂容器

22回转摇摆机

具体实施方式

以下是通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容了解本发明的其他优点与功效。

1.蘑菇菌种筛选与培养

本发明可应用的蘑菇菌株是如裂褶菌、巴西蘑菇、冬虫夏草、灵芝、云芝、樟芝、桑黄、珊瑚菇、香菇、田头菇属如柳松菇、猴头菇、杏鲍菇、花瓣茸、木茸、金针菇等，但不限于上述菌株。以裂褶菌与灵芝作为实施例，说明如下。

在无菌操作条件下，将其接种于YM琼脂培养基上，置于28℃培养箱（Incubator）培养，其中YM琼脂培养基包含0.3%(w/w)酵母菌萃取物、0.3%麦芽萃取物、0.5%蛋白胨(peptone)、1.0%右旋糖(dextrose)、1.5%琼脂(agar)等。约培养2～3天后，开始出现菌丝体，约一周后菌丝体长满固体培养基。观察其菌种形态及生长速率，进行蘑菇菌种筛选及后续继代培养

YM培养液20毫升加入80T的T型动物细胞培养盒（T型塑胶培养盒）中，将筛选出的固态培养菌丝体切一小块植入培养液，在28℃培养一周后，选择生长良好快速的菌丝体，用作液态前置发酵的菌种。

2.前置发酵

使用图1的装置，取玻璃容器11(例如1公升的血清瓶)，使用单向透气的多孔硅胶塞12作为瓶盖，瓶内放入Teflon磁石搅拌子13。在玻璃容器11内配制800毫升的YM培养液，并将配置的培养液进行高温高压灭菌，灭菌条件121℃、15分钟，灭菌后降至室温。

将在T型塑胶培养盒培养完成的蘑菇菌液接种于玻璃容器11内，将玻璃容器11置于磁石搅拌机14上，于室温条件下培养。将搅拌机的转速控制在约300rpm，使培养液均匀分布，并利用转速控制液体中的溶氧量，通过磁石旋转的切应力使菌丝体生长细密、增殖快速并使菌球形成减少与形成体积减小。待发酵至生长曲线的静止期(stationaryphase)而停止发酵。

如上述条件，另取更大体积的玻璃容器(例如10公升的血清瓶)，其中注入8公升YM培养液，接种前述发酵完成的菌液，进行第二次菌种放大的前置发酵步骤。当然，可视需要而进行多次的前置发酵步骤。

3.大量发酵

经由至少两次的前置发酵，由于菌丝体被磁石旋转切碎，使得菌体的体积不至于过大而影响后续的发酵，此时可进行菌种大量发酵。

本发明所使用的生产培养基包含4%葡萄糖(glucose)与0.5%酵母菌萃取物，将该生产培养基15-18公升注入体积为20公升的聚碳酸树脂容器中，并放入高温高压灭菌，灭菌条件为121℃、15分钟，灭菌后降至室温。

将前置发酵完成的蕈菇培养液接种入聚碳酸树脂容器21中，将聚碳酸树脂容器固定在回转摇摆机22(如图2)上，调节适当的转速，约80rpm，并给予充分的溶氧及旋转震荡，于室温下培养，待发酵至生长曲线的静止期(stationary phase)而停止发酵，此时菌丝体的细胞数与多糖体的浓度维持在最高。

发酵期间，由于聚碳酸树脂容器具有透明瓶身，可供清楚观察整体的发酵情形，进行筛选及控制。

4.β-葡聚糖的分离与纯化

经本发明方法所获得的液态蘑菇培养菌液，在培养液与菌丝体中皆含有β-葡聚糖，可直接供后续应用；但也可从培养液与菌丝体中将β-葡聚糖进一步分离纯化。

如图3所示，将上述发酵完成的蘑菇菌液，用超高速均质机及超音波震荡机分别处理10分钟，以震碎菌丝体细胞壁。高速离心(每分钟6,000～8,000转)，逐步收取上清液。加入与上清液等量的95%乙醇以萃取高分子多糖体，收取沉淀物。将沉淀物均匀溶解于二次蒸馏水中，再将此水溶液利用分离膜系统（Membrane Separation System）去除乙醇及剩余的小分子物质，例如低于10kDa的小分子，则可获得β-葡聚糖。

5.β-葡聚糖的浓度测定

以测量多糖体的酚-硫酸法（Phenol-sulfuric acid method）测定本发明萃取的β-葡聚糖含量。于10毫升样品加入40毫升95%乙醇(NACALAI)，充分混合。以1,000g离心15分钟，沉淀物即为多糖体；倒掉上清液，以75%乙醇洗涤多糖体2次。经离心后，去除残余乙醇。以蒸馏水溶解沉淀物，并将最后体积调成10毫升，作为待测样品的溶液。

取0.5毫升溶液与等体积5%酚(AMRESCO)混合，再缓缓加入2.5毫升浓硫酸。静置10分钟后震荡，使其充分混合。静置30分钟后，用分光光度计(Ultrospec1000,PHARMACIABIOTECH)测量波长490nm的吸光值。并依据葡萄糖标准曲线计算样品中所含多糖体的浓度。

