CN105408490A - 由木质纤维素生物质生产寡糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由木质纤维素生物质生产寡糖的方法，所述方法包括至少下列步骤：a)在预处理反应器(1)中预处理生物质以提供包含预处理过的底物的流出物；b)在反应器中在纤维素酶存在下进行获自步骤a)的流出物中所含的预处理过的底物的酶法水解以产生含有葡萄糖、纤维素酶和水的水解产物；c)取出包含液体部分的至少一部分获自步骤b)的水解产物；d)降低步骤c)中取出的所述部分的水解产物的水含量以使所述水解产物的液体部分的水含量为所述水解产物的液体部分的总重量的小于65重量%水；e)将获自步骤d)的水解产物在40℃至70℃的温度下孵育产生富含寡糖的流出物所需的时间。

Description

由木质纤维素生物质生产寡糖的方法
本发明涉及由木质纤维素生物质生产寡糖的方法。本发明还涉及生产纤维素酶的方法，其包含用于生产由木质纤维素生物质合成的寡糖的单元。最后，本发明涉及由木质纤维素生物质生产糖和醇、溶剂或有机酸并包括用于原位生产寡糖和纤维素酶的单元的被称作“第二代”方法的方法。
现有技术
为了满足能源转型的挑战，特别是为了降低运输模式对环境的影响和它们对油的依赖，正在进行许多研究以利用和优化可再生生物资源，如木质纤维素生物质。
木质纤维素生物质代表地球上最丰富的可再生资源之一。考虑中的基材差异很大，因为它们涉及木质基材（硬木和软木）、农业副产品（稻草）和来自生成木质纤维素废料的工业（农业食品（agroalimentary）工业、造纸工业）的那些。
木质纤维素生物质由三种主要成分构成：纤维素（35%至50%）、半纤维素（23%至32%）（其是基本由戊糖和己糖构成的多糖）和木质素（15%至25%）（其是具有复杂结构和源自苯基丙烯醇（phenylpropenoicalcohols）的共聚的高分子量的大分子）。这些各种分子对植物壁的固有性质负责并组织成复杂的基质。
在这种生物质中占多数的纤维素因此是地球上最丰富的聚合物并具有用于形成材料和生物燃料的最大潜力。但是，主要由于纤维素的提取困难，迄今尚未充分开发纤维素及其衍生物的潜力。实际上，植物本身的结构使这一步骤困难。关于纤维素的提取和转化，已确认的主要技术障碍是其可及性、其结晶度、其聚合程度以及半纤维素和木质素的存在。
使用生物技术工艺转化木质纤维素生物质的方法的原理使用了酶法水解植物材料中所含的纤维素以产生葡萄糖的步骤。所得葡萄糖随后可以发酵成各种产物，如醇（乙醇、1,3-丙二醇、1-丁醇、1,4-丁二醇等）或酸（乙酸、乳酸、3-羟基丙酸、富马酸、琥珀酸等）。
纤维素和可能半纤维素是酶法水解的靶标，但酶无法直接触及它们。因此，这些底物必须经过在酶法水解步骤之前的预处理。该预处理旨在改变木质纤维素材料的物理和物理化学性质以改进对截留在木质素和半纤维素基质中的纤维素的可及性。
水解是一种困难的操作，其通常涉及酶型水解。实际上推荐后者，因为其与化学型水解（例如酸水解）相比生成极少的待加工流出物。
目前，这种类型的水解在由微生物，如细菌或真菌（梭菌属、曲霉属、木霉属）产生的纤维素酶存在下进行。这些微生物产生以协同方式作用以将纤维素水解成单体葡萄糖以及可能半纤维素的酶混合物。在存在的酶系中特别强调的是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。其中，里氏木霉（Trichodermareesei）是最有希望的物种，因为其能够分泌大量的高活性纤维素酶。
但是，生产纤维素酶的成本仍然高并代表以工业规模实施这种类型的方法的经济障碍之一。
