CN103642738B - 一株产内切菊粉酶的灰平链霉菌s501 及其培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一株产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501及其培养方法和应用。所述的产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501(Streptomyces griseoplanus)的保藏编号为CGMCC No.8185。所述的产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501具有较高的产酶活性，产酶活力可达121.62U/mL。利用所述的产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501和农产品为主要原料生产内切菊粉酶具有生产效率高，成本低的优点，能适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501(Streptomyces griseoplanus,CGMCC No.8185）及其培养方法以及利用该菌株生产内切菊粉酶的应用。
技术背景
菊粉(inulin)又称菊糖，主要来源于菊芋、菊苣、大丽花等植物，是由D-呋喃果糖分子经β-2,1糖苷键脱水聚合而成的线性直链多糖，其还原端含有一个葡萄糖残基，呈直链结构，聚合度通常在2～60，分子量为3000～5000碳单位，是一种功能性果聚糖和水溶性膳食纤维。菊粉作为一种纯天然的功能性食品配料，已被世界20多个国家批准为营养增补剂，广泛运用于乳制品、饮料、低脂低热量食品、焙烤食品、保健食品等。2009年，中国卫生部批准菊粉为新资源食品。
低聚果糖也称果寡糖、或蔗果低聚糖，是由β-D-果糖残基通过β-2,1糖苷键连接而成的直链低聚糖。常见低聚果糖为由酶法合成的蔗果低聚糖和由菊糖部分水解得到的全果糖低聚糖。二者在结构上稍有不同，但生理功能基本一样。其中，商业生产的全果糖低聚糖是从菊苣或菊芋根提取的菊糖经内切菊粉酶部分水解产生的，其聚合度通常小于9，甜度为蔗糖的30%。低聚果糖生理功能可归纳为降血压、胆固醇、血脂；改善肠道环境、促进肠道有益菌增殖(被称之为“益生元”因子，微生态促进剂)；防治便秘、预防结肠癌；促进矿物质吸收；预防肥胖症；不易引起血糖波动，作为糖尿病人甜味剂等，被誉为营养、保健、疗效三位一体的21世纪健康新糖原。
以微生物发酵获得内切菊粉酶，水解菊粉是生产全果糖低聚糖的主要方法。目前报道产菊粉酶的微生物包括鲁维酵母属、海洋酵母菌、青霉属、曲霉属、芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、节杆菌属、产微球茎菌属等，放线菌属则少有报道。其中产内切菊粉酶微生物主要集中于酵母菌属、青霉属、曲霉属。
尤其是产内切菊粉酶高效菌株少，并且筛选困难，因此筛选出高效、高活力的产内切菊粉酶菌株具有特别重要的科学研究意义和实际应用价值。
目前国内外报道产菊粉酶的微生物主要包括:芽孢杆菌属（Bacillus），梭状芽孢杆菌属（Clostridium hertmosuccinogenes）,节杆菌属(Arthrobacer),产微球茎菌属（Microbulbifer）,克鲁维酵母属(Kluveromyces),海洋酵母菌（Pichiaguilliermondii）,青霉属(Penicillium),曲霉属(Aspergillus)，而国内外报道的有关产内切菊粉酶的放线菌属文献则非常少，同时国外报道的产内切菊粉酶的放线菌的活性较低，通常只有几十个酶活力。
发明内容
为解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明的第一个目的是提供一株产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501（Streptomyces griseoplanus，CGMCC No.8185）。
本发明的另一个目的是提供上述产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501的培养方法。
本发明的第三个目的是提供一种利用上述产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501生产内切菊粉酶的应用。
本发明的技术方案如下：
一株产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501，其保藏编号为CGMCC No.8185。
所述的产内切菊粉酶菌株是发明人从鸭绿江滨海湿地海泥中分离得到的一株放线菌，经传统和分子生物学方法鉴定为灰平链霉菌Streptomycesgriseoplanus。
所述的灰平链霉菌S501已于2013年9月13日提交保藏，具体保藏信息如下：
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
保藏日期：2013年9月13日；
保藏编号：CGMCC No.8185。
