BRPI1101054B1 - Método de produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas por meio de um micro-organismo celulolítico em um biorreator agitado e aerado - Google Patents

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Abstract

método de produção de celulase na regulação da oscilação da pressão do oxigênio dissolvido no meio de cultura. a presente invenção refere-se a um método de produção de enzimas celuloliticas e/ ou hemiceluloliticas por meio de um micro-organismo celulolítico em um biorreator agitado e aerado, que compreende uma fase de crescimento na presença de uma fonte de carbono e uma fase de produção na presença de um substrato indutivo contendo carbono, em que o forneci- mento do substrato indutivo contendo carbono durante a fase de produção é regulado por meio de uma oscilação da pressão parcial de oxigênio dissolvido no meio.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ENZIMAS CELULOLÍTICAS E/OU HEMICELULOLÍTICAS POR MEIO DE UM MICRO-ORGANISMO CELULOLÍTICO EM UM BIORREATOR AGITADO E AERADO.
Campo da Invenção [001] A invenção refere-se a um método de produção de enzimas para a hidrólise da biomassa lignocelulósica.
Antecedentes da Invenção [002] A biomassa lignocelulósica é caracterizada por uma estrutura complexa que consiste em três polímeros condutores: celulase, hemicelulase e lignina. A celulase e possivelmente as hemicelulases são os alvos da hidrólise enzimática, mas elas não são diretamente acessíveis às enzimas.
[003] Estes substratos por esse motivo têm de ser submetido a um pré-tratamento antes da fase de hidrólise enzimática. O prétratamento visa modificar as propriedades físicas e físico-químicas do material lignocelulósico a fim de melhorar a acessibilidade da celulase capturada na matriz de lignina e de hemicelulase. Estes prétratamentos podem ser de diferentes tipos: ebulição acídica, ebulição alcalina, explosão da corrente ou processos Organosolv podem ser mencionados.
[004] A fase de hidrólise enzimática permite a celulase e as hemicelulases ser convertida para açúcares empregando enzimas celulolíticas e/ ou hemicelulolíticas. Os micro-organismos, tais como, fungos pertencentes aos gêneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium ou Schizophyllum, ou bactérias anaeróbicas pertencentes, por exemplo, ao gênero Clostrialium, produz três enzimas contendo notavelmente celulases e hemicelulases, adequada para a hidrólise total da celulase e das hemicelulases.
[005] Os açúcares obtidos por meio da hidrólise da biomassa lig
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2/15 nocelulósica são pentoses (principalmente xilose e arabinose), dissacarídeos (celobiose) e glicose que podem ser fermentados por microorganismos A glicose pode, por exemplo, ser facilmente convertida em etanol pela levedura Saccharomyces cerevisiae durante a fase de fermentação alcoólica.
[006] Finalmente, uma fase destilação permite separar e recuperar o produto de fermentação, deste modo obtido, etanol no caso anterior, a partir da fermentação necessária.
[007] Vários estudos técnico-econômicos mostram a necessidade de reduzir o custo ligado com a fase de hidrólise enzimática a fim de levar o custo do etanol produzido a valores próximos ao do etanol obtido a partir do amido.
[008] Um meio de diminuir os custos consiste na otimização das condições de operação do método de produção de celulase a fim de aumentar a produtividade ou para se obter um coquetel enzimático tendo uma atividade específica melhorada.
[009] O micro-organismo geralmente mais empregado para a produção de celulase é o fungo Trichoderma reesel filamentoso. As cepas selvagens têm a capacidade de secretar, na presença de um substrato indutivo, tal como, celulase ou lactose, por exemplo, um complexo enzimático adequado para a hidrólise da celulase. As enzimas do complexo enzimático que compreende os três maiores tipos de atividades: endoglicanases, exoglicanases e celabiases.
[0010] Os mecanismos complexos de regulação de síntese de celulase requerem implementações particulares para sua produção em um reator. Empregando cepas que não são sensíveis à repressão catabólica e substratos indutivos solúveis utilizável em uma larga escala, tal como, a lactose, tem permitido a obtenção de produções significantes da ordem de 40 g/L das proteínas extracelulares por T. reesel CL 847 de acordo com um método descrito em Bioresource Technol.
