CN102674929B - 一种桦褐孔菌的深层发酵培养基及其深层发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药用真菌发酵技术领域，涉及一种桦褐孔菌的深层发酵培养基及其深层发酵方法。该方法按以下步骤实施：以蜂花粉1.2-1.8%、党参1.5-2.5%、葡萄糖1.5-2.0%、麦芽糖1.0-1.5%、黄豆粉2.0-3.0%、蛋白胨0.4-0.6%、磷酸二氢钾0.2-0.3%、硫酸镁0.1-0.2%，余量为水，培养基初始pH：5.5-7配制深层发酵培养基，接入桦褐孔菌菌种分两阶段深层发酵培养，培养结束后，分离收集菌丝体，干燥得发酵菌粉。该方法利用具有活性成分的中药基质进行桦褐孔菌的深层发酵生产，满足药用、医用的中间体原料生产和研究需求。本发明优化了桦褐孔菌的培养条件，生产的桦褐孔菌发酵菌粉具有产量高、时间短、效益高、成本低、应用广、无毒安全，具有显著的社会和经济效益。
Description
技术领域
本发明属于药用真菌发酵技术领域，尤其涉及一种桦褐孔菌的深层发酵培养基及其深层发酵方法。
背景技术
桦褐孔菌，拉丁学名：Inonotus obliquus(Fr.)Pilát，亦称为白桦茸，是一种生长在白桦树活立木上的野生珍贵药用真菌，具有广泛的药理作用和国际市场需求。桦褐孔菌富含真菌多肽蛋白、三萜类、多糖类、生物碱类化合物等，其中葡聚糖、SOD（超氧化物歧化酶）比灵芝和姬松茸高达数10倍，被誉为“万能药”、“神奇的真菌”；桦褐孔菌含有大量的抗癌、降血压、降血糖、复活免疫作用的植物纤维类多糖体，能抑制癌细胞扩散和复发，在胃肠内防止致癌物质的吸收并促进排泄；对高血压的防治效果显著，又称为“血液血管的清洁剂”。桦褐孔菌主要分布于俄罗斯北部、北欧、中国黑龙江、日本北海道，滋生在北半球北纬40°～50°的地区。由于野生资源日益枯竭，人工培养研究迫在眉睫。目前子实体的人工栽培仅小批量获得成功，且栽培周期长，极易被杂菌污染，满足不了市场需求。深层发酵技术能够快速、稳定、规模化的获取桦褐孔菌菌丝体及具有活性的次级代谢产物，因此液体深层发酵生产是桦褐孔菌资源开发的重要手段。然而，现有深层发酵桦褐孔菌菌丝收率低、发酵的有效成分产量低，不能满足药用、医用研究需求。
发明内容
本发明提供了一种桦褐孔菌的深层发酵培养基及其深层发酵方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明首先提供了一种桦褐孔菌的深层发酵培养基，所述深层发酵培养基的原料按重量百分比为：蜂花粉1.2-1.8%、党参1.5-2.5%、葡萄糖1.5-2.0%、麦芽糖1.0-1.5%、黄豆粉2.0-3.0%、蛋白胨0.4-0.6%、磷酸二氢钾0.2-0.3%、硫酸镁0.1-0.2%，余量为水，培养基初始pH：5.5-7；其中蜂花粉、党参为80-100目固体粉末。
所述蜂花粉为椴树蜂花粉。
本发明还提供了一种桦褐孔菌的深层发酵方法，所述深层发酵方法包括以下步骤：
（1）配制深层发酵培养基：以蜂花粉、党参、葡萄糖、麦芽糖、黄豆粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁为原料，其重量百分比为：蜂花粉1.2-1.8%、党参1.5-2.5%、葡萄糖1.5-2.0%、麦芽糖1.0-1.5%、黄豆粉2.0-3.0%、蛋白胨0.4-0.6%、磷酸二氢钾0.2-0.3%、硫酸镁0.1-0.2%，余量为水，其中蜂花粉、党参为80-100目固体粉末；
（2）接种桦褐孔菌发酵种子液，分两阶段深层有氧发酵：
A、一级种子罐培养条件：培养基装液量为发酵罐容积的1/5-3/5；桦褐孔菌菌种接种量：15-20%；培养温度：26-29℃；光照条件：连续黑暗条件；搅拌速率：150-220 r∕min；罐压： 0.04-0.05MPa；无菌空气通气量：1∶0.5-0.6v∕v·min；发酵周期：40-48h；当培养基pH降至3.0-3.5，一级发酵结束；
