CN102234639A - 基于调节培养基中溶解氧压力振荡以生产纤维素酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于调节培养基中溶解氧压力振荡以生产纤维素酶的方法。具体地，本发明涉及一种在搅拌的和通气的生物反应器中通过分解纤维素的微生物来生产分解纤维素的和/或分解半纤维素的酶的方法，该方法包括在碳源存在下的生长阶段和在含碳诱导底物存在下的生产阶段，其中在生产阶段过程中含碳诱导底物的供给是通过培养基中溶解氧分压的振荡来调节的。

Description

基于调节培养基中溶解氧压力振荡以生产纤维素酶的方法
技术领域
本发明涉及一种生产用于木质纤维素生物质水解的酶的方法。 
背景技术
木质纤维素生物质的特征在于由三种主要的聚合物：纤维素、半纤维素和木质素组成的复杂的结构。纤维素和可能地半纤维素是酶促水解的靶，但是它们不可直接接近酶。 
因此，在酶促水解阶段之前这些底物必须经过预处理。所述预处理的目的在于修饰木质纤维素材料的物理的和物理化学的性质，以提高截留在木质素和半纤维素基质中的纤维素的可接近性。这些预处理可以是不同的类型：酸法煮沸(acidic boiling)、碱法煮沸(alkaline boiling)、蒸爆(steam explosion)或者有机溶剂(Organosolv)过程可以被提及。 
酶促水解阶段允许使用分解纤维素的和/或分解半纤维素的(hemicellulolytic)酶使纤维素和半纤维素转化为糖。微生物生产这些显著含有纤维素酶和半纤维素酶的酶，所生产的这些酶适合于完全水解纤维素和半纤维素，所述微生物例如属于木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)或者裂褶菌属(Schizophyllum)的真菌，或者例如属于梭状芽孢杆菌属(Clostridium)的厌氧细菌。 
通过木质纤维素生物质水解所得到的糖是戊糖(主要为木糖和阿拉伯糖)、二糖类(纤维二糖)和葡萄糖，其可以被微生物发酵。例如，在酒精发酵阶段过程中，通过啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)酵母可以容易地将葡萄糖转化为乙醇。 
最后，蒸馏阶段允许从发酵葡萄汁中分离和回收这样所得到的发酵产物，在前面的实例中这样所得到的发酵产物是乙醇。 
各种技术经济(technico-economic)研究显示为了使所生产的乙醇的成本达到接近于从淀粉中获得的乙醇的值，必须降低与酶促水解阶段相关的成本。 
降低成本的一种方法在于最优化纤维素酶生产方法的操作条件，以便于增 加生产力或者得到具有提高的比活性的酶的混合物。 
纤维素酶生产中最普遍使用的微生物是丝状的里氏木霉(Trichoderma reesei)真菌。在诱导底物(例如纤维素或者乳糖)存在的情况下，野生菌株有分泌例如适于纤维素水解的酶复合物的能力。所述酶复合物的酶包括三种主要类型的活性：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和纤维二糖酶。 
对于纤维素酶在反应器中的生产来说，复杂的纤维素酶合成调节机制需要特殊的仪器。采用对分解代谢阻抑不敏感的菌株和能大规模使用的可溶性诱导底物(例如：乳糖)已经允许获得有效的生产，所述有效的生产约为根据Bioresource Technol.(1992)39，125-130中描述的方法，通过里氏木霉(T.reesei)CL 847的40g/L细胞外的蛋白质。在这个方法中，在两个阶段发生发酵，里氏木霉(T.reesei)细胞的分批生产的第一个阶段和以防止在培养基中积累的速度补料分批供给诱导物的第二个阶段。 
对于酶生产来说微生物的生理状态并不总是保持在其最优水平，在一些情况中观察到无效细胞生长的现象，或者导致酶生产力降低的不需要的细胞的溶胞作用或者孢子形成。最优生产状态和不需要的生理状态之间的平衡是相当敏感的。Bailey等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.2003，62：156-162)已经显示出当细胞处于接近于在培养基中含碳底物限制的状态时，纤维素酶的生产力是最优的。已经建议采用监控用于pH控制的基本消耗速度来添加含碳底物的方法。 
