CN102586135A - 一种细菌及选育方法和其生产纤维素酶的方法 - Google Patents

Abstract

一种纤维素产生菌潮湿纤维单胞菌（Cellulomonasuda）NJ0807，所述菌株于2011年6月29号保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为CGMCC No.5022。该菌的16SrDNA序列在GenBank登录号为HM034815。该菌是一株新型野生纤维素降解细菌，筛选自牛瘤胃液中。该菌株在以微晶纤维素、羧甲基纤维素及稻壳等纤维素资源的培养基中，液体摇瓶发酵能够产生纤维素酶组分。本发明同时提供该纤维素酶主要组分的纯化方法，通过该纯化方法纯化出三种组要的纤维素酶组分。本发明是关于细菌发酵制备纤维素酶的方法，属于微生物制造领域，有潜在的应用前景。

Description

一种细菌及选育方法和其生产纤维素酶的方法

技术领域

本发明属于微生物制造领域，涉及到一种细菌和选育方法，及其生产纤维素酶的方法。

背景技术

纤维素（cellulose）是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物，也是地球上数量最大的可再生资源，据估计每年由光合作用而产生的植物中纤维素的含量为8.5×10¹⁰吨，相当于世界每年总能源消耗量的四倍（Yung-Chung Lo et al., 2009）。而纤维素这一巨大的可再生资源的有效利用对于解决环境污染、食品短缺、能源危机具有重大的现实意义，同时可以创造可观的经济效益和社会效益（S. M. Read and T. Bacic, 2002）。利用微生物及其代谢产物进行生物转化纤维素，可以被广泛用来生产可持续的生物源产品以取代日益枯竭的化石燃料（Angenent LT et al., 2004; Demain AL et al., 2005; Hoffert MI et al., 2002; Kamm B et al.,2004; Moreira N, 2005）。研究表明使用生物制品和生物能源可以达到二氧化碳零排放（Demain AL et al., 2004; Lynd LR et al., 1999）。

纤维素酶系统是一个复杂的酶体系，对纤维素产生作用的纤维素酶主要有以下三类酶的协同作用，这三类纤维素酶分别为：（1）内切葡聚糖酶（1，4-β-D-glucanglucanhydrolase或endo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，来自真菌的简称为EG，来自细菌的简称Cen）或称为Cx酶。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4糖苷键，产生大量有非还原端的小分子纤维素，因此可以快速降低聚合度，其底物类型一般为无定形纤维素，如羧甲基纤维素（Carboxymethyl cellulose）、磷酸膨胀纤维素等，对结晶纤维素几乎没有降解能力，然而有些内切纤维素酶可以作用微晶纤维素（Avicel）释放大量的还原糖（Zhang Y-HP et al., 2004b）；（2）外切葡聚糖纤维二糖水解酶（1，4-β-D-glucan cellobiohydrolase或exo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91，来自真菌的简称为CBH，来自细菌的简称为Cex）或称为C1酶，这类酶作用于纤维素线状分子的末端，水解β-1，4糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，研究发现外切纤维素酶有些时候也可以从内部切断纤维素链，而且也不是绝对需要链末端的存在（Armand S et al., 1997; Boisset C et al., 2000）。（3）β-葡聚糖苷酶（β-1，4-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG），主要水解纤维二糖和低聚糖，产生葡萄糖或者从可溶性纤维寡糖的非还原末端移去糖残基。

目前对表达纤维素酶的微生物的研究主要集中在以木霉和曲霉为代表的真菌上，真菌作为纤维素酶生产的菌株，世界市场中的纤维素酶有20%是来自木霉属和曲霉属（魏亚琴等，2008）。木霉被公认为是产纤维素酶最高的菌种之一，是当前生产上应用较多的菌种，真菌作为纤维素酶生产菌株，具有纤维素酶产量高、分泌胞外酶，有利于分离纯化、产纤维素酶系组分较齐全，利于对纤维素的降解等优点。但是，由于真菌产纤维素酶的生产周期长；纤维素酶的比活性低；分泌的纤维素酶以酸性纤维素酶为主，不利于在纺织工业等方面的应用，这些缺点在一定程度上都限制了真菌纤维素酶的应用。