B、二级发酵罐培养条件：培养基装液量为发酵罐容积的1/5-3/5；接种量：25-30%；培养温度：26-29℃；光照条件：连续黑暗条件；搅拌速率：150-220 r∕min；罐压：0.04-0.05MPa；无菌空气通气量：1∶0.4-0.6v∕v·min；发酵周期：42-48h，当培养基pH降至3.0-3.5，深层发酵结束。
其中步骤（2）所述的桦褐孔菌发酵种子液为经斜面活化、摇瓶种子培养得到，且活化、摇瓶种子培养基均采用通用的药用真菌培养基。
所述的深层发酵结束后，分离、收集菌丝体，干燥得发酵菌粉，做为保健食品和药品的中间体原料。
所述蜂花粉为椴树蜂花粉。
本发明利用具有活性成分的中药基质进行桦褐孔菌的深层发酵生产，优化了桦褐孔菌深层发酵方法。选用的蜂花粉和党参均含有丰富的营养物质，其中蜂花粉含有丰富的氨基酸、维生素、微量元素以及大量的活性蛋白酶、核酸及其它活性物质，特别是B族维生素的含量极为丰富；党参含多糖类、维生素B1、B2，多种人体必须的氨基酸、皂甙、微量生物碱、及微量元素等。两者丰富的维生素B1、微量元素锰、生物碱等不仅可促进桦褐孔菌菌丝体的生长及其代谢产物的生产，而且所制备的发酵产物可增加桦褐孔菌本身的生物活性，同时桦褐孔菌强大的酶系能分解中药中的多糖类、蛋白质、脂类等并加以利用。
本发明的优点：
1、桦褐孔菌的深层发酵培养基是在基础培养基上添加中药成分蜂花粉和党参，两者丰富的微量元素、维生素等营养成分促进桦褐孔菌菌丝体的生长及其代谢产物的生产，提高了菌丝体产量，且时间短、成本低、无毒安全，具有显著的经济效益；2、桦褐孔菌同时能分解中药成分，在发酵产物中，既包含中药的成分，也包含桦褐孔菌的活性代谢产物以及他们相互作用产生的新组分，大幅度提高了发酵产物的质量和桦褐孔菌菌丝体产量，为保健食品和药品等进一步提取真菌多糖、萜类化合物、生物碱等活性物质提供充足的中间体原料。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明，但不以任何方式限制本发明。
以下所有实施例中的桦褐孔菌菌种由工业微生物教育部工程研究中心华尔康生物药物研究所提供，是该所从东北吉林长白山老爷岭采集的子实体经分离而得。其中桦褐孔菌发酵种子液的制备如下：斜面种子于PDA固体培养基上27℃恒温培养箱培养6d后，将菌丝刮下接入基础培养基中，静置4h，然后于140r/min的恒温培养振荡器上振荡培养4d，接入基础培养基中：500mL三角瓶装100mL培养基，接种量10%（V/V），27℃静置10h后于160r/min的恒温培养振荡器上振荡培养7d，即得桦褐孔菌发酵种子液。以上基础培养基成分为（m/V）:葡萄糖2%，蛋白胨0.4%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.05%，余量为水，pH6.5的液体培养基。
实施例1：桦褐孔菌的深层培养
1、配制深层发酵培养基：按以下重量百分比配制液体培养基：蜂花粉1.2%、党参2.5%、葡萄糖1.8%、麦芽糖1.2%、黄豆粉2.5%、蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾0.25%、硫酸镁0.15%，余量为水，其中蜂花粉、党参为80目的固体粉末；调节培养基初始pH为6.5。
2、接种桦褐孔菌发酵种子液，分两阶段深层有氧发酵：
（1）一级种子罐：采用500L不锈钢罐，投料300L。培养基在121℃条件下灭菌30min，冷却后备用。
