CN113122460B - 一种水稻秸秆降解菌及其筛选方法和应用 - Google Patents

一种水稻秸秆降解菌及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明创造提供了一种水稻秸秆降解菌及其筛选方法和应用，菌株为东方伊萨酵母菌株，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.21582。本发明创造所述的水稻秸秆降解菌以水稻秸秆粉为主要碳源发酵后的粗酶液中纤维素酶酶活力达到30.5U/mL，漆酶酶活力达到188.54U/mL，还原糖浓度达到20.6g/L。

Description

一种水稻秸秆降解菌及其筛选方法和应用
技术领域
本发明创造属于生物质加工领域，尤其是涉及一种水稻秸秆降解菌及其筛选方法和应用。
背景技术
由于我国是农业生产大国，每年产生的水稻秸秆数量巨大，目前，对于水稻秸秆的处理方式一般将其焚烧，这不仅造成资源的浪费，在焚烧过程中也会进一步造成环境的污染。为解决这个问题，国家鼓励秸秆还田和秸秆资源化利用，发展生态农业。水稻秸秆直接还田会造成土壤营养失调，有机酸积累等问题，故研究如何将水稻秸秆生化处理后进行资源化再利用是目前的主要发展方向，也十分迫切。
水稻秸秆中含有丰富的纤维素、半纤维素、木质素、碳水化合物、糖类、脂类、矿物质等组分，是制备生物肥料的理想原料。但由于水稻秸秆中纤维素、半纤维素、木质素的存在使得降解困难，如何筛选出能够高效降解水稻秸秆的微生物，提高漆酶和纤维素酶的产量，是本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种水稻秸秆降解菌及其筛选方法和应用。
为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
一种水稻秸秆降解菌株，所述的菌株为东方伊萨酵母菌(Issatchenkiaorientalis)PTQJ-19-02，该菌株已于2021年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC NO.21582。
本发明还提供上述的水稻秸秆降解菌在制备水稻秸秆酵储料中的应用。
本发明还提供上述的的水稻秸秆降解菌株的筛选方法，该筛选方法包括如下步骤：
(1)称取菌源样本，溶于灭菌生理盐水中，配制成悬浊液,用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10-7倍，分别选取原液及每个稀释梯度的悬浊液100μL涂布至以愈创木酚、蒽酮、邻联甲苯胺、联苯胺、没食子酸为底物的培养基上，挑选培养基上出现氧化带的菌株，利用愈创木酚-PDA平板法筛选漆酶高产菌株；
(2)将步骤(1)筛选得到的菌株制备成菌液，分别均匀涂布至羧甲基纤维素钠筛选固体培养基,25-30℃倒置培养2-4d后,挑选有透明圈的单菌落，划线，于羧甲基纤维素钠固体培养基上进行纯化培养2-4d，然后挑取相应的单菌落置于羧甲基纤维素钠液体培养基的三角瓶中，恒温震荡培养24-72h，保藏至-50--80℃，最终得到的菌株为初筛菌株；
(3)将筛选得到的初筛菌株的菌液分别均匀涂布至木聚糖筛选固体培养基，25-30℃倒置培养2-4d后,挑选有透明圈的单菌落，划线，于木聚糖固体培养基上进行纯化培养2-4d，然后挑取相应的单菌落置于木聚糖液体培养基的三角瓶中，恒温震荡培养2-4d，保藏至-50--80℃，最终得到的菌株为水稻秸秆降解菌株。
优选地，所述步骤(2)中的羧甲基纤维素钠筛选固体培养基配方为羧甲基纤维素钠5-20g、KH2PO4 1-5g、MgSO4·7H2O 0.5-0.7g、NaNO3 0.5-3g、琼脂粉10-20g、蒸馏水1000mL。