此外，在专利EP-B1-0,448,430中描述的方法要求最优的糖供给率为35-45mg.g-1.h-1。事实上，过高的供给率导致培养基中含碳底物的积累，所述含碳底物的积累导致代谢朝向生物质生产而不是酶生产的方向变化。另一方面，过低的供给率导致生物质裂解和生产损失。此外，里氏木霉(Trichoderma reesei)分泌更多的蛋白酶，再消耗部分所生产的纤维素酶。 
本发明提供了一种对于酶生产来说允许使微生物保持在对应于其最优水平的状态的方法。 
发明内容
本发明提供了一种生产分解纤维素的和/或分解半纤维素的酶的方法，其中生产阶段所需要的含碳诱导底物的供给是通过培养基中溶解氧压力的振荡来调节的。 
附图说明
图1显示出培养基中溶解氧压力作为时间函数的记录，以及含碳底物的供给率。 
具体实施方式
本发明涉及一种在搅拌的和通气的生物反应器中通过分解纤维素的微生物来生产分解纤维素的和/或分解半纤维素的酶的方法，该方法包括在碳源存在下的生长阶段和在含碳诱导底物存在下的生产阶段，其中在生产阶段过程中含碳诱导底物的供给是根据生长培养基中的溶解氧分压来调节的，所述的压力振荡介于Po2min和Po2max两个值之间，Po2min的值高于在其下微生物活性受影响的临界压力Po2critical，且低于启动生物反应器时设置的饱和氧分压Po2sat的95％，并且Po2max的值比Po2min至少高5％，培养基中溶解氧分压一高于Po2max值，就启动含碳诱导底物的添加，且培养基中溶解氧压力一低于Po2min值，就终止含碳诱导底物的添加。 
这个方法允许在保持细胞处于最优生产力阶段的同时，最优化分解纤维素的和/或分解半纤维素的酶的生产。 
通过根据本发明所述的方法，生产显示出比活性最高达比采用常规生产方法所获得的酶的比活性高50％的酶的混合物是可能的，在常规生产方法中由恒定供给率施加碳限制。 
此外，这种方法提供了对仪器来说耐用和简单的优点。该方法也允许避免培养基中糖的积累，所述糖的积累导致生物质以酶生产为代价而形成。 
在与微生物菌株生长和酶生产相容的条件下，在搅拌的和通气的生物反应器中培养所用的微生物菌株。 
在发酵开始时，生物反应器处于氧饱和状态，且与饱和对应的溶解氧分压以Po2sat来表示。 
生长阶段所用的碳源被进料到生物反应器中，以使生产阶段开始时具有范围在15-60g/L之间的初始糖浓度。 
在生长阶段过程中，通气是以操作员选定的值来设定的，且氧分压Po2是通过搅拌以一定百分率的饱和压力来调节的，其中该百分率由操作员定义。培养基中的氧分压必须高于在其下微生物活性受影响的临界氧压力Po2critical。 
Po2critical的值对于本领域技术人员来说是公知的，且它依赖于所用的微生物。它可被定义为这样的压力，在该压力下通过降低细胞生存力或者降低目的代谢 物的生产而影响微生物的代谢。 
在生产阶段过程中，生物反应器的搅拌和通气是以预先确定的值来设定的，从而允许对于所述生物反应器而言具有与Kla值对应的充氧能力，所述Kla值取决于最初考虑的生物质，范围在50-150h-1之间。 
在根据本发明所述的方法中，在耗尽初始底物之后，引入含碳诱导底物：这是生产阶段的开始。氧消耗率与微生物所消耗的含碳诱导底物的消耗率成比例。 
因此，发酵罐中糖的小积累导致氧分压的下降。当测量的氧分压达到最小值Po2min时，系统调节终止含碳诱导底物的添加。此终止导致在含碳诱导底物浓度接近于微生物对于含碳底物的亲和常数Ks时所述含碳诱导底物消耗率的降低。此终止也导致氧消耗率的降低，所述氧消耗率的降低导致氧分压升高到Po2max值。当达到压力Po2max时，系统调节又启动含碳诱导底物供给泵。 
发酵培养基中溶解氧分压在Po2min和Po2max值之间振荡，所述Po2min和Po2max值是由操作员根据氧饱和压力Po2sat测定的，依赖于所使用的微生物菌株和/或发酵培养基。 
在Po2min和Po2max值之间振荡的振幅调节时间间隔，所述时间间隔是含碳诱导底物被注射的时间和注射终止的时间之间的时间间隔。 
