CN101809151A - 纤维素酶的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种使用半纤维素源碳水化合物以生产其中纤维素酶比例高于半纤维素酶比例的纤维素酶混合物的发酵方法。通过本发明的方法生产的纤维素酶的特征还在于高比生产率。获得的纤维素酶混合物包含的纤维素酶比半纤维素酶至少多两倍，并可用于水解纤维素底物尤其是预处理的木质素纤维素底物。

Description

纤维素酶的生产方法
相关申请
本申请主张2007年8月30日提交的名称为METHOD FORFUNGAL CELLULASE PRODUCTION(真菌纤维素酶的生产方法)、申请号为No.60/969,025的临时申请的优先权，所述临时申请的全部内容以引用的方式纳入本文中。
技术领域
本发明涉及由真菌宿主细胞生产纤维素酶的发酵方法。
背景技术
纤维素和半纤维素构成了一种生产可发酵糖的重要的可再生和廉价的碳源。纤维素由通过β-1，4糖苷键以直链连接在一起的D-葡萄糖单元构成。半纤维素主要由直链木糖骨架和多个侧链构成，所述直链木糖骨架包含通过β-1，4糖苷键连接在一起的D-木糖单元，所述侧链通过β-1，2或β-1，3糖苷键或酯键(例如，L-阿拉伯糖、乙酸、阿魏酸等)与所述木糖单元连接。
里氏木霉(Trichoderma reesei)(红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性型)是一种能够生产包含多种纤维素酶和半纤维素酶的纤维素酶混合物的丝状真菌。它们包括两种纤维二糖水解酶、八种内切葡聚糖酶、四种木聚糖酶、两种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和一种β-甘露聚糖酶。里氏木霉(T.reesei)也生产多种帮助从纤维素和半纤维素生成单糖的辅助酶，包括乙酰木聚糖酯酶、β-木糖苷酶和数种β-葡萄糖苷酶。
对里氏木霉生产纤维素酶和半纤维素酶的调控是复杂的，其主要是在针对可用碳源应答的转录水平上被控制。葡萄糖通过转录调控子如crel(Strauss，J.，et al.，1995，FEBS Letters 376：103-107)和acel(Aro，N.，et al.，2003，Appl.Environ.Microbiol.69：56-65)的作用抑制纤维素酶基因表达。在限制葡萄糖的条件下，纤维素酶转录被抑制，转录的完全激活需要存在诱导性碳水化合物，如纤维素或β-连接的二糖如纤维二塘、槐糖、龙胆二糖和乳糖(Ilmen，M.，et al.，1997，Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306)。诱导纤维素酶的碳水化合物(CIC)也导致半纤维素酶转录的激活(Mach，R.L.and Zeilinger，S.，2003，Appl.Microbiol.Biotechnol.60：515-522；Margolles-Clark et al.，1997，J.Biotechnol 57：167-179)。已经发现xyrl基因产物参与木糖对半纤维素酶和纤维素酶基因的转录激活(Striker，A.R.，et al.，2006，Eukaryotic Cell 5：2128-2137)。
尽管里氏木霉在诱导纤维素酶的条件下只产生低水平的木聚糖酶活性，然而以木糖或其他半纤维素源碳水化合物培养的里氏木霉培养物生产的酶系统的半纤维素酶活性高于纤维素酶活性。分泌的木聚糖酶的生产可被木聚糖(Bailey，M.J.，et al.，1993，Appl.Microbiol.Biotechnol.40：224-229)和阿拉伯糖(Xiong et al.，2004，Appl.Microbiol.Biotech 64：353-358)增强。半纤维素酶基因的转录既被半纤维素或其分解产物又被纤维素所激活。在里氏木霉中，编码木聚糖酶1和2(xlnl和xln2)的基因的转录被纤维素、槐糖、木聚糖和阿拉伯糖醇所激活，阿拉伯呋喃糖苷酶基因abfl的转录被阿拉伯糖、阿拉伯糖醇和木聚糖所激活(Margolles-Clark，et al.，1997，J.Biotechnol.57：167-179)。然而，由于木聚糖酶表达的增加，纤维素酶在分泌酶组成中的相对比例下降。这导致纤维素酶的比活性降低，并因此需要更多总量的蛋白用于纤维素底物的有效水解。
提供等摩尔量的纤维二糖和木二糖在里氏木霉菌株QM9414的摇瓶批式培养物中产生相似水平的木聚糖酶活性(Zeilinger，S.，et al.，1996，J.Biol.Chem.271：25624-25629)。由这两种培养物产生的纤维素酶活性未见报道。通过将碳源从100％乳糖更换为75％乳糖/25％木糖，里氏木霉菌株RutC30分泌在补料批式培养物中的木聚糖酶的相对比例从0.8％上升到3.5％(Margeot，A.，et al.，2007，poster presentation at Physiology ofYeast and Filamentous Fungi，Espoo，Finland)。同时，四种主要纤维素酶组分(纤维二糖水解酶1和2，内切葡聚糖酶1和2)的总比例从82％下降到62％。其他半纤维素酶和纤维素酶的比例未见报道。文献报道了使用锯末水解产物进行的里氏木霉菌株RutC30的摇瓶批式培养物产生的分泌纤维素酶活性(以每ml培养物的滤纸单位表示)水平与使用纤维素水解产物相似(Lo，C-H.et al.，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.Spring(121-124)：561-573)。所述锯末水解产物通过用浓硫酸处理而产生，且就锯末而言，该锯末水解产物由25-40％半纤维源碳水化合物、5-9％诱导纤维素酶的碳水化合物、13-45％葡萄糖和2-45％寡糖组成。然而，由于没有给出有关锯末水解产物对半纤维素酶活性或总分泌蛋白的作用的信息，因此无法评估所述锯末水解产物对纤维素酶和半纤维素酶在所分泌蛋白中的相对比例的影响。