培养条件：桦褐孔菌菌种接种量：18%；培养温度：27℃；光照条件：连续黑暗条件；搅拌速率：200 r∕min；罐压：0.045MPa；无菌空气通气量：1∶0.55v∕v·min；发酵48h，pH降至3.0-3.5，菌丝体发酵成熟，一级发酵终了。
（2）二级发酵罐：采用5000L不锈钢罐，投料3000L。
培养条件：接种量：28%；培养温度：27℃；光照条件：连续黑暗条件；搅拌速率：180 r∕min；罐压：0.045MPa；无菌空气通气量：1∶0.55v∕v·min；发酵48h，pH降至3.0-3.5之间，菌丝体发酵成熟，深层发酵结束。
3、深层发酵培养结束后，分离、干燥、收集菌丝体发酵干粉的得率为30.48g/L，（干粉实测含水量为4.84%）。
实施例2：桦褐孔菌的深层培养
1、配制深层发酵培养基：按以下重量百分比配制液体培养基：椴树蜂花粉1.5%、党参2.0%、葡萄糖1.8%、麦芽糖1.2%、黄豆粉2.5%、蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾0.25%、硫酸镁0.15%，余量为水，其中蜂花粉、党参为80目的固体粉末；培养基初始pH为6.5。
2、深层发酵方法及条件同实施例1，最后发酵菌粉干燥后的得率为30.77g/L,（干粉实测含水量为4.66%）。
实施例3：桦褐孔菌的深层培养
1、配制深层发酵培养基：按以下重量百分比配制液体培养基：椴树蜂花粉1.8%、党参1.5%、葡萄糖1.8%、麦芽糖1.2%、黄豆粉2.5%、蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾0.25%、硫酸镁0.15%，余量为水，其中蜂花粉、党参为80目的固体粉末；培养基初始pH为6.5。
2、深层发酵方法及条件同实施例1，最后发酵菌粉干燥后的得率为30.59g/L,（干粉实测含水量为4.59%）。
实施例4：成分检测对照表
表1 天然桦褐孔菌成分及含量（g/100g干重）
表2 不含蜂花粉、党参培养基的发酵菌粉成分及含量（g/100g干重）
注：不含蜂花粉、党参的培养基成分：葡萄糖1.8%、麦芽糖1.2%、黄豆粉2.5%、蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾0.25%、硫酸镁0.15%，余量为水，培养基初始pH为6.5；深层发酵方法及条件与实施例1相同。
表3 含椴树蜂花粉、党参培养基的发酵菌粉成分及含量（g/100g干重）
表1、2、3结果说明：本发明大大提高了桦褐孔菌的菌丝体收率以及桦褐孔菌粗多糖、三萜类有效活性成分的含量；而且两活性成分的含量均高于天然桦褐孔菌含量的两倍。其中粗蛋白含量为天然桦褐孔菌的4倍以上。
上述成分的检测方法依据如下：
1、粗多糖：苯酚——硫酸法
发酵菌粉多糖提取：精确称取桦褐孔菌发酵菌粉1.000g于50mL容量瓶，加40mL蒸馏水于100℃水浴中煮2h，冷却后加水至刻度，过滤，取滤液2mL，加8mL无水乙醇（分析纯），混匀、离心，弃上清液，沉淀加水溶解，定容至25mL得供试液。
标准曲线制备：准确吸取葡聚糖标准溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL分别具塞比色管中，各加蒸馏水使成2.0mL，再加苯酚试液（10g苯酚溶于150mL水制得。）1.0mL，摇匀，于冰浴中滴加浓硫酸（分析纯）5.0mL，迅速摇匀，于沸水浴放置15min，取出，冷却至室温，用紫外分光光度计，在490nm处测其吸光度，并绘制标准曲线。
多糖测定：精取多糖供试液0.2mL，加蒸馏水使成2.0mL，再加苯酚试液1.0mL，同标准曲线制备项下操作。由标准曲线中求得多糖含量。
2、三萜类：紫外分光光度法
发酵菌粉三萜类提取：精确称取桦褐孔菌发酵菌粉0.100g，置100ml容量瓶中，用乙酸乙酯溶解，超声30min，并稀释至刻度，摇匀，过滤。
