CN101603059B - 一种秸秆原料同步糖化发酵生产丁二酸的方法 - Google Patents

Abstract

一种秸秆原料同步糖化发酵生产丁二酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明以农业废弃物秸秆为原料，用微生物同步糖化发酵生产丁二酸，秸秆经切割粉碎，稀碱预处理后，在里氏绿色木霉所产的纤维素酶和琥珀酸放线杆菌的共同作用下发酵生成丁二酸。70g/L的稀碱预处理后的秸秆经38℃厌氧发酵生产丁二酸35.5g/L。本发明具有采用廉价的非粮原料、对设备投资费用和操作费用少，对环境友好，可以缓解化学合成丁二酸对石化资源依赖的优点。

Description

一种秸秆原料同步糖化发酵生产丁二酸的方法

技术领域

本发明涉及一种以农业废弃物秸秆为原料，用微生物同步糖化发酵生产丁二酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

丁二酸，又称琥珀酸，是工业上一种重要的C₄平台化合物，是合成1，4丁二醇、四氢呋喃、己二酸、γ-丁内酯、N-甲基吡咯烷酮等大宗化学品、专业化学制品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)等可降解塑料的基本原料。作为有机化工的基本原材料，丁二酸广泛应用于食品、医药、表面活性剂、清洁剂、绿色溶剂、生物可降解塑料等领域。目前商业上主要通过马来酸酐催化加氢后水解的化学方法制备丁二酸。化学方法生产丁二酸，不可避免地消耗大量不可再生的化石原料。以可再生资源和二氧化碳作为主要原料微生物发酵生产丁二酸，不但可以避免传统化学方法中对化石原料的依赖，生产过程环境友好，并且还能固定CO₂，缓解温室效应。因此，开发基于可再生资源生产丁二酸的方法已成为当今研究的热点。

秸秆是一种重要的木质纤维素类可再生资源，年产量约占生物质年产量的一半以上。在我国秸秆类资源非常丰富，每年产量约达7亿多吨，其中玉米秸秆(35％)、小麦秸杆(21％)和稻草(19％)是我国的三大秸秆(http://www.efst.sh.cn/show Knowledge)。秸秆由于其含有大量纤维素营养价值较低，难于被畜禽利用，过多饲喂反而降低畜禽对其他营养物质的利用，因此仅少量作填充饲料在草食动物中利用外，大量的秸秆就地烧掉，造成环境的污染和对资源的浪费。

农业废弃物秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，纤维素是由β-1，4-糖苷键连接而成的多糖，半纤维素是由带支链的多聚糖(主要是己聚糖和戊聚糖)组成的杂多糖，木质素是一种酚醛聚合物。三者组成的木质纤维素具有很强的抗水解和酶解特性，因此木质纤维素作为发酵原料时必须经过预处理才能使用。

以木质纤维素为原料发酵，通常的方法是先将纤维类物质进行水解，释放出含葡萄糖、木糖等六碳糖和五碳糖的水解糖浆，水解糖浆再用于发酵，称为分步糖化发酵方法。本发明人曾从牛瘤胃中筛选的琥珀酸放线杆菌Actinobacillussuccinogenes CGMCC1593，它能够发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖等糖类的糖质原料(中国专利ZL200610038113.6)，并且进行了以秸秆等木质纤维物的水解糖浆为原料，用琥珀酸放线杆菌CGMCC1593发酵生产琥珀酸(中国专利CN101215582A)。该发明采用的是分步糖化发酵方法：即对秸秆纤维物原料的水解，采用稀酸或稀碱或汽爆的方法预处理，处理后秸秆用纤维素酶水解，得到六碳和五碳混合糖液，经NaOH调pH后直接用于发酵配料使用。最近有报道玉米秸秆用汽爆预处理后，再用稀硫酸高压水解，水解后固体部分用纤维素酶和半纤维素酶酶解，合并两部分水解液，用于发酵生产丁二酸的分步糖化发酵方法(World J Microbiol Biotechnol，2009，25：667-677)。虽然秸秆水解的方法较多，但需要有水解的设备和技术条件。并且由于维素酶水解反应时，存在水解产物的反馈抑制，水解液糖浓度的积累受到限制。

