CN101643708B

CN101643708B - 一株组成型酸性内切纤维素酶高产菌株

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Publication number: CN101643708B
Application number: CN200810124679A
Authority: CN
Inventors: 何冰芳; 欧阳平凯; 许婧; 柏中中; 吴斌
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2008-08-29
Filing date: 2008-08-29
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2028-08-29
Also published as: CN101643708A

Abstract

本发明从富含植物纤维素的土样中筛选到一株组成型酸性内切纤维素酶高产菌株，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis LC，保藏登记号为CCTCC No：M208073。本发明所筛选到的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis LC属于罕见的组成型纤维素酶高产菌株。与当前工业用酶的细菌菌株相比，发酵产酶周期短，酶活力高，且产酶过程无需诱导因此其产生的纤维素酶即为组成型纤维素酶，因此该菌适用于大规模的发酵生产的特点。

Description

一株组成型酸性内切纤维素酶高产菌株

技术领域

本发明属于微生物学技术领域，特别涉及一株组成型酸性内切纤维素酶高产菌株。

背景技术

纤维素酶是将纤维素及其衍生物水解成葡萄糖的一组酶的总称。一组完整的纤维素酶系通常有相互协同催化水解纤维素的三类酶组成：内切纤维素酶(CMCase)、外切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。内切纤维素酶主要作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，并产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；外切纤维素酶再将小分子纤维素降解生成纤维二糖和葡萄糖；最后由β-葡萄糖苷酶将纤维二糖彻底降解为葡萄糖。因此，内切纤维素酶在生物质的降解过程中发挥了最关键的作用。按催化反应的最适pH，可将内切纤维素酶分为：酸性内切纤维素酶(最适pH3～5)、中性内切纤维素酶(最适pH6～8)、碱性内切纤维素酶(最适pH8～10)。酸性纤维素酶已广泛应用于纺织、造纸以及食品加工等行业中：在棉织物整理上，经过酸性纤维素酶整理后，棉织物的手感和外观获得很大的改善；在旧纸脱墨中过程中酸性纤维素酶可以在较低pH值的纸浆中进行脱墨；酸性纤维素酶还广泛应用于水果和蔬菜汁以及橄榄油的提取，果汁的澄清等食品加工过程中。

能产生内切纤维素酶的微生物主要是真菌和部分细菌。真菌所产纤维素酶多为酸性胞外酶且产酶效率高，且酶系结构完整，但真菌所产纤维素酶都是复合酶，且酶系结构复杂，分子量大，不易分离提取，通常其产酶过程需要加入纤维素类物质进行诱导，且发酵周期长，因此在工业用酶开发方面显示出了诸多不足。细菌所产纤维素酶虽然成分单一(即通常只含有一类纤维素酶)，可以简化提取步骤，但是细菌纤维素酶多为中性或者碱性胞内酶，多吸附于菌壁，且其酶活普遍较低，另外，大部分菌株产诱导型内切纤维素酶，需要添加诱导物，不适应用于工业大规模生产。因此，目前的研究工作一直围绕着筛选可产组成型纤维素酶甚至酸性纤维素酶，且其产酶为胞外产物，酶活高，酶纯化工艺方便的优良菌种而进行。

目前对于组成型高效纤维素酶生产细菌的研究较少，90年代日本花王公司曾报道了一株组成型纤维素高产野生菌株Alkalophilic Bacillus KSM-635，该菌株在无诱导剂存在时发酵液上清中碱性纤维素酶活力为2.202IU/mL，而在木聚糖的诱导下酶活可提高到原来的三倍(碱性纤维素酶的生产方法，昭63：112981)。而国内近几年所报道的高产纤维素酶野生菌株都需要添加纤维素类诱导物，如沈雪亮等用刚果红染色法从腐烂的废纸浆中筛选得到嗜碱菌株ZU-04，在CMC诱导后酶活可达5.37IU/mL(产纤维素酶细菌的筛选及酶学特性研究.林产化学与工业，2002，22(1)：47～51)。对于开发高活力的纤维素酶降解菌株以及高催化能力的特殊纤维素酶仍是纤维素酶研究领域的瓶颈问题，因此对于有效的纤维素酶产生菌以及多功能纤维素酶、组成型纤维素酶产生菌株的开发工作具有较高的理论和实际应用价值。

