BRPI1101054A2 - método de produção de celulase na regulação da oscilação da pressão do oxigênio dissolvido no meio de cultura - Google Patents

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Abstract

MéTODO DE PRODUçãO DE CELULASE NA REGULAçãO DA OSCILAçãO DA PRESSãO DO OXIGêNIO DISSOLVIDO NO MEIO DE CULTURA. A presente invenção refere-se a um método de produção de enzimas celuloliticas e/ ou hemiceluloliticas por meio de um micro-organismo celulolítico em um biorreator agitado e aerado, que compreende uma fase de crescimento na presença de uma fonte de carbono e uma fase de produção na presença de um substrato indutivo contendo carbono, em que o forneci- mento do substrato indutivo contendo carbono durante a fase de produção é regulado por meio de uma oscilação da pressão parcial de oxigênio dissolvido no meio.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE PRODUÇÃO DE CELULASE NA REGULAÇÃO DA OSCILAÇÃO DA PRESSÃO DO OXIGÊNIO DISSOLVIDO NO MEIO DE CULTURA".
Campo da Invenção
A invenção refere-se a um método de produção de enzimas para
a hidrólise da biomassa lignocelulósica. Antecedentes da Invenção
A biomassa lignocelulósica é caracterizada por uma estrutura complexa que consiste em três polímeros condutores: celulase, hemicelula- se e lignina. A celulase e possivelmente as hemicelulases são os alvos da hidrólise enzimática, mas elas não são diretamente acessíveis às enzimas.
Estes substratos por esse motivo têm de ser submetido a um pré-tratamento antes da fase de hidrólise enzimática. O pré-tratamento visa modificar as propriedades físicas e físico-químicas do material lignocelulósi- co a fim de melhorar a acessibilidade da celulase capturada na matriz de lig- nina e de hemicelulase. Estes pré-tratamentos podem ser de diferentes ti- pos: ebulição acídica, ebulição alcalina, explosão da corrente ou processos Organosolv podem ser mencionados.
A fase de hidrólise enzimática permite a celulase e as hemicelu- Iases ser convertida para açúcares empregando enzimas celulolíticas e/ ou hemicelulolíticas. Os micro-organismos, tais como, fungos pertencentes aos gêneros Tríchoderma, Aspergillus, Penicillium ou Schizophyllum, ou bacté- rias anaeróbicas pertencentes, por exemplo, ao gênero Clostrialium, produz três enzimas contendo notavelmente celulases e hemicelulases, adequada para a hidrólise total da celulase e das hemicelulases.
Os açúcares obtidos por meio da hidrólise da biomassa lignoce- lulósica são pentoses (principalmente xilose e arabinose), dissacarídeos (ce- lobiose) e glicose que podem ser fermentados por micro-organismos A glico- se pode, por exemplo, ser facilmente convertida em etanol pela levedura Saccharomyces cerevisiae durante a fase de fermentação alcoólica.
Finalmente, uma fase destilação permite separar e recuperar o produto de fermentação, deste modo obtido, etanol no caso anterior, a partir da fermentação necessária.
Vários estudos técnico-econômicos mostram a necessidade de reduzir o custo ligado com a fase de hidrólise enzimática a fim de levar o custo do etanol produzido a valores próximos ao do etanol obtido a partir do amido.
Um meio de diminuir os custos consiste na otimização das con- dições de operação do método de produção de celulase a fim de aumentar a produtividade ou para se obter um coquetel enzimático tendo uma atividade específica melhorada. O micro-organismo geralmente mais empregado para a produ-
ção de celulase é o fungo Trichoderma reesel filamentoso. As cepas selva- gens têm a capacidade de secretar, na presença de um substrato indutivo, tal como, celulase ou lactose, por exemplo, um complexo enzimático ade- quado para a hidrólise da celulase. As enzimas do complexo enzimático que compreende os três maiores tipos de atividades: endoglicanases, exoglica- nases e celabiases.
