CN102851220B - 高产β-半乳糖苷酶的酵母菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株高产β-半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。该菌株2011年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC No.5293。其产酶量达到出发菌株的5倍，经3吨发酵罐培养后酶活仍能保持较高水平；本发明还提供胞内β-半乳糖苷酶的高压均质、膜过滤分离提取技术；并通过一步酶转化乳糖溶液获得低聚半乳糖组分大于60wt％的产品。本发明突破了低聚半乳糖生产中关键环节的瓶颈问题，大幅度降低了生产成本，具有良好的工业化价值。
Description
技术领域
本发明涉及高产β-半乳糖苷酶的酵母菌株及其应用，特别是一株经过离子束注入诱变选育获得的能够高产β-半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
低聚半乳糖(Galactooligosaccharides，GOS)是一种具有天然属性的功能性低聚糖，其分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1-7个半乳糖基。在自然界中，动物的乳汁中存在微量的GOS，而人母乳中含量较多，婴儿体内的双歧杆菌菌群的建立很大程度上依赖母乳中的GOS成分。低聚半乳糖具有双歧杆菌增殖效果好、生产原料来源广、耐酸耐热性能好等优点。目前，生产低聚半乳糖的厂家主要在日本，国内低聚半乳糖尚未形成规模生产，大部分处在研究阶段。
β-半乳糖苷酶(又称乳糖酶)是制备低聚半乳糖的关键酶制剂，它能在特定的条件下水解β-D-半乳糖苷键，将乳糖水解成α-D-葡萄糖和β-D-半乳糖，β-半乳糖苷酶同时也具有半乳糖苷转移作用，能把半乳糖连接到半乳糖和葡萄糖上，生成低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶一般都是从微生物中得到，根据不同来源可分为胞内水解酶和胞外水解酶，其中黑曲霉、米曲霉和米根霉等所产生的β-半乳糖苷酶均为胞外水解酶，脆壁克鲁维酵母和大部分细菌所产生的β-半乳糖苷酶均为胞内水解酶。自然界分离出的菌种生产能力低，故而β-半乳糖苷酶的产量往往不能满足工业上的需要。因此，人工诱变方法常用于菌种选育，以获得高产目标代谢物的优良菌株，紫外诱变、化学诱变以及两者复合诱变是常用的诱变源。离子束注入与传统诱变源相比，除了具有能量沉积效应外，还有动量传递、质量沉积及电荷的中和与交换效应，能够在低剂量注入、细胞损伤较轻的情况下，诱发生物细胞的生理、生化性能和碱基改变，引起染色体结构变异。王岁楼等(食品科学，2009，Vol.30，No.05，135-140)用低能N+注入黏红酵母高压突变株，使其β-胡萝卜素产量由出发菌株的9.64mg/L提高到17.36mg/L，增加了80.08％。王菊芳等(原子核物理评论，第26卷，第3期)利用C离子束对高产酒精酵母菌株进行了辐照诱变，得到5株产酒精能力提高的突变酵母菌，T4突变株的产酒精能力比原始出发菌株提高了18.6％。
胞内酶的分离提取技术属于生物工程下游技术，一般包括细胞破碎、酶与细胞碎片分离、酶纯化、酶浓缩等步骤。专利文件CN1916170A(申请号200610010516.X)介绍了一种中性乳糖酶的提取方法，包括酶法预破壁处理、冻融破壁、高压匀浆破壁三道工序，但是该方法工艺设备要求高、生产成本高，很难满足工业化生产的要求。本发明中的β-半乳糖苷酶为胞内酶，β-半乳糖苷酶高效、低成本分离提取技术是实现低聚半乳糖产业化的必要条件。
β-半乳糖苷酶对乳糖的水解、转苷反应存在产物抑制现象，导致乳糖水解率低、低聚半乳糖含量不符合要求等问题，后续常需要增加膜分离、色谱分离或进一步发酵等工序来提高低聚半乳糖含量，这些工序降低了产品收率，使生产成本大幅度增加。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株高产β-半乳糖苷酶的酵母菌株及其应用。
发明概述
本发明通过离子束注入方法诱变选育一株高产β-半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22，产酶量达到出发菌株的5倍，经3吨发酵罐培养后酶活仍能保持较高水平；开发出胞内β-半乳糖苷酶的高压均质、膜过滤分离提取技术；并通过一步酶转化乳糖溶液获得低聚半乳糖组分大于60％的产品。本发明突破了低聚半乳糖生产中关键环节的瓶颈问题，大幅度降低了生产成本，具有良好的工业化价值。
发明详述
一株高产β-半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22，该菌株2011年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC No.5293。
上述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22在制备β-半乳糖苷酶中的应用。所述应用，步骤如下：