多数细菌表达的纤维素酶一般不分泌到胞外，这样不利于纤维素酶的分离纯化，且相对于真菌产纤维素酶产量较低，但是许多纤维素降解细菌，特别是瘤胃厌氧菌产生的纤维素酶的比活性较高，同时细菌产纤维素酶的周期短，一般2天左右即可完成发酵，细菌产中性纤维素酶和碱性纤维素酶具有特殊的工业用途，因此细菌纤维素酶的应用越来越广泛。

本发明旨在从牛瘤胃液中筛选出纤维素降解微生物，并利用微生物发酵代谢产生纤维素酶组分，利用多种纯化方式分离其中主要的纤维素酶组分。

发明内容

本发明有以下三个目的：

（1）提供一种纤维素降解微生物潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda）NJ0807。

（2）提供一种上述菌株的选育方法。

（3）提供一种利用上述菌株生产纤维素酶的制备方法。

本发明目的（1）是这样实现的：

一种纤维素降解菌潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda）NJ0807于2011年6月29号保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏登记号为CGMCC No. 5022，该菌的16S rDNA序列在GenBank登录号为HM034815。

本发明目的（2）是这样实现的：

一种上述纤维素降解微生物的选育方法，其步骤如下：

a, 将牛瘤胃液中的微生物于以纤维素为唯一碳源的富集培养基中，30℃条件下180rpm富集培养摇瓶培养3~5天；

b,对富集培养的菌液稀释后用细胞计数板计算菌液的浓度，用无菌生理盐水对菌悬液进行稀释，采用十倍稀释法对富集培养的菌液梯度稀释到10^-8，分别取10^-6、10^-7和10^-8三个梯度的菌悬液0.1mL涂布到筛选培养基中，30℃培养2~10天；

c,挑取具有纤维素水解圈的微生物在液体培养基中30℃条件下180rpm培养2~3天，将发酵液在4℃以12000 rpm离心10 min，测定上清液的纤维素酶活力，筛选出酶活力最大的菌株进行复筛，复筛后得到潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda）NJ0807。

步骤a中所述的富集培养基组成为：0.5% CMC，0.5%滤纸，0.2% NaNO₃，0.1% K₂HPO₄，0.05% KCl，0.05% MgSO₄·7H₂O，0.0001% FeSO₄，pH自然。

步骤b中所述的筛选培养基组成为：0.5% CMC，0.2% NaNO₃，0.1% K₂HPO₄，0.05% KCl，0.05% MgSO₄·7H₂O，0.0001% FeSO₄，添加终浓度为1.6%的琼脂。

步骤c中所述的液体培养基组成为：1%蛋白胨，0.5% CMC，0.5% NaCl，0.1% K₂HPO₄，0.05% MgSO₄，0.03% CaCl₂，0.2% (NH₄)₂SO₄，调节pH为7.2。

本发明目的（3）是这样实现的：

一种上述细菌生产纤维素酶的方法，其步骤如下：

(1)通过将菌株潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda）NJ0807先在LB液体培养基中进行种子液培养，接种后在30 ℃培养24小时，按2%~10%接种量接种到下列培养基：蛋白胨或酵母膏0.5%~1%，蔗糖0.2%~1%，CMC 0.1~1%或微晶纤维素0.1%~0.5%，NaCl 0.1%~0.5%，K₂HPO₄ 0.1%~0.2%，MgSO₄·7H₂O 0.01%~0.05%，培养基的初始pH为6.5~8.5；

(2)在500 mL三角烧瓶中装有200 mL培养基进行摇瓶发酵，24~30 ℃培养2~3天；

(3)将发酵液在4 ℃条件下12000 rpm离心30分钟出去菌体细胞，上清液使用75%冷乙醇沉淀，加入无水乙醇时边搅拌边缓慢加入，溶液放置半小时后以12000 rpm离心10分钟，沉淀溶解在等体积的20 mM Tris-HCl（pH 8.8）缓冲液中得到纤维素酶粗酶液。

本发明还提供了纯化的内切纤维素酶组分，该组分由潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda）NJ0807发酵产生，将制备的纤维素酶粗酶液使用凝胶过虑色谱和阴离子交换色谱对其进行纯化，纯化的组分使用SDS-PAGE鉴定为单带，相对分子质量分别为66.2 KDa、40.6 KDa和31.0 KDa。其中国内外对于纤维单胞菌代谢产生的纤维素酶，分子量为40.6 KDa和31.0 KDa的纤维素酶有过报道，但66.2 KDa这个组分是较新的，在相关数据库中没有报道。