Os mecanismos complexos de regulação de síntese de celulase requerem implementações particulares para sua produção em um reator. Empregando cepas que não são sensíveis à repressão catabólica e substra- tos indutivos solúveis utilizável em uma larga escala, tal como, a lactose, tem permitido a obtenção de produções significantes da ordem de 40 g/L das proteínas extracelulares por T. reesel CL 847 de acordo com um método descrito em Bioresource Technol. (1992) 39, 125-130. Neste método, a fer- mentação ocorre em duas fases, uma primeira fase da produção em batela- da das células T. reels e uma segunda fase do fornecimento em batelada a- Iimentada do indutor em uma taxa prevenindo o seu acúmulo no meio.
O estado fisiológico do micro-organismo não sendo sempre mantido em seu nível ideal para a produção de enzima, os fenômenos de crescimento de células não produtivas, ou de Iise da célula indesejável ou esporulação levando a uma diminuição na produtividade de enzima, são ob- servados em alguns casos. O equilíbrio entre os estados ideais de produção e os estados fisiológicos indesejáveis é de preferência sensível. Balley e ou- tros, (Appl. Microbiol. Blatechnol. 2003 62: 156-162) têm mostrado que a produtividade das celulases é ideal quando as células estão em um estado próximo à limitação do substrato contendo carbono no meio. Um método de adição do substrato contendo carbono empregando o monitoramento da taxa básica de consumo empregada para o controle do pH tem sido proposto.
Além disso, o método descrito na patente EP-B1-D.448.430 re- quer uma taxa otimizada de fornecimento de açúcar de 35 a 45 mg.g"1.h"1. Na realidade, uma taxa muito alta de fornecimento causa um acúmulo do substrato contendo carbono no meio, que leva a uma alteração metabólica com relação à produção da biomassa ao invés da produção de enzima. Por outro lado, uma muito baixa taxa de fornecimento leva a Iise da biomassa e à perda de produção. Além disso, Thichoderma reesel excreta em seguida mais proteases reconsumindo parte das celulases produzidas.
A presente invenção fornece um método permitindo manter o micro-organismo no estado correspondente a seu nível ideal para a produ- ção de enzima. Sumário da Invenção
A invenção fornece um método de produção de enzimas celulolí- ticas e/ou hemicelulolíticas em que o fornecimento do substrato indutivo contendo carbono necessário para a fase de produção é regulado por meio de uma oscilação da pressão do oxigênio dissolvido no meio. Breve Descrição do Desenho
A figura 1 mostra o registro da pressão do oxigênio dissolvido no meio como uma função de tempo, bem como a taxa de fornecimento do substrato contendo carbono. Descrição Detalhada
A presente invenção se refere a um método de produção de en- zimas celulolíticas e/ ou hemicelulolíticas por meio de um micro-organismo celulolítico em um biorreator agitado e aerado, que compreende uma fase de crescimento na presença de uma fonte de carbono e uma fase de produção na presença de um substrato indutivo contendo carbono, em que o forneci- mento do substrato indutivo contendo carbono durante a fase de produção é regulado de acordo com a pressão parcial de oxigênio dissolvido no meio de crescimento, a referida pressão oscilando entre os dois valores da Po2min e da Po2max, o valor da Po2min sendo maior do que a pressão crítica da Po2Critica abaixo da qual a atividade do micro-organismo é afetada e de menos do que 95 % da pressão parcial do oxigênio de saturação da Po2sat estabelecida quando iniciando o biorreator, e o valor da Po2max sendo pelo menos 5 % maior do que a adição da Po2min do substrato indutivo contendo carbono sendo iniciada logo que a pressão parcial de oxigênio dissolvido no meio é maior do que o valor da Po2max e interrompida logo que a pressão do oxigê- nio dissolvido no meio é abaixo do valor da Po2min.
Este método permite otimizar a produção de enzimas celulolíti- cas e/ou hemicelulolíticas ao mesmo tempo que mantendo as células em uma fase ideal de produtividade.
Por meio do método de acordo com a invenção, é possível pro- duzir um coquetel enzimático exibindo uma atividade específica de até 50 % maior do que aquelas das enzimas obtidas com um método convencional de produção em que a limitação de carbono é imposta como uma taxa constan- te de fornecimento.