半纤维素酶的相对比例也可通过调节发酵培养基的pH进行控制(Bailey，MJ.，et al.，1993，Appl.Microbiol.Biotechnol.40：224-229)；木聚糖酶活性相对纤维素酶活性的比例在pH 6-7时增加。曲霉(Aspergillus)中的木聚糖酶基因转录受到pH倚赖的转录调控子pacC的调控(Maccabe，A.P.，et al.，1998，J.Bacteriol.180：1331-1333)。
有时希望使用主要包含来源于半纤维素的木糖和其他戊糖(例如通过对木质素纤维素生物质进行化学处理产生的戊糖)的碳水化合物源由真菌培养物生产高纤维素酶比例的纤维素酶混合物。美国专利No.4,461,648、5,916,780、6,090,595、6,043,392、4,600,590；Weil et al.，1997，Appl.Biochem.Biotechnol.681：21-40和K.，et al.，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.Spring(121-124)：1055-1067中描述了含有半纤维的木质素纤维素生物质的预处理方法，所述文献都以引用的方式纳入本文中。
发明内容
本发明涉及由真菌宿主细胞生产纤维素酶的发酵方法。
本发明的目标是提供一种生产纤维素的改进方法。
本发明提供一种生产其中纤维素酶比例高于半纤维素酶的纤维素酶混合物的发酵方法，包括在有助于生产半纤维素酶的条件下培育一种能够生产纤维素酶的宿主细胞。
生产纤维素的方法包括木霉属种或肉座菌属种通过液体深层发酵以高生产力获得的、具有高纤维素酶∶半纤维素酶比的真菌酶混合物的使用，其中用于所述方法的高于40％的碳源来自半纤维素源碳水化合物，高于3但低于20％的碳源来自诱导纤维素酶的碳水化合物。
本发明提供一种生产纤维素酶混合物的发酵方法，包括在约20℃到约35℃的温度和约3.0到约6.5的pH下为一种分泌纤维素酶的木霉属或肉座菌属宿主细胞提供一种用于纤维素酶生产的碳源达约3到约30天，其中所述碳源包含占所述碳源中存在的总碳的约40wt％(重量百分比)到约97wt％的半纤维素源碳水化合物和占所述碳源中存在的总碳约3wt％到约20wt％的诱导纤维素酶的碳水化合物；以及获得所述纤维素酶混合物。
本发明包括上述发酵方法，其中占所述碳源中存在的总碳的约80wt％到约97wt％的为半纤维素源碳水化合物，占所述碳源中存在的总碳的约8wt％到约15wt％的为诱导纤维素酶的碳水化合物。此外，所述纤维素酶混合物包含的纤维素酶与半纤维素酶的比例为至少2∶1，或至少3∶1。在如上所述发酵方法中使用的碳源还可包含一种或多种其他碳源。所述一种或多种其他碳源可为甘油或有机酸。此外，所述发酵方法可为批式、补料批式或连续式的。
本发明提供如上所述的发酵方法，其中所述宿主细胞是里氏木霉菌株。
本发明还提供如上所述的发酵方法，其中与碳源由半纤维素源碳水化合物组成的方法所产生的分泌纤维素酶的量相比，所述方法生产至少高2倍的分泌纤维素酶。本发明方法的特征还可为，与碳源由半纤维素源碳水化合物组成的方法的比生产率(specific productivity)(qp)相比，其qp至少提高3倍。此外，本发明方法的特征还可为，与碳源由半纤维素源碳水化合物组成的方法中的比生产率(qp)相比，其qp至少提高5倍。
本发明还涉及通过如上所述的发酵方法生产的纤维素酶混合物用于水解纤维素底物的用途。所述纤维素底物可为一种预处理的木质素纤维素底物。
本发明还提供一种水解纤维素底物的方法，包括：
将通过权利要求1的发酵方法生产的纤维素酶混合物加至所述纤维素底物以形成反应混合物，其中所述纤维素底物的浓度为从约1g/L到约200g/L并且所述纤维素酶混合物以约0.1至约100mg蛋白/gm纤维素的浓度加入；
将所述反应混合物在约30℃到约60℃的温度和约3.5到约7.0的pH下孵育约4小时到约120小时以水解纤维素并产生反应产物。
本发明部分基于以下意外发现：含有半纤维素源碳水化合物(HDC)和诱导纤维素酶的碳水化合物(CIC)的碳水化合物源可用于发酵方法以生产具有高纤维素酶比例和相应的低半纤维素酶比例的真菌纤维素酶混合物。所述发酵方法的生产力显著高于只使用半纤维素酶源碳水化合物的相同方法。
附图说明
本发明的这些特征和其他特征会通过下面参照附图的描述更加清楚，其中：
图1示出了由里氏木霉菌株RutC30(A)和P59G(B)在14L补料批式发酵中生成和分泌的纤维素酶混合物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，其中供给所述发酵的碳水化合物由0-15％的诱导纤维素酶的碳水化合物(对于RutC30为纤维二糖，或对于P59G为CIC混合物)和85-100％的木糖组成。