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3/15 (1992) 39, 125-130. Neste método, a fermentação ocorre em duas fases, uma primeira fase da produção em batelada das células T. reels e uma segunda fase do fornecimento em batelada alimentada do indutor em uma taxa prevenindo o seu acúmulo no meio.
[0011] O estado fisiológico do micro-organismo não sendo sempre mantido em seu nível ideal para a produção de enzima, os fenômenos de crescimento de células não produtivas, ou de lise da célula indesejável ou esporulação levando a uma diminuição na produtividade de enzima, são observados em alguns casos. O equilíbrio entre os estados ideais de produção e os estados fisiológicos indesejáveis é de preferência sensível. Balley e outros, (Appl. Microbiol. Blatechnol. 2003 62: 156-162) têm mostrado que a produtividade das celulases é ideal quando as células estão em um estado próximo à limitação do substrato contendo carbono no meio. Um método de adição do substrato contendo carbono empregando o monitoramento da taxa básica de consumo empregada para o controle do pH tem sido proposto.
[0012] Além disso, o método descrito na patente EP-B1-D.448.430 requer uma taxa otimizada de fornecimento de açúcar de 35 a 45 mg.g'1.h·1. Na realidade, uma taxa muito alta de fornecimento causa um acúmulo do substrato contendo carbono no meio, que leva a uma alteração metabólica com relação à produção da biomassa ao invés da produção de enzima. Por outro lado, uma muito baixa taxa de fornecimento leva a lise da biomassa e à perda de produção. Além disso, Thichoderma reesel excreta em seguida mais proteases reconsumindo parte das celulases produzidas.
[0013] A presente invenção fornece um método permitindo manter o micro-organismo no estado correspondente a seu nível ideal para a produção de enzima.
Sumário da Invenção [0014] A invenção fornece um método de produção de enzimas ce
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4/15 lulolíticas e/ou hemicelulolíticas em que o fornecimento do substrato indutivo contendo carbono necessário para a fase de produção é regulado por meio de uma oscilação da pressão do oxigênio dissolvido no meio.
Breve Descrição do Desenho [0015] Afigura 1 mostra o registro da pressão do oxigênio dissolvido no meio como uma função de tempo, bem como a taxa de fornecimento do substrato contendo carbono.
Descrição Detalhada [0016] A presente invenção se refere a um método de produção de enzimas celulolíticas e/ ou hemicelulolíticas por meio de um microorganismo celulolítico em um biorreator agitado e aerado, que compreende uma fase de crescimento na presença de uma fonte de carbono e uma fase de produção na presença de um substrato indutivo contendo carbono, em que o fornecimento do substrato indutivo contendo carbono durante a fase de produção é regulado de acordo com a pressão parcial de oxigênio dissolvido no meio de crescimento, a referida pressão oscilando entre os dois valores da Po2min e da Po2max, o valor da Po2min sendo maior do que a pressão crítica da Po2crítica abaixo da qual a atividade do micro-organismo é afetada e de menos do que 95 % da pressão parcial do oxigênio de saturação da Po2sat estabelecida quando iniciando o biorreator, e o valor da Po2max sendo pelo menos 5 % maior do que a adição da Po2min do substrato indutivo contendo carbono sendo iniciada logo que a pressão parcial de oxigênio dissolvido no meio é maior do que o valor da Po2maXe interrompida logo que a pressão do oxigênio dissolvido no meio é abaixo do valor da Po2min.
[0017] Este método permite otimizar a produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas ao mesmo tempo que mantendo as células em uma fase ideal de produtividade.
[0018] Por meio do método de acordo com a invenção, é possível
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5/15 produzir um coquetel enzimático exibindo uma atividade específica de até 50 % maior do que aquelas das enzimas obtidas com um método convencional de produção em que a limitação de carbono é imposta como uma taxa constante de fornecimento.
