CN107189996A - 一种利用桦褐孔菌固体发酵农林废弃物生产酸性纤维素酶的工艺 - Google Patents

一种利用桦褐孔菌固体发酵农林废弃物生产酸性纤维素酶的工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用桦褐孔菌固体发酵农林废弃物生产酸性纤维素酶的工艺，包括（1）菌种活化，（2）液体菌种培养，（3）固体发酵，（4）酸性纤维素酶分离步骤。本发明设备投资少,后处理简单,基本无污染,成本低，生产的纤维素酶具有较好的pH耐受性和温度稳定性。

Description

一种利用桦褐孔菌固体发酵农林废弃物生产酸性纤维素酶的 工艺
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，特别涉及一种利用桦褐孔菌固体发酵农林废弃物生产酸性纤维素酶的工艺。
背景技术
植物纤维在自然界中普遍存在，而大部分的植物纤维因无法分解利用而废弃，如果这些纤维素能被合理利用，不仅可以作为新资源、新能源为人类造福，同时也可以缓解或解决农作物资源对环境的污染问题，具有重大的战略意义。
纤维素分子是由β-2D葡萄糖分子以β-1,4糖苷键结合形成的链状聚合物,所以很难分解。纤维素酶可以将纤维素最终水解成葡萄糖。而纤维素酶一般只在微生物体内产生很少一部分动物也可以产生纤维素酶。目前纤维素的降解一般是由微生物分解实现的，现在人们正在研究利用微生物产生的纤维素酶分解纤维素产生葡萄糖，再以葡萄糖为原料生产其他物质。这已经成为一个热门话题，当前研究较多的能够降解天然纤维的微生物主要是木霉、青霉、曲霉和白腐菌等真菌， 主要原因是这类真菌产纤维素酶系较全，能较好地降解天然纤维素。但研究野生纤维素酶产出菌主要存在两个问题，一是产纤维素酶的菌株的产酶量低， 二是产生的纤维素酶的活力不高，也就是分解纤维素的能力较弱。人们主要是通过菌种筛选、基因克隆等手段来提高酶的产量和活力，以降低产酶成本，改进酶的回收利用，二是改变天然纤维素酶的结构， 以提高其对酶作用的敏感性。并且自然界中废弃的植物纤维资源用于生产蛋白饲料的研究也是目前的热点之一， 利用高效降解植物纤维的纤维素酶进行预处理后再经过微生物发酵能够有效提高植物原料中的蛋白含量用于饲料成分，具有重要的应用价值。
在微生物发酵的过程中，纤维素酶产生菌的产酶能力低且质量不稳定是目前纤维素酶研究与实际应用的主要瓶颈，如何有针对性的提高纤维素酶活性的技术还有待提高:现在的研究渠道显示，纤维素酶能够在其它工程菌中得以表达，但是怎样研究出一套既能表达纤维素酶又能使其具有良好的热稳定性和低的末端产物抑制调节以及高产量的研究方案，是现在研究者探讨的问题: 尤其现在我国的纤维素酶还大量依靠于国外进口，其价格非常昂贵，大大限制了其应用范围, 生产国产化的纤维素酶以及降低纤维素酶的生产成本还是一个急待解决的问题。而要想进一步提高纤维素酶的分泌能力， 除选育优良菌株外还必须对培养基中的各种营养成分及发酵条件进行优化，以实现目标产物的大幅度积累。
随着科学领域的不断发展，将有望选育出高产率、低成本的优良生产菌株。至今尚未报道有关白腐真菌桦褐孔菌固体发酵生产纤维素酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用桦褐孔菌固体发酵农林废弃物生产酸性纤维素酶的工艺，设备投资少,后处理简单,基本无污染,成本低，生产的纤维素酶具有较好的pH耐受性和温度稳定性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种利用桦褐孔菌固体发酵农林废弃物生产酸性纤维素酶的工艺，包括如下步骤：
（1）菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，接种至斜面菌种培养基上培养，获得活化菌种；
（2）液体菌种培养：将活化菌种转入种子培养基中，28℃下摇床转速150转/分钟的条件下摇床培养3天得液体菌种；
（3）固体发酵：将液体菌种接种至固体发酵培养基中，控制初始pH至3.5-9.0，24-32℃下发酵培养10-15天；所述固体发酵培养基由农林废弃物与营养盐溶液按 1g:1-4mL的配比， pH 6.0，充分搅拌，121℃湿热灭菌20min而得；
（4）酸性纤维素酶分离：发酵结束后，按照每1g发酵产物干重加10mL醋酸-醋酸钠缓冲液的配比加入浓度50mM的 pH5.0醋酸-醋酸钠缓冲液，搅拌混合均匀，在28℃下振荡浸提1h，4000r/min离心5min，透析，冷冻干燥。
作为优选，所述农林废弃物为麸皮、玉米芯、榉木、柚子皮、豆粕、甘蔗渣、木薯皮、花生壳中的一种或几种。