附图说明

图1为本发明潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda）NJ0807在刚果红/纤维素培养基上产生的水解圈。

图2为本发明潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda）NJ0807细胞的显微观察图片。

图3为本发明纯化的纤维素酶组分的SDS-PAGE，marker为标准蛋白分子量（1为发酵液，2为离子交换后活性组分，3~5分别为纯化后的40.6 KDa、31.0 KDa和66.2 KDa三个内切纤维素酶组分）。

图4为本发明阴离子交换色谱图。

图5为本发明凝胶过滤色谱图。

图6为本发明菌株NJ0807的部分16S rDNA核苷酸序列。

图7为本发明基于邻接法构建的菌株NJ0807 16S rDNA序列系统进化树。

具体实施方式

实施例一

从牛瘤胃液中分离纤维素降解微生物潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda）NJ0807

1 牛瘤胃液的取样

将安徽某屠宰场刚宰杀的水牛胃取出，瘤胃液快速装入事先高温灭菌的无菌瓶中，将包含牛瘤胃液的瓶子在低温环境中快速运往实验室。

2 纤维素降解微生物的富集培养

将牛瘤胃液中的纤维素降解微生物使用以纤维素为唯一碳源的富集培养基中进行富集培养。富集培养基的组成为0.5% CMC，0.5%滤纸，0.2% NaNO₃，0.1% K₂HPO₄，0.05% KCl，0.05% MgSO₄·7H₂O，0.0001% FeSO₄，pH自然。培养基在121℃条件下蒸汽灭菌20 min。将牛瘤胃液按10%（v/v）的量接种到装有100mL富集培养基的300mL三角烧瓶中，在30 ℃条件下180rpm富集培养4天。

3 纤维素降解微生物的初筛

对富集培养的菌液稀释后用细胞计数板计算菌液的浓度，用无菌生理盐水对菌悬液进行稀释，采用十倍稀释法对富集培养的菌液梯度稀释到10^-8，分别取10^-6、10^-7和10^-8三个梯度的菌悬液0.1mL涂布到筛选培养基中进行培养。筛选培养基的组成为0.5% CMC，0.2% NaNO₃，0.1% K₂HPO₄，0.05% KCl，0.05% MgSO₄·7H₂O，0.0001% FeSO₄，添加终浓度为1.6%的琼脂。涂布后的培养基先平放在培养箱中2h，待菌悬液被培养基吸收后进行倒置培养，培养箱的温度设置为30℃，培养2~10天，随着培养时间的延长，部分菌落周围产生暗淡的纤维素水解圈，挑取这些菌落作为纤维素降解菌进行纯培养。

4 纤维素降解微生物的复筛

将挑取的具有纤维素水解圈的微生物使用摇瓶发酵，测定发酵液中的纤维素酶活力进行复筛。摇瓶发酵的培养基组成为1%蛋白胨，0.5% CMC，0.5% NaCl，0.1% K₂HPO₄，0.05% MgSO₄，0.03% CaCl₂，0.2% (NH₄)₂SO₄，调节pH为7.2。将初筛到的微生物接种到摇瓶发酵培养基中，30 ℃条件下180rpm培养2~3天。将发酵液在4℃以12000 rpm离心10 min，上清液作为粗酶液使用DNS法测定纤维素酶活力。3，5-二硝基水杨酸（DNS）溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内还原糖的量和棕红色的物质颜色深浅的程度成一定比例关系，可用于比色测定。

纤维素酶活性的测定根据Mille等人的分析方法，一个反应混合物包括1.8 mL的1% CMC磷酸盐缓冲液（pH 6.0），0.2 mL等体积稀释的酶液样品，这个反应混合物在50 ℃恒温保持30 min。水解纤维素释放的还原糖的数量用DNS法来测量。以没有添加酶样品的反应液作为对照，测量540 nm波长下的吸光度。酶活力的定义为每分钟从底物释放出1 μmol还原糖（以葡萄糖量计）的酶量为一个活力单位。