因此，细胞被保持在接近于碳限制(在接近于Ks的浓度)的状态，进而有利于分解纤维素的和/或分解半纤维素的酶的最优化生产。 
根据本发明的方法，培养基中溶解氧分压一高于Po2max值，就启动含碳诱导底物的添加，且培养基中溶解氧压力一低于Po2min值，就终止含碳诱导底物的添加。当启动生物感应器时，Po2min和Po2max值是根据氧临界压力和培养基中的氧饱和压力Po2sat所测定的。 
Po2min的值必须高于在其下微生物代谢受影响的临界压力Po2critical，且低于启动生物反应器时饱和氧分压Po2sat的95％。Po2min优选范围介于Po2sat的10-60％之间。 
Po2max的值必须比Po2min的值至少高5％。Po2max能代表氧分压Po2sat的100％。Po2max优选范围介于Po2sat的30-70％之间。 
根据更优选的实施方案，Po2max优选范围介于Po2sat的40-60％之间，且Po2min优选范围介于Po2sat的30-50％之间。 
含碳诱导底物选自乳糖、木糖、纤维二糖、槐糖、纤维素生物质的酶促水解产物的单体糖的酒精发酵后所得到的残余物和/或来自于纤维素生物质预处理的水溶性戊糖的粗提物。 
根据优选的实施方案，底物是在溶液中被供给的。 
制备10-800g/L的浓度，优选150-600g/L的水溶液，所述水溶液包含酶生产阶段所选择的含碳诱导底物。 
包含含碳诱导底物的水溶液优选是乳糖溶液。 
有利地，采用250g/L的乳糖溶液。 
分批阶段过程中所使用的含碳底物选自葡萄糖、半乳糖、甘油、纤维素生物质的酶促水解产物的单体糖的酒精发酵后所得到的残余物和/或来自于纤维素生物质预处理的水溶性戊糖的粗提物。 
分解纤维素的微生物选自真菌或者其它修饰的微生物(酵母、细菌)。优选，分解纤维素的微生物属于木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)或者裂褶菌属(Schizophyllum)，且更优选属于里氏木霉(Trichoderma reesei)物种。 
本发明所描述的方法提供了根据培养基中的溶解氧分压调节含碳诱导底物的供给。根据由在出口测量的气体组成所计算的二氧化碳生产率或者双氧消耗率的调节将会是实现本发明的等同手段。 
实施例
在下列实施例中，实施例1呈现了参考发酵，所述参考发酵用乳糖作为生产含碳底物，采用35-45mg.g-1.h-1的最优供给率，从而允许达到高的蛋白质生产。 
实施例2呈现了相同的实验，所述实验在生产阶段过程中采用两倍的含碳底物供给率。此实施例已导致大的生物质积累。它显示出当含碳底物供给率高于最优供给率时涉及的风险。 
实施例3-5与本发明的方法相一致。实施例3采用与实施例1相同的供给率，而实施例4采用与实施例2相同的供给率。后一个实施例显示出该方法的耐用性，这是因为该方法导致了高蛋白质生产以及在生产阶段过程中没有观察到生物质积累。实施例5阐明了更大的振荡范围。 
实施例1(比较的)：根据专利FR-B-2,811,753所描述的常规发酵方法所进行的酶生产 
纤维素酶的生产是在机械搅拌的发酵罐中实现的。矿质培养基有下列组成：KOH 1.66g/L、85％H3PO4 2mL/L、(NH4)2SO4 2.8g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、CaCl20.6g/L、MnSO4 3.2mg/L、ZnSO4·7H2O 2.8mg/L、CoCl2 104.0mg/L、FeSO4·7H2O10mg/L、玉米浆(com steep)1.2g/L、消泡剂0.5mL/L。 
含有矿质培养基的发酵罐在120℃灭菌20分钟，葡萄糖含碳源在120℃单独灭菌20分钟，然后被无菌添加到发酵罐中以使其具有15g/L的终浓度。向发酵罐中接种10％(v/v)CL847里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株的液体预培养物(preculture)。预培养物的矿质培养基中除了添加5g/L邻苯二甲酸钾作为pH缓冲剂之外，其它与发酵罐中的矿质培养基相同。预培养物真菌生长是用30g/L浓度的葡萄糖作为含碳底物实现的。接种物生长持续2-3天，且该接种物生长是在28℃在搅拌的培养箱中实现的。如果剩余的葡萄糖浓度低于15g/L就转移到发酵罐中。 