在工业上，在使用含有乳糖作为诱导纤维素酶生成的糖的进料溶液的分批补料程序（进料但无排料（infeedwithoutwithdrawal））中进行通过里氏木霉生成纤维素酶的最优化生产（FR2555603）。但是，独自使用的乳糖太昂贵以致无法低成本生产纤维素酶。
为了降低与购买乳糖有关的成本，可以考虑将所有或一部分乳糖诱导部分换成另一诱导糖，其：
·是一样好的诱导剂但更便宜
·或是更昂贵但更好的诱导剂，这意味着可以进一步降低用于分批补料程序的进料溶液中的诱导剂的最低量。
因此，例如，纤维二糖（β(1→4)葡萄糖二聚体）是用于生成里氏木霉中的纤维素酶的天然诱导剂。纤维二糖是纤维素水解成葡萄糖（这被酶β-葡糖苷酶催化）中的最后一种中间体。为了产生纤维二糖，可以考虑使用不含β-葡糖苷酶的纤维素酶混合物以将纤维素水解成纤维二糖。但是，这种反应的动力学缓慢，因为纤维二糖极强地抑制纤维素酶（纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶）。此外，这一选项要求单独生产不含β-葡糖苷酶的特定混合物，这使工业利润较低。
另一替代方案可能包括使用槐糖（β(1→2)葡萄糖二聚体），其已知是更强的诱导剂，但其成本仍抑制工业使用。
因此，本发明的一个目的是提出从运行成本的角度看优化的生产糖、纤维素酶和醇和/或溶剂的方法，其特别由木质纤维素生物质起始。
发明概述
第一方面，本发明提出由木质纤维素生物质生产寡糖的方法，其包括至少下列步骤：
a)在预处理反应器中预处理生物质以提供包含预处理过的底物的流出物；
b)在反应器中在纤维素酶存在下进行获自步骤a)的流出物中所含的预处理过的底物的酶法水解以产生含有葡萄糖、纤维素酶和水的水解产物；
c)取出包含液体部分的至少一部分获自步骤b)的水解产物；
d)降低步骤c)中取出的所述部分的水解产物的水含量以使所述水解产物的液体部分的水含量为所述水解产物的液体部分的总重量的小于65重量%水；
e)将获自步骤d)的水解产物在40℃至70℃的温度下孵育产生富含寡糖的流出物所需的时间。
本发明的寡糖生产方法使用木质纤维素生物质作为起始材料，其易得，也便宜。
本发明人已经观察到，当所述水解产物的液体部分的水含量为所述水解产物的液体部分的总重量的小于或等于65重量%时，可以促进由含有葡萄糖和纤维素酶的水解产物起始通过孵育形成寡糖。
优选地，所孵育的获自水解步骤的水解产物具有至少1IU/mL，优选至少5IU/mL的β-葡糖苷酶活性。在50℃下孵育30分钟的同时，在50mM柠檬酸盐缓冲液中在4.75pH下使用5mMpNPG（对-硝基酚-β-吡喃葡萄糖）作为底物测量这种β-葡糖苷酶活性[Dashtban,Maki,Leung,Mao和Qin(2010)Cellulaseactivitiesinbiomassconversion:MeasurementMethodsandComparison.CriticalReviewsinBiotechnology30(4)第302-309页]。接着，通过吸光度测量pNPG被β-葡糖苷酶水解产生的对硝基酚的浓度。β-葡糖苷酶活性以IU/mL表示，其中IU代表μmol/min（每分钟反应释放的产物的μmol数）。
根据一个实施方案，通过在低于90℃的温度下蒸发，进行降低水解产物的液体部分的水含量的步骤d)。
根据另一实施方案，通过将葡萄糖添加到步骤c)中取出的水解产物中，进行降低水解产物的液体部分的水含量的步骤d)。
或者，在步骤d)中，将步骤c)中取出的水解产物分离成至少第一部分和第二部分，第一部分的水解产物在大于90℃的温度下浓缩以获得浓缩水解产物部分，并将该浓缩水解产物与第二、未浓缩的水解产物部分混合。
根据另一实施方案，在步骤d)中，例如通过反渗透或通过纳滤进行步骤c)中取出的水解产物的膜分离以回收具有降低的水含量的水解产物和水溶液。