Além disso, este método produz a vantagem de ser forte e sim- pies de implementar. Também permite evitar o acúmulo de açúcares no mei- o, que leva a formação de biomassa à custa da produção de enzima.
As cepas de micro-organismo empregadas são cultivadas nos biorreatores agitados e aerado sob condições compatíveis com seu cresci- mento e produção de enzima. No início da fermentação, o biorreator é saturado com oxigênio e
a pressão parcial de oxigênio dissolvido correspondente à saturação é deno- tada por meio da Po2sat.
A fonte de carbono empregada para a fase de crescimento é a- Iimentada no biorreator a fim de ter uma concentração inicial de açúcar para o início da fase de produção variando entre 15 e 60 g/L.
Durante a fase de crescimento, a aeração é estabelecida em um valor selecionado pelo operador e a pressão parcial de oxigênio da Po2 é re- guiada em uma porcentagem, definida pelo operador, da pressão de satura- ção por meio de agitação. A pressão parcial de oxigênio no meio tem de ser maior do que a pressão de oxigênio crítica da Po2crítica abaixo da qual a ativi- dade do micro-organismo é afetada.
Este valor da P02crítica é conhecido pela pessoa versada na técni- ca e depende do micro-organismo empregado. Pode ser definido como a pressão abaixo da qual o metabolismo do micro-organismo é afetado por uma diminuição na viabilidade da célula ou na produção dos metabólitos de interesse.
Durante a fase de produção, a agitação e a aeração no biorrea- tor são estabelecidas em um valor predeterminado permitindo ter uma capa- cidade de oxigenação para o referido biorreator correspondente a um valor de Kla variando entre 50 e 150 h"1 dependendo da biomassa inicialmente considerada.
No método de acordo com a invenção, o substrato indutivo con- tendo carbono é introduzido após o esgotamento do substrato inicial: é o iní- cio da fase de produção. A taxa de consumo do oxigênio é proporcional à taxa de consumo do substrato indutivo contendo carbono pelo micro- organismo.
Deste modo, um pequeno acúmulo de açúcar no fermentador le- va a uma perda na pressão parcial de oxigênio. Quando a pressão parcial de oxigênio avaliado alcança um valor mínimo de Po2mIn, a regulação do siste- ma interrompe a adição do substrato indutivo contendo carbono. Esta inter- rupção causa uma diminuição na taxa de consumo do substrato indutivo contendo carbono de uma vez quando a sua concentração é próxima à afini- dade constante de Ks do micro-organismo para o substrato contendo carbo- no. Esta interrupção, da mesma forma, causa uma diminuição na taxa de consumo de oxigênio, que leva a um aumento na pressão parcial de oxigê- nio até um valor da Po2max. Quando a pressão da Po2max é alcançada, a regu- lação do sistema inicia novamente a bomba de fornecimento do substrato indutivo contendo carbono.
Os valores da Po2min e da Po2max entre os quais a pressão parcial de oxigênio dissolvido nas oscilações no meio de fermentação são determi- nados pelo operador da pressão de saturação de oxigênio Po2sat, dependen- do das cepas do micro-organismo empregadas e/ ou no meio de fermenta- ção.
A amplitude das oscilações entre os valores da Po2min e da
Po2max regula o intervalo de tempo entre os momentos quando o substrato indutivo contendo carbono é injetado e os momentos quando a injeção é in- terrompida.
Deste modo, as células são consequentemente mantidas em um estado próximo à limitação de carbono (em uma concentração próxima a Ks), por esse motivo favorável a uma produção ideal de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas.
De acordo com o método da presente invenção, a adição do substrato indutivo contendo carbono é iniciada logo que a pressão parcial de oxigênio dissolvido no meio é maior do que o valor da Po2max e interrompida logo que a pressão do oxigênio dissolvido no meio é abaixo do valor da Po2min· Os valores da Po2min e da Po2max são determinados de acordo com a pressão crítica de oxigênio e à pressão de saturação de oxigênio da Po2sat do meio quando o biorreator é iniciado. O valor da Po2min tem que ser maior do que a pressão crítica
Po2Critica abaixo da qual o metabolismo do micro-organismo é afetado e de menos do que 95 % da pressão parcial do oxigênio de saturação da Po2sat estabelecida quando iniciando o biorreator A Po2min de preferência varia entre e 60% da Po2sat.