在生物反应器中实施的该实验包括两个阶段： 
-葡萄糖含碳底物(初始浓度15g/L)上、温度27℃和pH值4.8(通过5.5M氨来调节)的生长阶段。通气是0.5vvm(体积/体积/分钟(volume/volume/minute))，且培养基中的溶解氧分压是Po2sat的40％。 
-酶生产阶段。当发酵罐中的初始底物被耗尽时，以对应于每小时每克细胞35-45mg的供给率的2mL/h连续注射250g/L的乳糖溶液进行最高达200小时。温度低于25℃，且保持pH值为4直到培养结束。pH值是通过添加5.5N氨溶液来调节的，所述氨溶液提供了分泌的蛋白质的合成所需要的氮。保持溶解氧含量为Po2sat的40％。 
在通过过滤或离心分离菌丝体后，酶生产通过借助于劳里方法(Lowry method)和BSA标准(BSA standard)测定细胞外蛋白质的浓度进行监控。所测定的分解纤维素的活性是： 
-滤纸活性(FPU：滤纸单位)，该活性允许测定内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶酶池的全部活性； 
-芳基β-葡糖苷酶活性。 
FPU活性在Whatman 1号纸上(由IUPAC生物技术委员会(IUPAC Commission of Biotechnology)推荐的程序)以50g/L的初始浓度进行测量；测定待分析的酶溶液的测试样品，所述酶溶液在60分钟内释放2g/L葡萄糖(比 色测定)的等价物。滤纸活性的原理是通过DNS(二硝基水杨酸)方法测定从Whatman 1号纸上释放的还原的糖量。 
测定芳基β-葡糖苷酶活性所使用的底物是对硝基苯β-D-吡喃葡糖苷(PNPG)。它是通过释放对硝基酚的β-葡糖苷酶切割的。 
定义芳基β-葡糖苷酶活性单位为：每分钟从PNPG生产1μmol对硝基酚所需要的酶量，且它是以IU/mL表示的。 
比活性是通过将以IU/mL表示的活性除以蛋白质浓度得到的。它们是以IU/mg表示的。 
最终的分析测定必须给出下列结果： 
生物质g/L 14.5 
蛋白质g/L 35.6 
FPU IU/mL 18.7 
比FPU IU/mg 0.52 
比芳基β-葡糖苷酶IU/mg 0.95。 
实施例2(比较的)：与实施例1相比，在补料分批阶段过程中以两倍的含碳底物供给率进行的酶生产 
在与实施例1相同的条件下实施酶生产。生长30小时后，耗尽初始底物之后，以与实施例1的实验相比两倍(4mL/h代替2mL/h)的供给率注射补料分批溶液。这导致显著的生物质形成以及低的蛋白质产量。与消耗的含碳底物相关的蛋白质的生产得率是0.1g/g，然而在实施例1中该生产得率是0.3g/g。 
最终的分析测定必须给出下列结果： 
生物质g/L 35.4 
蛋白质g/L 16.8 
FPU IU/mL 11.7 
比FPU IU/mg 0.70 
比芳基β-葡糖苷酶IU/mg 2.02。 
实施例3(根据本发明)：通过调节培养基中溶解氧分压来调节糖的供给而进行的酶生产(供给率2mL/h) 
在与实施例1相同的条件下实施酶生产。在耗尽生长阶段的含碳底物之后，保持通气流速为0.5vvm，并以800rpm搅拌，这在所使用的发酵罐的情况下允 许具有70h-1以上的Kla值。根据Po2的值供给含碳底物。当氧分压高于饱和氧压力的50％时，以2mL/h的供给率启动底物供给，且当氧分压低于饱和氧分压的40％时，终止底物供给(参见图1)。 
最终的分析测定必须给出下列结果： 
生物质g/L 13.5 
蛋白质g/L 40.6 
FPU IU/mL 28.1 
比FPU IU/mg 0.69 
比芳基β-葡糖苷酶IU/mg 1.97。 
与含碳底物相关的蛋白质的最终生产得率为0.4g/g。所生产的酶混合物的比活性FPase被提高了33％。 
实施例4：通过调节氧分压来调节糖的供给，以与实施例3相比两倍的供给率进行的酶生产(供给率4mL/h) 