发明内容

为了解决上述现有技术存在的不足之处，本发明的技术目的在于提供一株高产组成型纤维素酶的菌株，使得该菌株产生的纤维素酶具有pH稳定性好、催化能力强，适合较高的酶反应温度、耐金属离子等，并适合于纺织、造纸以及食品加工等行业的优良酶学特性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一、本发明从富含植物纤维素的土样中筛选到一株组成型酸性内切纤维素酶高产菌株，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis LC，保藏登记号为CCTCC No：M208073。

取南京森林地区土样加入液体培养基中富集培养5d～7d后在相同的培养基中共转接三次。将经过富集培养后的菌液作适当稀释，取稀释液，涂平板培养。培养约24h后，用接种环挑出同一平板上不同形态的细菌菌落，再转接到平板上进行单菌落分离，最终得到42株细菌。将每株菌分别接种于发酵基础培养基和诱导培养基中培养36h，取发酵液进行刚果红平板的快速筛选。经反复实验筛选得到一株在两种培养中均能产生明显透明圈的菌株，将其命名为LC。

本发明将LC经BIOLOG全自动细菌鉴定仪鉴定，表明该菌株与芽孢杆菌Bacillussubtilis相似度(SIM)为0.95，分析结果与数据库匹配度(PROB)都到达100。通过对菌株LC的16SrDNA序列测定(具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，序列长度为1542bp)，采用BLAST分析表明该菌的16SrDNA与GenBank中Bacillussubtilis的序列同源性高达99.7％，与Biolog的生理生化性能鉴定结果一致，因此将该菌株命名为Bacillus subtilis LC。

本发明对Bacillus subtilis LC的生物特征进行了鉴定。该菌种的形态特征为：菌落呈白色，半透明；菌落表明平坦、湿润，边缘皱褶、粘稠；革兰氏染色鉴定阳性；显微镜下观察个体形态为长杆状，菌体中间有芽孢，边缘有荚膜。该菌株好氧，最佳生长和产酶温度为35℃，最适pH为5.0～5.5。

二、本发明从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis LC中提取出其胞外产物组成型内切纤维素酶：

1、细胞培养：

将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis LC接种于固体培养基，37℃培养10～12h后转接种子培养基，37℃条件下培养10～12h；以2％接种量再转接液体发酵培养基37℃条件下培养36h；

2、胞外产物粗酶液的处理：

将发酵液冷冻离心，取上清，即得粗酶液；取粗酶液于pH7.0的Na₂HPO₄-citrate缓冲溶液中透析过夜；用聚乙二醇浓缩透析液，再经0.45μm微孔滤膜过滤除杂，保存滤液。

3、离子交换层析

预先用pH7.0的Na₂HPO₄-citrate缓冲液充分平衡DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换柱，上样后用pH7.0的Na₂HPO₄-citrate缓冲液洗脱，收集穿透峰，用含有1mol/LNaCl的pH7.0的Na₂HPO₄-citrate缓冲液洗脱杂蛋白，柱子用pH9.0的Tris-HCl缓冲液重新平衡。将穿透峰浓缩调节pH至9.0，再次上样，采用0→1mol/L NaCl梯度洗脱，并收集有酶活的洗脱峰。

三、利用本发明的酶提取方法得到了一种组成型内切纤维素酶，并对该酶进行了酶学性质鉴定。

本发明从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis LC产生的酸性组成型内切纤维素酶LC的比活力高达1650.67IU/mg，对CMC-Na催化时米氏常数K_m为0.0423g/L，V_max为135.85mg/min，与报道菌株相比，具有更高的催化能力。

本发明从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis LC产生的组成型内切纤维素酶LC的最适反应pH为5.0；该酶在pH4.0～11.0的缓冲液中保存2h酶活力可保持最高酶活的90％以上，体现了较好的pH稳定性；最适反应温度为60～65℃；具有耐Na⁺、K⁺、Li⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺等金属离子的良好特性，EDTA对酶活性影响甚微，该酶为非金属离子纤维素酶。

因此，从本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis LC中提取的组成型内切纤维素酶LC可确定为优良的组成型酸性内切纤维素酶。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