在根据本发明的生产寡糖的方法的情况下，也可以进行获自步骤a)的流出物的固/液分离以回收含有糖的液体部分和送往步骤b)的含有预处理过的底物的固体部分。关于该液体部分，这可以作为与水解产物的混合物在步骤d)中处理，或与获自步骤e)的富含寡糖的流出物混合。
优选地，在孵育步骤e)结束时，获得包含选自槐糖和龙胆二糖（单独或作为混合物）的寡糖的流出物。
根据本发明的生产寡糖的方法本身可并入到生产醇和/或溶剂的现有单元中，被称作第二代，其使用木质纤维素生物质作为起始材料。
因此，本发明还涉及由木质纤维素生物质起始生产纤维素酶的方法，其包括至少下列步骤：
a)在预处理反应器中预处理生物质以提供包含预处理过的底物的流出物；
b)在反应器中在纤维素酶存在下进行获自步骤a)的流出物中所含的预处理过的底物的酶法水解以产生含有葡萄糖、纤维素酶和水的水解产物；
c)取出包含液体部分的至少一部分获自步骤b)的水解产物；
d)降低步骤c)中取出的所述部分的水解产物的水含量以使所述水解产物的液体部分的水含量为所述水解产物的液体部分的总重量的小于65重量%水；
e)将获自步骤d)的水解产物在40℃至70℃的温度下孵育产生富含寡糖的流出物所需的时间；
f)将至少一部分富含寡糖的水解产物送往含有培养基和能够产生纤维素酶的微生物的反应器；和
g)培养混合物以产生富含纤维素酶的流出物。
根据本发明，使用获自步骤e)的含寡糖的流出物作为用于生产纤维素酶的单元中的诱导溶液。
本发明还涉及单独或作为混合物生产醇、溶剂或有机酸的方法，其包括上述生产纤维素酶的方法的步骤和附加步骤，其中将一部分获自步骤b)的水解产物送往包含微生物的发酵反应器以产生包含单独或作为混合物的醇、溶剂或有机酸的发酵汁并将至少一部分获自步骤g)的富含纤维素酶的流出物再循环到步骤b)的反应器。
或者，本发明的单独或作为混合物生产醇、溶剂或有机酸的方法可以实施这样的步骤，其中将一部分获自步骤a)的流出物送往用于同时水解和发酵的单元以产生醇和/或溶剂，并将至少一部分获自步骤g)的富含纤维素酶的流出物再循环到同时水解和发酵单元。
例如，本发明的发酵可用于生产作为主要醇的乙醇或单独的或作为与丙酮或异丙醇的混合物的正丁醇。
本发明的生产醇和/或溶剂的方法包括由寡糖起始原位生产纤维素酶的步骤，寡糖本身由该方法中已存在的糖原位合成。
本发明的单独或作为混合物生产醇、溶剂或有机酸的方法的优点在于它的实施省去了购买、运输和储存用于生产纤维素酶所必需的寡糖（用作诱导剂）的成本，因为由于该方法，由该方法内已可得的糖起始原位生产寡糖。
附图简述
从参考附图作出的下列描述中更好地理解和更清楚看出本发明的其它特征和优点，所述附图中：
·图1是根据本发明的生产寡糖的方法的一个实施方案的图示；
·图2是根据本发明的生产纤维素酶的方法的一个实施方案的图示；
·图3是根据本发明的生产醇和/或溶剂的方法的第一实施方案的图示；
·图4是根据本发明的生产醇和/或溶剂的方法的第二实施方案的图示。
一般而言，在附图中由相同标号表示类似的元件。
发明详述
参考图1，根据本发明的生产寡糖的方法包括在预处理反应器1中进行的在酶法水解步骤之前的生物质预处理步骤。预处理的目的是使纤维素和任选半纤维素可被酶触及。特别地，预处理旨在改变木质纤维素材料的物理和物理化学性质以改进对截留在木质素和半纤维素基质内的纤维素的可及性。
存在大量用于进行这种预处理的技术。可提到的实例是酸消化、碱性消化、汽爆、有机溶剂法等。通过预处理结束时的材料平衡（单体或可溶低聚物或不可溶聚合物形式的糖的回收度）以及通过纤维素和半纤维素残渣的易酶法水解性测量预处理效率。