在与实施例3相同的条件下实施酶生产。根据Po2的值供给含碳底物。当氧分压高于饱和氧压力的50％时，以4mL/h(代替2mL/h)的供给率启动底物供给，且当氧分压低于饱和氧压力的40％时，终止底物供给。这允许测试更大的糖供给的影响。 
本实施例显示出该方法的耐用性。由于调节，两倍供给率并没有导致如实施例2中的生物质积累。这意味着，即使供给盘中含碳底物浓度是可变的(这在工业规模中可能发生)，该方法自我调节并保持对于酶生产来说最优的供给率。 
最终的分析测定必须给出下列结果： 
生物质g/L 16.1 
蛋白质g/L 43.6 
FPU IU/mL 33.9 
比FPU IU/mg 0.78 
比芳基β-葡糖苷酶IU/mg 1.60。 
与含碳底物相关的蛋白质的最终生产得率为0.4g/g。与实施例1相比，所生产的酶混合物的比活性FPase被提高了50％。 
实施例5：通过20-80％之间氧分压的振荡调节糖的供给而进行的酶生产 
在与实施例4相同的条件下实施酶生产。根据Po2的值供给含碳底物。当氧分压高于饱和氧压力的80％时，以4mL/h的供给率启动底物供给，且当氧分压低于饱和氧压力的20％时，终止底物供给。这允许测试更宽振荡范围的影响。 
图1显示出Po2的振荡和补料分批溶液供给率。 
最终的分析测定必须给出下列结果： 
生物质g/L 13.6 
蛋白质g/L 21.8 
FPU IU/mL 20.4 
比FPU IU/mg 0.93 
比芳基β-葡糖苷酶IU/mg 2.14。 
由于注射的底物的量更小，所以蛋白质的最终生产得率更低。然而，可注意到酶混合物的比活性比实施例4(Po2的振荡介于40-50％之间)中酶混合物的比活性高。实施例4中所应用的条件更使人感兴趣，这是因为它们允许具有更高的生产力和得率。 

Claims (10)

1.在搅拌的和通气的生物反应器中通过分解纤维素的微生物生产分解纤维素的和/或分解半纤维素的酶的方法，该方法包括在碳源存在下的生长阶段和在含碳诱导底物存在下的生产阶段，其中生产阶段过程中含碳诱导底物的供给是根据生长培养基中的溶解氧分压调节的，所述的压力振荡介于Po2min和Po2max两个值之间，Po2min的值高于在其下微生物活性受影响的临界压力Po2critical，且低于启动生物反应器时设置的饱和氧分压Po2sat的95％，且Po2max的值比Po2min至少高5％，培养基中溶解氧分压一高于Po2max值，就启动含碳诱导底物的添加，且培养基中溶解氧压力一低于Po2min值，就终止含碳诱导底物的添加。
2.根据权利要求1的方法，其中Po2max范围介于Po2sat的30-70％之间，且Po2min范围介于Po2sat的10-60％之间。
3.根据权利要求2的方法，其中Po2max范围介于Po2sat的40-60％之间，且Po2min范围介于Po2sat的30-50％之间。
4.根据前面权利要求中的任意一项的方法，其中所述含碳诱导底物选自乳糖、木糖、纤维二糖、槐糖、纤维素生物质的酶促水解产物的单体糖的酒精发酵后所得到的残余物和/或来自于纤维素生物质预处理的水溶性戊糖的粗提物。
5.根据前面权利要求中的任意一项的方法，其中底物是在溶液中供给的。
6.根据权利要求5的方法，其中酶生产阶段所选择的含碳诱导底物的浓度为10-800g/L，优选浓度为150-600g/L。
7.根据权利要求5或6中任意一项的方法，其中所述含碳诱导底物是乳糖溶液，优选浓度为250g/L。
8.根据前面权利要求中的任意一项的方法，其中生物反应器的搅拌和通气是以预先确定的值来设定的，从而允许对于所述生物反应器而言具有范围在50-150h-1之间的充氧能力。
9.根据前面权利要求中的任意一项的方法，其中所述分解纤维素的微生物选自真菌，所述真菌属于木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)和裂褶菌属(Schizophyllum)。
10.根据权利要求9的方法，其中所述分解纤维素的微生物属于里氏木霉(Trichoderma reesei)物种。
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