CN102876589A - 高产纤维素酶活力的菌株及其筛选方法和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酿酒领域，具体涉及一种高产纤维素酶活力的菌株及其筛选方法和使用方法。本高产纤维素酶活力的菌株为曲霉菌，该筛选包括：A.通过无机盐培养基富集培育菌；B.将A富集培育的菌在浸有无机盐培养基的滤纸上进行一次或多次接种；C.获取滤纸断裂处的培养物并将其在羧甲基纤维素培养基平板上进行一次或多次划线分离，得到纯菌株；D.将C得到的纯菌株在无机盐培养基中进行培养并进行纤维素分解；E.将D中纤维素分解能力强的纯菌株接种于灭菌的固态发酵培养基中进行培养；F.通过水浴法提取粗酶液并进行酶活力测试得到高产纤维素酶菌株。该菌株与酿酒酵母复配使用，以白酒丢糟、麸皮为主要原料进行发酵。本发明能够提高白酒丢糟的发酵率。

Description

高产纤维素酶活力的菌株及其筛选方法和使用方法

技术领域

本发明涉及酿酒领域，具体涉及一种高产纤维素酶活力的菌株，xqx-6，烟曲霉Aspergillus fumigatus保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址为武汉大学，邮编为430072，保藏号为CCTCC NO.M 2012231，及其筛选方法和使用方法。

背景技术

纤维素酶是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，它可将纤维素分解成多糖或单糖。纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。

纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、放线菌、动物体内等都能产生纤维素酶。纤维素细菌的纤维素酶产量不高，主要是葡聚糖内切酶，而且大多数对结晶纤维素没有活性，所分泌的酶是胞内酶或吸附在细菌细胞壁上，很少能分泌到细胞外。纤维素放线菌的纤维素酶产量极低，研究很少。纤维素真菌产生的多为胞外酶，产酶效率高，而且纤维素酶的酶系结构较为合理，同时产生许多半纤维素酶、果胶酶和淀粉酶等，是降解纤维素原料的主要类群。其中比较典型的有木霉属(Trichoderma)、曲霉属（Aspergillus）和青霉属(Penicillium）。但产生纤维素酶的菌种多易退化，从而导致产酶能力降低。

目前工业生产纤维素酶有两种方法，液体发酵和固体发酵。液体发酵工艺控制简单，容易扩大规模。但其生产原料多为葡萄糖，对生产设备及环境等都要求很高，且废水处理量大，提高了生产成本。固态发酵法原料多采用纤维质原料，来源广泛，价格低廉，但其得到的是纤维素酶曲，后期萃取、浓缩较为困难。这就导致目前市场上见到的纤维素酶多为液体发酵得到的，价格相对较高。因此，解决固态发酵后期处理问题是目前纤维素酶菌种低廉、高效利用的关键。

中国白酒产量巨大，其废弃产物白酒丢糟每年可产生上千万吨。白酒丢糟主要含有纤维素，半纤维素和木质素三种组分，此外还含有少量淀粉，粗蛋白等。其中仅少量白酒丢糟被用来生产动物饲料或产沼气等，大部分白酒丢糟的利用已成为白酒厂亟待解决的问题。因此，利用白酒丢糟生产燃料酒精越来越受到大家的关注。但由于其自身结构原因，需对白酒丢糟进行预处理后才能用来发酵产生酒精。采用化学处理方法一般都需要在高温高压下，不仅生产成本高，而且过程繁琐，不易操作，用生物方法可以很好的解决这一问题，但纤维素酶价格却较贵。

发明内容

本发明提供一种高产纤维素酶活力的菌株及其筛选方法和使用方法，能够提高白酒丢糟的发酵率。

本发明提供了一种高产纤维素酶活力的菌株，xqx-6，烟曲霉Aspergillusfumigatus保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC NO.M2012231。