O valor da Po2max tem de ser pelo menos 5 % maior do que o va-
lor da Po2min. Pode representar 100 % da pressão parcial de oxigênio da Po2sat. A Po2max de preferência varia entre 30 e 70 % da Po2sat.
De acordo com uma modalidade mais preferida, a Po2max de pre- ferência varia entre 40 e 60 % da Po2sat e a Po2min de preferência varia entre 30 e 50 % da Po2sat.
O substrato indutivo contendo carbono é selecionado dentre Iac- tose, xilose, celobiase, soforose, os resíduos obtidos após a fermentação etanólica dos açúcares monoméricos dos hidrolisados enzimáticos da bio- massa celulósica e/ ou de um extrato bruto de pentoses hidrossolúveis do pré-pré-tratamento de uma biomassa celulósica.
De acordo com uma modalidade preferida, o substrato é forneci- do na solução.
Uma solução aquosa que compreende o substrato indutivo con- tendo carbono selecionada para a fase de produção de enzima é preparada em uma concentração de 10 a 800 g/L de preferência de 150 a 600 g/L.
A solução aquosa que compreende o substrato indutivo conten- do carbono é de preferência uma solução de lactose.
Vantajosamente, uma solução de lactose de 250 g/L é emprega- da.
O substrato contendo carbono empregado durante a fase em ba- telada é selecionado dentre glicose, galactose, glicerol, os resíduos obtidos após a fermentação etanólica dos açúcares monoméricos dos hidrolisados enzimáticos da biomassa celulósica e/ ou de um extrato bruto de pentoses hidrossolúveis do pré-tratamento de uma biomassa celulósica.
O micro-organismo celulolítico é selecionado dentre os fungos ou outros micro-organismos modificados (leveduras, bactérias). De preferên- cia, o micro-organismo celulolítico pertence aos gêneros Trichoderma, As- pergillus, Penicillium e Schizophyllum, e mais de preferência às espécies Tri- choderma reesel.
O método descrito na presente invenção fornece a regulação do fornecimento do substrato indutivo contendo carbono de acordo com a pres- são parcial de oxigênio dissolvido no meio. Uma regulação de acordo com a taxa de produção de dióxido de carbono ou à taxa de consumo de dioxigênio calculada a partir da composição de gás avaliada na saída seria um meio equivalente de implementação da presente invenção. Exemplos
No meio dos exemplos que seguem, o Exemplo 1 apresenta a
fermentação de referência empregando lactose como a produção de subs- trato contendo carbono com uma taxa de fornecimento otimizada de 35 a 45 mg.g~1.h~1 permitindo uma elevada produção de proteína.
O Exemplo 2 apresenta o mesmo experimento com uma dupla taxa de fornecimento do substrato contendo carbono durante a fase de pro- dução. Este exemplo tem levado a um grande acúmulo de biomassa. Mostra o risco envolvido quando a taxa de fornecimento do substrato contendo car- bono é maior do que a taxa de fornecimento ideal.
Os Exemplos de 3 a 5 são de acordo com o método da presente invenção. O Exemplo 3 usa a mesma taxa de fornecimento como o Exemplo 1 e o Exemplo 4 a mesma taxa de fornecimento como o Exemplo 2. Os e- xemplos mais recentes mostram a força do método uma vez que levou a uma elevada produção de proteína e nenhum acúmulo de biomassa foi ob- servado durante a fase de produção. O Exemplo 5 ilustra uma ampla faixa de oscilação.
Exemplo 1 (comparativo): Produção de enzima de acordo com um método convencional de fermentação como descrito na patente FR-B- 2.811.753.