本发明采用秸秆的水解和微生物发酵在同一反应器内同时进行的同步糖化发酵方法，即将预处理后的秸秆作为微生物发酵培养基中的碳源，在加入纤维素酶液的同时接种发酵微生物的菌种，纤维素水解产生的还原糖可以立即被微生物消耗掉，转化为最终发酵产物。采用同步糖化发酵可以有效地避免纤维素酶水解反应过程中的反馈抑制作用，同时由于水解产生的还原糖马上被微生物利用，发酵应过程中还原糖浓度较低，不易造成高糖浓度对发酵的抑制。并且还简化了整个发酵工艺，降低了对设备投资费用和操作费。目前还没有利用秸秆原料同步糖化发酵生产丁二酸的研究实例。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用廉价秸秆原料同步发酵生产丁二酸的方法。

本发明的技术方案：一种以秸秆为原料同步糖化发酵生产丁二酸的方法，秸秆经切割粉碎、稀碱预处理后，在纤维素酶和琥珀酸放线杆菌共同作用下生成丁二酸；步骤为：

(1)秸秆原料与预处理：

以农业废弃物秸秆为原料，将收割的秸秆烘干后，粉碎成20-60目的秸秆颗粒，秸秆颗粒和质量浓度1％-8％稀NaOH碱液，按固液质量比1∶5～1∶15的比例混合，在80-130℃下处理0.5-2h，过滤或离心分离固体，固体水洗至中性，烘干得到处理后的秸秆颗粒；

(2)纤维素酶液的制备：

里氏绿色木霉CICC40359或其突变株经种子培养，以5％-10％的接种量接入发酵产酶培养，发酵产酶培养基为质量浓度含蛋白胨0.1％-0.6％，硫酸铵0.1％-0.5％，酵母膏0.01％-0.05％，KH₂PO₄ 0.2％-0.5％，CaCl₂·2H₂0 0.01％-0.05％、MgSO₄·7H₂O 0.01％-0.05％、Tween-80 0.01％-0.06％，微晶纤维素0.5％-2.5％，麸皮2％-8％，pH 5.0-6.0；28-30℃震荡培养4-8天，得到含纤维素酶的发酵液；发酵液过滤除菌得到纤维素酶液，并于4℃保存；

(3)同步糖化发酵：

菌株：琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC1593，为从牛的瘤胃中分离获得，保藏在中国北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，中国专利ZL200610038113.6已公开。里氏绿色木霉TrichodermareeseiCICC40359，保藏在中国北京朝阳区霄云路32号中国工业微生物菌种保藏管理中心。突变株的获得：用紫外线(UV)、γ-射线和X-射线物理诱变方法，或采用羟胺、亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯等化学诱变剂诱变的方法，或者采用或重组DNA技术、基因组改组技术等分子工程育种手段，选育产酶能力提高的里氏绿色木霉菌株；以及耐低pH、或耐温性能改进，丁二酸产率提高的琥珀酸放线杆菌菌株。

同步糖化培养基组成质量浓度为：处理后秸秆颗粒2％-10％，酵母膏0.3％-1％，K₂HPO₄·12H₂O 0.1％-0.2％，NaH₂PO₄·2H₂O 0.1％-0.2％，MgCl₂0.01％-0.03％，CaCl₂ 0.01％-0.03％，乙酸钠0.05％-0.2％，pH5.0-7.5；

同步糖化培养基灭菌后，加入里氏绿色木霉发酵生产的纤维素酶液或市售的纤维素酶，添加量为5-35IU滤纸酶活/g处理秸秆颗粒，和添加纤维二糖酶，添加量为1-15IU/g处理后的秸秆颗粒；并同时按5％-10％的接种量接入琥珀酸放线杆菌CGMCC1593或其突变株，于30-45℃在充满CO₂的环境中，静止或震荡培养20-72h；并用碳酸盐或碱溶液调节维持发酵液pH 5.0-7.5；