[0019] Além disso, este método produz a vantagem de ser forte e simples de implementar. Também permite evitar o acúmulo de açúcares no meio, que leva a formação de biomassa à custa da produção de enzima.
[0020] As cepas de micro-organismo empregadas são cultivadas nos biorreatores agitados e aerado sob condições compatíveis com seu crescimento e produção de enzima.
[0021] No início da fermentação, o biorreator é saturado com oxigênio e a pressão parcial de oxigênio dissolvido correspondente à saturação é denotada por meio da Po2sat[0022] A fonte de carbono empregada para a fase de crescimento é alimentada no biorreator a fim de ter uma concentração inicial de açúcar para o início da fase de produção variando entre 15 e 60 g/L.
[0023] Durante a fase de crescimento, a aeração é estabelecida em um valor selecionado pelo operador e a pressão parcial de oxigênio da P02 é regulada em uma porcentagem, definida pelo operador, da pressão de saturação por meio de agitação. A pressão parcial de oxigênio no meio tem de ser maior do que a pressão de oxigênio crítica da Po2crítica abaixo da qual a atividade do micro-organismo é afetada.
[0024] Este valor da Po2crítica é conhecido pela pessoa versada na técnica e depende do micro-organismo empregado. Pode ser definido como a pressão abaixo da qual o metabolismo do micro-organismo é afetado por uma diminuição na viabilidade da célula ou na produção dos metabólitos de interesse.
[0025] Durante a fase de produção, a agitação e a aeração no
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6/15 biorreator são estabelecidas em um valor predeterminado permitindo ter uma capacidade de oxigenação para o referido biorreator correspondente a um valor de Kla variando entre 50 e 150 h'1 dependendo da biomassa inicialmente considerada.
[0026] No método de acordo com a invenção, o substrato indutivo contendo carbono é introduzido após o esgotamento do substrato inicial: é o início da fase de produção. A taxa de consumo do oxigênio é proporcional à taxa de consumo do substrato indutivo contendo carbono pelo micro-organismo.
[0027] Deste modo, um pequeno acúmulo de açúcar no fermentador leva a uma perda na pressão parcial de oxigênio. Quando a pressão parcial de oxigênio avaliado alcança um valor mínimo de Po2mín, a regulação do sistema interrompe a adição do substrato indutivo contendo carbono. Esta interrupção causa uma diminuição na taxa de consumo do substrato indutivo contendo carbono de uma vez quando a sua concentração é próxima à afinidade constante de Ks do microorganismo para o substrato contendo carbono. Esta interrupção, da mesma forma, causa uma diminuição na taxa de consumo de oxigênio, que leva a um aumento na pressão parcial de oxigênio até um valor da Po2max- Quando a pressão da Po2max é alcançada, a regulação do sistema inicia novamente a bomba de fornecimento do substrato indutivo contendo carbono.
[0028] Os valores da Po2min e da Po2max entre os quais a pressão parcial de oxigênio dissolvido nas oscilações no meio de fermentação são determinados pelo operador da pressão de saturação de oxigênio Po2sat, dependendo das cepas do micro-organismo empregadas e/ ou no meio de fermentação.
[0029] A amplitude das oscilações entre os valores da Po2min e da Po2max regula o intervalo de tempo entre os momentos quando o substrato indutivo contendo carbono é injetado e os momentos quando a
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7/15 injeção é interrompida.
[0030] Deste modo, as células são consequentemente mantidas em um estado próximo à limitação de carbono (em uma concentração próxima a Ks), por esse motivo favorável a uma produção ideal de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas.
[0031] De acordo com o método da presente invenção, a adição do substrato indutivo contendo carbono é iniciada logo que a pressão parcial de oxigênio dissolvido no meio é maior do que o valor da Po2max e interrompida logo que a pressão do oxigênio dissolvido no meio é abaixo do valor da Po2min. Os valores da Po2min e da Po2max são determinados de acordo com a pressão crítica de oxigênio e à pressão de saturação de oxigênio da Po2satdo meio quando o biorreator é iniciado.
