CN102115350A - 一种桦褐孔菌深层发酵培养基及桦褐孔菌的深层发酵方法 - Google Patents

Abstract

一种桦褐孔菌深层发酵培养基及桦褐孔菌的深层发酵方法，它涉及一种微生物深层发酵培养基及该微生物的深层发酵方法。它要解决现有桦褐孔菌深层发酵菌丝体收率低和深层发酵有效成分桦褐孔菌胞内多糖、胞外多糖产量低的问题。深层发酵培养基由羧甲基纤维素、葡萄糖、大豆粉、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B₁和余量的水制成。深层发酵：一、配制桦褐孔菌深层发酵培养基；二、接种桦褐孔菌；三、分两阶段深层发酵。本发明使用的深层发酵培养基及桦褐孔菌深层发酵方法，可获得更高的菌丝体收率和胞内、胞外多糖。本发明获得的菌丝体多糖高于野生子实体的1.4倍，其他有效成分含量高于或与野生子实体相同。本发明可为桦褐孔菌大规模人工栽培提供快速、充足的种子液。

Description

一种桦褐孔菌深层发酵培养基及桦褐孔菌的深层发酵方法

技术领域

本发明涉及一种微生物深层发酵培养基及该微生物的深层发酵方法。

背景技术

桦褐孔菌(Inonotus obliguus(Fr.)Pilat)是珍稀的药用真菌，早在16～17世纪以来，东欧、俄罗斯、波兰、芬兰等国家就用野生桦褐孔菌防治各种疑难杂病。目前，美国、日本、韩国的研究人员对桦褐孔菌正加大研究力度，尤其是俄罗斯，民间利用野生桦褐孔菌子实体治疗多种疾病。桦褐孔菌在世界各地已引起广泛重视和关注。桦褐孔菌是一种药用真菌，属于纯中药，是21世纪的保健功能性食品。桦褐孔菌的药效已被证明具有治疗各种癌症、心脏病、糖尿病，同时还可用来防治肝癌、艾滋病，具有抗衰老和有效抑制传染性病毒的作用，桦褐孔菌中胞外多糖更是抗癌、降血压、降血糖、复活免疫的重要活性物质，长期的动物实验及临床实验表明使用桦褐孔菌无任何毒副作用。桦褐孔菌的神奇功效，无论从经济价值还是社会价值，都有必要去研究、开发。随着人类对菌类药物的重新认识，桦褐孔菌在全球范围内将会有广阔的开发前景。

野生桦褐孔菌价格昂贵，是灵芝的7～8倍，且子实体野生资源有限，日益枯竭，很难满足市场的需求。人工栽培技术由于现阶段的研究还处于初期阶段，栽培出实困难，产量低，且人工栽培子实体由于生长周期短，有效成分(特别是桦褐孔菌胞外多糖)积累不足，不能满足药用需求。采用周期短、条件可控、不受外界环境条件影响的液体发酵技术能够弥补桦褐孔菌野生资源匮乏的现状。现有桦褐孔菌深层培养方法中多以桦木汁和麦麸汁配以营养物质制备桦褐孔菌深层发酵培养基(例如公开号为CN101368158的中国发明专利申请“桦褐孔菌深层发酵培养基的制备方法”)。由于桦木汁中含有丰富的营养物质，其中的干物质含量为1.31％、还原糖含量为0.43％、苏氨酸454.0％、谷氨酸8789.1mg/L、甘氨酸744.9mg/L、丙氨酸1895.6mg/L、缬氨酸934.1mg/L、异亮氨酸313.9mg/L、亮氨酸566.1mg/L、酪氨酸369.3mg/L、苯丙氨酸474.4mg/L、组氨酸2712.7mg/L、赖氨酸325.3mg/L，且微量元素也很丰富，对人体有益的钾、钠、钙、镁、铁、锰、锌等含量较高，而铜、铅等微量元素含量很低，所以，用桦木汁来培养桦褐孔菌效果较好，但是，桦木作为落叶乔木(或灌木)生长周期比草本植物长，而且过度砍伐桦木也会导致生态资源遭到破坏。2010年1月13日公开的中国发明专利申请“桦褐孔菌深层培养方法”(公开号为CN101622939)中用玉米糖化液、可溶性淀粉、酵母浸膏、蛋白胨、KH₂PO₄、MgSO₄作为桦褐孔菌深层培养基，虽然用其他物质替代了桦木汁，但是与以桦木汁为主的深层培养基一样，都不能提高桦褐孔菌有效成分桦褐孔菌胞外多糖的产量。