优选地，所述步骤(2)中的羧甲基纤维素钠筛选固体培养基配方为羧甲基纤维素钠10g、KH2PO4 2g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaNO3 1g、琼脂粉16g、蒸馏水1000mL。
优选地，所述步骤(3)中的木聚糖筛选固体培养基配方为木聚糖5-20g、KH2PO4 1-5g、MgSO4·7H2O 0.1-1g、NaNO3 1-3g、琼脂粉10-20g、蒸馏水1000mL。
优选地，所述步骤(3)中的木聚糖筛选固体培养基配方为木聚糖10g、KH2PO4 2g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaNO3 1g、琼脂粉16g、蒸馏水1000mL。
优选地，上述筛选方法还包括步骤(4)，具体包括如下步骤：
以水稻秸秆粉为主要碳源，将步骤(3)得到的菌株接种到发酵培养基中，发酵温度60℃，pH 5.5，发酵结束后得到的粗酶液，测定粗酶液中的纤维素酶酶活力和漆酶酶活力，当纤维素酶酶活力大于30U/mL，且漆酶酶活力大于100U/mL时的菌株为水稻秸秆降解菌株。
相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：
本发明创造所述的水稻秸秆降解菌株具有耐酸性、耐高温性、酒精耐受性和不代谢木糖等特性，以水稻秸秆粉为主要碳源发酵后的粗酶液中纤维素酶酶活力达到30.5U/mL，漆酶酶活力达到188.54U/mL，还原糖浓度达到20.6g/L。为水稻秸秆的后续应用提供了新思路。
附图说明
图1为本发明创造实施例所述的不同原料中的还原糖浓度；
图2为本发明创造实施例所述的不同原料中的纤维素酶酶活力；
图3为本发明创造实施例所述的不同原料中的漆酶酶活力。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明创造。
实施例1：菌株筛选和发酵培养
1.1菌株筛选的方法
本发明产漆酶菌种的分离与筛选的方法：根据菌株在愈创木酚、蒽酮、邻苯二酚、邻联甲苯胺、邻甲苯胺、α－萘酚、联苯胺、没食子酸为底物的选择性培养基上的生长情况、菌落大小、漆酶催化氧化还原反应产生的变色圈直径大小及其颜色深浅程度，进行产漆酶真菌初筛，采用液体产酶发酵法选用ABTS为底物测定漆酶活力进行复筛。
本发明产纤维素酶菌种的分离与筛选的方法：在产漆酶菌株筛选的基础上，根据产纤维素酶菌种可以利用羧甲基纤维钠，将羧甲基纤维钠作为唯一碳源制备成选择性培养基，通过刚果红染色，根据其在固体培养基上的生长情况、菌落大小和透明圈的有无对产纤维素酶菌株初筛，再比对透明圈的大小，采用液体产酶发酵法选用羧甲基纤维钠为底物测定纤维素酶酶活力进行复筛。
本发明产半纤维素酶菌种的分离与筛选的方法：在以上两种筛选得到的菌株里，根据产半纤维素酶菌种可以利用木聚糖，将木聚糖作为唯一碳源制备成分离培养基，根据透明圈的有无，筛选出能产半纤维素酶的菌株。
1.2菌株筛选实例
筛选实例1
称取1g腐熟苹果树枝条样品，溶于10mL灭菌生理盐水中,配制成悬浊液,用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10-7倍,分别选取原液及每个稀释梯度的悬浊液100μL涂布至以愈创木酚、蒽酮、邻联甲苯胺、联苯胺、没食子酸为底物的固体培养基上，挑选培养基上出现氧化带的菌株，利用愈创木酚-PDA平板筛选高产漆酶菌株，经鉴定筛选得到菌株为蜡状芽孢杆菌、毛木耳和烟曲霉。
筛选实例2
称取1g高寒草地土壤样本，溶于10mL灭菌生理盐水中，配制成悬浊液,用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10-7倍，分别选取原液及每个稀释梯度的悬浊液100μL涂布至以愈创木酚、蒽酮、邻联甲苯胺、联苯胺、没食子酸为底物的培养基上，挑选培养基上出现氧化带的菌株，利用愈创木酚-PDA平板筛选漆酶高产菌株，经5.8SrDNA-ITS序列测定结果与已登录的序列进行Blast比对得到能产漆酶的菌株为Scytalidium和Marasmius tricolor。