[0032] O valor da Po2min tem que ser maior do que a pressão crítica Po2crítica abaixo da qual o metabolismo do micro-organismo é afetado e de menos do que 95 % da pressão parcial do oxigênio de saturação da Po2sat estabelecida quando iniciando o biorreator A Po2min de preferência varia entre 10 e 60 % da Po2sat[0033] O valor da Po2max tem de ser pelo menos 5 % maior do que o valor da Po2min. Pode representar 100 % da pressão parcial de oxigênio da Po2sat- A Po2maxde preferência varia entre 30 e 70 % da Po2sat[0034] De acordo com uma modalidade mais preferida, a Po2max de preferência varia entre 40 e 60 % da Po2sat e a Po2min de preferência varia entre 30 e 50 % da Po2sat[0035] O substrato indutivo contendo carbono é selecionado dentre lactose, xilose, celobiase, soforose, os resíduos obtidos após a fermentação etanólica dos açúcares monoméricos dos hidrolisados enzimáticos da biomassa celulósica e/ ou de um extrato bruto de pentoses hidrossolúveis do pré-pré-tratamento de uma biomassa celulósica.
[0036] De acordo com uma modalidade preferida, o substrato é
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8/15 fornecido na solução.
[0037] Uma solução aquosa que compreende o substrato indutivo contendo carbono selecionada para a fase de produção de enzima é preparada em uma concentração de 10 a 800 g/L de preferência de 150 a 600 g/L [0038] A solução aquosa que compreende o substrato indutivo contendo carbono é de preferência uma solução de lactose.
[0039] Vantajosamente, uma solução de lactose de 250 g/L é empregada.
[0040] O substrato contendo carbono empregado durante a fase em batelada é selecionado dentre glicose, galactose, glicerol, os resíduos obtidos após a fermentação etanólica dos açúcares monoméricos dos hidrolisados enzimáticos da biomassa celulósica e/ ou de um extrato bruto de pentoses hidrossolúveis do pré-tratamento de uma biomassa celulósica.
[0041] O micro-organismo celulolítico é selecionado dentre os fungos ou outros micro-organismos modificados (leveduras, bactérias). De preferência, o micro-organismo celulolítico pertence aos gêneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium e Schizophyllum, e mais de preferência às espécies Trichoderma reesel.
[0042] O método descrito na presente invenção fornece a regulação do fornecimento do substrato indutivo contendo carbono de acordo com a pressão parcial de oxigênio dissolvido no meio. Uma regulação de acordo com a taxa de produção de dióxido de carbono ou à taxa de consumo de dioxigênio calculada a partir da composição de gás avaliada na saída seria um meio equivalente de implementação da presente invenção.
Exemplos [0043] No meio dos exemplos que seguem, o Exemplo 1 apresenta a fermentação de referência empregando lactose como a produção
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9/15 de substrato contendo carbono com uma taxa de fornecimento otimizada de 35 a 45 mg.g'1.h·1 permitindo uma elevada produção de proteína.
[0044] O Exemplo 2 apresenta o mesmo experimento com uma dupla taxa de fornecimento do substrato contendo carbono durante a fase de produção. Este exemplo tem levado a um grande acúmulo de biomassa. Mostra o risco envolvido quando a taxa de fornecimento do substrato contendo carbono é maior do que a taxa de fornecimento ideal.
[0045] Os Exemplos de 3 a 5 são de acordo com o método da presente invenção. O Exemplo 3 usa a mesma taxa de fornecimento como o Exemplo 1 e o Exemplo 4 a mesma taxa de fornecimento como o Exemplo 2. Os exemplos mais recentes mostram a força do método uma vez que levou a uma elevada produção de proteína e nenhum acúmulo de biomassa foi observado durante a fase de produção. O Exemplo 5 ilustra uma ampla faixa de oscilação.
Exemplo 1 (comparativo): Produção de enzima de acordo com um método convencional de fermentação como descrito na patente FR-B2.811.753.