发明内容

本发明要解决现有桦褐孔菌深层发酵菌丝体收率低和深层发酵有效成分桦褐孔菌胞内多糖、胞外多糖产量低的问题，而提供的一种桦褐孔菌深层发酵培养基及桦褐孔菌的深层发酵方法。

桦褐孔菌深层发酵培养基按质量百分比由0.1％～3.0％的羧甲基纤维素、0.1％～5.0％的葡萄糖、0.01％～2.0％的大豆粉、0.01％～2.0％的酵母膏、0.01％～1.0％的磷酸二氢钾、0.01％～1.0％的硫酸镁、0％～0.05‰的维生素B₁和余量的水制成，桦褐孔菌深层发酵培养基pH值为3～7。

用上述桦褐孔菌深层发酵培养基的桦褐孔菌的深层发酵按以下步骤实施：

一、配制桦褐孔菌深层发酵培养基：桦褐孔菌深层发酵培养基按质量百分比由0.1％～3.0％的羧甲基纤维素、0.1％～5.0％的葡萄糖、0.01％～2.0％的大豆粉、0.01％～2.0％的酵母膏、0.01％～1.0％的磷酸二氢钾、0.01％～1.0％的硫酸镁、0％～0.05‰的维生素B₁和余量的水制成，并调节桦褐孔菌深层发酵培养基pH值为3～7，桦褐孔菌深层发酵培养基装样量为深层发酵罐容积的1/5～3/5；

二、接种桦褐孔菌：接种桦褐孔菌发酵种子液，接种量为2％～15％；

三、分两阶段深层发酵：第一阶段静止发酵，静止发酵时间为0.5～5天，静止发酵温度控制为23～34℃；第二阶段摇床发酵，摇床发酵时间为3～10天，摇床发酵温度控制为23～34℃，摇床转速为60～180r/min；即完成桦褐孔菌的深层发酵。

本发明桦褐孔菌深层发酵培养基中不使用桦木汁，保护了生态环境，而且以廉价易得的羧甲基纤维素、葡萄糖、大豆粉、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B₁和水作为原材料，大幅降低了生产成本。并且采用本发明方法所获得的桦褐孔菌菌丝体收率和桦褐孔菌胞内多糖、胞外多糖含量大为提升，远高于现有其他技术方案。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式桦褐孔菌深层发酵培养基按质量百分比由0.1％～3.0％的羧甲基纤维素、0.1％～5.0％的葡萄糖、0.01％～2.0％的大豆粉、0.01％～2.0％的酵母膏、0.01％～1.0％的磷酸二氢钾、0.01％～1.0％的硫酸镁、0％～0.05‰的维生素B₁和余量的水制成，桦褐孔菌深层发酵培养基pH值为3～7。

本实施方式中以羧甲基纤维素和葡萄糖为碳源、以大豆粉和酵母膏为氮源，改变了桦褐孔菌菌丝生长的代谢途径，促进了桦褐孔菌胞内、胞外营养物质的积累，增加了菌丝数量和桦褐孔菌胞内多糖、胞外多糖的产量。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：桦褐孔菌深层发酵培养基按质量百分比由0.2％～2.8％的羧甲基纤维素、0.2％～4.9％的葡萄糖、0.05％～1.8％的大豆粉、0.02％～1.9％的酵母膏、0.02％～0.98％的磷酸二氢钾、0.02％～0.99％的硫酸镁、0.01‰～0.05‰的维生素B₁和余量的水制成，桦褐孔菌深层发酵培养基pH值为4～6.8。其它与实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：桦褐孔菌深层发酵培养基按质量百分比由0.1％～3.0％的羧甲基纤维素、0.1％～5.0％的葡萄糖、0.01％～2.0％的大豆粉、0.01％～2.0％的酵母膏、0.01％～1.0％的磷酸二氢钾、0.01％～1.0％的硫酸镁和余量的水制成，桦褐孔菌深层发酵培养基pH值为3～7。其它与实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：桦褐孔菌深层发酵培养基按质量百分比由0.5％～2.5％的羧甲基纤维素、0.5％～4.5％的葡萄糖、0.1％～1.5％的大豆粉、0.05％～1.5％的酵母膏、0.05％～0.95％的磷酸二氢钾、0.05％～0.95％的硫酸镁、0.02‰～0.04‰的维生素B₁和余量的水制成，桦褐孔菌深层发酵培养基pH值为5.5～6.5。其它与实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一、二、三或四的不同点是：羧甲基纤维素的分子量为5000～8000。其它与实施方式一、二、三或四相同。

