CN102851220B - 高产β-半乳糖苷酶的酵母菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株高产β-半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22及其培养方法与应用,属于微生物技术领域。该菌株2011年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,菌种保藏编号为CGMCC No.5293。其产酶量达到出发菌株的5倍,经3吨发酵罐培养后酶活仍能保持较高水平;本发明还提供胞内β-半乳糖苷酶的高压均质、膜过滤分离提取技术;并通过一步酶转化乳糖溶液获得低聚半乳糖组分大于60wt%的产品。本发明突破了低聚半乳糖生产中关键环节的瓶颈问题,大幅度降低了生产成本,具有良好的工业化价值。

Description

高产β-半乳糖苷酶的酵母菌株及其应用
技术领域
本发明涉及高产β-半乳糖苷酶的酵母菌株及其应用,特别是一株经过离子束注入诱变选育获得的能够高产β-半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株及其应用,属于微生物技术领域。
背景技术
低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)是一种具有天然属性的功能性低聚糖,其分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1-7个半乳糖基。在自然界中,动物的乳汁中存在微量的GOS,而人母乳中含量较多,婴儿体内的双歧杆菌菌群的建立很大程度上依赖母乳中的GOS成分。低聚半乳糖具有双歧杆菌增殖效果好、生产原料来源广、耐酸耐热性能好等优点。目前,生产低聚半乳糖的厂家主要在日本,国内低聚半乳糖尚未形成规模生产,大部分处在研究阶段。
β-半乳糖苷酶(又称乳糖酶)是制备低聚半乳糖的关键酶制剂,它能在特定的条件下水解β-D-半乳糖苷键,将乳糖水解成α-D-葡萄糖和β-D-半乳糖,β-半乳糖苷酶同时也具有半乳糖苷转移作用,能把半乳糖连接到半乳糖和葡萄糖上,生成低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶一般都是从微生物中得到,根据不同来源可分为胞内水解酶和胞外水解酶,其中黑曲霉、米曲霉和米根霉等所产生的β-半乳糖苷酶均为胞外水解酶,脆壁克鲁维酵母和大部分细菌所产生的β-半乳糖苷酶均为胞内水解酶。自然界分离出的菌种生产能力低,故而β-半乳糖苷酶的产量往往不能满足工业上的需要。因此,人工诱变方法常用于菌种选育,以获得高产目标代谢物的优良菌株,紫外诱变、化学诱变以及两者复合诱变是常用的诱变源。离子束注入与传统诱变源相比,除了具有能量沉积效应外,还有动量传递、质量沉积及电荷的中和与交换效应,能够在低剂量注入、细胞损伤较轻的情况下,诱发生物细胞的生理、生化性能和碱基改变,引起染色体结构变异。王岁楼等(食品科学,2009,Vol.30,No.05,135-140)用低能N+注入黏红酵母高压突变株,使其β-胡萝卜素产量由出发菌株的9.64mg/L提高到17.36mg/L,增加了80.08%。王菊芳等(原子核物理评论,第26卷,第3期)利用C离子束对高产酒精酵母菌株进行了辐照诱变,得到5株产酒精能力提高的突变酵母菌,T4突变株的产酒精能力比原始出发菌株提高了18.6%。
胞内酶的分离提取技术属于生物工程下游技术,一般包括细胞破碎、酶与细胞碎片分离、酶纯化、酶浓缩等步骤。专利文件CN1916170A(申请号200610010516.X)介绍了一种中性乳糖酶的提取方法,包括酶法预破壁处理、冻融破壁、高压匀浆破壁三道工序,但是该方法工艺设备要求高、生产成本高,很难满足工业化生产的要求。本发明中的β-半乳糖苷酶为胞内酶,β-半乳糖苷酶高效、低成本分离提取技术是实现低聚半乳糖产业化的必要条件。
β-半乳糖苷酶对乳糖的水解、转苷反应存在产物抑制现象,导致乳糖水解率低、低聚半乳糖含量不符合要求等问题,后续常需要增加膜分离、色谱分离或进一步发酵等工序来提高低聚半乳糖含量,这些工序降低了产品收率,使生产成本大幅度增加。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,提供一株高产β-半乳糖苷酶的酵母菌株及其应用。
发明概述
本发明通过离子束注入方法诱变选育一株高产β-半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22,产酶量达到出发菌株的5倍,经3吨发酵罐培养后酶活仍能保持较高水平;开发出胞内β-半乳糖苷酶的高压均质、膜过滤分离提取技术;并通过一步酶转化乳糖溶液获得低聚半乳糖组分大于60%的产品。本发明突破了低聚半乳糖生产中关键环节的瓶颈问题,大幅度降低了生产成本,具有良好的工业化价值。
发明详述
一株高产β-半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22,该菌株2011年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,菌种保藏编号为CGMCC No.5293。