作为优选，所述的营养盐溶液配方为：(NH4)2SO4 1.7g，KH2PO4 2g，CaCl2 0.3g，蛋白胨1 g， Tween-80 2mL，MgSO4 0.3 g， 蒸馏水1000mL，微量元素混合液1mL；所述微量元素混合液每毫升含：FeSO4 0.005mg，MnSO4 0.002mg， ZnSO4·7H2O 0.0016mg，CoCl20.0014mg。本发明针对桦褐孔菌固体发酵，设计了特定的营养盐溶液配方以适合固体发酵所需。其中，添加的Tween-80是一种表面活性剂，在本发明中还具有诱导剂的作用，加入Tween-80促进了酸性纤维素酶的产生。
作为优选，步骤（3）中液体菌种的接种量为每1g农林废弃物加0.1-0.8mL。
作为优选，所述种子培养基组成为：KH2PO4 0.3g，MgSO4 0.2 g，酵母浸膏 3 g，蛋白胨0.5 g ，葡萄糖10 g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃湿热灭菌20min。
作为优选，所述斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6。
作为优选，斜面菌种培养基上培养的参数为：温度27-28℃，培养200-250小时。
作为优选，所述酸性纤维素酶最适反应温度范围为40℃-60℃，最适反应pH范围为3.0-4.0。
一种酸性纤维素酶的应用，所述酸性纤维素酶用于稻秆和麦秆的降解糖化。
本发明的有益效果是：
固体发酵相比较液体发酵具有设备投资少,后处理简单,基本无污染,成本低等优点。
利用农林废弃物作为发酵培养基原料, 节约了能源和材料, 做到了废物利用，改善环境，又有效降低了纤维素酶制备的成本。该措施遵从了我国节约资源和保护环境的基本国策， 遵循了尊重自然、顺应自然、保护自然的理念。
本发明公开的产纤维素酶的白腐真菌桦褐孔菌在较广泛的pH条件下均可产CMCase、滤纸纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。
本发明生产的纤维素酶具有较好的pH耐受性和温度稳定性。
本发明生产的纤维素酶能用于稻秆、麦秆的降解糖化。
附图说明
图1是不同木质纤维素对固体发酵产酶的影响。
图2是接种量对固体发酵产酶的影响。
图3是不同初始pH对固体发酵产酶的影响。
图4是水料比对固体发酵产酶的影响。
图5是培养基及培养条件优化后桦褐孔菌的产酶曲线。
图6是酶促反应温度与酶活力的关系。
图7是酶促反应pH与酶活力的关系。
图8是酸性纤维素酶热稳定性。
图9是在酸性纤维素酶作用下的稻秆、麦秆随时间变化的糖化曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例：
一种利用桦褐孔菌固体发酵农林废弃物生产酸性纤维素酶的工艺，包括如下步骤：
（1）菌种活化：以桦褐孔菌为菌种（市售），接种至斜面菌种培养基上培养，获得活化菌种；所述斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6，斜面菌种培养基上培养的参数为：温度27-28℃，培养200-250小时。
（2）液体菌种培养：将活化菌种转入种子培养基中，28℃下摇床转速150转/分钟的条件下摇床培养3天得液体菌种；所述种子培养基组成为：KH2PO4 0.3g，MgSO4 0.2 g，酵母浸膏 3 g，蛋白胨0.5 g ，葡萄糖10 g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃湿热灭菌20min。
（3）固体发酵：将液体菌种接种至固体发酵培养基中，液体菌种的接种量为每1g农林废弃物加0.1-0.8mL，控制初始pH至3.5-9.0，24-32℃下发酵培养10-15天；所述固体发酵培养基由农林废弃物与营养盐溶液按 1g:1-4mL的配比， pH 6.0，充分搅拌，121℃湿热灭菌20min而得；所述农林废弃物为麸皮、玉米芯、榉木、柚子皮、豆粕、甘蔗渣、木薯皮、花生壳中的一种或几种。所述的营养盐溶液配方为：(NH4)2SO4 1.7g，KH2PO4 2g，CaCl2 0.3g，蛋白胨1 g， Tween-80 2mL，MgSO4 0.3 g， 蒸馏水1000mL，微量元素混合液1mL；所述微量元素混合液每毫升含：FeSO4 0.005mg，MnSO4 0.002mg， ZnSO4·7H2O 0.0016mg，CoCl20.0014mg。
（4）酸性纤维素酶分离：发酵结束后，按照每1g发酵产物干重加10mL醋酸-醋酸钠缓冲液的配比加入浓度50mM的 pH5.0醋酸-醋酸钠缓冲液，搅拌混合均匀，在28℃下振荡浸提1h，4000r/min离心5min，透析，冷冻干燥。
工艺优化：
1、固体发酵条件优化