发酵过程中，分次补加处理后的秸秆颗粒5-40g/L；

琥珀酸放线杆菌CGMCC1593或其突变株的种子培养基的组成为：葡萄糖0.5％-1.5％，酵母膏0.1％-1.0％，K₂HPO₄·3H₂O 0.05％-0.2％，NaH₂PO₄·2H₂O0.02％-2.0％，混合维生素溶液0.1-1mL/100mL，pH 5.0-7.5；

混合维生素溶液组成为：B₁₂ 5mg，B₆ 100mg，叶酸20mg，核黄素20mg，硫胺素20mg，烟酸20mg，泛酸50mg，对氨基苯甲酸50mg，去离子水定容至1000mL；

种子培养基配制后用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，热敏性的混合维生素液于接种前加入。

里氏绿色木霉CICC40359的突变株是通过传统或分子育种手段，产酶能力提高的菌株。

琥珀酸放线杆菌CGMCC1593的突变株是用传统或分子育种手段，得到的耐低pH或耐温性能改善或丁二酸产率提高的菌株。

农业废弃物秸秆原料为：玉米秸秆以及麦草、稻草、玉米芯、甘蔗渣。

分析方法：

将发酵培养液离心，采用高效液相色谱法分析上清液中的琥珀酸等代谢产物及糖类物质。采用美国Waters高效液相色谱仪，Waters RI检测器，Breeze色谱工作站。其中，琥珀酸，乙酸，乳酸和甲酸等有机酸的测定使用Aminex HPX-87H离子色谱柱(300mm×7.8mm，9μm；Bio-Rad Chemical Division，Richmond，Calif.)，流动相8mM硫酸；柱温55℃；流速0.5mL/min；进样量10μL。葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖等糖类含量的测定采用Zobax NH₂氨基柱(250mm×4.6mm，5μm；Agilent，USA)，流动相：75％乙腈；流速1mL/min进样量10μL。

以滤纸酶活(filter paper activity，FPA)表示纤维素酶的总活力，按照国际理论和应用化学协会(IUPAC)推荐的国际标准方法(Pure Appl Chem，1987，59(2)：257-268)进行测定。取适当稀释的酶液0.5mL，加入1mL 0.1M的pH 4.8的醋酸缓冲液和一条16cm Whatman NO.1滤纸(约50mg)，在50℃下恒温水浴中振荡反应1h，反应完后加入3mL DNS试剂，沸水浴5min，迅速冷却后定容到25mL，于540nm处测定OD值。滤纸酶活定义：在酶促反应中每min生成1.0μmol葡萄糖所需的酶量为一个国际酶活单位(IU/mL)。

纤维二糖酶活力(cellobiase activity，CBA)按照IUPAC推荐的标准方法测定(Pure Appl Chem，1987，59(2)：257-268)。取1.0mL的纤维二糖底物(15mmol/L、pH4.8)于比色管中，加入1mL适当稀释的酶液，在50℃下恒温反应30min。反应结束后使用SBA生物传感分析仪测定葡萄糖含量。定义一个纤维二糖酶活力国际单位(CBIU)等于标准酶促反应条件下每分钟生成2.0μmol葡萄糖的酶量。

采用Van Soest凡氏测定法分析测定秸秆原料中纤维素、半纤维素和木质素含量(《饲料分析及饲料质量检测技术》，P70，北京农业大学出版社)。

本发明的有益效果：本发明以农林废弃物秸秆原料同步糖化发酵生产丁二酸，丁二酸对秸秆产率达0.245g/g秸秆，表明了良好的应用价值。本发明突出的优点是采用不与人争粮的廉价秸秆为发酵原料，并且秸秆的水解和微生物发酵在同一反应器内同时进行，降低了整个工艺对设备的投资和操作费。对于低成本生产生物基丁二酸，缓解丁二酸产品及其衍生物对石化资源的依赖，促进农林废弃物资源的利用，保护环境，增加农民收入有积极的经济与社会意义。