5 纤维素降解菌株的鉴定

筛选的纤维素降解菌通过形态学、生理生化试验和16S rDNA序列分析鉴定为潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda）。图1为该菌株的显微观察图片，其他特征如说明书内容中所述。菌株的16S rDNA序列如6图，将该序列与GeneBank数据库中报道的细菌16S rDNA核苷酸序列进行比对，结果与该菌株的16S rDNA核苷酸序列同源性最高的细菌均属于纤维单胞菌属，同源性都高于99%以上。下载与NJ0807 16S rDNA序列相似性最高的前16个细菌的16S rDNA序列，进一步构建系统进化树如图7所示，菌株与Cellulomonas uda，CellulomonasANA-NS-6位于同一簇群，亲缘关系最接近。

实施例二

利用上述菌株生产纤维素酶

将菌株潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda）NJ0807划线接种到LB固体培养基中，在30 ℃条件下培养3天，接种到液体种子培养基中，种子培养基的组成为0.5%酵母膏，0.5%蔗糖，0.4% NaCl，0.1% K₂HPO₄，0.05% MgSO₄·7H₂O，调节培养基初始pH为7.5，121 ℃灭菌20 min。细菌在种子培养基中28℃ 180 rpm培养30小时后，菌体浓度得到大量积累，将种子液按5%（v/v）接种量接种到装有400 mL液体发酵培养基的1 L三角烧瓶中，液体发酵培养基的组成为1%蛋白胨，1% CMC，0.5%蔗糖，0.4% NaCl，0.1% K₂HPO₄，0.05% MgSO₄·7H₂O，调节培养基初始pH为7.5，121 ℃灭菌20 min。在24 ℃恒温条件下摇床转速为180 rpm培养2天后，发酵液在4 ℃条件下以转速为16000 rpm离心30 min，除去菌体细胞，上清液作为纤维素酶溶液。纤维素酶溶液使用冷乙醇进行沉淀，在纤维素酶溶液中缓慢加入预冷的无水乙醇并搅拌，至乙醇的浓度达到75%，低温放置半小时后，将该溶液在4 ℃条件下以12000 rpm离心10 min，沉淀低温干燥后即可作为纤维素酶产品，这种方式生产的纤维素酶产品比活力可达到20000 U·g^-1。

实施例三

纤维素酶的纯化

将乙醇沉淀的粗酶液产品溶解在适当体积的20 mM Tris-HCl（pH 8.8）缓冲液中，使用阴离子交换色谱Q Sepharose Fast Flow快速蛋白液相色谱（FPLC）纯化系统进行纯化，使用XK 16制备柱，离子交换树脂使用20 mmol·L^-1 Tris-HCl (pH 8.8)缓冲液平衡，10倍柱体积的平衡缓冲液洗涤平衡，将溶解后的粗酶溶液进行加样，上样的总蛋白量为柱吸附容量的10%左右。采用梯度洗脱方式进行洗脱，NaCl浓度在8倍柱体积内升至0.4 mol·L^-1，流速为2 mL·min^-1。分管收集，每管收集2 mL，对收集的部分进行纤维素酶活力测定并合并活性片段。该纯化步骤得到两个主要的纤维素酶组分，在图4中分别对应peak1和peak2，第二个组分SDS-PAGE检测已达到电泳纯，相对分子质量大约为66.2 KDa，对第一个组分进一步采用凝胶过滤色谱纯化。

将阴离子交换收集到的第一个活性片段进一步采用Sephadex G-75凝胶过滤色谱纯化（1.6×60 cm，填料为Amersham Biosciences公司），凝胶过滤色谱利用快速蛋白液相色谱（FPLC）纯化系统进行，使用20 mmol·L^-1 Tris-HCl (pH 8.8)缓冲液平衡，加样量为2 mL，平衡缓冲液进行洗脱，流速为0.5 mL·min^-1，分管收集，每管收集1 mL，纯化的色谱图如图5所示。对收集的部分进行纤维素酶活性测定，合并活性片段，测量蛋白质浓度及活性。凝胶过滤也出现两个纤维素酶活性片段，对两个活性片段合并后SDS-PAGE分析均已达到电泳纯，相对分子质量分别为40.6 KDa和31.0 KDa（图3）。

对合并的纤维素酶活性部分使用SDS电泳进行检测，根据Laemmli的方法使用12%的聚丙烯酰胺凝胶，凝胶电泳后使用考马斯亮蓝R-250进行染色，再用含10%醋酸和10%甲醇的脱色液脱色过夜，使用凝胶成像系统拍照并分析相对分子质量大小。