标准曲线的绘制：分别精密吸取0.00 ml、0.10 ml、0.30 ml、0.50 ml、0.70 ml、0.90 ml熊果酸对照品溶液于10ml试管中，于100 ℃水浴上蒸干后，加入0.20 ml 5 %香草醛—冰醋酸溶液和1.00 ml高氯酸，摇均，在60 ℃水浴中加热10 min并移入冰水浴中冷却3 min，再加入5.00 ml冰醋酸，摇匀并置于室温。15 min后用分光光度计于548 nm波长下测定对照品溶液的吸光度。分别以熊果酸质量为横坐标和吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
三萜测定：精密吸取1ml滤液于10ml的试管中，于100℃水浴上蒸干后，加入0.20ml5% 香草醛—冰醋酸和1.00ml高氯酸，摇均，于60℃水浴中加热10min，然后立即移入冰水浴中冷却3min，再加入5.00ml冰醋酸，摇匀并置于室温。15min后用紫外分光光度计于548nm波长下测定样品溶液的吸光度。
3、粗蛋白：凯氏定氮法
按《食品卫生检验技术手册》（化学工业出版社 第三版）“第二篇 食品卫生检验技术”中“食品中蛋白质的测定”规定的方法测定。
4、粗脂肪：酸水解法
按《食品卫生检验技术手册》（化学工业出版社 第三版）“第二篇 食品卫生检验技术”中“食品中脂肪的测定”，按照“酸水解法”规定的方法测定。
5、粗纤维：酸碱洗涤法
按《食品卫生检验技术手册》（化学工业出版社 第三版）“第二篇 食品卫生检验技术”中“食品中纤维素的测定”，按照“粗纤维的测定”规定的方法测定。
Claims (4)
1.一种桦褐孔菌的深层发酵方法，其特征在于：所述深层发酵方法包括以下步骤：
（1）配制深层发酵培养基：以蜂花粉、党参、葡萄糖、麦芽糖、黄豆粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁为原料，其重量百分比为：蜂花粉1.2-1.8%、党参1.5-2.5%、葡萄糖1.5-2.0%、麦芽糖1.0-1.5%、黄豆粉2.0-3.0%、蛋白胨0.4-0.6%、磷酸二氢钾0.2-0.3%、硫酸镁0.1-0.2%，余量为水，其中蜂花粉、党参为80-100 目固体粉末；
（2）接种桦褐孔菌发酵种子液，分两阶段深层有氧发酵：
A、一级种子罐培养条件：培养基装液量为发酵罐容积的1/5-3/5 ；桦褐孔菌菌种接种量：15-20% ；培养温度：26-29℃；光照条件：连续黑暗条件；搅拌速率：150-220 r ∕ min ；罐压： 0.04-0.05MPa ；无菌空气通气量：1 ∶ 0.5-0.6v ∕ v·min ；发酵周期：40-48h ；当培养基pH 降至3.0-3.5，一级发酵结束；
B、二级发酵罐培养条件：培养基装液量为发酵罐容积的1/5-3/5 ；接种量：25-30% ；培养温度：26-29 ℃ ；光照条件：连续黑暗条件；搅拌速率：150-220 r ∕ min ；罐压：0.04-0.05MPa ；无菌空气通气量：1 ∶ 0.4-0.6v ∕ v·min ；发酵周期：42-48h，当培养基pH降至3.0-3.5，深层发酵结束。
2. 根据权利要求1 所述的桦褐孔菌的深层发酵方法，其特征在于，步骤（2）所述的桦褐孔菌发酵种子液为经斜面活化、摇瓶种子培养得到，且活化、摇瓶种子培养基均采用通用的药用真菌培养基。
3. 根据权利要求1所述的桦褐孔菌的深层发酵方法，其特征在于，所述的深层发酵结束后，分离、收集菌丝体，干燥得发酵菌粉，做为保健食品和药品的中间体原料。
4. 根据权利要求1所述的桦褐孔菌的深层发酵方法，其特征在于，所述蜂花粉为椴树蜂花粉。
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