优选使用通过蒸汽爆破（也称作“汽爆”、“蒸汽喷射”、“爆炸性减压”和“蒸汽预处理”）进行预处理，其以在纤维素的可降解性和其低稀释度方面的性能著称。在这种方法中，通过在压力下喷射蒸汽，将该生物质快速加热到高温（150℃–250℃）。通常通过骤然减压（被称作减压或爆破，这分解木质纤维素基质）终止该处理。停留时间为在10至50巴的压力下10秒至数分钟不等。分批或连续进行这种技术。某些技术提出在减压前喷水以冷却介质。
在汽爆前可以酸浸渍以提高半纤维素在煮沸过程中的水解。当对已例如用H2SO4酸化的底物施以汽爆时，其使半纤维素溶解并几乎完全水解成它们的单体，同时限制降解成糠醛。此外，改进纤维素的易酶法水解性。酸催化剂的使用意味着可以降低该方法的温度（150℃至200℃，而在无催化剂的汽爆的情况下为250℃），因此可以将降解化合物的形成减至最少。在汽爆前还可存在酸煮沸步骤，其旨在水解半纤维素并将它们以单体和/或低聚糖形式提取到液体溶液中。
包含预处理过的生物质的流出物经管线2取出并在酶法水解反应器3中处理以获得可通过纤维素酶对已通过预处理步骤变得可及的纤维素的作用发酵的糖。如图1中可以看出，经管线5将纤维素酶引入该单元。优选地，可用于将纤维素转化成单体糖（例如葡萄糖）的纤维素酶构成多酶体系的一部分，该多酶体系通常包含：
·在纤维素的非晶区随机裂解纤维素的内切葡聚糖酶（EG）；
·渐进作用于纤维素链的自由端的外切葡聚糖酶；
·特别将纤维糊精和纤维二糖水解成葡萄糖的β-葡糖苷酶。
选择酶法水解的条件，主要是要水解的混合物的干物质含量（使用ASTM方法E1756-01测定）和所用酶的量以使溶解纤维素总重量的20重量%至99重量%，优选30重量%至95重量%的纤维素以提供含有单体糖，特别包括葡萄糖的水解产物。将获得目标干物质含量所需的水经管线（未显示）添加到反应器3中。所需干物质含量通常为5重量%至45重量%，优选8重量%至40重量%。酶法水解优选在4至5.5的pH范围和40℃至60℃的温度下进行。经专用于此目的的管线（未显示）引入必要的添加剂，例如营养素、化学试剂如氢氧化钠和/或氨和/或氢氧化钾。
获自酶法水解反应器的水解产物包含含水的液体部分、单体糖混合物（包括葡萄糖）、酶混合物和含未水解固体材料（包括木质素）的固体部分。在该方法的剩余部分中使用的水解产物优选具有至少1IU/mL，优选至少5IU/mL的β-葡糖苷酶活性。通常，获自水解步骤的水解产物的液体部分的水含量为该水解产物的液体部分的总重量的85%至95%。
如图1中所示，经管线7从所述反应器3中排出水解产物并将一部分（或部分）水解产物经管线8送往处理单元，该处理单元可用于降低该水解产物的液体部分的水含量以使此含量为该液体部分的总重量的65重量%或更低，优选低于60重量%，更优选低于50%的值。
通过经孔隙率1.2微米的过滤介质过滤水解产物的样品以回收液体部分，测定该水解产物的液体部分的水含量。所述液体部分随后进行根据ASTM标准E1756-01的试验，其包括通过在105℃下干燥直至残留物重量恒定来测量该液体部分的重量损失。干燥过程中的重量损失随之相当于该样品中最初存在的水重量，剩余重量相当于固体材料和该液体部分中所含的可溶材料。
可以使用技术人员已知的任何浓缩技术，例如通过膜分离（例如反渗透、纳滤）、通过蒸发一部分水或通过液-液萃取来进行降低水含量的步骤。在一个未显示的变体中，例如通过将该水解产物与更浓缩的糖溶液，例如葡萄糖糖浆混合来降低水含量。
该浓缩处理优选包括至少一个蒸发水的步骤。现在参考图1详述三个实施方案。
在第一个优选实施方案中，在蒸发器中进行这一降低水解产物的水含量的步骤以萃出水并由此使该水解产物富集糖。将从水解反应器3中取出的至少一部分水解产物经管线8,8a送往蒸发器9以蒸发出水。通过在大气压下或在真空下将该水解产物加热到小于90℃，优选40℃至70℃的温度来进行这种蒸发。选择所用温度以使水解产物中存在的并可用于下面解释的随后的孵育操作的纤维素酶不变性。然后经管线10将获自蒸发器9的脱水流出物转移至孵育反应器11。