A produção das celulases é obtida em um fermentador mecani- camente agitado. O meio mineral tem a composição que segue: KOH 1,66 g/L, 85 % de H3PO4 2 mL/L, (NH4)2SO4 2,8 g/L, MgSO4 7 H2O 0,6 g/L, CaCL 0,6 g/L, MnSO4 3,2 mg/L, ZnSO4, 7 H2O 2,8 mg/L, CoCI2 10 4,0 mg/L, Fe- SO4, 7 H2O 10 mg/L, Macerado de Milho 1,2 g/L, agente antiespumação 0,5 mL/L.
O fermentador contendo o meio mineral é esterilizado a 120 0C durante 20 minutos, a fonte contendo carbono glicose é esterilizado a 120 0C durante 20 minutos, e em seguida esterilmente adicionado no fermentador a fim de ter uma concentração final de 15 g/L. O fermentador é semeado em % (v/v) com uma pré-cultura líquida da cepa Thichoderma reesel CL847. O meio mineral da pré-cultura é idêntico àquele do fermentador, exceto para a adição de 5 g/L de ftalato de potássio com um agente de tamponamento de pH. O crescimento do fungo da pré-cultura é obtido empregando glicose como o substrato contendo carbono, em uma concentração de 30 g/L. O crescimento do inóculo dura por 2 a 3 dias e é realizado a 28 0C em um in- cubador agitado. A transferência para o fermentador é realizada se a con- centração residual da glicose é abaixo de 15 g/L.
O experimento realizado no biorreator que compreende duas fa- ses:
- uma fase de crescimento no substrato contendo carbono na glicose (concentração inicial de 15 g/L) em uma temperatura de 27 0C e um valor de pH de 4,8 (regulado por 5,5 M de amônia). A aeração é de 0,5 vvm (volume/ volume/ minuto) e a pressão parcial de oxigênio dissolvido no meio é de 40 % da Po2sat;
- uma fase de produção de enzima. Quando o substrato inicial do fermentador é esvaziado, a solução de 250 g/L de Iactose é injetada con- tinuamente em 2 mL/h correspondente a uma taxa de fornecimento de 35 a 45 mg por g das células e por hora até 200 horas. A temperatura é diminuída para 25 0C e o valor do pH é mantido a 4 até o final da cultura. O valor do pH é regulado por meio da adição de uma solução de 5,5 N de amônia que for- nece o nitrogênio necessário para a síntese das proteínas secretadas. O teor do oxigênio dissolvido é mantido a 40 % da Po2sat-
A produção de enzima é monitorada através da determinação da concentração da proteína extracelular por meio do método Lowry e padrão BSA, após a separação do micélio por meio de filtragem ou centrifugação. As atividades celulolítica determinadas são:
- atividade de papel de filtro (FPU: unidade de papel de filtro) permitindo determinar a atividade global da mistura enzimática de endogli- canase e de exoglicanase;
- atividade de aril β-glicosidase.
A atividade da FPU é avaliada no papel Whatman N0. 1 (um pro- cedimento recomendado pela IUPAC Commission of Biotechnology) em uma concentração inicial de 50 g/L : a amostra do teste da solução enzimática a ser analisada que libera o equivalente a 2 g/L de glicose (determinação colo- rimétrica). Em 60 minutos é determinada. O princípio da atividade de papel de filtro é para determinar pelo método DNS (ácido dinitrosalicíclico) da quantidade dos açúcares reduzidos liberados por um papel Whatman N0. 1. O substrato empregado para determinar a atividade de aril β- glicosidase é p-nitrofenil β-D-glicopiranosidase (PNPG). É dividido pela β- glicosidase que libera o p-nitrofenol.
Uma unidade da atividade de β-glicosidase é definida como a quantidade de enzima necessária para produzir 1 Dmol de p-nitrofenol por minuto e é expressa em lU/mL.
As atividades específicas são obtidas pela divisão das atividades expressas em lll/mL pela concentração de proteína. São expressas em I U/mg.