具体实施方式六：本实施方式桦褐孔菌的深层发酵按以下步骤实施：

一、配制桦褐孔菌深层发酵培养基：桦褐孔菌深层发酵培养基按质量百分比由0.1％～3.0％的羧甲基纤维素、0.1％～5.0％的葡萄糖、0.01％～2.0％的大豆粉、0.01％～2.0％的酵母膏、0.01％～1.0％的磷酸二氢钾、0.01％～1.0％的硫酸镁、0％～0.05‰的维生素B₁和余量的水制成，并调节桦褐孔菌深层发酵培养基pH值为3～7，桦褐孔菌深层发酵培养基装样量为深层发酵罐容积的1/5～3/5；

二、接种桦褐孔菌：接种桦褐孔菌发酵种子液，接种量为2％～15％；

三、分两阶段深层发酵：第一阶段静止发酵，静止发酵时间为0.5～5天，静止发酵温度控制为23～34℃；第二阶段摇床发酵，摇床发酵时间为3～10天，摇床发酵温度控制为23～34℃，摇床转速为60～180r/min；即完成桦褐孔菌的深层发酵。

本实施方式桦褐孔菌母种购自于黑龙江省微生物研究所。本实施方式方法获得的菌丝体多糖高于野生子实体的1.4倍，其他有效成分含量高于或与野生子实体相同。

本实施方式接种的桦褐孔菌发酵种子液按下述步骤获得：

A、桦褐孔菌母种用cPDA斜面培养基转接两次，每次26℃培养10天，获得复壮的桦褐孔菌母种；每升cPDA培养基由200.0g马铃薯、20.0g葡萄糖、2.0g蛋白胨、2.0g酵母粉、3.0g KH₂PO₄、1.5g MgSO₄.7H₂O、15g琼脂、10mg VB₁和余量的水制成；

B、向复壮的桦褐孔菌母种中无菌操做移入5mL种子培养液，并用接种针将表层复壮的桦褐孔菌母种菌丝刮入种子培养液中，轻轻混匀，再接入种子液培养基，置于26℃环境中静止培养2天，然后再放入160r/min的摇床培养5天，即得到桦褐孔菌发酵种子液。步骤B中种子液培养基与种子培养液成分相同，每升都是由20.0g葡萄糖、1.0g蛋白胨、3.0g酵母膏、3.0g磷酸二氢钾、1.5g硫酸镁、10mg VB₁和余量的水制成。

本实施方式深层发酵分两阶段进行，第一阶段深层发酵可以使接入的桦褐孔菌种子在静止的条件下萌发并向四周生长出幼嫩的菌丝，为下一阶段的深层发酵提供更多的发酵种子萌发点；第二阶段深层发酵将第一阶段的菌丝打碎成细小片段，这些细小的片段会各自生长成小的菌球，增加了培养的菌球个数，使菌球数量多、且大小均一，可增加菌丝体收率。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六的不同点是：步骤一中桦褐孔菌深层发酵培养基按质量百分比由0.2％～2.8％的羧甲基纤维素、0.2％～4.9％的葡萄糖、0.05％～1.8％的大豆粉、0.02％～1.9％的酵母膏、0.02％～0.98％的磷酸二氢钾、0.02％～0.99％的硫酸镁、0.01‰～0.05‰的维生素B₁和余量的水制成，桦褐孔菌深层发酵培养基pH值为4～6.8。其它步骤及参数与实施方式六相同。

本实施方式方法与现有专利技术进行对比(接种量均为10％)，实验结果如表1所示。

表1

实验结果说明采用本实施方式可显著提高桦褐孔菌的菌丝体收率和桦褐孔菌胞内多糖及桦褐孔菌胞外多糖的产量。

桦褐孔菌胞内多糖按下述步骤提取测定：

经深层发酵所得的桦褐孔菌菌丝体90℃烘干至恒重，然后将菌丝体粉碎，过120目筛，获得桦褐孔菌菌粉；然后精确称取桦褐孔菌菌粉1.000g，按1g桦褐孔菌菌粉加40mL蒸馏水的比例加入蒸馏水，再在80℃温度下煮1.5h(提取)，提取2次，合并提取液，以苯酚-硫酸法测定提取液总糖，DNS法测定提取液中的还原糖。总糖减去还原糖即为胞内多糖。