所述的产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501（CGMCC No.8185）的形态特征为：在高氏培养基上28℃培养7天后，呈灰色，表面无光泽、粗糙、粉状，菌落边缘不平滑，基内菌丝呈黄色，不透明，孢子初期白色，成熟后灰色，孢子丝缠结，弯曲至松敞螺旋形，孢子浑圆形至卵圆形。
上述产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501的培养方法，包括以下步骤：取采集到的新鲜海泥5g，置于45ml无菌水中充分混匀，梯度稀释到10-4后涂布到ISP5培养基上，28℃培养5-7d，挑取单菌落并在以菊粉为唯一碳源的固体培养基上培养，挑取该培养基上生长出的菌落加入到液体培养基中进行摇瓶培养，采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)测定酶活，得到所述的产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501。
在一个优选的实施方案中，所述的ISP5培养基由包括以下含量的组分组成：
所述的ISP5培养基的pH为7.2；
优选的，所述的微量盐为质量比为1:1:1的MgCl2·7H2O、FeSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O。
在一个优选的实施方案中，所述的固体培养基由包括以下含量的组分组成：
所述固体培养基的pH为7.2。
在一个优选的实施方案中，所述的液体培养基由包括以下含量的组分组成：
所述液体培养基的pH为7.2。
在一个优选的实施方案中，所述的产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501的短期保存方法为，将产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501接种于含菊粉改良斜面高氏培养基上，于4℃冰箱内短期保存。
在一个优选的实施方案中，所述的产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501采用低温冷冻干燥法保存，使用前进行活化。
活化采用的培养基由包括以下含量的组分组成：
所述固体培养基的pH为7.2。
利用上述产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501生产内切菊粉酶的应用，包括以下步骤：将产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501加入产酶培养基中，采用摇瓶发酵法生产内切菊粉酶。
在一个优选的实施方案中，所述的产酶培养基由以下方法制得，将底物10g/L，KNO3 1g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L混合均匀，调节pH值到6.5，在121℃下高压灭菌30min得到产酶培养基。
所述的底物选自粗菊粉、香蕉皮、花生饼粉、玉米粉、大豆饼粉、米糠、麸皮或大蒜粉中的一种或一种以上，优选麸皮；
发明人发现，相同条件下以麸皮作为发酵底物，产菊粉酶活性最高，可达110.02U/ml，与粗菊粉为底物（95U/ml）相比提高显著，同时这些底物成本相对较低。
所述的产酶培养基的pH值为6.5-7.2，优选6.5。
pH与产酶活力关系密切，且不同微生物都有其最适生长pH值和一定的pH范围，即最高、最适与最低三个数值，在最适pH范围内微生物生长繁殖速度快，产酶活力高，在最低或最高pH值的环境中，微生物虽然能生存和生长，但生长非常缓慢而且容易死亡，影响酶活力的产量。发明人发现，产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501最佳的初始pH为6.5
在一个优选的实施方案中，所述的摇瓶发酵法工艺中的产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501的接种量为1-8vt%，优选6.5vt%(孢子数6-7×106个/mL)；培养温度为20-40℃，优选31℃；转速为150-250rpm/min，优选205rpm/min；发酵时间为24-120小时，优选48小时。
关于接种量，发明人发现产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501的最佳的接种量为6.5%。
关于培养温度，温度是影响微生物生长繁殖的重要因素之一，在最适温度，菌体代谢活动与生长繁殖均能到达最旺盛期，当温度高于或低于最适温度时，就会对菌体产生不利影响，菌体生长不旺盛，产酶不高。发明人发现培养过程中最佳培养温度为31℃。
关于发酵时间，发明人发现最佳的培养温度为48小时。
关于转速，转速对微生物的生长和产物形成有着重要的影响,直接影响微生物的酶的活性、代谢途径及产酶产量，通氧量少不利于菌体的生长，通氧量大，菌体生长过快，生成的次级代谢产物会阻遏菊粉酶的产生，故选择最适的转速对菊粉酶的产量有一定的影响。发明人发现产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501的最佳转速为205rpm/min。
利用上述内切菊粉酶可将菊粉酶解为低聚果糖。