本发明还提供了一种上述的高产纤维素酶活力的菌株的筛选方法，包括如下步骤：

A.通过纤维素无机盐液体培养基富集培育菌；

B.将步骤A富集培育的菌在浸有无机盐培养基的滤纸上进行一次或多次接种；

C.获取所述滤纸断裂处的培养物并将其在羧甲基纤维素培养基平板上进行一次或多次划线分离，得到纯菌株；

D.将步骤C得到的所述纯菌株在无机盐培养基中进行培养并进行纤维素分解；

E.将步骤D中纤维素分解能力强的所述纯菌株接种于灭菌的固态发酵培养基中进行培养；

F.通过水浴法提取粗酶液并进行酶活力测定得到所述纤维素酶菌株。

所述步骤A、所述步骤B、所述步骤D中的所述无机盐培养基优选包括：以重量份数计，NH₄NO₃1份，K₂HPO₄0.5份，KH₂PO₄0.5份，MgSO₄0.5份，NaCl 1.0份，CaCl₂0.1份，FeCl₃0.02份，酵母膏0.05份，水1000份；和/或，所述步骤A、所述步骤B、所述步骤D中的所述无机盐培养基的PH值优选为7.0～7.2。

所述固体发酵培养基优选为白酒酒糟8份、麸皮4份、Mandels营养液10~50份；所述Mandels营养液包括：以重量份数计，KH₂PO₄2000份、硫酸(NH₄)₂SO₄1400份、MgSO₄.7H₂O 3000份、CaCl₂300份、FeSO₄.7H₂O 5份、MnSO₄1.6份、氯化ZnCl₂1.7份、CoCl₂2.0份、溶于1000份蒸馏水；和/或，所述固体发酵培养基的PH值优选为5.0。

在所述步骤A之前，所述筛选方法优选进一步包括：通过无菌水进行溶解；步骤A包括取所述溶解后的悬液加入到含有纤维素无机盐液体培养基的三角瓶中，静置培养；

和/或，

所述步骤A、和/或所述步骤E中的培育温度优选为28~32℃，培养时间为5~7天；

和/或，

所述步骤B的接种量优选为10%；

和/或，

所述步骤D的培养时间优选为7～28天。

所述步骤E优选包括：将步骤D得到的分解纤维素能力强的菌株培养成熟，刮下成熟的孢子，制成孢子菌悬液，取3~5mL的孢子菌悬液接种于灭菌的固态发酵培养基中，28~32℃下培养5~9天。

所述步骤F优选包括：

在步骤E的固态发酵培养基中加入80～100毫升蒸馏水，在40～50℃的水浴提取1～2小时；用四层纱布过滤；

离心分离得上清液；离心速率优选为3500转/分钟；

对上清液进行纤维素酶酶活测定确定为高产纤维素酶活力的菌株。

本发明还提供一种利用上述任一种所述的筛选方法筛选的上述的高产纤维素酶活力的菌株的使用方法，包括：

利用上述任一种所述的筛选方法筛选的上述的高产纤维素酶活力的菌株；

所述菌株与酿酒酵母复配使用，以白酒丢糟、麸皮为主要原料进行发酵。

所述白酒丢糟优选为湿白酒丢糟。

通过本发明提供一种高产纤维素酶活力的菌株及其筛选方法和使用方法，能够达到如下的有益效果：

1.本发明提供一种高产纤维素酶活力的菌株及其筛选方法、使用方法，该菌株在筛选时经过无机盐培养基培育、接种、羧甲基纤维素培养基平板划线、将划线得到的纯菌株再进行无机盐培养基培养并纤维素分解，将分解能力强的接种于灭菌的固态发酵培养基中培养，水浴法提取得到纤维素酶粗酶液；将此纤维素酶菌株同酿酒酵母、白酒丢糟、麸皮一起进行发酵，得到酒精。筛选到的纤维素酶菌株分解纤维素能力强、筛选条件简单、易操作，在发酵酒精中不需要添加多余的纤维素降解酶，利用筛选的菌株直接降解白酒丢糟中的纤维质成分产生可发酵糖类，进而发酵产生乙醇，达到高效分解白酒丢糟的效果。