图2示出了由里氏木霉菌株P59G在14L补料批式发酵中生成和分泌的纤维素酶混合物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，其中供给所述发酵的碳水化合物由0％、2％或10％的诱导纤维素酶的碳水化合物和100％、98％或90％的阿拉伯糖组成。
图3示出了由里氏木霉菌株P59G在14L补料批式发酵中生成的生物质的量，其中供给所述发酵的碳水化合物(A)由如所示的0-15％的CIC混合物加85-100％的木糖组成或(B)由0-10％的纤维二糖加90-100％的阿拉伯糖组成。每个柱形表示三次独立发酵的平均值和标准差。
图4示出了由里氏木霉菌株P59G在14L补料批式发酵中生成的分泌蛋白的量，其中供给所述发酵的碳水化合物(A)由如所示的0-15％的CIC混合物加85-100％的木糖组成或(B)由0-10％的纤维二糖加90-100％的阿拉伯糖组成。每个柱形表示三次独立发酵的平均值和标准差。
图5示出了14L补料批式发酵中的里氏木霉菌株P59G以mg分泌蛋白/g生物质/h表示的平均比生产率(qp)，其中供给所述发酵的碳水化合物由(A)由如所示的0-15％的CIC混合物加85-100％的木糖组成或(B)由0-10％的纤维二糖加90-100％的阿拉伯糖组成。每个柱形表示三次独立发酵的平均值和标准差。
具体实施方式
本发明涉及由真菌宿主细胞生产纤维素酶的发酵方法。
下面描述的为优选实施方案，这些只以示例方式进行描述，而非对实施本发明所必需的特征的组合进行限制。
本发明提供通过真菌细胞的发酵、优选地通过液体深层培养发酵进行的纤维素酶的生产。
生产纤维素酶混合物的方法
纤维素酶混合物可通过使生长旺盛的真菌培养物在适于宿主细胞的温度和pH下在几乎不含或不含葡萄糖但含有诱导纤维素酶的碳水化合物(CIC)以及其他细胞生长所需的营养素的培养基(固体或液体)上生长而产生。如本文所述，可使用任何已知的生产纤维素的方法，其中诱导物如纯纤维素被替换为一种碳水化合物源，该碳水化合物源包含半纤维素源碳水化合物(HDC)和诱导纤维素酶的碳水化合物(CIC)，优选地包含约40％到约97％或之间任何量的HDC以及约3％到约20％或之间任何量的CIC。例如，约40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、97％或之间任何量的HDC以及约3、4、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20％或之间任何量的CIC。
对里氏木霉及相关丝状真菌的液体深层发酵通常以批式、补料批式或连续式方法进行。在批式方法中，将除用于好氧方法的氧气以外的所有必需材料在操作起始时置于反应器中，使发酵进行至完成，然后收获产物。在补料批式方法中，随着培养液的取出，将一种或多种培养基组分连续或序贯供给所述培养物。在连续式方法中，以体积相等的速度连续地提供新鲜培养基并取出培养液体以将培养物维持在一个稳定的生长速率。
本发明的方法可以批式、补料批式、重复补料批式、连续式方法或它们的任何组合的方式进行。例如，所述方法可为一种补料批式方法。
本发明的方法可在从约20℃到约35℃或之间的任何温度下进行，例如在从约25℃到约30℃或之间的任何温度下进行，或在约20、22、25、26、27、28、29、30、32、35℃或之间的任何温度下进行。
本发明的方法可在约pH3.0-6.5或之间的任何pH下进行，例如在约pH3.5-5.5或之间的任何pH下进行，或在约pH3.0、3.2、3.4、3.5、3.7、3.8、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.5、5.7、5.8、6.0、6.2、6.5或之间的任何pH下进行。
本发明的方法可进行3-30天或之间任意长的时间，例如进行3-10天或之间任意长的时间，进行4-8天或之间任意长的时间，或进行3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30天或之间任意长的时间。
本发明的方法可在至少1升的培养物中进行，例如，在从约1到约400000升或之间任何量，在从10到约400000升或之间任何量，在从1000到约200000升或之间任何量，在从10000到约200000升或之间任何量，在约1、10、50、100、200、400、600、800、1000、2000、4000、6000、8000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90,000、95000、100000、150000、200000、300000、400000升的体积或之间任何量的培养物中进行。
本发明方法可在好氧即存在氧气的条件下进行，或在厌氧即无氧气的条件下进行。例如，所述方法可在好氧条件下进行。
与碳源只含有HDC且所用真菌菌株未就增加HDC的纤维素酶生产活性而被改造或选择的相应方法相比，本发明的发酵方法可产生高至少2.5倍、更优选高3倍的分泌蛋白。例如，与碳源只含有HDC且所用真菌菌株未就增加HDC纤维素酶生产活性而被改造或选择的相应方法相比，本文所述方法可产生高2.5到约10倍或之间任意倍数例如约2.5、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10倍或之间任意倍数的分泌蛋白，或者高于10倍的分泌蛋白。因此，本发明发酵方法的特征可为，与碳源只含有HDC且所用真菌菌株未就增加HDC纤维素酶生产活性而被改造或选择的相应方法相比，以mg产生的分泌纤维素酶/gm生物质/h表示的比生产率提高至少3倍，更优选地提高5倍，或之间任何倍数。存在如本文所述的不同量的HDC、CIC或HDC及CIC时蛋白生产的比生产率的提高示于表1。