As determinações analíticas, no final, devem dar os resultados
que seguem:
Biomassa g/L 14,5 Proteínas g/L 35,6 FPU lU/mL 18,7 FPU Específica lU/mg 0,52
Aril β-glicosidase específica lU/mg 0,95
Exemplo 2 (comparativo): Produção de enzimas com uma dupla taxa de fornecimento do substrato contendo carbono durante a fase em ba- telada alimentada em relação ao Exemplo 1. Produção de enzima é realizada sob as mesmas condições co-
mo no Exemplo 1. Após 30 horas de crescimento, após a depleção do subs- trato inicial, a solução em batelada alimentada é injetada em uma taxa de fornecimento a qual é dupla (4 ml_/h ao invés de 2 ml_/h) em relação ao ex- perimento do Exemplo 1. Isto leva a uma significante formação de biomassa e para uma baixa produção de proteína. O rendimento da produção das pro- teínas em relação ao substrato contendo carbono consumido é de 0,1 g/g, considerando que é de 0,3 g/g no Exemplo 1.
As determinações analíticas, no final, devem dar os resultados que seguem: Biomassa g/L 35,4
Proteínas g/L 16,8 FPU lU/mL 11,7 FPU Específica IU/mg 0,70
Aril β-glicosidase específica lU/mg 2,02
Exemplo 3 (de acordo com a invenção): Produção de enzimas por meio da regulação do fornecimento de fornecimento através da regula- ção da pressão parcial de oxigênio dissolvido no meio (taxa de fornecimento 2 mL/η)
Produção de enzima é realizada sob as mesmas condições co- mo no Exemplo 1. Após a depleção do substrato contendo carbono da fase de crescimento, a taxa de fluxo da aeração é mantida a 0,5 vvm e agitação a 800 rpm, que permite, no caso do fermentador empregado, ter um valor de Kla acima de 70 h"1. O substrato contendo carbono é fornecido de acordo com o valor da Po2. O fornecimento de substrato é iniciado quando a pres- são parcial de oxigênio é maior do que 50 % da pressão de saturação de o- xigênio com uma taxa de fornecimento de 2 mL/h e é interrompida quando é de menos do que 40 % da pressão parcial do oxigênio de saturação (veja, Figura 1).
As determinações analíticas, no final, devem dar os resultados que seguem:
Biomassa g/L 13,5 Proteínas g/L 40,6
FPU IU/mL28,1 FPU Específica lU/mg 0,69 Aril β-glicosidase específica lU/mg 1,97
O rendimento final da produção das proteínas em relação ao substrato contendo carbono é de 0,4 g/g. A atividade específica da FPase do coquetel enzimático produzido é melhorada por 33 %.
Exemplo 4: Produção de enzimas por meio da regulação do for- necimento de açúcar através da regulação da pressão parcial de oxigênio com uma dupla taxa de fornecimento em relação ao Exemplo 3 (taxa de for- necimento 4 mL/h).
A produção de enzima é realizada sob as mesmas condições como no Exemplo 3. O substrato contendo carbono é fornecido de acordo com o valor da Po2. O fornecimento de substrato é iniciado quando a pres- são parcial de oxigênio é maior do que 50 % da pressão de saturação de o- xigênio com uma taxa de fornecimento de 4 mL/h ao invés de 2 mL/h e é interrompida quando é de menos do que 40 % da pressão de saturação de oxigênio. Isto permite testar o efeito de um amplo fornecimento de açúcar.
Este exemplo mostra a força do método. A duplicação da taxa de fornecimento não leva a um acúmulo de biomassa como no caso do Exem- plo 2, graças a regulação. Isto significa que, mesmo que a concentração do substrato contendo carbono na bandeja de fornecimento é variável (que po- de ocorrer em uma escala industrial), o método se autorregula e mantém a taxa de fornecimento ideal para a produção de enzima.
As determinações analíticas, no final, devem dar os resultados que seguem:
Biomassa g/L 16,1 Proteínas g/L 43,6
FPU lU/mL 33,9 FPU Específica lU/mg 0,78 Aril β-glicosidase específica lU/mg 1,60
O rendimento final da produção das proteínas em relação ao substrato contendo carbono é de 0,4 g/g. A atividade específica da FPase do coquetel enzimático produzido é melhorada em 50 % em relação ao Exem- plo 1.