(1)取脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22接种至斜面培养基，在温度28-30℃培养14-38小时，然后用生理盐水将菌种从斜面培养基洗下，得菌液；
(2)将步骤(1)制得的菌液接种至种子培养基，在温度28-30℃、压力0.05-0.15MPa、溶解氧饱和度2％-40％的条件下，培养时间10-38h，得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液接种至发酵培养基，在28-30℃、压力0.03-0.15MPa，溶氧量1％-40％的条件下，培养时间10-40h，得发酵液；
(4)将步骤(3)制得的发酵液分离菌体后，破碎菌体，然后用截留分子量为50,000-300,000Da的卷式超滤膜过滤，取滤液即为β-半乳糖苷酶酶液。
所述步骤(1)中的斜面培养基组分如下：
酵母膏1-15g/L，蛋白胨1-30g/L，葡萄糖10-40g/L，磷酸氢二钠0.5-2g/L，琼脂20g/L，pH 5.0-7.0。
所述步骤(2)中的种子培养基组分如下：
酵母膏1-15g/L，蛋白胨1-30g/L，葡萄糖10-40g/L，磷酸氢二钠0.5-2g/L，pH 5.0-7.0。
所述步骤(3)中的发酵培养基组分如下：
酵母膏1-15g/L，蛋白胨1-30g/L，乳糖10-40g/L，pH 5.0-7.0。
所述步骤(4)中的分离菌体，发酵液在离心力2000g-8000g的条件下离心，取沉淀，0.01-0.5M磷酸盐缓冲液悬浮，即得β-半乳糖苷酶酶液。
所述步骤(4)中的破碎菌体是指在均质压力30MPa-100MPa的条件下，经均质机破碎获得；或者，在冰水浴、400-750W的条件下，超声波处理。
上述超声波处理，步骤为超声波处理3-4s、停止超声波处理10-12s，重复该处理步骤15-25次。间歇时间大于处理时间，有利于保护酶的活性。
上述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22在制备低聚半乳糖中的应用。所述应用，步骤如下：
(1)将上述步骤制得的β-半乳糖苷酶酶液加入至浓度为200-550g/L乳糖溶液中，β-半乳糖苷酶的加入量为每克乳糖添加5-40U，pH 5.0-7.5，得混合液；
(2)将步骤(1)制得的混合液在30-50℃的条件下，反应20-45h，得低聚半乳糖粗液；
(3)将步骤(2)制得的低聚半乳糖粗液经灭酶活、脱色过滤、离交、浓缩，得低聚半乳糖。
最终制得的低聚半乳糖中，固形物含量大于75wt％、低聚半乳糖组分高于60wt％。
本发明的有益效果
1、本发明所述高产β-半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22经离子束注入诱变获得，菌株生产性状稳定，经过20代传代转接，酶活仍保持筛选后水平；克服了现有菌株β-半乳糖苷酶产量低、低聚半乳糖制备成本高的缺陷，具有良好的工业化价值。
2、本发明采用高压均质、膜过滤组合方法分离提取胞内β-半乳糖苷酶，酶活损失少，工艺简单，酶的分离提取成本大大降低。
3、本发明采用一步酶转化工艺制备低聚半乳糖含量大于60wt％的产品，省去膜分离、色谱分离或进一步发酵等工序，提高了产品收率，极大降低了生产成本。
附图说明
图1是实施例1制得的低聚半乳糖成品HPLC色谱图；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中所述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22于2011年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC No.5293。
实施例1
野生型脆壁克鲁维酵母菌株的获得
从北京某奶牛厂奶牛鲜乳中筛选得到脆壁克鲁维酵母菌株，操作方法如下：
(1)取5mL鲜乳样品，加入以乳糖为唯一碳源的50mL富集选择培养基中，28-30℃富集培养48h；用灭菌生理盐水以10倍的稀释梯度对样品进行稀释。选取10-3、10-5、10-7三个稀释梯度，分别吸取0.2mL样品稀释液均匀涂布于富集选择平板培养基上，28℃培养72h，得酵母菌落；
上述富集选择培养基，组分为：乳糖15g/L，土豆汁200g/L，pH 6.5-7.0，
上述富集选择平板培养基，组分为：乳糖15g/L，土豆汁200g/L，琼脂20g/L，pH 6.5-7.0；
(2)挑取步骤(1)制得的酵母菌落，通过平板划线进行分离纯化，重复三次，得到纯化菌株；
(3)将步骤(2)制得的纯化菌株分别接种于产酶发酵培养基中，28-30℃摇床培养20h，摇床转速150rpm，得菌液；
所述产酶发酵培养基为：乳糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，磷酸氢二钠2g/L，pH 6.5-7.0；
(4)取50mL步骤(3)制得的菌液以5,000rpm离心5分钟，收集细胞，并用5mL生理盐水悬浮，得细胞悬液；