2.本发明中没有将固态发酵产生的酶液提取出来制成纤维素酶，而是利用丢糟为发酵基质，在菌体发酵培养中产生的纤维素酶直接用于降解含大量纤维素的丢糟，即边利用丢糟培养菌株产酶，边利用产生的酶降解丢糟产生还原糖，不仅解决了纤维素酶固态发酵生产的后期萃取问题，还为利用白酒丢糟生产酒精提供了一条廉价、无污染的有效途径。

3.本发明的筛选方法和使用方法均操作简单，方法容易掌握，且原料来源广泛，价格低廉，生产成本低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，以下描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图所示实施例得到其它的实施例及其附图。

图1为本发明一个实施例中高产纤维素酶活力的菌株的筛选方法基本流程图。

该生物材料保藏在中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC），保藏号为CCTCC NO.M 2012231，保藏日期为2012年6月14日。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。

本发明提供一种高产纤维素酶活力的菌株，中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC），保藏号为CCTCC NO.M 2012231，保藏日期为2012年6月14日，曲酶菌Aspergillus fumigatus。

本发明还提供了一种上述高产纤维素酶活力的菌株的筛选方法，包括如下步骤：

A.通过纤维素无机盐液体培养基富集培育菌；

B.将步骤A富集培育的菌在浸有无机盐培养基的滤纸上进行一次或多次接种；

C.获取所述滤纸断裂处的培养物并将其在羧甲基纤维素培养基平板上进行一次或多次划线分离，得到纯菌株；

D.将步骤C得到的所述纯菌株在无机盐培养基中进行培养并进行纤维素分解；

E.将步骤D中纤维素分解能力强的所述纯菌株接种于灭菌的固态发酵培养基中进行培养；

F.通过水浴法提取粗酶液并进行酶活力测定得到所述纤维素酶菌株。

本发明筛选到的纤维素酶菌株分解纤维素能力强、筛选条件简单、易操作。

下面通过一些实施例来详细描述下筛选过程，见图1，所示：

101，选取待筛选的样品；

样品的选取可以任意定，只要是通过纤维素发酵酿制的白酒即可，本发明的一个具体实施例中采用的是：习酒2010年1月发酵31的大曲。

102，将样品通过无菌水进行溶解、稀释；

具体的操作步骤为：将样品放入容器中，加入无菌水，振荡，摇匀。

103，将102溶解、稀释的样品通过无机盐培养基培育菌；

具体的操作步骤为：取部分或全部102溶解、稀释的样品加入到装有纤维素无机盐培养基的容器中，在28~32℃静置培养，培养时间为5~7天。

其中，无机盐培养基包括：NH₄NO₃1份，K₂HPO₄0.5份，KH₂PO₄0.5份，MgSO₄0.5份，NaCl 1.0份，CaCl₂0.1份，FeCl₃0.02份，酵母膏0.05份，水1000份；PH值为7.0～7.2。

上面的份数均为重量份数，水可以以水的密度换算成体积的方式。

104，将103培养的菌在浸有无机盐培养基的滤纸上进行一次或多次接种；

具体操作步骤为：待103中培养的菌大量生长后，按一定的接种率（比如：10%）接种到渗有无机盐培养基的滤纸条上，静置培养，培养温度为28℃，待菌体大量生长后，再转接到新鲜的无机盐培养液中，接种率与上次相同，如此转接数代。

105，获取所述滤纸断裂处的培养物并将其在羧甲基纤维素培养基平板上进行一次或多次划线分离，得到纯菌株；

具体操作步骤：经过104多次接种后，观察滤纸的断裂情况，在滤纸断裂处挑取培养物在羧甲基纤维素培养基平板上划线分离，28℃培养获得单菌落。为了得到较纯的菌株，可以进行反复划线纯化，期间可以结合显微镜镜检，直至纯化得到纯菌株。