(1)本发明所筛选到的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis LC属于罕见的组成型纤维素酶高产菌株。与当前工业用酶的细菌菌株相比，发酵产酶周期短，酶活力高，且产酶过程无需诱导因此其产生的纤维素酶即为组成型纤维素酶，因此该菌适用于大规模的发酵生产的特点。

(2)从本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis LC提取的组成型内切纤维素酶比活达1650.67IU/mg，对CMC-Na催化时米氏常数K_m为0.0423g/L，V_max为135.85mg/min，与报道菌株相比，具有更高的催化能力；该酶最适反应pH为5.0，为罕见的酸性组成型纤维素酶；该酶在pH4.0～11.0的缓冲液中保存2h酶活力可保持最高酶活的90％以上，体现了较好的pH稳定性；最适反应温度为60～65℃；具有耐Na⁺、K⁺、Li⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺等金属离子的良好特性，EDTA对酶活性影响甚微，该酶为非金属离子纤维素酶，显示了良好的特性，在纺织、造纸以及食品加工等工业领域具有良好的应用前景。

综上，本发明所述的组成型酸性内切纤维素酶的高产细菌菌株可以填补目前在研究酸性内切纤维素酶领域存在的诸如酶比活力低，底物催化能力差、不耐金属离子及EDTA或者依赖金属离子以及pH稳定性差等不足。

附图说明

图1刚果红杯碟快速鉴定LC酶活的结果

图2提取组成型内切纤维素酶LC的SDS-PAGE电泳图谱

其中标记为：1，发酵液粗酶液；2，标准分子量蛋白；3，DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换pH7.0穿透液；4，pH9.0时DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换后纤维素酶液。

图3CMC-Na为底物的米氏方程双倒数曲线

图4内切纤维素酶LC的最适pH

图5内切纤维素酶LC的pH稳定性

图6内切纤维素酶LC的最适温度

图7内切纤维素酶LC的热稳定性

图8不同浓度金属离子对纤维素酶LC活力的影响

本发明的微生物分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis LC，保藏日期为2008年5月19日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏登记号为CCTCC No：M208073。

具体实施方式：

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例说明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis LC的筛选过程：

其中筛选所用培养基为：

液体培养基配方(g/L)：3.0KH₂PO₄，0.3MgSO₄·7H₂O，5.0蔗糖，15.0蛋白胨，30mL/L玉米浆。

发酵基础培养基(g/L)：3.0KH₂PO₄，0.3MgSO₄·7H₂O，5.0酵母膏，15.0蛋白胨。

诱导培养基(g/L)：在发酵基础培养基的基础上添加5g/L CMC-Na。

刚果红平板培养基(g/L)：3.0KH₂PO₄，0.3MgSO₄·7H₂O，5CMC-Na。

取南京森林地区土样约0.5g，加入液体培养基中富集培养(30℃，180r/min)，培养5d～7d后转接，在相同的培养基中共转接三次。将经过富集培养后的菌液作适当稀释，稀释梯度根据培养液的浑浊度而定(105～107倍)。取100μL稀释液，涂平板培养。培养约24h后，用接种环挑出同一平板上不同形态的细菌菌落，再转接到平板上进行单菌落分离，最终得到42株细菌。将每株菌分别接种于发酵基础培养基和诱导培养基中培养36h，取发酵液进行刚果红平板的快速筛选。经反复实验筛选得到一株在两种培养中均能产生明显透明圈的菌株，将其命名为LC。

从附图2中可以看出，菌株LC在添加诱导剂(图中B)和未添加诱导剂(图中A)的培养液中都有较强的纤维素酶活力(A、B分别为菌株LC在发酵基础培养基和诱导培养基中发酵液，下标为稀释倍数)，而诱导型对照菌株只有在诱导培养基(C+)中才能产生透明圈(C-、C+分别为诱导型对照菌株在发酵基础培养基和诱导培养基中发酵液，无稀释)，表明新筛选的菌株LC很可能产生组成型的纤维素酶。从透明圈大小来看，LC发酵液稀释10倍(A₁₀、B₁₀)和100倍(A₁₀₀、B₁₀₀)后仍显示明显透明圈，显示了较强的内切纤维素酶活力(中间D为饲料级纤维素酶(0.067IU/mLCMCase)产生透明圈情况)。