[0046] A produção das celulases é obtida em um fermentador mecanicamente agitado. O meio mineral tem a composição que segue: KOH 1,66 g/L, 85 % de H3PO4 2 ml_/L, (NH4)2SO4 2,8 g/L, MgSCU 7 H2O 0,6 g/L, CaCL 0,6 g/L, MnSCU 3,2 mg/L, ZnSO4, 7 H2O 2,8 mg/L, C0CI210 4,0 mg/L, FeSO4, 7 H2O 10 mg/L, Macerado de Milho 1,2 g/L, agente antiespumação 0,5 mL/L.
[0047] O fermentador contendo o meio mineral é esterilizado a 120 °C durante 20 minutos, a fonte contendo carbono glicose é esterilizado a 120 °C durante 20 minutos, e em seguida esterilmente adicionado no fermentador a fim de ter uma concentração final de 15 g/L. O fermentador é semeado em 10 % (v/v) com uma pré-cultura líquida da cepa
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Thichoderma reesel CL847. O meio mineral da pré-cultura é idêntico àquele do fermentador, exceto para a adição de 5 g/L de ftalato de potássio com um agente de tamponamento de pH. O crescimento do fungo da pré-cultura é obtido empregando glicose como o substrato contendo carbono, em uma concentração de 30 g/L. O crescimento do inóculo dura por 2 a 3 dias e é realizado a 28 °C em um incubador agitado. A transferência para o fermentador é realizada se a concentração residual da glicose é abaixo de 15 g/L.
[0048] O experimento realizado no biorreator que compreende duas fases:
uma fase de crescimento no substrato contendo carbono na glicose (concentração inicial de 15 g/L) em uma temperatura de 27 °C e um valor de pH de 4,8 (regulado por 5,5 M de amônia). A aeração é de 0,5 wm (volume/ volume/ minuto) e a pressão parcial de oxigênio dissolvido no meio é de 40 % da Po2sat;
uma fase de produção de enzima. Quando o substrato inicial do fermentador é esvaziado, a solução de 250 g/L de lactose é injetada continuamente em 2 mL/h correspondente a uma taxa de fornecimento de 35 a 45 mg por g das células e por hora até 200 horas. A temperatura é diminuída para 25 °C e o valor do pH é mantido a 4 até o final da cultura. O valor do pH é regulado por meio da adição de uma solução de 5,5 N de amônia que fornece o nitrogênio necessário para a síntese das proteínas secretadas. O teor do oxigênio dissolvido é mantido a 40 % da Po2sat[0049] A produção de enzima é monitorada através da determinação da concentração da proteína extracelular por meio do método Lowry e padrão BSA, após a separação do micélio por meio de filtragem ou centrifugação. As atividades celulolítica determinadas são:
atividade de papel de filtro (FPU: unidade de papel de filtro) permitindo determinar a atividade global da mistura enzimática de enPetição 870180166369, de 21/12/2018, pág. 13/25
11/15 doglicanase e de exoglicanase;
atividade de aril β-glicosidase.
[0050] A atividade da FPU é avaliada no papel Whatman N°. 1 (um procedimento recomendado pela IUPAC Commission of Biotechnology) em uma concentração inicial de 50 g/L : a amostra do teste da solução enzimática a ser analisada que libera o equivalente a 2 g/L de glicose (determinação colorimétrica). Em 60 minutos é determinada. O princípio da atividade de papel de filtro é para determinar pelo método DNS (ácido dinitrosalicíclico) da quantidade dos açúcares reduzidos liberados por um papel Whatman N°. 1.
[0051] O substrato empregado para determinar a atividade de aril β-glicosidase é p-nitrofenil β-D-glicopiranosidase (PNPG). É dividido pela β-glicosidase que libera o p-nitrofenol.
[0052] Uma unidade da atividade de β-glicosidase é definida como a quantidade de enzima necessária para produzir 1 mol de pnitrofenol por minuto e é expressa em lU/mL.