筛选实例3
称取1g葡萄酒厂新鲜的酒槽，溶于10mL灭菌生理盐水中，稀释涂布到以愈创木酚、蒽酮、邻联甲苯胺、联苯胺、没食子酸为底物的固体培养基上，挑选能产生氧化带的菌株，初筛得到能产漆酶的菌株，取培养物进行革兰氏染色，于显微镜下观察，经鉴定为东方伊萨酵母。
筛选实例4
将筛选得到的蜡状芽孢杆菌、毛木耳、烟曲霉、Scytalidium、Marasmius tricolor和东方伊萨酵母菌液分别均匀涂布至羧甲基纤维素钠筛选固体培养基,培养基配方为羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10g、KH2PO4 2g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaNO3 1g、琼脂粉16g、蒸馏水1000mL，28℃倒置培养3d后,挑选有透明圈的单菌落，划线，于羧甲基纤维素钠固体培养基上进行纯化培养3d左右，然后挑取相应的单菌落置于羧甲基纤维素钠液体培养基的三角瓶中，恒温震荡培养48h左右，保藏至-70℃，最终得到的菌株为蜡状芽孢杆菌、烟曲霉和东方伊萨酵母。
筛选实例5
将筛选得到的蜡状芽孢杆菌、烟曲霉和东方伊萨酵母菌液分别均匀涂布至木聚糖筛选固体培养基,培养基配方为木聚糖10g、KH2PO4 2g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaNO3 1g、琼脂粉16g、蒸馏水1000mL，28℃倒置培养3d后,挑选有透明圈的单菌落，划线，于木聚糖固体培养基上进行纯化培养3d左右，然后挑取相应的单菌落置于木聚糖液体培养基的三角瓶中，恒温震荡培养48h左右，保藏至-70℃，最终得到的菌株为东方伊萨酵母。
将得到的东方伊萨酵母分别以葡萄糖和木糖为唯一碳源，点样于YPD固体培养基上，挑选出在木糖培养基不生长，葡萄糖培养基上生长的菌株，验证结果为东方伊萨酵母不代谢木糖。
1.3发酵培养菌株
1.3.1培养基配制
YPD液体培养基：1％酵母浸出物、2％蛋白胨、2％葡萄糖；
YPD固体培养基：1％酵母浸出物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、1.8％琼脂；
1.3.2发酵培养流程
从YPD固体培养基上挑选出单菌落(3-5个)，转到相应的YPD液体培养基中，37℃，200r/min培养12h，按照2％的接种量转接到发酵培养基中，37℃，200r/min培养36h。
2.酶活测定方法
2.1漆酶酶活测定
在4m L含4.0mmol/L愈创木酚的50mmol/L琥珀酸缓冲液(p H4.5)中加入1m L经适当稀释的粗酶液,混匀后置30℃恒温水浴准确反应30min,470nm处比色。以煮沸热灭活粗酶液加入上述含愈创木酚的琥珀酸缓冲液作为空白对照；一个酶活单位(U)定义为1min内氧化1μmol愈创木酚所需要的酶量,470nm处愈创木酚的摩尔消光系数ε470＝6740L/mol。
2.2纤维素酶和木聚糖酶酶活测定
纤维素酶酶活力定义：在50℃，pH 5.0的条件下，每分钟从浓度为4g/L的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)，酶活测定按照实验室现有的方法测定纤维素酶的酶活力。
木聚糖酶酶活力定义：在50℃，pH 5.0的条件下，每分钟从浓度为5g/L的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。
酶活测定按照实验室现有的方法测定纤维素酶的酶活力。
3.水稻秸秆降解菌株发酵不同生物质原料