表1：在14L补料批式发酵中生长在HDC加0-20％CIC中的里氏木霉菌株的液体深层培养物的蛋白和真菌细胞生产。
Figure GPA00001077188700071
Figure GPA00001077188700081
a用于这些发酵的CIC是包含基于总碳水化合物的56％龙胆二糖、14％槐糖、6％纤维二塘、10％海藻糖、6％麦芽三糖、4％葡萄糖和14％其他碳水化合物的诱导混合物。
b用于这些发酵的CIC为纤维二糖。
c对于P59G菌株，报告值为三次(木糖)或两次(阿拉伯糖)重复发酵的平均结果；对于RutC30菌株，报告值为单次发酵的结果。
发酵培养基
在本发明的实施方案中，在发酵过程中对所述真菌细胞提供至少两种碳源∶半纤维素源碳水化合物(HDC)和诱导纤维素酶的碳水化合物(CIC)。
本文所用的术语半纤维素源碳水化合物或HDC是指一种或多种源自半纤维素并可被宿主微生物用于生长、酶生产或生长及酶生产的寡糖、二糖或单糖。HDC的非限制性实例包括木寡糖(xylo-oligosaccharide)、阿拉伯木寡糖(arabinoxylo-oligosaccharide)、D-木糖、木二糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖和D-半乳糖。优选地，HDC包含D-木糖和/或L-阿拉伯糖。源自HDC的碳为在发酵过程中供给真菌细胞的总碳量的从约40％到约97％。例如，源自HDC的碳可为在发酵过程中供给真菌细胞的总碳量的40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或之间任何量。例如，源自HDC的碳为在发酵过程中供给真菌细胞的总碳量的从约80％到约97％。
本文所用的术语诱导纤维素酶的碳水化合物或CIC是指一种或多种导致宿主细胞生产纤维素酶的寡糖、二糖或单糖。优选地，CIC是一种或多种纤维二糖、槐糖或龙胆二糖。CIC可通过由一种或多种纤维素酶进行的主要产生β连接的葡萄糖二聚体的纤维素的酶水解来产生。或者，高浓度的葡萄糖浆可缩合形成葡萄糖二聚体的混合物。产生葡萄糖的缩合反应可通过稀酸催化并在120-150℃以上的温度下进行，或者用β-葡萄糖苷酶或纤维素酶催化并在约40-70℃的较适中的温度下进行(美国专利申请US2004/0121446A1)。本发明的实施并不受到所用的产生CIC的方法的限制。
优选地，源自CIC的碳为在发酵过程中供给真菌细胞的总碳量的从约3％到约20％或之间任何量。例如，源自CIC的碳可为在发酵过程中供给真菌细胞的总碳量的3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％或之间的任何量。例如，源自CIC的碳为在发酵过程中供给真菌细胞的总碳量的从约8％到约15％或之间的任何量。
除HDC和CIC以外，在发酵过程中供给宿主细胞的总碳量的从约0.1％到约20％或之间的任何量可包含一种或多种葡萄糖、甘油、有机酸或其他可被所述宿主细胞利用的碳源。例如，在发酵过程中供给宿主细胞的总碳量的约0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20％或之间的任何量可包含一种或多种葡萄糖、甘油、有机酸或其他可被所述宿主细胞利用的碳源。
对于批式发酵，可在接种之前或同时将碳源加入发酵培养基。对于补料批式或连续式操作，也可在发酵过程中连续或间歇地供给碳源。优选地，给料速率为0.2到2.5g碳/L培养物/h或之间的任何量。更优选地，给料速率为0.4到1.6g碳/L培养物/h或之间的任何量。
本领域技术人员知晓可向发酵培养基中加入其它营养素、维生素和矿物质以提高宿主细胞的生长和酶生产。这些其他培养基组分可在用宿主细胞接种培养物之前、同时或之后加入。有时使用有机氮源如氨基酸和肽作为碳源；然而，这些有机氮源不计算在发酵过程中供给宿主细胞的总碳量之内。
发酵后，含有纤维素酶的发酵液可直接使用，或者可将纤维素酶通过例如过滤或离心从真菌细胞中分离出来。低分子溶质例如未耗尽的发酵培养基组分可通过超滤而除去。纤维素酶可通过例如蒸发、沉淀、沉降或过滤而浓缩。可加入化学物质例如甘油、蔗糖、山梨糖醇等以稳定纤维素酶。可将其他化学物质如苯甲酸钠或山梨酸钾加入纤维素酶中以防止所包含微生物的生长。
生产纤维素酶的真菌细胞
用于所述方法的真菌细胞可为任何属于子囊真菌亚门(Acomycotina)或担子真菌亚门(Basidiomycotina)的丝状真菌，例如木霉属、肉座菌属、曲霉属(Aspergillus)、腐质酶属(Humicola)、链孢霉属(Neurospora)、Orpinomyces、赤霉菌属(Gibberella)、翘孢霉属(Emericella)、毛壳菌属(Chaetomium)、镰刀酶属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)、稻瘟菌属(Magnaporthe)或平革菌属(Phanerochaete)的种。优选地，所述宿主细胞是木霉属种或肉座菌属种。最优选地，所述宿主细胞是里氏木霉菌株。