(5)将步骤(4)制得的细胞悬液50μL与1mg/mL邻硝基苯酚-β-D半乳糖苷(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG)溶液按菌细胞悬液∶ONPG溶液＝1∶20的比例混合(v/v)，35℃反应15分钟，得反应液；
(6)向步骤(5)制得的反应液中加0.15mol/L Na2CO3溶液2mL终止反应，以10,000rpm离心5分钟，收集上清液；
(7)如果上清液呈黄色，说明原无色的ONPG被β-半乳糖苷酶水解成了黄色的邻硝基苯酚，即证明该菌细胞含有β-半乳糖苷酶，即为产β-半乳糖苷酶菌株；并将该产β-半乳糖苷酶菌株接种至斜面培养基，28℃培养48h，置4℃冰箱保藏，得野生型脆壁克鲁维酵母菌株；
所述斜面培养基为：葡萄糖40g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，磷酸氢二钠2g/L，琼脂20g/L，pH 6.5-7.0。
脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22的筛选
取上述经斜面培养的野生型脆壁克鲁维酵母菌株，用无菌水制成105细胞悬液，将0.5ml细胞悬液分装于无菌平皿内，无菌风吹干，在微生物专用小室内进行低能离子束注入处理，离子束参数为：注入离子为N+，能量为50Kev，剂量为300×1013ions/cm2，将经过离子束处理的菌液用无菌水稀释100倍后，取0.1mL涂平板(组分：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖40g/L，磷酸氢二钠2g/L，琼脂20g/L，pH 6.5)，30℃培养36h。从中挑取单菌落转接于装有50mL液体发酵培养基的500mL摇瓶中，于30℃，200rpm旋转摇床培养20h，离心收集菌体，用0.1M磷酸盐缓冲液稀释菌体细胞至109倍，该细胞悬液用超声波破碎，超声条件：在冰水浴、500W的条件下，超声波处理3s、停止超声波处理12s，然后重复该处理步骤15个循环；离心，测定上清液中β-半乳糖苷酶酶活(经试验数据比对，高压均质和超声波对酵母细胞均有较好的破碎效果，两种方法获得的酶活无显著差异，摇瓶筛选阶段采用超声波破碎提取β-半乳糖苷酶可缩短试验时间，提高筛选效率)。经过4批次的诱变筛选，正突变率10.7％-20.3％，酶活单位比出发菌株提高2.5-4.0倍，结果如表1所示。
表1诱变前后菌株产酶量变化
酶活测定方法：取2ml ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)，固体4℃避光保存，用pH7.0的缓冲液配成1mg/mL；于35℃预热10min，加0.5ml酶液准确反应15min，加0.15MNa2CO3溶液2.5ml终止反应，放置2-3min，420nm测吸光度。结果如图1所示。
酶活计算公式：Y＝3.25A×N(A：吸光度，Y：酶活，单位U/mL，N：酶液稀释倍数)。
将诱变后获得的酶活为115U/mL的菌株在斜面培养基中进行20代转接培养，经测定酶活仍高达110U/mL，经3吨发酵罐培养后酶活仍能保持较高水平。该菌株2011年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCCNo.5293。
实施例2
上述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22在制备β-半乳糖苷酶中的应用，步骤如下：
(1)将保藏号为CGMCC No.5293的脆壁克鲁维酵母菌株BLB-22进行斜面培养，斜面细胞用生理盐水洗下接入三角瓶中，得菌液；
(2)在无菌状态下将步骤(1)制得的菌液接入发酵罐中的种子培养基，种子培养基组分为：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖40g/L，磷酸氢二钠2g/L，pH 6.5。种子罐为30L外循环气升式发酵罐，培养温度30℃，罐压0.1MPa，通气量1m3/h，溶解氧饱和度20％，培养时间30h，得一级种子液；
将上述一级种子液用无菌空气压入二级发酵罐中的种子培养基中，二级种子罐为300L外循环气升式发酵罐，培养温度30℃，罐压0.1MPa，通气量8m3/h，培养时间30h，得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液用无菌空气压入发酵培养罐中的发酵培养基，发酵培养基组分为：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，pH 6.5。发酵罐为3吨外循环气升式发酵罐，培养温度30℃，罐压0.1MPa，通气量80m3/h，溶解氧饱和度20％，培养时间30h，得发酵液；
(4)将步骤(3)制得的发酵液泵入碟式离心机，离心力5000g，离心后获得的菌体用其重量5倍的0.1M磷酸盐缓冲液稀释，得到细胞悬液，细胞悬液经均质机破碎，使胞内β-半乳糖苷酶游离出来，均质压力维持在55MPa-60MPa。均质后料液用截留分子量为300,000Da的卷式超滤膜过滤，除去酵母细胞碎片，得到β-半乳糖苷酶酶液。
酶活经测定达到110U/mL，测定方法同实施例1。