用筛选得到的东方伊萨酵母为生物降解的菌株，以不同种类的生物质为原料，探究东方伊萨酵母对不同原料作用效果的不同，以生成的还原糖(还原性物质)、漆酶和纤维素酶为检测依据。
实施例1
以芦苇秸秆粉末为生物质原料，发酵培养基为：60目芦苇粉10g,(NH4)2SO4 2.0g，酵母抽提粉1.5g，KH2PO4 1.15g，MgSO4·7H2O 1.15g，NaCl 1.5g,CaCO3 1.1g(培养基初始pH为5.18，定容至1L)，将筛选得到的东方伊萨酵母菌按照5％的接种量接种在摇床(60℃，150r/min)培养3d后，6 000r/min离心10min，取上清液即为制备的粗酶液。测得最终东方伊萨酵母产漆酶的酶活力为0.992U/mL，纤维素酶的酶活力20.36U/mL，还原糖浓度为13.8g/L。
表1以芦苇秸秆粉末为原料发酵数据
实施例2
以麸皮为生物质原料，发酵培养基为：(NH4)2SO4 2.0g，酵母抽提粉1.5g，KH2PO41.15g，MgSO4·7H2O 1.15g，NaCl 1.5g,CaCO3 1.1g(培养基初始pH为5.18，定容至1L)，培养基中还含有2％的60目麸皮粉，将筛选得到的东方伊萨酵母菌按照5％的接种量接种在摇床(60℃，150r/min)培养3d后，6 000r/min离心10min，取上清液即为制备的粗酶液。测得东方伊萨酵母产漆酶酶活力达到18.8U/mL，纤维素酶的酶活力为3.8U/mL，还原糖浓度为2.6g/L。
表2以麸皮为原料发酵数据
实施例3
以玉米粉为生物质原料，发酵培养基为：60目玉米粉10g,(NH4)2SO4 2.0g，酵母抽提粉1.5g，KH2PO4 1.15g，MgSO4·7H2O 1.15g，NaCl 1.5g,CaCO3 1.1g(培养基初始pH为5.18，定容至1L)，将筛选得到的东方伊萨酵母菌按照5％的接种量接种在摇床(60℃，150r/min)培养3d后，6 000r/min离心10min，取上清液即为制备的粗酶液。测得漆酶的酶活性力为15.8U/mL，纤维素酶的酶活力为28.1U/mL，还原糖浓度为18.9g/L。
表3以玉米粉为原料发酵数据
实施例4
以水稻秸秆粉为生物质原料，发酵培养基为：60目水稻秸秆粉10g,(NH4)2SO42.0g，酵母抽提粉1.5g，KH2PO4 1.15g，MgSO4·7H2O 1.15g，NaCl 1.5g,CaCO3 1.1g(培养基初始pH为5.18，定容至1L)，将筛选得到的东方伊萨酵母菌按照5％的接种量接种在摇床(60℃，150r/min)培养3d后，6 000r/min离心10min，取上清液即为制备的粗酶液。测得漆酶酶活力达到188.54U/mL，纤维素酶酶活力为30.5U/mL，还原糖浓度为20.6g/L。
表4以水稻秸秆粉为原料发酵数据
综上所述，东方伊萨酵母以水稻秸秆粉为原料时，还原糖的浓度最高20.6g/L，漆酶酶活力达到188.54U/mL，纤维素酶酶活力为30.5U/mL。根据筛选条件和图1-3可得，本发明筛选出的东方伊萨酵母对于水稻秸秆的降解率高，同时具有耐酸性、耐高温性、酒精耐受性和不代谢木糖的特性，为水稻秸秆的后续利用提供理论依据和可能。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种水稻秸秆降解菌株，其特征在于：所述的菌株为东方伊萨酵母菌（Issatchenkia orientalis）PTQJ-19-02，该菌株已于2021年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO. 21582。
2.权利要求1所述的水稻秸秆降解菌在制备水稻秸秆酵储料中的应用。
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