可改造所述真菌细胞以增加或减少一种或多种同源或异源蛋白的生产和分泌。例如，可用一种或多种遗传构建体改造所述真菌细胞，所述遗传构建体包含与一个可被HDC和/或CIC诱导的启动子可操作地连接的编码纤维素酶的基因。例如，可根据美国专利No.6,015,703改造所述真菌细胞以过表达β-葡萄糖苷酶。也可根据共同未决的美国专利申请US2008/0057541A1和60/969,046改造所述宿主细胞以生产一种优化的纤维素酶组分和辅助组分的混合物。制备包含与纤维素酶基因可操作地连接的CIC或HDC诱导型启动子的遗传构建体的方法和遗传改造真菌菌株的方法包括本领域技术人员所知的方法，包括但不限于通过CaCl2、电穿孔、生物射弹轰击、PEG-介导的原生质体融合来处理细胞(美国专利No.6,015,703和美国专利No.6,939,704)。
纤维素酶混合物
本文所用的纤维素酶混合物是在所述发酵过程中由真菌细胞分泌的纤维素酶、半纤维素酶和其他蛋白的混合物。使用本发明的发酵方法生产的纤维素酶混合物优选地具有约大于2∶1的纤维素酶∶半纤维素酶组分比例(表2)。更优选地，所述纤维素酶∶半纤维素酶比例为至少约3∶1。最优选地，所述纤维素酶∶半纤维素酶比例为至少约4∶1。例如，所述半纤维素酶∶纤维素酶比例可为约2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1或之间的任意比例。
表2：在14L补料批式发酵中在HDC和CIC的液体深层培养物中生长的里氏木霉培养物的分泌酶的组成。
Figure GPA00001077188700111
＊通过对在如实施例4中所述的每种条件下分泌到发酵液中的蛋白的SDS-PAGE分析的扫描光密度法确定。
＊＊如实施例4中所述的对预处理的木质素纤维素底物的相对水解活性。
a用于这些发酵的CIC是包含基于总碳水化合物的56％龙胆二糖、14％槐糖、6％纤维二塘、10％海藻糖、6％麦芽三糖、4％葡萄糖和14％其他碳水化合物的诱导混合物。
b用于这些发酵的CIC为纤维二糖。
纤维素底物的水解
用本发明的发酵方法生产的分泌纤维素酶可用于纤维素底物的水解。术语“纤维素底物”是指源自植物生物质并包含纤维素的任何底物，包括但不限于，用于生产乙醇或其他高价值产品的预处理的木质素纤维素原料、动物饲料、林业废产品如纸浆和木片、以及纺织品。分泌纤维素酶对预处理的木质素纤维素和滤纸的活性示于表3。
表3：在14L补料批式发酵中在HDC和CIC的液体深层培养物中生长的里氏木霉培养物的纤维素酶混合物的活性。
Figure GPA00001077188700112
Figure GPA00001077188700121
＊通过对在如在实施例4所述的每种条件下分泌到发酵液中的蛋白的SDS-PAGE分析的扫描光密度法确定。
＊＊如实施例4中所述的对预处理的木质素纤维素底物的相对水解活性；n.d.＝未确定的。
a用于这些发酵的CIC为包含基于总碳水化合物的56％龙胆二糖、14％槐糖、6％纤维二塘、10％海藻糖、6％麦芽三糖、4％葡萄糖和14％其他碳水化合物的诱导混合物。
b用于这些发酵的CIC为纤维二糖。
用本发明的发酵方法生产的纤维素酶可用于“预处理的木质素纤维素原料”的酶水解。预处理的木质素纤维素原料是一种植物来源的材料，其在预处理前含有至少20％纤维素(干重)，更优选地含有超过约30％的纤维素，甚至更优选地含有超过40％的纤维素，以及含有至少10％木素(干重)，更典型地含有至少12％木素(干重)，并且已经过物理和/或化学加工以使其纤维更易于受到和/或接受纤维素分解酶的作用。预处理加工的非限制实例包括用以下物质对木质素纤维素原料进行化学处理：硫酸、亚硫酸，或其他酸；氨、石灰、氢氧化铵或其他碱；乙醇、丁醇或其他有机溶剂；或加压水(参见美国专利No.4,461,648、5,916,780、6,090,595、6,043,392、4,600,590，Weil et al.，1997，Appl.Biochem.Biotechnol.681：21-40和
Figure GPA00001077188700122
K.，et al.，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.Spring(121-124)：1055-1067；这些文献以引用的方式纳入本文中)。
例如，可用本文所述方法生产的纤维素酶孵育纤维素底物，其中所述底物的浓度为约1至约200g纤维素/L反应混合物或之间的任何量，例如约1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200g纤维素/L反应混合物或之间的任何量，并且纤维素酶的剂量为约0.1至约100mg蛋白/g纤维素或之间的任何量，例如约0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mg蛋白/g纤维素或之间的任何量。可将所述反应混合物孵育约4至约120小时或之间任意长的时间，其中温度为约30至约60℃或之间的任何温度，例如约30、35、40、45、50、55、60℃或之间任意温度，pH为约3.5至约7.0或之间任意pH，例如约3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0或之间的任意pH。孵育后，反应产物(包括半纤维素源碳水化合物、诱导纤维素酶的碳水化合物、葡萄糖、寡糖)可用于进一步加工，例如作为生产乙醇、丁醇、糖醇、乳酸、乙酸的底物，或者终产物可使用本领域所知的标准方法浓缩和纯化。