根据第二实施方案，如图1中所示，将经管线8取出的水解产物分别经管线12和13分成两个料流。将经管线12取出的水解产物流送往在高于90℃的温度下运行的蒸发器14，以萃出水并由此使该水解产物富集糖，特别是葡萄糖。在蒸发步骤结束时，借助管线15将该水解产物送往孵育器11。关于经管线13取出的水解产物流，其直接送往孵育器11以供应将葡萄糖转化成寡糖所需的纤维素酶。
根据合并上文描述的前两个实施方案的第三实施方案，将经管线8取出的水解产物分成三个料流，它们分别经管线8a、12和13送往蒸发器9、蒸发器14和孵育器11。
根据本发明，该生产寡糖的方法包括孵育水解产物的步骤，所述水解产物的液体部分包含65重量%或更低的水含量。这一步骤的目的是实施将至少一部分葡萄糖转化成寡糖，所述寡糖具有诱导真菌中的纤维素酶编码基因的表达的性质。特别地，该孵育步骤可用于生产槐糖（经β-1-2键连接的葡萄糖分子的二聚体）和/或龙胆二糖（经β-1-6键连接的葡萄糖分子的二聚体）。该寡糖溶液优选含有总浓度(槐糖+龙胆二糖)通常低于30g/L的槐糖和龙胆二糖的混合物。这两种寡糖（或二糖）是丝状真菌中，特别是里氏木霉中的纤维素酶分泌的有力诱导剂。
这种孵育步骤包括将该水解产物加热到40℃至70℃，优选50℃至65℃的温度0.1至100小时，优选至少24小时，非常优选24至72小时。
在孵育步骤结束时，经管线16从孵育器11中取出包含寡糖的水溶液。
根据该寡糖合成方法的另一实施方案（未显示在图1中），在固/液分离单元中处理经管线8取出的水解产物，从该固/液分离单元中提取固体部分和含有葡萄糖和纤维素酶的液体水解产物部分。然后根据上述三个实施方案之一以在孵育步骤前降低其水含量的方式处理该水解产物的液体部分。这种固/液分离步骤可以使用下列技术之一：离心、沥干、施压、过滤和沉降。
参考图1，本发明的方法可包括对获自预处理反应器的流出物进行的使用单元17的任选固/液分离步骤。这一步骤因此可用于：
·经管线18提取出含有获自半纤维素的糖（例如木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖）的液体部分；和
·经管线2a提取出含固体的部分（预处理过的生物质），将其送往水解反应器3。
根据图1，将所有或一部分液体部分18经管线20直接与获自孵育器11的流出物混合，或独自或作为与获自水解步骤的水解产物的混合物经管线19送往蒸发器14以蒸发水，或独自或作为与水解产物的混合物（经未显示的管线）送往蒸发器9。
根据本发明，为了降低水解产物中的水含量，可以实施另一方法作为上述方法的替代或补充，其包括将糖添加到水解产物中。
参考图2，除上文已描述的步骤外，根据本发明的生产纤维素酶的方法实施使用发酵罐4并使用原位合成的寡糖生产纤维素酶的步骤。在发酵罐4中借助经管线6供应的微生物进行酶的生产。该微生物优选选自属于瘤胃球菌属、梭菌属、纤维单胞菌属、Thermonospora、链霉菌属的纤维分解细菌或来自曲霉属、青霉属或木霉属的纤维分解真菌。其中，里氏木霉是优选物种，因为其能够分泌大浓度的高活性纤维素酶。
如图2中可以看出，将经管线16从孵育器11中提取出的所有或一部分流出物送往发酵罐4。
在搅拌和充气发酵罐中在与它们的生长和酶的生成相容的条件下孵育这些菌株。可以使用技术人员已知的适用于该微生物的任何类型的生产方法。特别可以使用如文献FR2555603中描述的“分批补料”型方法。