不同木质纤维素对固体发酵产酶的影响：向250mL锥形瓶中分别加入5g不同种类的农林废弃物（麸皮、玉米芯、榉木、柚子皮、豆粕、甘蔗渣、木薯皮、花生壳），2mL的接种量，于28℃、150r/min恒温摇床培养7d后测定酶活。根据CMCase、滤纸纤维素酶、β-葡萄糖苷酶活的方法测定不同农林废弃物对酶活力的影响，确定最佳农林废弃物。如图1所示，麸皮为最佳的底物。
接种量对固体发酵产酶的影响：在已优化的培养基中，分别按0.5 mL、1 mL、1.5mL、2 mL、2.5 mL、3 mL、3.5 mL、4 mL的接种量接入液体菌种，28℃、150r/min恒温摇床培养7d后测定酶活，根据CMCase、滤纸纤维素酶、β-葡萄糖苷酶活, 确定不同接种量对发酵产纤维素酶的影响。如图2所示，最适接种量为2 mL。
不同初始pH对固体发酵产酶的影响：在已优化的培养基中，调节培养基的初始酸碱值，使pH分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0, 于28℃、150r/min恒温摇床培养7d后测定酶活, 根据CMCase、滤纸纤维素酶、β-葡萄糖苷酶活力，确定最佳初始pH值。如图3所示，最佳初始pH值为6.0。
水料比对固体发酵产酶的影响 在已优化的培养基中, 分别加入5 mL、7.5 mL、10mL、12.5 mL、15 mL、17.5 mL、20 mL 改良Mandels’营养盐溶液，使各水平的水料比 ( 营养盐溶液体积 /mL: 农林废弃物质量/g ) 分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0, 于28℃、150r/min恒温摇床培养7d后测定酶活,根据CMCase、滤纸纤维素酶、β-葡萄糖苷酶活力,确定最佳水料比。如图4所示，最佳水料比为1:2.5。
2、培养基及培养条件优化后白腐真菌桦褐孔菌的产酶曲线
向前面实验优化得到的发酵培养基中，接入液体菌种，于28℃、150r/min恒温摇床培养，每隔24h取样测定固态发酵中产酶（CMCase、滤纸纤维素酶、β-葡萄糖苷酶）。结果如图5所示，当培养至第10d时,CMCase和FPase酶活达到最大,分别为27.15 IU/g, 3.16 IU/g ,而β-Glucosidase在第12d 酶活力达到最大,为2.53 IU/g。
酶促反应温度对纤维素酶活力的影响：在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃和80℃条件下分别进行酶促反应,并测定相对酶活。如图6所示，CMCase、FPase和β-Glucosidase的最适反应温度分别为55℃,40℃和60℃。
酶促反应pH对纤维素酶活力的影响：在pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的条件下分别进行酶促反应，并测定相对酶活。如图7所示，CMCase、FPase和β-Glucosidase的最适反应pH分别为3.5, 4.0和3.5。
纤维素酶的温度稳定性：粗酶液在50℃条件下分别保温30 min、60min、90 min、120 min、180 min、240 min、300 min、360 min 、420 min 、480 min 、540 min 、600 min、660 min、720 min、1440 min、2880 min和3000 min后, 在50℃条件下进行酶促反应，测定相对酶活。如图8所示，在50℃下处理60min, 具有50﹪的β-Glucosidase酶活; 在50℃下处理90min, FPase酶能够保持53﹪的酶活; 在50℃下处理720min, CMCase酶依然具有54﹪的酶活力。由此认为, 该酶具有良好的热稳定性。
稻秆、麦秆随时间变化的糖化曲线：精确称取1g生物质材料(干基)放入100 mL 的锥形瓶中，按5 FPU/g的量添加纤维素酶到每个锥形瓶中，加入10 mL磷酸盐缓冲液 (50mM, pH 5.0), 0.005%叠氮化钠作为抑菌剂。50℃培养箱中以150 r/min的转速震荡反应48小时进行酶解。如图9所示，取发酵培养12天的粗酶液降解稻秆、麦秆产糖能力最强, 分别达125.362 mg/g, 130.244 mg/g底物。
经优化，当农林废弃物为麸皮，接种量为2mL，水料比为1:2.5，初始pH 6.0时, 摇床28℃培养至第10d, CMCase和FPase酶活达到最大，分别为27.15 IU/g和3.16 IU/g; 而培养至第12d，β-葡萄糖苷酶达到最高活性，为2.53 IU/g。