总之，本发明提供生产可用于纤维素底物水解的具有低半纤维素酶含量的纤维素酶的高生产力发酵方法。
以上描述并非意图以任何方式限制要求保护的发明。此外，所讨论的特征的结合对本发明的解决方案可能并非绝对必需。
实施例
以下实施例将进一步阐释本发明。然而，应理解，这些实施例只用于说明，而不应用于以任何方式限制本发明的范围。
实施例1描述了以下实施例中使用的菌株。实施例2描述了使用HDC和CIC的补料批式和连续式发酵方法。实施例3描述了使用HDC和CIC的补料批式发酵方法的比生产率和产量的确定。实施例4描述了使用HDC和CIC的补料批式发酵中生产的纤维素酶混合物的表征。
实施例1：里氏木霉菌株
以下实施例使用了里氏木霉菌株RutC30(ATCC #56765；Montenecourt，B.and Eveleigh，D.1979.Adv.Chem.Ser.181：289-301)或P59G。菌株P59G是一种生产和分泌高水平的由里氏木霉bgl1编码的β-葡萄糖苷酶的遗传改造菌株，如US 6,015,703中所述。P59G的亲本菌株BTR213是一种通过随机诱变产生的RutC30的衍生菌株，其中首先就在含有1％酸性溶胀纤维素和4g L-1 2-脱氧葡萄糖的基本培养基琼脂上产生更大透明圈的能力进行筛选，然后就在含有0.2μg/ml多菌灵(carbendazim)的乳糖培养基上生长的能力进行筛选。
实施例2：使用HDC和CIC混合物的发酵
将从冷冻(-80℃)的15％甘油原种中取出的木霉属孢子接种于装有马铃薯右旋糖琼脂(PDA)的标准85mm陪替氏培养皿(Petri plate)中。这些培养皿在28℃下孵育3-5天以实现新鲜绿色孢子的汇合生长。为制备用于发酵试验的接种体，将取自单个PDA培养皿的孢子转移到装有添加了5.1g/L玉米浆粉和10g/L葡萄糖的750mL液体Berkley培养基(pH5.5)的2L带挡板三角瓶中。将烧瓶使用轨道搅拌器(orbital agitator)(型号G-52 New Brunswick Scientific Co.)以100rpm在28℃下孵育3天。
用于烧瓶的Berkley培养基
组分            g/L
(NH4)2SO4       1.4
KH2PO4          2.00
MgSO4·7H2O     0.31
CaCl2·2H2O     0.53
玉米浆干粉      5.1
葡萄糖          10
微量元素＊      1mL/L
＊微量元素溶液含有5g/L FeSO4·7H2O；1.6g/L MnSO4·H2O；1.4g/L ZnSO4·7H2O。
2a补料批式发酵
将接种物烧瓶的内容物转移到一个装有10L初始试验培养基(pH5.5)的14L试验规模的发酵容器(型号MF114 New Brunswick Scientific Co.)中。所述容器以批式模式运行直至培养基中的葡萄糖耗尽。此时，以连续方式从通常含有36w％的固体的备料中加入碳源。蠕动泵被用于以0.4g碳/L培养物/小时的给料速率递送碳源。所述运行的批式和补料批式部分的操作参数为：通过500rpm的叶轮搅拌混合，以8标准升/min的速率注入空气，温度为28℃。使用与在线pH探头连接的自动控制器和可加入10％氢氧化铵溶液的泵，将培养物pH在批式生长过程中维持在4.0-4.5，而在纤维素酶生产过程中维持在pH3.5。定时取出100mL发酵液样品进行生物质和蛋白质分析。总发酵时间通常介于96-144小时。
补料批式发酵的初始培养基
组分            g/L
(NH4)2SO4       2.20
KH2PO4          1.39
MgSO4·7H2O     0.70
CaCl2·2H2O     0.185
玉米浆干粉      6.00
葡萄糖          13.00
微量元素＊      0.38mL/L
＊微量元素溶液含有5g/L FeSO4·7H2O；1.6g/L MnSO4·H2O；1.4g/L ZnSO4·7H2O。
将5-10mL的发酵液等分式样称重，通过玻璃微纤维真空过滤，然后在100℃下烘箱干燥4-24小时以确定发酵液的生物质含量。根据下面的公式确定生物质的浓度。
发酵液滤出液的蛋白浓度用Bradford试验测定。使用分光光度计测量595nm的吸收值以定量测量考马斯亮蓝G-250染料的颜色强度变化，这形成了此试验的基础。所用的标准试验对照是已知组成和浓度的纤维素酶混合物。
与只使用HDC的相应方法相比，使用HDC和CIC的补料批式发酵方法产生了多3-5倍的蛋白，并产生了少10％-46％之间任意量的生物质(表4，图3)。
表4：在仅使用HDC或使用HDC和CIC的里氏木霉菌株的14L补料批式培养物中的分泌蛋白和真菌细胞块的生产。
Figure GPA00001077188700152
Figure GPA00001077188700161
a CIC：诱导混合物，包含(基于总碳水化合物)56％龙胆二糖、14％槐糖、6％纤维二塘、10％海藻糖、6％麦芽三糖、4％葡萄糖和14％其他碳水化合物。
b对于P59G菌株，报告值为三次(木糖)或两次(阿拉伯糖)重复发酵的平均结果；对于RutC30菌株，报告值为单次发酵的结果。
2b.连续发酵
如上面的实施例2a所述制备木霉属菌株接种物烧瓶。