上述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22在制备β-半乳糖苷酶中的应用。所述应用,步骤如下:
(1)取脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22接种至斜面培养基,在温度28-30℃培养14-38小时,然后用生理盐水将菌种从斜面培养基洗下,得菌液;
(2)将步骤(1)制得的菌液接种至种子培养基,在温度28-30℃、压力0.05-0.15MPa、溶解氧饱和度2%-40%的条件下,培养时间10-38h,得种子液;
(3)将步骤(2)制得的种子液接种至发酵培养基,在28-30℃、压力0.03-0.15MPa,溶氧量1%-40%的条件下,培养时间10-40h,得发酵液;
(4)将步骤(3)制得的发酵液分离菌体后,破碎菌体,然后用截留分子量为50,000-300,000Da的卷式超滤膜过滤,取滤液即为β-半乳糖苷酶酶液。
所述步骤(1)中的斜面培养基组分如下:
酵母膏1-15g/L,蛋白胨1-30g/L,葡萄糖10-40g/L,磷酸氢二钠0.5-2g/L,琼脂20g/L,pH 5.0-7.0。
所述步骤(2)中的种子培养基组分如下:
酵母膏1-15g/L,蛋白胨1-30g/L,葡萄糖10-40g/L,磷酸氢二钠0.5-2g/L,pH 5.0-7.0。
所述步骤(3)中的发酵培养基组分如下:
酵母膏1-15g/L,蛋白胨1-30g/L,乳糖10-40g/L,pH 5.0-7.0。
所述步骤(4)中的分离菌体,发酵液在离心力2000g-8000g的条件下离心,取沉淀,0.01-0.5M磷酸盐缓冲液悬浮,即得β-半乳糖苷酶酶液。
所述步骤(4)中的破碎菌体是指在均质压力30MPa-100MPa的条件下,经均质机破碎获得;或者,在冰水浴、400-750W的条件下,超声波处理。
上述超声波处理,步骤为超声波处理3-4s、停止超声波处理10-12s,重复该处理步骤15-25次。间歇时间大于处理时间,有利于保护酶的活性。
上述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22在制备低聚半乳糖中的应用。所述应用,步骤如下:
(1)将上述步骤制得的β-半乳糖苷酶酶液加入至浓度为200-550g/L乳糖溶液中,β-半乳糖苷酶的加入量为每克乳糖添加5-40U,pH 5.0-7.5,得混合液;
(2)将步骤(1)制得的混合液在30-50℃的条件下,反应20-45h,得低聚半乳糖粗液;
(3)将步骤(2)制得的低聚半乳糖粗液经灭酶活、脱色过滤、离交、浓缩,得低聚半乳糖。
最终制得的低聚半乳糖中,固形物含量大于75wt%、低聚半乳糖组分高于60wt%。
本发明的有益效果
1、本发明所述高产β-半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22经离子束注入诱变获得,菌株生产性状稳定,经过20代传代转接,酶活仍保持筛选后水平;克服了现有菌株β-半乳糖苷酶产量低、低聚半乳糖制备成本高的缺陷,具有良好的工业化价值。
2、本发明采用高压均质、膜过滤组合方法分离提取胞内β-半乳糖苷酶,酶活损失少,工艺简单,酶的分离提取成本大大降低。
3、本发明采用一步酶转化工艺制备低聚半乳糖含量大于60wt%的产品,省去膜分离、色谱分离或进一步发酵等工序,提高了产品收率,极大降低了生产成本。
附图说明
图1是实施例1制得的低聚半乳糖成品HPLC色谱图;
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步阐述,但本发明所保护范围不限于此。
实施例中所述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22于2011年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,菌种保藏编号为CGMCC No.5293。
实施例1
野生型脆壁克鲁维酵母菌株的获得
从北京某奶牛厂奶牛鲜乳中筛选得到脆壁克鲁维酵母菌株,操作方法如下:
(1)取5mL鲜乳样品,加入以乳糖为唯一碳源的50mL富集选择培养基中,28-30℃富集培养48h;用灭菌生理盐水以10倍的稀释梯度对样品进行稀释。选取10-3、10-5、10-7三个稀释梯度,分别吸取0.2mL样品稀释液均匀涂布于富集选择平板培养基上,28℃培养72h,得酵母菌落;
上述富集选择培养基,组分为:乳糖15g/L,土豆汁200g/L,pH 6.5-7.0,
上述富集选择平板培养基,组分为:乳糖15g/L,土豆汁200g/L,琼脂20g/L,pH 6.5-7.0;
(2)挑取步骤(1)制得的酵母菌落,通过平板划线进行分离纯化,重复三次,得到纯化菌株;
(3)将步骤(2)制得的纯化菌株分别接种于产酶发酵培养基中,28-30℃摇床培养20h,摇床转速150rpm,得菌液;
所述产酶发酵培养基为:乳糖20g/L,酵母膏10g/L,蛋白胨20g/L,磷酸氢二钠2g/L,pH 6.5-7.0;