为此，制备含有该微生物和培养基（其包含常见的无机盐和维生素补充剂和优选为可溶糖（例如乳糖、葡萄糖、木糖或阿拉伯糖）形式的碳和能量源）的预培养物。然后将该预培养物转移到包含含有至少一种糖的培养基并定期补充寡糖-诱导溶液的用于生产酶的发酵罐中。接着，在该发酵罐中通过使微生物与培养基之间保持必要的接触和通过有规律地送入寡糖-诱导溶液（例如连续）来生产酶。
在初始碳源耗尽后，定期或连续喷入含诱导剂寡糖的水溶液，以送入在35至135毫克总糖（含有诱导剂寡糖）/克细胞/小时范围内，优选在35至45毫克范围内的最佳量。
如图2中所示，经管线5从发酵罐4中取出所有或一部分含有相关纤维素酶的发酵汁以供应水解反应器3。
图3是包含使用由该方法内部的料流生成的寡糖生产纤维素酶的单元的生产醇、溶剂或有机酸的方法的一个实施方案的图示。
参考图3，将未用于原位合成寡糖的那部分（或一部分）水解产物经管线21送往用于发酵该水解产物中存在的糖的单元22。
在发酵单元22中，使该水解产物与经管线23引入的一种或多种发酵微生物接触。由此通过微生物将可发酵的糖转化成单独或作为混合物的醇、溶剂或有机酸。单元22中的发酵步骤可以在30℃至40℃的温度和3至6.5的pH下进行。在发酵步骤结束时，获得发酵汁，其经管线24从单元22中排出并包含悬浮的材料和含一种或多种所需产物（醇和/或溶剂）的液相。
获自发酵单元22的发酵汁经管线24引入分离单元（未显示），其可用于将该发酵汁分离成不同产物：醇和/或溶剂、含有未发酵的糖的液体釜馏物和主要含有木质素以及尚未水解的纤维素和半纤维素的固体残余物。
例如，该发酵的类型可以是：
a)“乙醇”型，其相当于借助酵母（例如酿酒酵母(S.cerevisiae)）或细菌（例如运动发酵单胞菌(Z.mobilis)）或其它微生物生产乙醇作为主要醇。
b)“丁醇（butylic）”型，其本身在此包括：
·仅产生正丁醇的发酵；
·“ABE”发酵，其相当于生产包含丙酮、正丁醇（主要产物）和乙醇的混合物。也可能存在痕量异丙醇；
·“IBE”发酵，其相当于生产异丙醇、正丁醇（主要产物）和乙醇；
这些发酵通常使用梭菌属的微生物进行并在严格的厌氧条件下进行；
·“异丁醇型（isobutylic）”发酵，其通常相当于仅生产异丁醇。许多微生物（都基因改造）能利用氨基酸途径进行这种转化（例如大肠杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母）；
c)“丙醇（propylic）”型，其相当于生产丙醇或异丙醇。
根据包含使用由该方法内部的料流生成的寡糖生产纤维素酶的单元的生产醇和/或溶剂的方法的一个实施方案，与酶法水解步骤同时进行糖发酵成醇和/或溶剂（“SSF”实施方案，同时糖化和发酵）。参考图4，经管线2和25将获自预处理单元1的流出物分成两个料流。将含有预处理过的生物质的料流2送往如对图2描述的用于原位生产纤维素酶的单元。将料流25转移至SSF发酵单元26，其同时进行：
·借助经管线27供应的来自纤维素酶的原位生产单元4的纤维素酶水解纤维素；和
·借助经管线23引入的微生物发酵在酶法水解过程中释放的可发酵糖。
当酶法水解和乙醇发酵在一个相同操作中进行（SSF法）时，温度通常为30℃至45℃，且pH为4至6。
应该指出，在本发明的生产醇和/或溶剂的方法的内容中完全可以合并对生产寡糖和纤维素酶的方法描述的实施方案。
实施例
缩写“DM”在下文中用于培养基中存在的干物质（固体和可溶物）。根据ASTM方法E1756-01测定干物质的量（或“总固体量”），其包括在105℃下直到获得恒重时的重量损失。
实施例1（不符合）：
在包含15重量%DM（15克稻草干物质/100克总质量）的培养基中使用由里氏木霉生成的纤维素酶混合物进行通过酸消化预处理的稻草的酶法水解。用于水解的纤维素酶的量固定为10毫克纤维素酶/克干物质（DM）。该混合物在搅拌下在50℃下水解72小时。在水解结束时，回收粗制水解产物，其具有75g/L的葡萄糖浓度和10IU/mL的β-葡糖苷酶活性。此外，该液体部分的水含量为该液体部分的重量的92重量%。