实施例3
上述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株在制备低聚半乳糖中的应用，步骤如下：
(1)配制浓度为400g/L的乳糖溶液，加入实施例2制得的β-半乳糖苷酶酶液，β-半乳糖苷酶的加入量为每克乳糖添加10U，调pH 6.0，得混合液；
(2)将步骤(1)制得的混合液在35-45℃的条件下，反应28h，HPLC测定低聚半乳糖组分达到63wt％后，得低聚半乳糖粗液；
(3)将步骤(2)制得的低聚半乳糖粗液盐酸调节料液pH至6.0，添加粉末活性炭，70℃维持30min，达到灭酶、脱色效果，料液经板框过滤机压滤除去不溶物。料液分别用强酸性阳离子-弱碱性阴离子-强酸性阳离子交换树脂脱盐，控制出料电导≤100μs/cm，出柱pH2.8-3.8。离交后料液经双效蒸发器浓缩固形物至75wt％，经测定成品中低聚半乳糖含量为61.7wt％，结果见表2，各项指标符合卫生部公告(2008年第20号)对低聚半乳糖的要求。
表2低聚半乳糖成品中主要组分及其含量
Claims (2)
1.高产β-半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis）菌株BLB-22，该菌株2011年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC No.5293。
2.权利要求1所述脆壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis）菌株BLB-22在制备β-半乳糖苷酶中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下：
（1）取脆壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis）菌株BLB-22接种至斜面培养基，在温度28-30℃培养14－38小时，然后用生理盐水将菌种从斜面培养基洗下，得菌液；
（2）将步骤（1）制得的菌液接种至种子培养基，在温度28-30℃、压力0.05-0.15MPa、溶解氧饱和度2%-40%的条件下，培养时间10-38h，得种子液；
（3）将步骤（2）制得的种子液接种至发酵培养基，在28-30℃、压力0.03-0.15MPa，溶氧量1%-40%的条件下，培养时间10-40h，得发酵液；
（4）将步骤（3）制得的发酵液分离菌体后，破碎菌体，然后用截留分子量为50,000-300,000Da的卷式超滤膜过滤，取滤液即为β-半乳糖苷酶酶液。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中的斜面培养基组分如下：
酵母膏1-15g/L，蛋白胨1-30g/L，葡萄糖10-40g/L，磷酸氢二钠0.5-2g/L，琼脂20g/L，pH 5.0-7.0。
5. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中的种子培养基组分如下：
酵母膏1-15g/L，蛋白胨1-30g/L，葡萄糖10-40g/L，磷酸氢二钠0.5-2g/L，pH 5.0-7.0。
6. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中的发酵培养基组分如下：
酵母膏1-15g/L，蛋白胨1-30g/L，乳糖10-40g/L， pH 5.0-7.0。
7. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（4）中的分离菌体采用以下方法获得：发酵液在离心力2000g-8000g的条件下离心，取沉淀，0.01-0.5M磷酸盐缓冲液悬浮，即得。
8. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（4）中的破碎菌体是指在均质压力30MPa-100MPa的条件下，经均质机破碎获得；或者，在冰水浴、400-750W的条件下，超声波处理。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，上述超声波处理，步骤为超声波处理3-4s、停止超声波处理10-12s，重复该处理步骤15-25次。
10. 权利要求1所述脆壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis）菌株BLB-22在制备低聚半乳糖中的应用。
11. 如权利要求10所述的应用，其特征在于，步骤如下：
（1）将权利要求3制得的β-半乳糖苷酶酶液加入至浓度为200-550g/L乳糖溶液中，β-半乳糖苷酶的加入量为每克乳糖添加5-40U，pH 5.0-7.5，得混合液；
（2）将步骤（1）制得的混合液在30-50℃的条件下，反应20-45h，得低聚半乳糖粗液；
（3）将步骤（2）制得的低聚半乳糖粗液经灭酶活、脱色过滤、离交、浓缩，得低聚半乳糖。
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| GR01 | Patent grant |