具体实施方式

以下是琥珀酸放线杆菌CGMCC1593同步糖化发酵生产丁二酸的实施例。但本发明并不限于所列出的几个实例。

实施例1稀碱预处理玉米秸秆酶水解液发酵产丁二酸

取80g烘干粉碎后的玉米秸秆，用1％(w/w)的氢氧化钠溶液1200mL混匀，于120℃下处理1h，过滤得残渣，残渣水洗至中性，60℃烘干，得到41.3g处理后的秸秆颗粒，重量损失48.3％，稀碱处理前后玉米秸秆成分分析如下表1。

表1稀碱处理前后玉米秸秆成分的分析

称取其中2g处理后的秸秆颗粒，装入150mL三角瓶，加入42mL pH4.8的柠檬酸缓冲液、6mL纤维素酶液，添加酶量在20IU/g(底物)，总装液量50mL，在50℃下水浴摇床上进行水解36h，测定水解液中糖含量如下：

表2稀碱处理后的玉米秸秆酶水解后的成分分析

将酶解后的水解液进行离心，清液中加入终浓度营养成分：酵母膏10g/L，磷酸二氢钠1.5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，无水氯化钙0.15g/L，MgCl₂ 0.15g/L，乙酸钠0.5g/L，调节pH6.8，121℃灭菌后接入5％种量的琥珀酸放线杆菌CGMCC1593，厌氧发酵36h，结果如下表：

表3稀碱预处理后的玉米秸秆酶水解液丁二酸发酵情况

实施例2稀碱预处理后的玉米秸秆同步发酵产丁二酸

称取稀碱预处理后的干秸秆颗粒2g于150mL厌氧瓶中，加入50mL培养液，其中含：酵母膏10g/L，磷酸二氢钠1.5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，无水氯化钙0.2g/L，MgCl₂0.15g/L，乙酸钠0.5g/L，调节pH 6.8，搅拌均匀后121℃灭菌15min，然后接入2.5mL种量琥珀酸放线杆菌CGMCC1593厌氧种子，加入市售的Celluclast1.5L诺维信纤维素酶，用量为20IU/g底物。摇匀，在100％CO₂条件下，静置培养72h，测定发酵液中含丁二酸20.8g/L。

实施例3里氏木霉摇瓶液体发酵产纤维素酶

发酵培养基：蛋白胨0.3％、硫酸铵0.2％、酵母膏0.05％、KH₂PO₄ 0.4％、CaCl₂·2H₂0 0.03％、MgSO₄·7H₂O 0.03％、Tween-80 0.02％，微晶纤维素(Avicel)1％-2.5％，麸皮2％-6％。发酵条件：培养温度28～30℃，pH 5.5，培养时间5～6天，摇床转数180r·min^-1，250mL三角瓶装液50mL。

将长好的里氏绿色木霉CICC40359斜面用20mL生理盐水冲洗，冲洗液传入装有玻璃珠的三角瓶中，摇匀后作为种子液按5％接种发酵培养基中，发酵6天后测定酶活结果如表4。

表4不同微晶纤维素和麸皮含量的产酶情况

实施例4-9不同处理玉米秸秆浓度的同步糖化发酵产丁二酸

分别称取2g、2.5g、3g、3.5g、4g、4.5g处理秸秆颗粒于150mL厌氧瓶中，加入琥珀酸放线杆菌发酵培养基中的其它营养成分，混合液体积分别约为46mL、45mL、44mL、43mL、42mL、41mL，搅拌均匀后，121℃灭菌15min。冷却，分别加入4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL里氏绿色木霉CICC40359发酵酶液，0.1mL售纤维二糖酶，2g MgCO₃，接入2.5mL培养好的CGMCC1593种子，在100％CO₂的环境中38℃培养72h。测定丁二酸的产量如下表5