[0053] As atividades específicas são obtidas pela divisão das atividades expressas em lU/mL pela concentração de proteína. São expressas em lU/mg.
[0054] As determinações analíticas, no final, devem dar os resultados que seguem:
Biomassa g/L 14,5
Proteínas g/L 35,6
FPU IU/ml_18,7
FPU Específica lU/mg 0,52
Aril β-glicosidase específica lU/mg 0,95
Exemplo 2 (comparativo): Produção de enzimas com uma dupla taxa de fornecimento do substrato contendo carbono durante a fase em batelada alimentada em relação ao Exemplo 1.
[0055] Produção de enzima é realizada sob as mesmas condições
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12/15 como no Exemplo 1. Após 30 horas de crescimento, após a depleção do substrato inicial, a solução em batelada alimentada é injetada em uma taxa de fornecimento a qual é dupla (4 ml_/h ao invés de 2 ml_/h) em relação ao experimento do Exemplo 1. Isto leva a uma significante formação de biomassa e para uma baixa produção de proteína. O rendimento da produção das proteínas em relação ao substrato contendo carbono consumido é de 0,1 g/g, considerando que é de 0,3 g/g no Exemplo 1.
[0056] As determinações analíticas, no final, devem dar os resultados que seguem:
Biomassa g/L 35,4
Proteínas g/L 16,8
FPU IU/ml_11,7
FPU Específica lU/mg 0,70
Aril β-glicosidase específica lU/mg 2,02 [0057] Exemplo 3 (de acordo com a invenção): Produção de enzimas por meio da regulação do fornecimento de fornecimento através da regulação da pressão parcial de oxigênio dissolvido no meio (taxa de fornecimento 2 mL/η) [0058] Produção de enzima é realizada sob as mesmas condições como no Exemplo 1. Após a depleção do substrato contendo carbono da fase de crescimento, a taxa de fluxo da aeração é mantida a 0,5 wm e agitação a 800 rpm, que permite, no caso do fermentador empregado, ter um valor de Kla acima de 70 h'1. O substrato contendo carbono é fornecido de acordo com o valor da P02. O fornecimento de substrato é iniciado quando a pressão parcial de oxigênio é maior do que 50 % da pressão de saturação de oxigênio com uma taxa de fornecimento de 2 mL/h e é interrompida quando é de menos do que 40 % da pressão parcial do oxigênio de saturação (veja, Figura 1).
[0059] As determinações analíticas, no final, devem dar os resulPetição 870180166369, de 21/12/2018, pág. 15/25
13/15 tados que seguem:
Biomassa g/L 13,5
Proteínas g/L 40,6
FPU IU/mL28,1
FPU Específica lU/mg 0,69
Aril β-glicosidase específica lU/mg 1,97 [0060] O rendimento final da produção das proteínas em relação ao substrato contendo carbono é de 0,4 g/g. A atividade específica da FPase do coquetel enzimático produzido é melhorada por 33 %.
[0061] Exemplo 4: Produção de enzimas por meio da regulação do fornecimento de açúcar através da regulação da pressão parcial de oxigênio com uma dupla taxa de fornecimento em relação ao Exemplo 3 (taxa de fornecimento 4 mL/h).
[0062] A produção de enzima é realizada sob as mesmas condições como no Exemplo 3. O substrato contendo carbono é fornecido de acordo com o valor da P02. O fornecimento de substrato é iniciado quando a pressão parcial de oxigênio é maior do que 50 % da pressão de saturação de oxigênio com uma taxa de fornecimento de 4 mL/h ao invés de 2 mL/h e é interrompida quando é de menos do que 40 % da pressão de saturação de oxigênio. Isto permite testar o efeito de um amplo fornecimento de açúcar.
[0063] Este exemplo mostra a força do método. A duplicação da taxa de fornecimento não leva a um acúmulo de biomassa como no caso do Exemplo 2, graças a regulação. Isto significa que, mesmo que a concentração do substrato contendo carbono na bandeja de fornecimento é variável (que pode ocorrer em uma escala industrial), o método se autorregula e mantém a taxa de fornecimento ideal para a produção de enzima.