和现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.目前国内外有关产内切菊粉酶的放线菌属文献则非常少，而本发明首次从鸭绿江滨海湿地的海泥里筛选出一株产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501(Streptomyces griseoplanus，CGMCC No.8185)。
2.目前国外报道的产内切菊粉酶的放线菌的活性较低，通常只有几十个酶活力，而本发明的产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501产酶活力可达121.62U/mL。
3.本发明确定了产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501的合适的培养基和培养条件，使得产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501能够得到有效的筛选和培养。
4.本发明中所述的产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501具有产酶活力高的优点，可以利用该产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501和农产品为主要原料生产内切菊粉酶，具有生产效率高，成本低的优点，能适合工业化生产。
附图说明
图1本发明灰平链霉菌S501于高氏培养基上培养形态图；
图2本发明灰平链霉菌S501扫描电子显微镜图；
图3本发明灰平链霉菌S501扫描电子显微镜图；
图4本发明灰平链霉菌S501系统发育树；
图5本发明灰平链霉菌S501产内切菊粉酶酶解菊粉为低聚果糖的TLC结果。其中:F果糖；S蔗糖；G葡萄糖；1,2酶解菊粉；3,4对照菊粉(未酶解)。
具体实施方式
下面以具体实施的方式对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。
如无特殊说明，本发明所用的仪器和试剂包括：菊粉，购自辽宁鞍山中兴生物技术有限公司；各种糖标准品、薄层层析板GF254，购自大连凯美特化学科技有限公司；紫外可见分光光度计（岛津UV2600）；其他试剂均为分析纯试剂。
如无特殊说明，本部分检测内切菊粉酶活性的DNS法和酶解产物的TLC法的条件为：
DNS：0.1mL酶液与0.9mL菊粉液（0.2mol/L，pH5.0醋酸缓冲溶液配制）在50℃下反应30min，沸水浴5min，取出冷却至室温，加入1.5ml 0.65%DNS溶液混合后沸水5min,取出立即冷却至室温,加蒸馏水定容到25ml,充分混匀后显色30min，在波长540nm处测定其吸光度值，根据果糖标准曲线计算样品中还原糖含量,从而计算出产酶活力。
TLC：展开剂：乙酸乙酯:无水乙醇:水:氨水(5:5:4:0.3,V/V)；
显色剂：二苯胺:苯胺:磷酸:丙酮(1:1:5:50,V/V)
一、菌株的分离筛选培养、保存、活化培养和鉴定
1.菌株的分离筛选培养
取采集到的新鲜海泥5g置于45ml无菌水中充分混匀，梯度稀释到10-4后涂布到ISP5培养基上，28℃培养5-7d，挑取单菌落并在以菊粉为唯一碳源的固体培养基上培养，挑取该培养基上生长出的菌落进行摇瓶培养，取培养液采用DNS法测定菊粉酶的活力。
ISP5培养基(g/L):酵母提取物5，L-天门冬酰胺1，丙三醇10，K2HPO4·3H2O1，KNO3 1，微量盐5，pH7.2。
微量盐：MgCl2·7H2O 0.1FeSO4·7H2O 0.1ZnSO4·7H2O 0.1100mL。
固体培养基(g/L):菊粉(Inulin)20,KNO3 1,NaCl 0.5,K2HPO4·3H2O 0.5，MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O 0.01,pH7.2，琼脂20。
液体培养基(g/L)：菊粉(Inulin)20,KNO3 1,NaCl 0.5,K2HPO4·3H2O 0.5，MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O 0.01,pH7.2。
本样品是通过自行采集的方式获得，由发明人于是2012年10月25日采自鸭绿江滨海湿地。
2.菌株保存及活化培养
筛选出的菌株可接种于含菊粉改良斜面高氏培养基上，于4℃冰箱内短期保存。
需长期保存的菌株采用低温冷冻干燥法保存，使用前活化：高氏培养基(g/L):菊粉20,KNO3 1,NaCl 0.5,K2HPO4·3H2O 0.5，MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O0.01,pH7.2,琼脂20；温度：28℃。
3.菌株的鉴定
采用微波法提取菌株S501的总DNA，利用设计引物进行PCR扩增，对PCR产物纯化及测序，在EzTaxon Server version2.1网站上搜索相近菌株序列，采用CLUSTAL-W软件进行比对，生成的比对文件用MEGA5.0软件，邻接法进行系统进化分析，构建发育树，确定了该菌株的分类地位。