106，将105得到的纯菌株在无机盐培养基中进行培养并进行纤维素分解；

具体操作步骤为：将105得到的纯菌株进行均分，放入装有同样的无机盐基础培养基的不同试管中，其中每个试管中浸泡一条滤纸，滤纸宽度依易于放入试管为宜，滤纸长度为5-7厘米。室温培养7～28天，然后观察每个试管中滤纸的分解情况，从中判断菌株分解纤维素的能力。

107，将106中纤维素分解能力强的所述纯菌株接种于灭菌的固态发酵培养基中进行培养；

具体操作步骤为：将106中得到的分解纤维素能力强的菌株培养成熟，刮孢子悬液接种于灭菌的固态发酵培养基中，28～32℃下培养5-9天。

所述固体发酵培养基包括：以重量份数计，白酒酒糟8份、麸皮4份、Mandels营养液10~50份；所述Mandels营养液包括：按重量份数计，KH₂PO₄2000份、硫酸(NH₄)₂SO₄1400份、MgSO₄.7H₂O 3000份、CaCl₂300份、FeSO₄.7H₂O 5份、MnSO₄1.6份、氯化ZnCl₂1.7份、CoCl₂2.0份、溶于1000份蒸馏水；和/或，所述固体发酵培养基的PH值为5.0。

108，通过水浴法提取粗酶液并进行酶活力测试得到高产纤维素酶活力的纤维素酶菌株。

具体操作步骤为：向发酵后的固态发酵培养基中加入蒸馏水，在40~50℃水浴提取1~2小时，用多层纱布过滤（比如：四层纱布）得到的液体纪委粗酶液。对粗酶液进行离心分离，离心速率为3500转/分钟，收集离心后的上清液。根据纤维素酶制剂轻工行业标准(QB2583-2003)对纤维素酶酶活力进行测定，选出高活力产纤维素酶的菌株。

下面，通过一个较为具体的实施例来描述筛选方法：

实施例1：本实例所用原料为习酒2010年1月发酵31的大曲。称取该大曲样品10g，置于250mL装有小玻璃珠的三角瓶中,加入90mL无菌水120r/min振荡10min。取1mL悬液加入到纤维素无机盐液体培养基的三角瓶中,28℃静置培养。待菌体大量生长后，按10%接种到装有滤纸条的无机盐培养基中，28℃静置培养数天，待菌体大量生长后，再转接到新鲜的培养液中，接种量为10%，如此转接数代，淘汰失去分解能力和不稳定的培养物。观察滤纸条断裂情况，在滤纸条断裂处挑取培养物在羧甲基纤维素培养基平板上划线分离，28℃培养获得单菌落。将单菌落反复划线纯化，结合显微镜镜检，纯化得到纯菌株即为具有产纤维素酶能力的菌株。

以白酒丢糟为碳源，从上述中筛选的菌株中筛选优良的高产纤维素酶的菌株。250mL三角瓶中装入以白酒丢糟为碳源的固态发酵培养基。开始发酵前，接入培养成熟的孢子菌悬液5mL，于28℃下培养静止培养，每天摇瓶一次。培养过程中定时取样，以检测固态发酵培养基中各纤维质成分的变化和纤维素酶活力。筛选出产纤维素酶活力最高的菌株xqx-6，烟曲霉Aspergillus fumigatus保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址为武汉大学，邮编为430072，保藏号为CCTCC NO.M 2012231，保藏日期为2012年6月14日。