实施例2

本实施例说明从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis LC中提取酸性组成型内切纤维素酶LC的方法。

1、细胞培养：

固体培养基配方(g/L)：1.0KH₂PO₄，0.5MgSO₄·7H₂O，5.0酵母膏，10.0蛋白胨，固体培养基pH为7.0～7.5；

液体培养基配方(g/L)：3.0KH₂PO₄，0.3MgSO₄·7H₂O，5.0蔗糖，15.0蛋白胨，30mL/L玉米浆，种子液培养基pH为7.0，发酵培养基最适初始pH为5～5.5。

将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis LC接种于固体培养基，37℃培养10～12h后转接50mL/250mL液体种子培养基，37℃、200r/min条件下培养10～12h，以2％接种量再转接50mL/250mL液体发酵培养基37℃、200r/min条件下培养36h。

2、胞外产物粗酶液的处理：

将发酵液以10000r/min的转速冷冻离心10min，取上清，即得粗酶液；取20mL粗酶液于20mmol/L Na₂HPO₄-citrate pH7.0缓冲溶液中透析过夜；用聚乙二醇浓缩透析液，再经0.45μm微孔滤膜过滤除杂，保存滤液。

3、离子交换层析

本实施例所用DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换介质购自Amersham PharmaciaBiotech.，Uppsala，Sweden公司。BCA蛋白质测定试剂盒K3001，购自上海申能博采生物技术有限公司。Acrylamide、N，N-甲叉双丙稀酰胺由Serva进口分装。

具体步骤：将步骤2所得酶液进行两步DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换。预先用pH7.0Na₂HPO₄-citrate缓冲液充分平衡DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换柱，上样后用pH7.0Na₂HPO₄-citrate缓冲液洗脱，收集穿透峰，用含有1mol/L NaCl的pH7.0Na₂HPO₄-citrate缓冲液洗脱杂蛋白，柱子用pH9.0的Tris-HCl缓冲液重新平衡。将穿透峰浓缩调节pH至9.0，再次上样，采用0→1mol/LNaCl梯度洗脱，并收集有酶活的洗脱峰，将活性峰浓缩后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。DEAE-Sepharose FF离子交换柱条件如下：

①去除大部分杂蛋白

平衡缓冲：20mmol/L pH7.0的Na₂HPO₄-citrate缓冲液—A

洗脱缓冲：20mmol/L pH7.0的Na₂HPO₄-citrate缓冲液+1mol/L NaCl—B

上样流速：1.5mL/min

洗脱流速：1.5mL/min

洗脱方式：0％B和100％B分段洗脱，收集穿透峰。

②分离得到目标蛋白

平衡缓冲：20mmol/L pH9.0的Tris-HCl缓冲液—A

洗脱缓冲：20mmol/L pH9.0的Tris-HCl缓冲液+1mol/L NaCl—B

上样流速：1.5mL/min

洗脱流速：1.5mL/min

洗脱方式：0％B～100％B梯度洗脱，分管收集蛋白峰，检测酶活力和蛋白浓度，得到含β-1，4-内切纤维素酶活性峰的收集液。

SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳按常规方法进行。分离胶、浓缩胶浓度分别为12％和5％，电极缓冲液为pH8.3Tris-Gly缓冲，考马斯亮蓝染色。

将提取各个步骤内切纤维素酶液进行分析鉴定，结果如附图2所示。表明粗酶液依次经柱前脱盐浓缩处理、两步DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换后，在SDS-PAGE图谱上呈单一条带，达到电泳纯。

内切纤维素酶LC酶活测定方法为：

取1％的羧甲基纤维素钠(溶解于0.2mol/L柠檬酸缓冲液)1.0mL作为底物，加入0.5mL适当稀释的纤维素酶溶液，在特定条件下反应30min，用DNS法测定还原糖，并扣除空白试验测定值。将在上述条件下每分钟由底物产1μmol还原糖所需的酶量定义为一个活力单位，用IU/mL表示。

内切纤维素酶LC提取结果如表1所示。结果表明，该酶提纯了542.98倍，比活力达1650.67IU/mg，酶活回收率为61.91％。

表1 内切纤维素酶LC的分离提取

实施例3

本实施例说明从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis LC中提取的酸性组成型内切纤维素酶LC的相关性质：