桦褐孔菌菌株在较广泛的pH条件下均可产CMCase、滤纸纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，特别是在碱性条件下仍具有产纤维素酶的能力。
该纤维素酶的最适pH为3.5, 在pH 3.0-5.0范围内, 纤维素酶 ( CMCase、FPase和β-Glucosidase）能够维持其60%以上的酶活； CMCase、FPase和β-Glucosidase的最适反应温度分别为55℃， 40℃和60℃； 在50℃下处理60min，具有50﹪的β-Glucosidase酶活；在50℃下处理90min， FPase酶能够保持53%的酶活；在50℃下处理720min, CMCase酶依然具有54%的酶活力。由此认为，该酶是酸性纤维素酶， 且具有良好的热稳定性。对稻秆、麦秆的水解糖化效果显著。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (9)

1.一种利用桦褐孔菌固体发酵农林废弃物生产酸性纤维素酶的工艺，其特征在于，包括如下步骤：
（1）菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，接种至斜面菌种培养基上培养，获得活化菌种；
（2）液体菌种培养：将活化菌种转入种子培养基中，28℃下摇床转速150转/分钟的条件下摇床培养3天得液体菌种；
（3）固体发酵：将液体菌种接种至固体发酵培养基中，控制初始pH至3.5-9.0，24-32℃下发酵培养10-15天；所述固体发酵培养基由农林废弃物与营养盐溶液按 1g:1-4mL的配比， pH 6.0，充分搅拌，121℃湿热灭菌20min而得；
（4）酸性纤维素酶分离：发酵结束后，按照每1g发酵产物干重加10mL醋酸-醋酸钠缓冲液的配比加入浓度50mM的 pH5.0醋酸-醋酸钠缓冲液，搅拌混合均匀，在28℃下振荡浸提1h，4000r/min离心5min，透析，冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的一种利用桦褐孔菌固体发酵农林废弃物生产酸性纤维素酶的工艺，其特征在于，所述农林废弃物为麸皮、玉米芯、榉木、柚子皮、豆粕、甘蔗渣、木薯皮、花生壳中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种利用桦褐孔菌固体发酵农林废弃物生产酸性纤维素酶的工艺，其特征在于，所述的营养盐溶液配方为：(NH4)2SO4 1.7g，KH2PO4 2g，CaCl2 0.3g，蛋白胨1 g， Tween-80 2mL，MgSO4 0.3 g， 蒸馏水1000mL，微量元素混合液1mL；所述微量元素混合液每毫升含：FeSO4 0.005mg，MnSO4 0.002mg， ZnSO4·7H2O 0.0016mg，CoCl20.0014mg。
4.根据权利要求1所述的一种利用桦褐孔菌固体发酵农林废弃物生产酸性纤维素酶的工艺，其特征在于，步骤（3）中液体菌种的接种量为每1g农林废弃物加0.1-0.8mL。
5.根据权利要求1所述的一种利用桦褐孔菌固体发酵农林废弃物生产酸性纤维素酶的工艺，其特征在于，所述种子培养基组成为：KH2PO4 0.3g，MgSO4 0.2 g，酵母浸膏 3 g，蛋白胨0.5 g ，葡萄糖10 g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃湿热灭菌20min。
6.根据权利要求1所述的一种利用桦褐孔菌固体发酵农林废弃物生产酸性纤维素酶的工艺，其特征在于，所述斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6。
7.根据权利要求6所述的一种利用桦褐孔菌固体发酵农林废弃物生产酸性纤维素酶的工艺，其特征在于，斜面菌种培养基上培养的参数为：温度27-28℃，培养200-250小时。
8.根据权利要求1所述的一种利用桦褐孔菌固体发酵农林废弃物生产酸性纤维素酶的工艺，其特征在于，所述酸性纤维素酶最适反应温度范围为40℃-60℃，最适反应pH范围为3.0-4.0。
9.一种利用权利要求1的工艺生产的酸性纤维素酶的应用，其特征在于，所述酸性纤维素酶用于稻秆和麦秆的降解糖化。
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曹思思等: "桦褐孔菌与玉米须双向固体发酵工艺优化研究", 《中医药信息》 *

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CN107189996B (zh) 2020-10-20

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