本发明还提供了一种利用上述任一种所述的筛选方法筛选的上述的高产纤维素酶活力的菌株的使用方法，包括：

A.利用上述任一种所述的筛选方法筛选的上述的高产纤维素酶活力的菌株；

B.所述菌株与酿酒酵母复配使用，以白酒丢糟、麸皮为主要原料进行发酵。

本发明在发酵酒精中不需要添加多余的纤维素降解酶，利用筛选的菌株直接降解白酒丢糟中的纤维质成分产生可发酵糖类，进而发酵产生乙醇，达到高效分解白酒丢糟的效果。

酿酒酵母可以采用现有技术中的任意一种酿酒酵母。

在本方法中，白酒丢糟为碳源，麸皮为氮源。

本发明的酒精产率约为2%～7%，以干白酒丢糟计。

所述白酒丢糟优选为湿白酒丢糟。

下面将通过几个较为具体的实施例来详细描述本使用方法：

实施例2：利用实施例:1中筛选的菌株xqx-6以白酒丢糟为碳源，发酵生产酒精。1000mL三角瓶中装入干白酒丢糟55g，麸皮27g，硫酸铵18g，水500mL，121℃高温蒸煮20min。冷却后接入xqx-6种子液25mL，安琪酵母种子液25mL，于30℃下直径培养15d。其酒精产率为5%。

实施例3：利用实施例1中筛选的菌株xqx-6以白酒丢糟为碳源，发酵生产酒精。1000mL三角瓶中装入湿白酒丢糟500g，水50mL，121℃高温蒸煮20min。冷却后接入xqx-6种子液20mL，安琪酵母种子液20mL，于28℃下直径培养20d。其酒精产率为3%。

实施例4：利用实施例2中筛选的菌株xqx-6以爆破白酒丢糟为碳源，发酵生产酒精。250mL三角瓶中装入爆破的白酒丢糟50g（爆破条件：添加1倍干秸秆量的0.1M丁酮溶剂，于温度175℃，压力3.1MPa,维压时间7min后爆破，物料于温度75℃干燥8h脱毒），水400mL，121℃高温蒸煮20min。冷却后接入xqx-6种子液10mL，安琪酵母种子液10mL，于37℃下静止培养10d。其酒精产率为7%。

注：安琪牌酿酒酒精酵母由湖北安琪酵母公司提供。

通过本发明提供一种高产纤维素酶活力的菌株及其筛选方法和使用方法，能够达到如下的有益效果：

1.本发明提供一种高产纤维素酶活力的菌株及其筛选方法、使用方法，该菌株在筛选时经过无机盐培养基培育、接种、羧甲基纤维素培养基平板划线、将划线得到的纯菌株再进行无机盐培养基培养并纤维素分解，将分解能力强的接种于灭菌的固态发酵培养基中培养，水浴法提取得到纤维素酶粗酶液；将此纤维素酶菌株同酿酒酵母、白酒丢糟、麸皮一起进行发酵，得到酒精。筛选到的纤维素酶菌株分解纤维素能力强、筛选条件简单、易操作，在发酵酒精中不需要添加多余的纤维素降解酶，利用筛选的菌株直接降解白酒丢糟中的纤维质成分产生可发酵糖类，进而发酵产生乙醇，达到高效分解白酒丢糟的效果。

2.本发明中没有将固态发酵产生的酶液提取出来制成纤维素酶，而是利用丢糟为发酵基质，在菌体发酵培养中产生的纤维素酶直接用于降解含大量纤维素的丢糟，即边利用丢糟培养菌株产酶，边利用产生的酶降解丢糟产生还原糖，不仅解决了纤维素酶固态发酵生产的后期萃取问题，还为利用白酒丢糟生产酒精提供了一条廉价、无污染的有效途径。

3.本发明的筛选方法和使用方法均操作简单，方法容易掌握，且原料来源广泛，价格低廉，生产成本低。

本发明提供的各种实施例可根据需要以任意方式相互组合，通过这种组合得到的技术方案，也在本发明的范围内。

显然，本领域技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也包含这些改动和变型在内。

Claims (9)

1.一种高产纤维素酶活力的菌株，其特征在于，xqx-6，烟曲霉Aspergillus fumigatus，保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC NO.M 2012231。