ATGGCGGCGTGCTTACACATGCAAGTCGAACGGTGAAGACCAGCTTGCTGGTTGGATCAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCTTCACTCTGGGATAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACATCCCTGCGCATGTGGGGGTGTGGAAAGATTTATCGGTGGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTGATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTAGTCGCGTCTGCTGTGAAAACTCGAGGCTCAACCTCGGGCTTGCAGTGGGTACGGGCTGACTAGAGTGCGGTAGGGGTGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCACTGGGCCGCAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGACCCATTCCACGGGTTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAAGTGCAGAGATGTGCTCCCCGTAAGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTCCCATGTTGCCAGCGGGTTATGCCGGGGACTCATGGGAGACTGCCGGGgTCAACTCGgAGgaAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCcTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATACCGTAAGGTGGAGCGAATCCCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCTTGGGGGGGAGCCGTCGAA

Claims (6)

1.一种细菌，其特征是它于2011年6月29号保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为CGMCC No. 5022，命名为潮湿纤维单胞菌NJ0807，分类命名为潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda），该菌的16S rDNA序列在GenBank登录号为HM034815。

2.一种如权利要求1所述的潮湿纤维单胞菌的选育方法，其特征是所述方法包括以下步骤：

步骤a,将牛瘤胃液中的微生物于以纤维素为唯一碳源的富集培养基中，30℃条件下180rpm富集培养摇瓶培养3~5天；

步骤b,对富集培养的菌液稀释后用细胞计数板计算菌液的浓度，用无菌生理盐水对菌悬液进行稀释，采用十倍稀释法对富集培养的菌液梯度稀释到10^-8，分别取10^-6、10^-7和10^-8三个梯度的菌悬液0.1mL涂布到筛选培养基中，30℃培养2~10天；

步骤c,挑取具有纤维素水解圈的微生物在液体培养基中30℃条件下180rpm培养2~3天，将发酵液在4℃以12000 rpm离心10 min，测定上清液的纤维素酶活力，筛选出酶活力最大的菌株进行复筛，复筛后得到潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda）NJ0807。

3.根据权利要求2所述的潮湿纤维单胞菌的选育方法，其特征是步骤a中所述的富集培养基组成为：0.5% CMC，0.5%滤纸，0.2% NaNO₃，0.1% K₂HPO₄，0.05% KCl，0.05% MgSO₄·7H₂O，0.0001% FeSO₄，pH自然。

4.根据权利要求2所述的潮湿纤维单胞菌的选育方法，其特征是步骤b中所述的筛选培养基组成为：0.5% CMC，0.2% NaNO₃，0.1% K₂HPO₄，0.05% KCl，0.05% MgSO₄·7H₂O，0.0001% FeSO₄，添加终浓度为1.6%的琼脂。

5.根据权利要求2所述的潮湿纤维单胞菌的选育方法，其特征是步骤c中所述的液体培养基组成为：1%蛋白胨，0.5% CMC，0.5% NaCl，0.1% K₂HPO₄，0.05% MgSO₄，0.03% CaCl₂，0.2% (NH₄)₂SO₄，调节pH为7.2。

6.一种用权利要求1所述的潮湿纤维单胞菌生产纤维素酶的方法，其特征是所述方法包括以下步骤：

步骤如下：

(1)通过将菌株潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda）NJ0807先在LB液体培养基中进行种子液培养，接种后在30 ℃培养24小时，按2%~10%接种量接种到下列培养基：蛋白胨或酵母膏0.5%~1%，蔗糖0.2%~1%，CMC 0.1~1%或微晶纤维素0.1%~0.5%，NaCl 0.1%~0.5%，K₂HPO₄ 0.1%~0.2%，MgSO₄·7H₂O 0.01%~0.05%，培养基的初始pH为6.5~8.5；

(2)在500 mL三角烧瓶中装有200 mL培养基进行摇瓶发酵，24~30 ℃培养2~3天;

(3)将发酵液在4 ℃条件下12000 rpm离心30分钟出去菌体细胞，上清液使用75%冷乙醇沉淀，加入无水乙醇时边搅拌边缓慢加入，溶液放置半小时后以12000 rpm离心10分钟，沉淀溶解在等体积的20 mM Tris-HCl（pH 8.8）缓冲液中得到纤维素酶粗酶液。

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