如上面的实施例2a所述，将接种物烧瓶的内容物转移到一个装有5L初始试验培养基(pH5.5)的14L试验规模的发酵容器(Model MF114 NewBrunswick Scientific Co.)中。所述容器以批式模式运行直至培养基中的葡萄糖耗尽。此时，以连续方式加入碳源和新鲜营养素。
蠕动泵被用于以0.025h-1的稀释速率，以0.85-1.1g碳/L培养物/小时的给料速率递送碳源。所述碳源由基于总碳水化合物的92％HDC和8％CIC组成。HDC是纯的木糖、葡萄糖和阿拉伯糖的混合物或者通过麦秸的预处理产生的预处理水解产物，HDC由81.1％木糖、11.1％葡萄糖和7.8％阿拉伯糖组成。CIC是一种具有如下所示组成的诱导混合物。通过使用虹吸管将培养物体积在整个发酵过程中都维持在5L。所述运行的批式和补料批式部分的操作参数为：通过500rpm的叶轮搅拌混合，以8标准升/min的速率注入空气，温度为28℃。使用与在线pH探头连接的自动控制器和可加入10％氢氧化铵溶液的泵，将培养物pH在批式生长过程中维持在4.0-4.5，而在纤维素酶生产过程中维持在pH3.5。定时取出100mL发酵液样品进行生物质和蛋白质分析。批式阶段的总发酵时间通常为24小时，连续阶段的总发酵时间为144小时。
连续发酵营养培养基的组成
组分                     g/kg
(NH4)2SO4                1.68
KH2PO4                   1.06
MgSO4·7H2O              0.53
CaCl2·2H2O              0.11
玉米浆干粉               2.52
微量元素＊                           0.29(mL/L)
糖(木糖、阿拉伯糖、葡萄糖)和aCIC)    97
＊微量元素溶液含有5g/L FeSO4·7H2O；1.6g/L MnSO4·H2O；1.4g/L ZnSO4·7H2O。
aCIC：诱导混合物，包含(基于总碳水化合物)56％龙胆二糖、14％槐糖、6％纤维二塘、10％海藻糖、6％麦芽三糖、4％葡萄糖和14％其他碳水化合物。
如实施例2a所述测定发酵液的含量和发酵液滤出液的蛋白浓度。如表5所示，使用各纯糖或预处理水解产物的HDC混合物生长的培养物产生相似量的蛋白和细胞。
表5：在使用CIC和来自预处理水解产物或各纯化学物质的HDC混合物的里氏木霉的14L连续培养物中的分泌蛋白和真菌细胞块的生产。
Figure GPA00001077188700171
aCIC：诱导混合物，包含(基于总碳水化合物)56％龙胆二糖、14％槐糖、6％纤维二塘、10％海藻糖、6％麦芽三糖、4％葡萄糖和14％其他碳水化合物。
b报告值是两次重复发酵的平均结果。
实施例3：比生产率
与只使用HDC的相应方法相比，使用HDC和CIC的补料批式发酵方法表现出高4-12倍的比生产率(表6，图4)。
表6：在仅使用HDC或使用HDC和CIC的里氏木霉菌株的14L补料批式培养物的比生产率。
Figure GPA00001077188700172
aCIC：诱导混合物，包含(基于总碳水化合物)56％龙胆二糖、14％槐糖、6％纤维二塘、10％海藻糖、6％麦芽三糖、4％葡萄糖和14％其他碳水化合物。
b对于P59G菌株，报告值为三次(木糖)或两次(阿拉伯糖)重复发酵的平均结果；对于RutC30菌株，报告值为单次发酵的结果。
连续发酵方法使用CIC结合以通过麦秸的稀酸流预处理产生的HDC混合物(如美国专利4,461,648和5,916,780中所述)或结合以使用纯糖制备的等价HDC混合物。这些HDC混合物基于总碳水化合物含有：81.1％木糖、11.1％葡萄糖和7.8％阿拉伯糖。如表7所示，使用预处理水解产物或各纯糖形式的HDC混合物的连续培养物的比生产率是相似的。
表7：使用CIC和来自预处理水解产物或各纯化学物质的HDC混合物的里氏木霉菌株的CSTR培养物的比生产率。
Figure GPA00001077188700182
aCIC：诱导混合物，包含(基于总碳水化合物)56％龙胆二糖、14％槐糖、6％纤维二塘、10％海藻糖、6％麦芽三糖、4％葡萄糖和14％其他碳水化合物。
b报告值代表使用每种HDC/CIC混合物进行的两次连续发酵的平均值。
实施例4：补料批式发酵中生产的纤维素酶混合物的表征
使用SDS聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)基于分子大小分离由实施例2中所述的发酵方法生产的纤维素酶混合物的各个组分。为此目的，堆积凝胶为4％丙烯酰胺、0.125M Tris-HCl，pH6.8；分离凝胶为12％丙烯酰胺、0.375M Tris-HCl，pH8.8。用于凝胶制备的凝胶单体原液的丙烯酰胺∶双丙烯酰胺比例为37.5∶1。上样前，将蛋白样品在含有β-巯基乙醇的缓冲液中煮沸5分钟进行变性。按照大约10μg蛋白/泳道上样到10×8×0.075cm凝胶上。电泳分离在200V下进行约45分钟。通过用考马斯亮蓝G-250染液染色使分级分离的蛋白显现。
通过SDS-PAGE分级分离的纤维素酶和半纤维素酶的比例用凝胶扫描测光密度法表征。此方法需要首先获取用考马斯亮蓝G-250染料染色的凝胶的数字图像。这是用CHEMIGENIUS2生物成像系统(SynopticsLtd.)和GeneSnap v6.03软件包(Synoptics Ltd.)完成的。然后基于一个给定样品中显示为可区分带的分级分离纤维素酶和半纤维素酶蛋白的图像信号强度相对于全部带的总信号进行表征。使用GeneTools v 3.05软件包(Synoptics Ltd.)按照默认设置测定信号强度。将数据导入Excel电子数据表(Microsoft Inc.)进行进一步分析。