(4)取50mL步骤(3)制得的菌液以5,000rpm离心5分钟,收集细胞,并用5mL生理盐水悬浮,得细胞悬液;
(5)将步骤(4)制得的细胞悬液50μL与1mg/mL邻硝基苯酚-β-D半乳糖苷(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG)溶液按菌细胞悬液∶ONPG溶液=1∶20的比例混合(v/v),35℃反应15分钟,得反应液;
(6)向步骤(5)制得的反应液中加0.15mol/L Na2CO3溶液2mL终止反应,以10,000rpm离心5分钟,收集上清液;
(7)如果上清液呈黄色,说明原无色的ONPG被β-半乳糖苷酶水解成了黄色的邻硝基苯酚,即证明该菌细胞含有β-半乳糖苷酶,即为产β-半乳糖苷酶菌株;并将该产β-半乳糖苷酶菌株接种至斜面培养基,28℃培养48h,置4℃冰箱保藏,得野生型脆壁克鲁维酵母菌株;
所述斜面培养基为:葡萄糖40g/L,酵母膏10g/L,蛋白胨20g/L,磷酸氢二钠2g/L,琼脂20g/L,pH 6.5-7.0。
脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22的筛选
取上述经斜面培养的野生型脆壁克鲁维酵母菌株,用无菌水制成105细胞悬液,将0.5ml细胞悬液分装于无菌平皿内,无菌风吹干,在微生物专用小室内进行低能离子束注入处理,离子束参数为:注入离子为N+,能量为50Kev,剂量为300×1013ions/cm2,将经过离子束处理的菌液用无菌水稀释100倍后,取0.1mL涂平板(组分:酵母膏10g/L,蛋白胨20g/L,葡萄糖40g/L,磷酸氢二钠2g/L,琼脂20g/L,pH 6.5),30℃培养36h。从中挑取单菌落转接于装有50mL液体发酵培养基的500mL摇瓶中,于30℃,200rpm旋转摇床培养20h,离心收集菌体,用0.1M磷酸盐缓冲液稀释菌体细胞至109倍,该细胞悬液用超声波破碎,超声条件:在冰水浴、500W的条件下,超声波处理3s、停止超声波处理12s,然后重复该处理步骤15个循环;离心,测定上清液中β-半乳糖苷酶酶活(经试验数据比对,高压均质和超声波对酵母细胞均有较好的破碎效果,两种方法获得的酶活无显著差异,摇瓶筛选阶段采用超声波破碎提取β-半乳糖苷酶可缩短试验时间,提高筛选效率)。经过4批次的诱变筛选,正突变率10.7%-20.3%,酶活单位比出发菌株提高2.5-4.0倍,结果如表1所示。
表1诱变前后菌株产酶量变化
Figure BDA0000101839510000041
酶活测定方法:取2ml ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷),固体4℃避光保存,用pH7.0的缓冲液配成1mg/mL;于35℃预热10min,加0.5ml酶液准确反应15min,加0.15MNa2CO3溶液2.5ml终止反应,放置2-3min,420nm测吸光度。结果如图1所示。
酶活计算公式:Y=3.25A×N(A:吸光度,Y:酶活,单位U/mL,N:酶液稀释倍数)。
将诱变后获得的酶活为115U/mL的菌株在斜面培养基中进行20代转接培养,经测定酶活仍高达110U/mL,经3吨发酵罐培养后酶活仍能保持较高水平。该菌株2011年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种保藏编号为CGMCCNo.5293。
实施例2
上述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22在制备β-半乳糖苷酶中的应用,步骤如下:
(1)将保藏号为CGMCC No.5293的脆壁克鲁维酵母菌株BLB-22进行斜面培养,斜面细胞用生理盐水洗下接入三角瓶中,得菌液;
(2)在无菌状态下将步骤(1)制得的菌液接入发酵罐中的种子培养基,种子培养基组分为:酵母膏10g/L,蛋白胨20g/L,葡萄糖40g/L,磷酸氢二钠2g/L,pH 6.5。种子罐为30L外循环气升式发酵罐,培养温度30℃,罐压0.1MPa,通气量1m3/h,溶解氧饱和度20%,培养时间30h,得一级种子液;
将上述一级种子液用无菌空气压入二级发酵罐中的种子培养基中,二级种子罐为300L外循环气升式发酵罐,培养温度30℃,罐压0.1MPa,通气量8m3/h,培养时间30h,得种子液;
(3)将步骤(2)制得的种子液用无菌空气压入发酵培养罐中的发酵培养基,发酵培养基组分为:酵母膏10g/L,蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L,pH 6.5。发酵罐为3吨外循环气升式发酵罐,培养温度30℃,罐压0.1MPa,通气量80m3/h,溶解氧饱和度20%,培养时间30h,得发酵液;
(4)将步骤(3)制得的发酵液泵入碟式离心机,离心力5000g,离心后获得的菌体用其重量5倍的0.1M磷酸盐缓冲液稀释,得到细胞悬液,细胞悬液经均质机破碎,使胞内β-半乳糖苷酶游离出来,均质压力维持在55MPa-60MPa。均质后料液用截留分子量为300,000Da的卷式超滤膜过滤,除去酵母细胞碎片,得到β-半乳糖苷酶酶液。