然后将该粗制水解产物在搅拌下在50℃下孵育24小时。在孵育期结束时，将该水解产物煮沸5分钟以使酶变性，然后通过HPLC分析。分析表明该水解产物不含寡糖。
不符合本发明的实施例1表明，孵育具有大于65重量%的水含量的水解产物无法将至少一部分葡萄糖转化成寡糖，特别是转化成槐糖和/或龙胆二糖。
实施例2（根据本发明）
在实施例1中获得的粗制水解产物中补充60重量%葡萄糖糖浆以获得具有500g/L的葡萄糖浓度和该液体水解产物部分的总重量的57.5重量%水的水含量的液体部分。该混合物在搅拌下在50℃下孵育24小时。在孵育期结束时，将该混合物煮沸5分钟以使酶变性，然后通过HPLC分析。所得水解产物含有22g/L的槐糖和龙胆二糖的混合物和477g/L的葡萄糖（即葡萄糖4.4%转化成寡糖）。
实施例3（根据本发明）
使用孔隙率100微米的过滤器过滤实施例1中获得的粗制水解产物以分离：
·含有12重量%干物质（DM）的液体部分；
·含有35重量%干物质（DM）的固体部分。
该液体部分含有75g/L的葡萄糖并具有6IU/mL的β-葡糖苷酶活性和大约90重量%的水含量。
然后在该液体部分中补充60重量%葡萄糖糖浆以获得具有500g/L的葡萄糖浓度和57.5重量%的水含量的液体部分。该混合物在搅拌下在50℃下孵育24小时。在孵育期结束时，将该混合物煮沸5分钟以使酶变性，然后通过HPLC分析。该分析表明所得水解产物含有大约11g/L的槐糖和龙胆二糖的混合物和488g/L的葡萄糖（即葡萄糖2.2%转化成寡糖）。
实施例4（根据本发明）
制备含有300g/L葡萄糖、300g/L木糖和10IU/mL的β-葡糖苷酶活性并具有大约50重量%的水含量的水溶液。这种溶液在搅拌下在50℃下孵育24小时。在孵育后，将该混合物煮沸5分钟以使酶变性，然后通过HPLC分析。该水解产物因此含有21g/L的槐糖和龙胆二糖的混合物（即葡萄糖7%转化成寡糖）、278g/L的葡萄糖和300g/L的木糖。
本发明的实施例2至4表明，当木质纤维素生物质水解产物的液体部分的水含量为该液体部分的总重量的小于65重量%时，可以通过木质纤维素生物质水解产物的孵育生产寡糖。
实施例4还表明，在孵育溶液中可以用戊糖替代至少一部分葡萄糖以生成诱导寡糖。
实施例5（根据本发明）
将四个含有盐水培养基（5g/LKH2PO4、2.8g/L(NH4)2SO4、0.6g/LMgSO4.7H2O、0.6g/LCaCl2.2H2O、60mg/LFeSO4.7H2O、13mg/LMnSO4.4H2O、17g/LZnSO4.7H2O、1g/L玉米浆）和15g/L葡萄糖的具有750毫升有效容积的Dasgip生物反应器消毒，然后在烧瓶中接种里氏木霉的预培养物。在培养全程，通过添加氢氧化铵NH4OH或硫酸H2SO4，使pH保持4.8。在葡萄糖耗尽后（在大约30小时后），使用各自含有250g/L的糖总量但具有不同糖组成的水溶液以分批补料模式进行里氏木霉分泌的纤维素酶的合成：
·溶液1仅含250g/L浓度的葡萄糖；
·溶液2是用水稀释以使其含有11g/L的槐糖和龙胆二糖的混合物和239g/L葡萄糖的实施例2的液体部分；
·溶液3是用100g/L葡萄糖水溶液稀释以使其含有6g/L的槐糖和龙胆二糖的混合物和244g/L葡萄糖的实施例3的液体部分；
·溶液4仅含250g/L浓度的乳糖。
使用Lowry’s方法[Lowry,Rosenbrough,Farr,Randall(1951)ProteinmeasurementwiththeFolinphenolreagent.JournalofBiochemicalChemistry193(1)第265-275页]测量培养基中的蛋白质（纤维素酶）浓度。