[0064] As determinações analíticas, no final, devem dar os resultados que seguem:
Petição 870180166369, de 21/12/2018, pág. 16/25
14/15
Biomassa g/L 16,1
Proteínas g/L 43,6
FPU IU/mL33,9
FPU Específica lU/mg 0,78
Aril β-glicosidase específica lU/mg 1,60 [0065] O rendimento final da produção das proteínas em relação ao substrato contendo carbono é de 0,4 g/g. A atividade específica da FPase do coquetel enzimático produzido é melhorada em 50 % em relação ao Exemplo 1.
[0066] Exemplo 5: Produção de enzimas por meio da regulação do fornecimento de açúcar por meio de uma oscilação da pressão parcial de oxigênio entre 20 e 80 %.
[0067] Produção de enzima é realizada sob as mesmas condições como no Exemplo 4. O substrato contendo carbono é fornecido de acordo com o valor da P02. O fornecimento do substrato é iniciado quando a pressão parcial de oxigênio é maior do que 80 % da pressão de saturação de oxigênio com uma taxa de fornecimento de 4 mL/h e é interrompida quando é de menos do que 20 % da pressão de saturação de oxigênio. Isto permite testar o efeito de uma mais ampla faixa de oscilação.
[0068] As oscilações da P02 e a solução em batelada alimentada taxa de fornecimento são mostradas na figura 1.
[0069] As determinações analíticas, no final, devem dar os resultados que seguem:
Biomassa g/L 13,6
Proteínas g/L 21,8
FPU IU/mL20,4
FPU Específica lU/mg 0,93
Aril β-glicosidase específica lU/mg 2,14 [0070] O rendimento final da produção das proteínas é mais baixo
Petição 870180166369, de 21/12/2018, pág. 17/25
15/15 porque a quantidade do substrato injetado é menor. Pode ser, entretanto, observado que as atividades específicas do coquetel enzimático são maiores do que aquelas do Exemplo 4 (oscilação da P02 entre 40 e 50 %). As condições aplicadas no Exemplo 4 são mais interessante, porque permitem ter uma maior produtividade e rendimento.

Claims (10)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método de produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas por meio de um micro-organismo celulolítico em um biorreator agitado e aerado, que compreende uma fase de crescimento na presença de uma fonte de carbono e uma fase de produção na presença de um substrato indutivo contendo carbono, caracterizado pelo fato de que o fornecimento do substrato indutivo contendo carbono durante a fase de produção é regulado de acordo com a pressão parcial de oxigênio dissolvido no meio de crescimento, a referida pressão oscilando entre dois valores Po2min e Po2max, o valor da Po2min sendo maior do que a pressão crítica Po2crítica abaixo da qual a atividade do micro-organismo é afetada e de menos do que 95 % da pressão parcial do oxigênio de saturação Po2sat estabelecida quando iniciando o biorreator, e o valor da Po2max sendo pelo menos 5 % maior do que a adição da Po2min do substrato indutivo contendo carbono sendo iniciada logo que a pressão parcial de oxigênio dissolvido no meio é maior do que o valor da Po2max e interrompida logo que a pressão do oxigênio dissolvido no meio é abaixo do valor da Po2min.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a Po2max varia entre 30 e 70 % da Po2sat e a Po2min varia entre 10 e 60 % da Po2sat-
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a Po2max varia entre 40 e 60 % da Po2sat e a Po2min varia entre 30 e 50 % da Po2sat-
  4. 4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o substrato indutivo contendo carbono é selecionado dentre lactose, xilose, celobiase, soforose, os resíduos obtidos após a fermentação etanólica dos açúcares monoméricos dos hidrolisados enzimáticos da biomassa celulósica e/ ou de um extrato bruto de pentoses hidrossolúveis do pré-tratamento de
    Petição 870180166369, de 21/12/2018, pág. 19/25
    2/2 uma biomassa celulósica.
  5. 5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o substrato é fornecido na solução.