桦褐孔菌胞外多糖按下述步骤提取测定：

取深层发酵液用200目尼龙网过滤除掉菌丝体，取上清液，以苯酚-硫酸法测定发酵液总糖，DNS法测定发酵液中的还原糖。总糖减去还原糖即为胞外多糖。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六的不同点是：步骤一中桦褐孔菌深层发酵培养基按质量百分比由0.1％～3.0％的羧甲基纤维素、0.1％～5.0％的葡萄糖、0.01％～2.0％的大豆粉、0.01％～2.0％的酵母膏、0.01％～1.0％的磷酸二氢钾、0.01％～1.0％的硫酸镁和余量的水制成，桦褐孔菌深层发酵培养基pH值为3～7。其它步骤及参数与实施方式六相同。

本实施方式方法与现有专利技术进行对比(接种量均为10％)，实验结果如表2所示。

表2

实验结果说明采用本实施方式可显著提高桦褐孔菌的菌丝体收率和桦褐孔菌胞内多糖及桦褐孔菌胞外多糖的产量。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式六的不同点是：步骤一中桦褐孔菌深层发酵培养基按质量百分比由0.5％～2.5％的羧甲基纤维素、0.5％～4.5％的葡萄糖、0.1％～1.5％的大豆粉、0.05％～1.5％的酵母膏、0.05％～0.95％的磷酸二氢钾、0.05％～0.95％的硫酸镁、0.02‰～0.04‰的维生素B₁和余量的水制成，桦褐孔菌深层发酵培养基pH值为5.5～6.5。其它步骤及参数与实施方式六相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式六、七、八或九的不同点是：步骤一中羧甲基纤维素的分子量为5000～8000。其它步骤及参数与实施方式六、七、八或九相同。

Claims (6)

1.一种桦褐孔菌深层发酵培养基，其特征在于桦褐孔菌深层发酵培养基按质量百分比由0.1％～3.0％的羧甲基纤维素、0.1％～5.0％的葡萄糖、0.01％～2.0％的大豆粉、0.01％～2.0％的酵母膏、0.01％～1.0％的磷酸二氢钾、0.01％～1.0％的硫酸镁、0％～0.05‰的维生素B₁和余量的水制成，桦褐孔菌深层发酵培养基pH值为3～7。

2.根据权利要求1所述的一种桦褐孔菌深层发酵培养基，其特征在于桦褐孔菌深层发酵培养基按质量百分比由0.2％～2.8％的羧甲基纤维素、0.2％～4.9％的葡萄糖、0.05％～1.8％的大豆粉、0.02％～1.9％的酵母膏、0.02％～0.98％的磷酸二氢钾、0.02％～0.99％的硫酸镁、0.01‰～0.05‰的维生素B₁和余量的水制成，桦褐孔菌深层发酵培养基pH值为4～6.8。

3.根据权利要求1所述的一种桦褐孔菌深层发酵培养基，其特征在于桦褐孔菌深层发酵培养基按质量百分比由0.5％～2.5％的羧甲基纤维素、0.5％～4.5％的葡萄糖、0.1％～1.5％的大豆粉、0.05％～1.5％的酵母膏、0.05％～0.95％的磷酸二氢钾、0.05％～0.95％的硫酸镁、0.02‰～0.04‰的维生素B₁和余量的水制成，桦褐孔菌深层发酵培养基pH值为5.5～6.5。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种桦褐孔菌深层发酵培养基，其特征在于羧甲基纤维素的分子量为5000～8000。

5.桦褐孔菌的深层发酵方法，其特征在于桦褐孔菌的深层发酵按以下步骤实施：

一、配制桦褐孔菌深层发酵培养基：桦褐孔菌深层发酵培养基按质量百分比由0.1％～3.0％的羧甲基纤维素、0.1％～5.0％的葡萄糖、0.01％～2.0％的大豆粉、0.01％～2.0％的酵母膏、0.01％～1.0％的磷酸二氢钾、0.01％～1.0％的硫酸镁、0％～0.05‰的维生素B₁和余量的水制成，并调节桦褐孔菌深层发酵培养基pH值为3～7，桦褐孔菌深层发酵培养基装样量为深层发酵罐容积的1/5～3/5；

二、接种桦褐孔菌：接种桦褐孔菌发酵种子液，接种量为2％～15％；

三、分两阶段深层发酵：第一阶段静止发酵，静止发酵时间为0.5～5天，静止发酵温度控制为23～34℃；第二阶段摇床发酵，摇床发酵时间为3～10天，摇床发酵温度控制为23～34℃，摇床转速为60～180r/min；即完成桦褐孔菌的深层发酵。

6.根据权利要求5所述的桦褐孔菌的深层发酵方法，其特征在于步骤一中羧甲基纤维素的分子量为5000～8000。