测定本发明所制备的β-葡聚糖，所得裂褶菌的β-葡聚糖浓度为20～25％；灵芝的β-葡聚糖浓度为20～25％。

上述结果证实本发明制备β-葡聚糖的方法与系统确实可提高蘑菇液态发酵的β-葡聚糖的产率。

经多次实验证实多种蘑菇，如裂褶菌、巴西蘑菇、冬虫夏草、灵芝、云芝、樟芝、桑黄、珊瑚菇、香菇、田头菇属如柳松菇、猴头菇、杏鲍菇、花瓣茸、木茸、金针菇等菌株，皆适用本发明的方法。

据上所述，本发明不仅提高蘑菇液态发酵的β-葡聚糖产率，而且具有至少以下优点与功效：

公知技术是使用三角烧瓶进行菌种的震荡培养。然而，本发明是以玻璃血清瓶盖上硅胶透气塞，并且通过磁石棒进行搅拌培养，有助于促进蘑菇胞外多糖体生成、降低菌丝体结成团块、增加溶氧及物质交换的速率。

本发明利用动物细胞培养方式取代一般琼脂培养法，用80T的T型塑胶培养盒来培养蘑菇菌种，与公知技术的琼脂培养基培养法相比，本发明所培养的菌种具有生长快速、复制量可提高、可提早观察出菌种是否遭受污染等优点。

再者，由于本发明的培养基采用食品级原料，故发酵完毕后，不需经过繁琐的纯化程序，即可直接食用；且发酵液可进一步加工调制为各种不同形态的健康食品、化妆品及医疗用品。

本发明的聚碳酸树脂(polycarbonate,PC)容器可耐高温达130℃，且具有材质透明的特性，作为发酵桶可方便观察内部发酵状况，使发酵控制和管理更为容易。根据本发明，聚碳酸树脂容器外型设计如一般蒸馏水桶，盖上硅胶透气塞，即可放入一般小型杀菌锅内灭菌，发酵时操作容积可达约16公升，比一般桌上型发酵槽容量大，并且聚碳酸树脂容器的重量较轻，且价格较低廉。

将培养基置于聚碳酸树脂容器中，用杀菌锅进行灭菌，待其灭菌冷却后，将血清瓶前置培养完成的菌株接种于聚碳酸树脂容器中，置于回转式摇摆机上，单次可操作1-16个容器，可视需要进行增减，亦可同时培养多种菌株，在生产或研发上的应用极具弹性。此外，聚碳酸树脂容器的透明瓶身可供随时观察发酵的情形，以调节摇摆的转速，控制溶氧及生长状况。

本发明用于培养制备β-葡聚糖的液态蘑菇系统适用于各类蘑菇的液态发酵，并可用以制备出多糖体(如β-葡聚糖)和其他代谢产物。该系统利用旋转摇摆转速，配合操作体积，可控制溶氧量；依此原理，本培养系统的应用范围更可扩及嗜氧、微好氧或厌氧类微生物发酵，并可延伸至动、植物细胞培养。此外，由于聚碳酸树脂容器为透明材质，可配合特殊光照设备，视培养的需要，可满足培养菌株的特定光照需求，因此，也适用于对于藻类、光合菌、或植株的液态培养。

上述实施例仅示例性说明本发明的系统与方法，而非用于限制本发明。任何本领域技术人员均可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，本发明的权利保护范围如前述权利要求。

Claims (11)

1.一种制备β-葡聚糖的方法，该方法包括：

a)将蘑菇菌液置入含有培养液与搅拌装置的容器，并通过该搅拌装置搅拌培养该蘑菇菌液；

b)将步骤a)所培养的蘑菇菌液置入由葡萄糖与酵母菌萃取物所组成的生产培养基的聚碳酸树脂容器，且通过回转式摇摆机，旋转该聚碳酸树脂容器而震荡培养该蘑菇菌液；及

c)从步骤b)震荡培养的蘑菇菌液中分离或纯化β-葡聚糖。

2.如权利要求1所述的方法，其中步骤c)包括：

将蘑菇菌液的菌丝体粉碎；

进行离心并收取上清液；

用乙醇沉淀该上清液，而得沉淀物；

用水溶解该沉淀物，而得水溶液；以及

用薄膜分离该水溶液，而获得β-葡聚糖。

3.如权利要求1所述的方法，其中步骤a)的培养视需要重复数次。

4.如权利要求1所述的方法，其中生产培养基由1至10％葡萄糖与0.1至1％酵母菌萃取物所组成。

5.如权利要求4所述的方法，其中生产培养基由4％葡萄糖与0.5％酵母菌萃取物所组成。

6.如权利要求1所述的方法，其中该步骤a)的容器为具有硅胶透气瓶塞的血清瓶。

7.如权利要求1所述的方法，其中该搅拌装置是磁石棒，用于提供转速控制溶氧量、菌丝体体积，及/或菌丝体生长速度。

8.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包含提供T型培养盒，用于蘑菇菌种培养。

9.如权利要求1所述的方法，其中该蘑菇为裂褶菌、巴西蘑菇、冬虫夏草、灵芝、云芝、樟芝、桑黄、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴头菇、杏鲍菇、花瓣茸、木茸、金针菇或其组合物。

10.如权利要求1所述的方法，其中回转式摇摆机转速设定为50至150rpm。

11.如权利要求10所述的方法，其中回转式摇摆机转速设定为70至100rpm。