  6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o substrato indutivo contendo carbono selecionado para a fase de produção de enzima está em uma concentração de 10 a 800 g/L.
  7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o substrato indutivo contendo carbono é uma solução de lactose.
  8. 8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a agitação e a aeração do biorreator são estabelecidas em um valor predeterminado permitindo ter uma capacidade de oxigenação para o referido biorreator variando entre 50 e 150 h'1.
  9. 9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo celulolítico é selecionado dentre os fungos pertencentes aos gêneros Tríchoderma, Aspergillus, Penicillium e Schizophyllum.
  10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo celulolítico pertence à espécie Trichoderma reesel.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2979111B1 (fr) 2011-08-19 2015-05-01 IFP Energies Nouvelles Procede de production de cellulases par un champignon filamenteux adapte a un fermenteur ayant un faible coefficient de transfert volumetrique d'oxygene kla
FR2984353B1 (fr) * 2011-12-14 2014-11-21 IFP Energies Nouvelles Procede de production d'un cocktail enzymatique utilisant les residus solides d'un procede de conversion biochimique de materiaux ligno-cellulosiques
FR2991998B1 (fr) * 2012-06-18 2014-07-11 IFP Energies Nouvelles Utilisation du co2 pour la desactivation d'un microorganisme cellulolytique utilise dans l a conversion biochimique de materiaux ligno-cellulosiques
FR2991997B1 (fr) * 2012-06-18 2015-08-21 IFP Energies Nouvelles Procede de production d'un cocktail enzymatique utilisant les residus liquides d'un procede de conversion biochimique de materiaux ligno-cellulosiques
FR3049957B1 (fr) * 2016-04-08 2020-09-25 Ifp Energies Now Procede de production de cellulases avec du marc lignocellulosique pretraite
EP3530743A1 (en) 2018-02-21 2019-08-28 Cambridge Glycoscience Ltd Method of production
WO2020035599A1 (en) 2018-08-15 2020-02-20 Cambridge Glycoscience Ltd. Novel compositions, their use, and methods for their formation
US11149261B2 (en) 2018-11-28 2021-10-19 Indian Oil Corporation Limited Provident method of cellulases enzymes production by Penicillium funiculosum MRJ-16 using low cost media components
CN110205250A (zh) * 2019-07-03 2019-09-06 上海中溶科技有限公司 一株纤维素酶高产菌株及其筛选方法与应用
CN114727642A (zh) 2019-08-16 2022-07-08 剑桥糖质科学有限公司 处理生物质以生产寡糖的方法和相关组合物
FR3103196A1 (fr) * 2019-11-18 2021-05-21 IFP Energies Nouvelles Procede de production d’enzymes par une souche appartenant a un champignon filamenteux
BR112022011603A2 (pt) 2019-12-12 2022-08-30 Cambridge Glycoscience Ltd Produtos alimentícios multifase com baixo teor de açúcar
CN112553181B (zh) * 2020-12-29 2022-09-02 宜昌东阳光生化制药有限公司 一种葡糖淀粉酶的生产方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4952505A (en) * 1988-08-08 1990-08-28 Florida State University Fermentation of trichoderma reesei and apparatus therefor
FR2659664B1 (fr) 1990-03-19 1994-08-05 Inst Francais Du Petrole Composition d'enzymes adaptee a l'hydrolyse des polysaccharides d'un substrat lignocellulosique, sa preparation et son utilisation.
FR2811753B1 (fr) 2000-07-12 2003-12-19 Jeannine Rampal Pese-personne de poche
FR2881753B1 (fr) * 2005-02-09 2009-10-02 Inst Francais Du Petrole Procede de production d'enzymes cellulolytiques et hemicellulolytiques utilisant les residus de distillation de fermentation ethanolique d'hydrolysats enzymatiques de materiaux (ligno-)cellulosique
US8569036B2 (en) * 2006-07-12 2013-10-29 E I Du Pont De Nemours And Company Immobilized TAL biocatalyst for production of para-hydroxycinnamic acid

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