2.一种权利要求1所述的高产纤维素酶活力的菌株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

A.通过纤维素无机盐液体培养基富集培育菌；

B.将步骤A富集培育的菌在浸有无机盐培养基的滤纸上进行一次或多次接种；

C.获取所述滤纸断裂处的培养物并将其在羧甲基纤维素培养基平板上进行一次或多次划线分离，得到纯菌株；

D.将步骤C得到的所述纯菌株在无机盐培养基中进行培养并进行纤维素分解；

E.将步骤D中纤维素分解能力强的所述纯菌株接种于灭菌的固态发酵培养基中进行培养；

F.通过水浴法提取粗酶液并进行酶活力测定得到所述纤维素酶菌株。

3.如权利要求2所述的高产纤维素酶活力的菌株的筛选方法，其特征在于，

所述步骤A、所述步骤B、所述步骤D中的所述无机盐培养基包括：以重量份数计，NH₄NO₃1份，K₂HPO₄0.5份，KH₂PO₄0.5份，MgSO₄0.5份，NaCl1.0份，CaCl₂0.1份，FeCl₃0.02份，酵母膏0.05份，水1000份；和/或，所述步骤A、所述步骤B、所述步骤D中的所述无机盐培养基的pH值为7.0～7.2。

4.如权利要求2所述的高产纤维素酶活力的菌株的筛选方法，其特征在于， 

所述固体发酵培养基包括：以重量份数计，白酒酒糟8份、麸皮4份、Mandels营养液10~50份；所述Mandels营养液包括：按重量份数计，KH₂PO₄2000份、硫酸(NH₄)₂SO₄1400份、MgSO₄.7H₂O 3000份、CaCl₂ 300份、FeSO₄.7H₂O 5份、MnSO₄1.6份、氯化ZnCl₂1.7份、CoCl₂2.0份、溶于1000份蒸馏水；和/或，所述固体发酵培养基的pH值为5.0。

5.如权利要求2-4任一项所述的高产纤维素酶活力的菌株的筛选方法，其特征在于，

在所述步骤A之前，所述筛选方法进一步包括：通过无菌水进行溶解；步骤A包括取所述溶解后的悬液加入到含有纤维素无机盐液体培养基的三角瓶中，静置培养；

和/或，

所述步骤A、和/或所述步骤E中的培育温度为28~32℃，培养时间为5~7天；

和/或，

所述步骤B的接种量为10%；

和/或，

所述步骤D的培养时间为7～28天。

6.如权利要求2-4任一项所述的高产纤维素酶活力的菌株的筛选方法，其特征在于，

所述步骤E包括：

将步骤D得到的分解纤维素能力强的菌株培养成熟，刮下成熟的孢子，制成孢子菌悬液，取3~5mL的孢子菌悬液接种于灭菌的固态发酵培养基中，28~32℃下培养5~9天。

7.如权利要求6所述的高产纤维素酶活力的菌株的筛选方法，其特征在于，所述步骤F包括：

在步骤E的固态发酵培养基中加入80～100毫升蒸馏水，在40～50℃的 水浴提取1～2小时；用四层纱布过滤；

离心分离得上清液；离心速率优选为3500转/分钟；

对上清液进行纤维素酶酶活测定确定为高产纤维素酶活力的菌株。

8.一种利用权利要求2-7任一种所述的筛选方法筛选的权利要求1所述的高产纤维素酶活力的菌株的使用方法，其特征在于，包括：

利用权利要求2-7任一种所述的筛选方法筛选的权利要求1所述的高产纤维素酶活力的菌株；

所述菌株与酿酒酵母复配使用，以白酒丢糟、麸皮为主要原料进行发酵。

9.如权利要求8所述的高产纤维素酶活力的菌株的使用方法，其特征在于，

所述白酒丢糟为湿白酒丢糟。 

Images