Exemplo 5: Produção de enzimas por meio da regulação do for- necimento de açúcar por meio de uma oscilação da pressão parcial de oxi- gênio entre 20 e 80 %.
Produção de enzima é realizada sob as mesmas condições co- mo no Exemplo 4. O substrato contendo carbono é fornecido de acordo com o valor da Po2. O fornecimento do substrato é iniciado quando a pressão parcial de oxigênio é maior do que 80 % da pressão de saturação de oxigê- nio com uma taxa de fornecimento de 4 ml_/h e é interrompida quando é de menos do que 20 % da pressão de saturação de oxigênio. Isto permite testar o efeito de uma mais ampla faixa de oscilação. As oscilações da Po2 e a solução em batelada alimentada taxa de fornecimento são mostradas na figura 1.
As determinações analíticas, no final, devem dar os resultados que seguem: Biomassa g/L 13,6
Proteínas g/L 21,8 FPU lU/mL 20,4 FPU Específica lU/mg 0,93 Aril β-glicosidase específica lU/mg 2,14 O rendimento final da produção das proteínas é mais baixo por-
que a quantidade do substrato injetado é menor. Pode ser, entretanto, ob- servado que as atividades específicas do coquetel enzimático são maiores do que aquelas do Exemplo 4 (oscilação da Po2 entre 40 e 50 %). As condi- ções aplicadas no Exemplo 4 são mais interessante, porque permitem ter uma maior produtividade e rendimento.

Claims (10)

1. Método de produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelu- lolíticas por meio de um micro-organismo celulolítico em um biorreator agita- do e aerado, que compreende uma fase de crescimento na presença de uma fonte de carbono e uma fase de produção na presença de um substrato in- dutivo contendo carbono, em que o fornecimento do substrato indutivo con- tendo carbono durante a fase de produção é regulado de acordo com a pressão parcial de oxigênio dissolvido no meio de crescimento, a referida pressão oscilando entre dois valores Po2min e Po2max, o valor da Po2min sendo maior do que a pressão crítica Po2crítica abaixo da qual a atividade do micro- organismo é afetada e de menos do que 95 % da pressão parcial do oxigê- nio de saturação Po2sat estabelecida quando iniciando o biorreator, e o valor da Po2max sendo pelo menos 5 % maior do que a adição da Po2min do subs- trato indutivo contendo carbono sendo iniciada logo que a pressão parcial de oxigênio dissolvido no meio é maior do que o valor da Po2max e interrompida logo que a pressão do oxigênio dissolvido no meio é abaixo do valor da Po2min-
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a Po2max varia entre 30 e 70 % da Po2sat e a Po2min varia entre 10 e 60 % da Po2sat.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, em que a Po2max varia entre 40 e 60 % da Po2sat e a Po2min varia entre 30 e 50 % da Po2sat.
4. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindica- ções anteriores, em que o substrato indutivo contendo carbono é seleciona- do dentre lactose, xilose, celobiase, soforose, os resíduos obtidos após a fermentação etanólica dos açúcares monoméricos dos hidrolisados enzimá- ticos da biomassa celulósica e/ ou de um extrato bruto de pentoses hidrosso- lúveis do pré-tratamento de uma biomassa celulósica.
5. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindica- ções anteriores, em que o substrato é fornecido na solução.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, em que o substra- to indutivo contendo carbono selecionado para a fase de produção de enzi- ma está em uma concentração de 10 a 800 g/L, de preferência em uma con- centração de 150 a 600 g/L.
7. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindica- ções 5 ou 6, em que o substrato indutivo contendo carbono é uma solução de lactose, de preferência em uma concentração de 250 g/L.
8. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindica- ções anteriores, em que a agitação e a aeração do biorreator são estabele- cidas em um valor predeterminado permitindo ter uma capacidade de oxige- nação para o referido bio-reator variando entre 50 e 150 h"1.
9. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindica- ções anteriores, em que o micro-organismo celulolítico é selecionado dentre os fungos pertencentes aos gêneros Tríchoderma, Aspergillus, Penicillium e Schizophyllum.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, em que o micro- organismo celulolítico pertence às espécies Tríchoderma reesel.
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