酶活经测定达到110U/mL,测定方法同实施例1。
实施例3
上述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株在制备低聚半乳糖中的应用,步骤如下:
(1)配制浓度为400g/L的乳糖溶液,加入实施例2制得的β-半乳糖苷酶酶液,β-半乳糖苷酶的加入量为每克乳糖添加10U,调pH 6.0,得混合液;
(2)将步骤(1)制得的混合液在35-45℃的条件下,反应28h,HPLC测定低聚半乳糖组分达到63wt%后,得低聚半乳糖粗液;
(3)将步骤(2)制得的低聚半乳糖粗液盐酸调节料液pH至6.0,添加粉末活性炭,70℃维持30min,达到灭酶、脱色效果,料液经板框过滤机压滤除去不溶物。料液分别用强酸性阳离子-弱碱性阴离子-强酸性阳离子交换树脂脱盐,控制出料电导≤100μs/cm,出柱pH2.8-3.8。离交后料液经双效蒸发器浓缩固形物至75wt%,经测定成品中低聚半乳糖含量为61.7wt%,结果见表2,各项指标符合卫生部公告(2008年第20号)对低聚半乳糖的要求。
表2低聚半乳糖成品中主要组分及其含量
Figure BDA0000101839510000051

Claims (2)

1.高产β-半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22,该菌株2011年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,菌种保藏编号为CGMCC No.5293。
2.权利要求1所述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22在制备β-半乳糖苷酶中的应用。
3如权利要求2所述的应用,其特征在于,步骤如下:
(1)取脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22接种至斜面培养基,在温度28-30℃培养14-38小时,然后用生理盐水将菌种从斜面培养基洗下,得菌液;
(2)将步骤(1)制得的菌液接种至种子培养基,在温度28-30℃、压力0.05-0.15MPa、溶解氧饱和度2%-40%的条件下,培养时间10-38h,得种子液;
(3)将步骤(2)制得的种子液接种至发酵培养基,在28-30℃、压力0.03-0.15MPa,溶氧量1%-40%的条件下,培养时间10-40h,得发酵液;
(4)将步骤(3)制得的发酵液分离菌体后,破碎菌体,然后用截留分子量为50,000-300,000Da的卷式超滤膜过滤,取滤液即为β-半乳糖苷酶酶液。
4如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(1)中的斜面培养基组分如下:
酵母膏1-15g/L,蛋白胨1-30g/L,葡萄糖10-40g/L,磷酸氢二钠0.5-2g/L,琼脂20g/L,pH 5.0-7.0。
5如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(2)中的种子培养基组分如下:
酵母膏1-15g/L,蛋白胨1-30g/L,葡萄糖10-40g/L,磷酸氢二钠0.5-2g/L,pH 5.0-7.0。
6如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(3)中的发酵培养基组分如下:
酵母膏1-15g/L,蛋白胨1-30g/L,乳糖10-40g/L, pH 5.0-7.0。
7如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(4)中的分离菌体采用以下方法获得:发酵液在离心力2000g-8000g的条件下离心,取沉淀,0.01-0.5M磷酸盐缓冲液悬浮,即得。
8如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(4)中的破碎菌体是指在均质压力30MPa-100MPa的条件下,经均质机破碎获得;或者,在冰水浴、400-750W的条件下,超声波处理。
9如权利要求8所述的应用,其特征在于,上述超声波处理,步骤为超声波处理3-4s、停止超声波处理10-12s,重复该处理步骤15-25次。
10权利要求1所述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22在制备低聚半乳糖中的应用。
11如权利要求10所述的应用,其特征在于,步骤如下:
(1)将权利要求3制得的β-半乳糖苷酶酶液加入至浓度为200-550g/L乳糖溶液中,β-半乳糖苷酶的加入量为每克乳糖添加5-40U,pH 5.0-7.5,得混合液;
(2)将步骤(1)制得的混合液在30-50℃的条件下,反应20-45h,得低聚半乳糖粗液; 
(3)将步骤(2)制得的低聚半乳糖粗液经灭酶活、脱色过滤、离交、浓缩,得低聚半乳糖。
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