对于溶液1，观察到没有诱导蛋白质生成。在培养250小时后，蛋白质浓度保持稳定在大约1至2g/L。
当溶液2、3和4（根据本发明）用于培养时，观察到蛋白质生成。在培养250小时后，培养基分别含有35g/L、36g/L和34g/L蛋白质。本发明的方法因此可用于由含有获自木质纤维素材料的水解产物的槐糖和龙胆二糖的混合物的诱导溶液起始由微生物产生纤维素酶。

Claims (17)

1.由木质纤维素生物质生产寡糖的方法，所述方法包括至少下列步骤：
a)在预处理反应器中预处理生物质以提供包含预处理过的底物的流出物；
b)在反应器中在纤维素酶存在下进行获自步骤a)的流出物中所含的预处理过的底物的酶法水解以产生含有葡萄糖、纤维素酶和水的水解产物；
c)取出包含液体部分的至少一部分获自步骤b)的水解产物；
d)降低步骤c)中取出的所述部分的水解产物的水含量以使所述水解产物的液体部分的水含量为所述水解产物的液体部分的总重量的小于65重量%水；
e)将获自步骤d)的水解产物在40℃至70℃的温度下孵育产生富含寡糖的流出物所需的时间。
2.根据权利要求1的方法，其中在步骤d)中，通过在低于90℃的温度下蒸发，浓缩步骤c)中取出的水解产物。
3.根据权利要求1的方法，其中在步骤d)中，将葡萄糖添加到步骤c)中取出的水解产物中。
4.根据权利要求1的方法，其中在步骤d)中，进行步骤c)中取出的水解产物的膜分离以分离所述液体部分的至少一部分水。
5.根据权利要求1的方法，其中在步骤d)中，将步骤c)中取出的水解产物分离成至少第一部分和第二部分，第一水解产物部分在大于90℃的温度下浓缩，并将浓缩水解产物部分与第二水解产物部分混合。
6.根据前述权利要求之一的方法，其中进行获自步骤a)的流出物的固/液分离以回收含有糖的液体部分和含有预处理过的底物的固体部分，所述固体部分送往步骤b)。
7.根据权利要求6的方法，其中水解产物作为与所述液体部分的混合物在步骤d)中处理。
8.根据权利要求6的方法，其中将所述液体部分与获自步骤e)的富含寡糖的流出物混合。
9.根据前述权利要求之一的方法，其中获自步骤e)的流出物包含槐糖和/或龙胆二糖。
10.由木质纤维素生物质生产纤维素酶的方法，所述方法包括根据权利要求1至9之一的生产寡糖的方法和下列附加步骤：
f)将至少一部分富含寡糖的水解产物送往含有培养基和能够产生纤维素酶的微生物的反应器；和
g)培养混合物以产生富含纤维素酶的流出物。
11.根据权利要求10的生产纤维素酶的方法，其中步骤f)中所用的微生物来自里氏木霉属。
12.根据权利要求10或权利要求11的生产纤维素酶的方法，其中步骤g)以半连续模式进行。
13.根据权利要求10至12之一的生产纤维素酶的方法，其中进行步骤g)中获得的流出物的固/液分离以回收含有纤维素酶的液体部分并将所述液体部分再循环至步骤b)的反应器。
14.单独或作为混合物生产醇、溶剂或有机酸的方法，所述方法包括根据权利要求10至13之一的生产纤维素酶的方法的步骤，且其中将一部分获自步骤b)的水解产物送往包含微生物的发酵反应器以产生包含醇和/或溶剂的发酵汁。
15.单独或作为混合物生产醇、溶剂或有机酸的方法，所述方法包括根据权利要求10至13之一的生产纤维素酶的方法的步骤，且其中将一部分获自步骤a)的流出物送往用于同时水解和发酵的单元。
16.根据权利要求14或权利要求15的方法，其中进行乙醇发酵以生产乙醇作为主要醇。
17.根据权利要求14或权利要求15的方法，其中进行丁醇发酵以生产单独的或作为与丙酮或异丙醇的混合物的正丁醇。
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