通过菌株培养形态学特征和16S rRNA测序后核苷酸序列构建系统发育树，确定菌株编号为S501菌种属性与Streptomyces griseoplanus AS4.1868T(AY999894)为同一菌属，其相似度为100%，因此可确定其为该菌属放线菌属灰平链霉菌。其形态学特征如图1、图2和图3所示，系统发育树如图4所示。
本发明灰平链霉菌S501生产内切菊粉酶发酵工艺方法
二、本发明筛选影响菊粉酶产量的单因素条件：
1.底物对产菊粉酶的影响
选择的底物包括粗菊粉、香蕉皮、花生饼粉、玉米粉、大豆饼粉、米糠、麸皮和大蒜粉。实验结果显示，相同条件下以麸皮作为发酵底物，产菊粉酶活性最高，可达110.02U/ml，与粗菊粉为底物（95U/ml）相比提高显著，同时这些底物成本相对较低。
2.初始pH对产菊粉酶的影响
pH与产酶活力关系密切，且不同微生物都有其最适生长pH值和一定的pH范围，即最高、最适与最低三个数值，在最适pH范围内微生物生长繁殖速度快，产酶活力高，在最低或最高pH值的环境中，微生物虽然能生存和生长，但生长非常缓慢而且容易死亡，影响酶活力的产量。本实验结果显示菌株S501最佳的初始pH为6.5。
3.培养温度对产菊粉酶的影响
温度是影响微生物生长繁殖的重要因素之一，在最适温度，菌体代谢活动与生长繁殖均能到达最旺盛期，当温度高于或低于最适温度时，就会对菌体产生不利影响，菌体生长不旺盛，产酶不高。本实验最终确定其最佳培养温度为31℃。
4.发酵时间对产菊粉酶的影响
菌体培养在24-120h,每隔24h测定一次，确定其产酶活力最高的培养时间为48h。
5.接种量对产菊粉酶的影响
分别测定接种量为1%、2%、4%、6%和8%的发酵液菊粉酶活性，确定其最佳的接种量为6.0%。
6.转速对产菊粉酶的影响
转速对微生物的生长和产物形成有着重要的影响,直接影响微生物的酶的活性、代谢途径及产酶产量，通氧量少不利于菌体的生长，通氧量大，菌体生长过快，生成的次级代谢产物会阻遏菊粉酶的产生，故选择最适的转速对菊粉酶的产量有一定的影响。本实验显示菌株S501的最佳转速为200rpm/min。
三、响应面法优化菌株S501发酵工艺
响应面分析法(response surface methodology，RSM)是一种优化反应条件和加工工艺参数的有效方法，广泛应用于化学化工、生物工程、食品工业等方面。它与正交试验设计法不同，具有试验周期短，求得的回归方程精度高，能更好研究几种因素间交互作用等优点。因此采用响应面法对菌株S501发酵工艺条件进行优化。在单因素实验的基础上，利用SAS(Statistics Analysis System)9.1分析软件，通过Plackett-Burman实验设计筛选出底物、初始pH、培养温度、发酵时间、接种量和转速6个因素对菌株S501产菊粉酶影响显著的因素，再通过Box-Behnken实验设计,对发酵工艺进行优化，采用此方法确保了实验数据的真确性和可靠性。
通过Box-Behnken设计实验，最终得到该菌株产菊粉酶的最佳条件。发酵培养基为(g/L)：麸皮10，KNO3 1,K2HPO4·3H2O 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O0.01,pH6.5。培养条件为：接种量6.5%，转速205rpm/min，在31℃培养48h，在此条件下，该菌株产菊粉酶活力为121.62U/ml。
四、用本发明生产的内切菊粉酶制备低聚果糖试验
取2mL本发明制备的粗酶液与2mL菊粉液（0.2mol/L，pH5.0醋酸缓冲溶液配置）在50℃下反应12h，沸水浴5min，取出冷却至室温后，采用TLC方法检测。结果如附图5所示。
结果可以看出，采用本发明所筛选到的灰平链霉菌S501(CGMCC No.8185)所产生的内切菊粉酶可以菊粉为底物，并使其酶解产生低聚果糖，该酶具有很好的底物选择性。
附件：
序列表
SEQ ID No.1（产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501菌株的16S rRNA核苷酸序列）
TGCAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGC
CCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACTCTGTCCCGCATGGGACGGGG
TTAAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGG
CGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGA
CGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCC
GGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAG
AGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGG
CTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAAC
ACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGG
ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGC
CGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGG
GGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACAT
ATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTC
GTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGG
GGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCA
TGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATGCCGCGAGGCGGA
GCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTA
GTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAA
AGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGAT
GGACGAAGT
Claims (6)
1.一株产内切菊粉酶的灰平链霉菌(Streptomyces griseoplanus)S501，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.8185。
2.一种利用如权利要求1所述的产内切菊粉酶的灰平链霉菌(Streptomyces griseoplanus)S501生产内切菊粉酶的应用，其特征在于，包括以下步骤：将产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501加入产酶培养基中，采用摇瓶发酵法生产内切菊粉酶。
3.根据权利要求2所述的利用产内切菊粉酶的灰平链霉菌(Streptomyces griseoplanus)S501生产内切菊粉酶的方法，其特征在于，所述的产酶培养基由以下方法制得，将底物10g/L，KNO3 1g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L混合均匀，调节pH值到6.5，在121℃下高压灭菌30min得到产酶培养基，所述的底物选自粗菊粉、香蕉皮、花生饼粉、玉米粉、大豆饼粉、米糠、麸皮或大蒜粉中的一种或一种以上。
4.根据权利要求3所述的利用产内切菊粉酶的灰平链霉菌(Streptomyces griseoplanus)S501生产内切菊粉酶的应用，其特征在于，所述底物为麸皮。
5.根据权利要求2所述的利用产内切菊粉酶的灰平链霉菌(Streptomyces griseoplanus)S501生产内切菊粉酶的应用，其特征在于，所述的摇瓶发酵法工艺中的产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501的接种量为1-8％(v/v)，培养温度为20-40℃，转速为150-250rpm，发酵时间为24-120小时。
6.根据权利要求5所述的利用产内切菊粉酶的灰平链霉菌(Streptomyces griseoplanus)S501生产内切菊粉酶的应用，其特征在于，产内切菊粉酶的灰平链霉菌S501的接种量为6.5％(v/v)，培养温度为31℃；转速为205rpm；发酵时间48小时。
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| WO1998049277A2 (de) * | 1997-04-26 | 1998-11-05 | Tshisuaka Barbara I | Verfahren zur erzeugung eines endoinulinase produzierenden mikroorganismus und verfahren zur detektion von endoinulinase aktivität |
| CN1594542A (zh) * | 2003-08-19 | 2005-03-16 | 中国农业科学院饲料研究所 | 黑曲霉菊粉内切酶基因和表达该基因的重组毕赤酵母菌株 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Molecular and biochemical characterization of a new endoinulinase producing bacterial strain of Bacillus safensis AS-08;Singh RS et al;《Biologia》;20131020;第68卷(第6期);1028-1033 * |
| 菊粉化学和微生物菊粉内切酶研究进展;华承伟 等;《中国食品学报》;20041231;第4卷(第4期);103-108 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103642738A (zh) | 2014-03-19 |
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