表5底物浓度对同步糖化发酵的影响

实施例10分次补加秸秆颗粒的同步糖化发酵产丁二酸

称取稀碱预处理干秸秆颗粒2g于150mL厌氧瓶中，加入44mL培养液，其中含：酵母膏10g/L，磷酸二氢钠1.5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，无水氯化钙0.2g/L，MgCl₂ 0.15g/L，乙酸钠0.5g/L，调节pH 6.8，搅拌均匀后121℃灭菌15min，然后接入2.5mL种量琥珀酸放线杆菌CGMCC1593厌氧种子，加入里氏绿色木霉CICC40359发酵酶液6mL，0.1mL售纤维二糖酶，4g MgCO₃，摇匀后在100％CO₂条件下，静置培养48h，补加灭菌过的处理秸秆颗粒1.5g，摇匀后在100％CO₂条件下继续静置培养48h，测定发酵液中含丁二酸40.2g/L，对纤维总量转化率67％。

Claims (2)

1.一种以秸秆为原料同步糖化发酵生产丁二酸的方法，其特征是秸秆经切割粉碎、稀碱预处理后，在纤维素酶和琥珀酸放线杆菌共同作用下生成丁二酸；步骤为：

(1)秸秆原料与预处理：

以农业废弃物秸秆为原料，将收割的秸秆烘干后，粉碎成20-60目的秸秆颗粒，秸秆颗粒和质量浓度1％-8％稀NaOH碱液，按固液质量比1∶5～1∶15的比例混合，在80-130℃下处理0.5-2h，过滤或离心分离固体，固体水洗至中性，烘干得到处理后的秸秆颗粒；

(2)纤维素酶液的制备：

里氏绿色木霉CICC40359经种子培养，以5％-10％的接种量接入发酵产酶培养，发酵产酶培养基为质量浓度含蛋白胨0.1％-0.6％，硫酸铵0.1％-0.5％，酵母膏0.01％-0.05％，KH₂PO₄ 0.2％-0.5％，CaCl₂·2H₂O 0.01％-0.05％，MgSO₄·7H₂O0.01％-0.05％，Tween-80 0.01％-0.06％，微晶纤维素0.5％-2.5％，麸皮2％-8％，pH 5.0-6.0；28-30℃震荡培养4-8天，得到含纤维素酶的发酵液；发酵液过滤除菌得到纤维素酶液，并于4℃保存；

(3)同步糖化发酵：

同步糖化培养基以质量浓度计组成为：处理后秸秆颗粒2％-10％，酵母膏0.3％-1％，K₂HPO₄·12H₂O 0.1％-0.2％，NaH₂PO₄·2H₂O 0.1％-0.2％，MgCl₂0.01％-0.03％，CaCl₂ 0.01％-0.03％，乙酸钠0.05％-0.2％，pH5.0-7.5；

同步糖化培养基灭菌后，加入里氏绿色木霉发酵生产的纤维素酶液或市售的纤维素酶，添加量为5-35IU滤纸酶活/g处理秸秆颗粒，和添加纤维二糖酶，添加量为1-15IU/g处理后秸秆颗粒；并同时按5％-10％的接种量接入琥珀酸放线杆菌CGMCC1593，于30-45℃在充满CO₂的环境中，静止或震荡培养20-72h；并用碳酸盐或碱溶液调节维持发酵液pH 5.0-7.5；

发酵过程中，分次补加处理后的秸秆颗粒5-40g/L；

琥珀酸放线杆菌CGMCC1593的种子培养基的组成为：葡萄糖0.5％-1.5％，酵母膏0.1％-1.0％，K₂HPO₄·3H₂O 0.05％-0.2％，NaH₂PO₄·2H₂O 0.02％-2.0％，混合维生素溶液0.1-1mL/100mL，pH 5.0-7.5；

混合维生素溶液组成为：B₁₂ 5mg，B₆ 100mg，叶酸20mg，核黄素20mg，硫胺素20mg，烟酸20mg，泛酸50mg，对氨基苯甲酸50mg，去离子水定容至1000mL；

种子培养基配制后用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，热敏性的混合维生素液于接种前加入。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于农业废弃物秸秆原料为：玉米秸秆以及麦草、稻草、玉米芯、甘蔗渣。