(一)基本动力学常数K_m及最大反应速度V_max的测定

以不同浓度的CMC-Na作为底物，在最适催化温度(65℃)和最适pH(pH5.0)条件下，测定酶促反应速度，再用双倒数作图得到K_m值和V_max，如附图3所示，其中1/V＝0.05607+1.32496×1/S。

内切纤维素酶LC的米氏常数K_m为0.0423mg/mL，V_max为135.85mg/min。表明该内切纤维素酶LC对底物羧甲基纤维素钠的亲和性更强，有很强的催化能力。

(二)酶学性质

1、酶蛋白分子量的测定

用SDS-PAGE电泳发测定，结果如附图2。电泳后用GEL-DOC2000(Bio-Rad)进行凝胶扫描。运用扫描系统自带软件Quantity One进行分子量测定，测得内切纤维素酶LC酶蛋白分子量为29kD，属于低分子量内切纤维素酶(分子量25～50kD)。

2、酶的最适pH

用各种缓冲配制不同pH值的CMC-Na底物。将提取后的内切纤维素酶LC与不同pH值CMC-Na底物反应，65℃条件下反应30min，并检测CMCase活力，如附图4所示。内切纤维素酶LC在中性偏酸性的具有较高的活力，在pH5.0～7.0范围内具有很高的活力，达到最高酶活的80％以上，其最适反应pH为5.0，为酸性纤维素酶。

3、酶的pH稳定性

提取后的内切纤维素酶溶解于不同pH缓冲液中，20℃条件下放置2h后，测定纤维素酶相对活力，如附图5所示。结果表明该内切纤维素酶LC在较宽的pH范围内显示了高度的稳定性，在pH4.0～11.0的缓冲液中能保持其最高酶活85％以上，显示了良好的pH稳定性，在纺织、造纸以及食品加工行业有良好的应用潜力。

4、酶的最适反应温度

将内切纤维素酶LC纯酶分别放置于不同温度下反应30min，测定其酶活如附图6所示。结果表明内切纤维素酶LC在60～65℃反应时具有较高的活力，其最适温度为65℃。

5、酶的热稳定性

提取的酶液分别于25℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃放置2小时后65℃条件下反应30min，每隔10min取样一次，检测CMCase活力。结果如附图7所示，表明LC对温度较敏感，在低于40℃条件下处理2h酶活可保持80％以上，而在50℃和60℃处理30min，酶活残留69％和67％，70℃条件下酶活直线下降。可见该纤维素酶在40℃以下显示出良好的稳定性，在室温25℃条件下酶活基本不变。

6、金属离子对内切纤维素酶LC活力的影响

在三个浓度水平1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L探讨Na⁺、K⁺、Li⁺一价金属离子；Ca²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺二价金属离子；Fe³⁺三价金属离子以及EDTA对CMCase活力的影响。4℃下放置30min，65℃条件下反应30min，并检测CMCase活力。以不加金属离子的酶活为对照测定酶的相对活力。结果如附图8所示，低浓度(1mmol/L)的金属离子存在条件下，大部分金属离子可明显促进内切纤维素酶活力，1mmol/L的Cu²⁺可将酶活提高至原来的157.72％，；中等浓度(5mmol/L)的金属离子存在条件下，大部分金属离子可提高纤维素酶活力，其中Co²⁺、Cu²⁺的促进作用最显著，分别可将酶活提高至原来的136.6％和121.3％；高浓度(10mmol/L)的Fe²⁺可提高酶活力。此外实验发现不同浓度的EDTA对酶活力影响不大，推测内切纤维素酶LC很可能为非金属离子纤维素酶，金属离子对该酶有一定的促进作用。表明该酶符合纺织、造纸以及食品加工行业应用的基本要求。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化、均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110>南京工业大学

<120>一株组成型酸性内切纤维素酶高产菌株

<130>njut200808

<160>1

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>1542

<212>DNA

<213>Bacillus subtilis LC

<400>1

Claims

1.一株组成型酸性内切纤维素酶高产菌株，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)LC，保藏登记号：CCTCC NO：M 208073。