通过测量从预处理的麦秸底物中或滤纸中释放的还原糖，测定了使用HDC和CIC的混合物的里氏木霉发酵生产的纤维素酶混合物的比活。
根据用于测量纤维素酶活性的标准IUPAC方法(Ghose，T.K.，1987，Pure & Appl.Chem.59：257-268)进行了对滤纸的水解。报告值是以IU/mg蛋白表示的纤维素酶比活。
麦秸的水解如下进行：将发酵滤出液稀释在含有0.5％苯甲酸钠的50mM pH5.0的柠檬酸盐缓冲液中，再加入来自黑曲霉(Aspergillis niger)的β-葡萄糖苷酶制剂补足并与根据美国专利No.4,461,648制备的酸预处理的麦秸一起孵育；在50℃下将所述反应混合物摇动24小时，目标纤维素转化水平大于70％。通过测定达到目标纤维素转化水平所需的酶量来计算酶活性。将这些酶活性标准化为对照发酵滤出液的活性，所述对照发酵滤出液是在利用由葡萄糖的酸缩合生成的碳源生长的相同菌株的14L补料批式培养物中生产的。在试验中检测的所有发酵滤出液的总蛋白量是相同的。
如表8所示，与只利用HDC生长的培养物相比，由利用至少3％CIC且结合以HDC生长的里氏木霉培养物产生的发酵滤出液可生产出质量更高的纤维素酶。在给予发酵物的碳源中加入至少3％的CIC提高了纤维素酶∶半纤维素酶的比例和用于纤维素底物的水解的纤维素酶的比活。
表8：在14L补料批式发酵中在HDC和CIC的液体深层培养物中生长的里氏木霉培养物的分泌酶的组成。
Figure GPA00001077188700191
Figure GPA00001077188700201
a用于这些发酵的CIC是包含(基于总碳水化合物)56％龙胆二糖、14％槐糖、6％纤维二塘、10％海藻糖、6％麦芽三糖、4％葡萄糖和14％其他碳水化合物的诱导混合物。
b用于这些发酵的CIC为纤维二糖。
c对预处理的木质素纤维素底物或滤纸的相对水解活性。值表示用来自三次(HDC＝木糖)或两次(HDC＝阿拉伯糖)独立14L发酵的滤出液的分泌酶进行的三次重复试验的平均值(n.d.＝未确定的)。
d纯糖的混合物(81.1％木糖、11.1％葡萄糖和7.8％阿拉伯糖)。
e预处理水解产物中的糖混合物(81.1％木糖、11.1％葡萄糖和7.8％阿拉伯糖)。

Claims (18)

1.一种生产纤维素酶混合物的发酵方法，所述方法包括：在约20℃到约35℃的温度和约3.0到约6.5的pH下为一种分泌纤维素酶的木霉属(Trichoderma)或肉座菌属(Hypocrea)宿主细胞提供一种用于纤维素酶生产的碳源达约3到约30天，所述碳源包含占所述碳源中存在的总碳的约40wt％到97wt％的半纤维素源碳水化合物和占所述碳源中存在的总碳的约3wt％到20wt％的诱导纤维素酶的碳水化合物；以及获得纤维素混合物。
2.权利要求1的发酵方法，其中占所述碳源中存在的总碳的约80wt％到约97wt％的为半纤维素源碳水化合物，并且占所述碳源中存在的总碳的约8wt％到约15wt％的为诱导纤维素酶的碳水化合物。
3.权利要求1的发酵方法，其中所述纤维素酶混合物包含的纤维素酶与半纤维素酶的比例为至少2∶1。
4.权利要求1的发酵方法，其中所述纤维素酶混合物包含的纤维素酶与半纤维素酶的比例为至少3∶1。
5.权利要求1的发酵方法，其中所述碳源包含一种或多种其他碳源。
6.权利要求5的发酵方法，其中所述一种或多种其他碳源为甘油或有机酸。
7.权利要求1的发酵方法，其中所述宿主细胞是里氏木霉(Trichoderma reesi)菌株。
8.权利要求1的发酵方法，其中与其中所述碳源由半纤维素源碳水化合物组成的方法所产生的分泌纤维素的量相比，所述方法生产至少高2倍的分泌纤维素酶。
9.权利要求1的发酵方法，其中所述方法的特征为，与所述碳源由半纤维素源碳水化合物组成的方法的比生产率(qp)相比，所述方法的qp至少提高3倍。
10.权利要求1的发酵方法，其中所述方法的特征为，与所述碳源由半纤维素源碳水化合物组成的方法中的比生产率(qp)相比，所述方法的qp至少提高5倍。
11.权利要求1的发酵方法，其中所述方法为补料批式的。
12.权利要求1的发酵方法，其中所述方法为连续式的。
13.权利要求1的发酵方法，其中所述方法在好氧条件下进行。
14.通过权利要求1的发酵方法生产的纤维素酶混合物用于水解纤维素底物的用途。
15.通过权利要求1的发酵方法生产的纤维素酶混合物用于水解预处理的木质素纤维素底物的用途。
16.一种水解纤维素底物的方法，包括：
将通过权利要求1的发酵方法生产的纤维素酶混合物加至所述纤维素底物以形成反应混合物，其中所述反应混合物中纤维素的浓度为从约1g/L到约200g/L并且所述纤维素酶混合物以约0.1mg蛋白/g纤维素到约100mg蛋白/g纤维素的浓度加入；
将所述反应混合物在约30℃到约60℃的温度和约3.5到约7.0的pH下孵育约4小时到约120小时以水解所述纤维素底物并生成反应产物。
17.权利要求16的方法，其中所述反应产物包括半纤维素酶源碳水化合物、葡萄糖、寡糖、诱导纤维素酶的碳水化合物以及它们的组合。
18.权利要求16的方法，其中所述纤维素底物为预处理的木质素纤维素底物。
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