ES2621673T3 - Procedimiento de producción de oligosacáridos a partir de biomasa lignocelulósica - Google Patents

Procedimiento de producción de oligosacáridos a partir de biomasa lignocelulósica Download PDF

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Abstract

Procedimiento de producción de oligosacáridos a partir de biomasa lignocelulósica que comprende al menos las etapas siguientes: a) se pretrata en un reactor de pretratamiento la biomasa con el fin de proporcionar un efluente que contiene un sustrato pretratado; b) se lleva a cabo, en un reactor, una hidrólisis enzimática del sustrato pretratado contenido en el efluente procedente de la etapa a) en presencia de celulasas con el fin de producir un hidrolizado que contiene glucosa, celulasas y agua; c) se extrae al menos una parte del hidrolizado procedente de la etapa b) que comprende una fracción líquida; d) se reduce el contenido en agua de dicha parte del hidrolizado extraído en la etapa c) de manera que la fracción líquida del hidrolizado presente un contenido en agua inferior al 65% en peso de agua con respecto al peso total de la fracción líquida del hidrolizado; e) se incuba a una temperatura comprendida entre 40 y 70ºC el hidrolizado procedente de la etapa d) durante el tiempo necesario para producir un efluente enriquecido en oligosacáridos.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento de produccion de oligosacaridos a partir de biomasa lignocelulosica
La presente invencion pertenece al ambito de un procedimiento de produccion de oligosacaridos a partir de biomasa lignocelulosica. La invencion tiene tambien por objeto un procedimiento de produccion de celulosas que integran una unidad de produccion de oligosacaridos sintetizados a partir de biomasa lignocelulocisa. Finalmente, la presente invencion se refiere a un procedimiento denominado de “segunda generacion” de produccion de azucares y de alcoholes, de disolventes o de acidos organicos a partir de biomasa lignocelulosica y que comprende una unidad de produccion in situ de oligosacaridos y de celulasas.
Estado de la tecnica
Con el fin de responder a los desaffos de la transicion energetica y en particular para reducir el impacto de los transportes sobre el medio ambiente y su dependencia del petroleo, se llevan a cabo actualmente numerosos estudios para utilizar y optimizar los bio-recursos renovables, como la biomasa lignocelulosica.
La biomasa lignocelulosica representa uno de los recursos renovables mas abundantes en la tierra. Los sustratos considerados son muy variados, ya que se refieren al mismo tiempo a los sustratos lenosos (frondosos y resinosos), los subproductos de la agricultura (paja) o los de las industrias generadoras de desechos lignocelulosicos (industrias agroalimenticias, papeleras).
La biomasa lignocelulosica esta compuesta de tres principales constituyentes: la celulosa (del 35 al 50%), la hemicelulosa (del 23 al 32%) que es un polisacarido esencialmente constituido de pentosas y de hexosas, y la lignina (del 15 al 25%) que es una macromolecula de estructura compleja y de alto peso molecular, que proviene de la copolimerizacion de alcoholes fenilpropenoicos. Estas diferentes moleculas son responsables de las propiedades intrrnsecas de la pared vegetal y se organizan en un entramado complejo.
La celulosa, mayoritaria en esta biomasa, es asf el polfmero mas abundante en la tierra y el que presenta el mayor potencial para formar unos materiales y unos biocarburantes. Sin embargo, el potencial de la celulosa y de sus derivados no ha podido, por el momento, ser completamente explotado, principalmente debido a la dificultad de extraccion de la celulosa. En efecto, esta etapa se hace diffcil por la estructura misma de las plantas. Los obstaculos tecnologicos identificados para la extraccion y para la transformacion de la celulosa son, en particular, su accesibilidad, su cristalinidad, su grado de polimerizacion, la presencia de la hemicelulosa y de la lignina.
El principio del procedimiento de conversion de la biomasa lignocelulosica por unos procedimientos biotecnologicos utiliza una etapa de hidrolisis enzimatica de la celulosa contenida en las materias vegetales para producir glucosa. La glucosa obtenida puede despues ser fermentada en diferentes productos tales como los alcoholes (etanol, 1,3- propanodiol, 1-butanol, 1,4-butanodiol, etc.) o unos acidos (acido acetico, acido lactico, acido 3-hidroxipropionico, acido fumarico, acido succmico, etc.).
La celulosa y eventualmente las hemicelulosas son las dianas de la hidrolisis enzimatica, pero no son directamente accesibles a las enzimas Esta es la razon por la cual estos sustratos deben experimentar un pretratamiento anterior a la etapa de hidrolisis enzimatica. El pretratamiento pretende modificar las propiedades ffsicas y fisicoqmmicas del material lignoceulosico, para mejorar la accesibilidad de la celulosa atrapada dentro de la matriz de lignina y de hemicelulosa.
La hidrolisis es una operacion diffcil que utiliza generalmente una hidrolisis de tipo enzimatica. En efecto, se recomienda esta ultima ya que genera pocos efluentes a tratar con respecto a una hidrolisis de tipo qmmico (por ejemplo acido).
En la actualidad, esta hidrolisis se realiza en presencia de celulasas que son producidas a partir de microorganismos tales como bacterias o hongos (Clostridium, Aspergillus, Trichoderma). Estos micro-organismos producen un coctel de enzimas que actuan en sinergia para hidrolizar la celulosa en monomero glucosa, y tambien eventualmente la hemicelulosa. Entre las familias de enzimas presentes, se senalan particularmente las endogluconasas, las exogluconasas y las p-glucosidasas. Entre estos, Trichoderma reesei es la especie mas prometedora ya que es capaz de segregar unas cantidades importantes de celulosas muy activas.
Sin embargo, el coste de produccion de las celulosas sigue siendo elevado y representa uno de los obstaculos economicos para una utilizacion de tales procedimientos a escala industrial.
Industrialmente, la produccion optimizada de celulasas por Trichoderma reesei se realiza en protocolo fed-batch (alimentacion sin trasiego) utilizando una solucion de alimentacion que contiene lactosa como azucar inductor de la produccion de celulasas (FR 2555603). Sin embargo, la lactosa utilizada sola es demasiado costosa para permitir una produccion de celulasas de bajo coste.
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A fin de disminuir el coste asociado a la compra de lactosa, es posible considerar sustituir en totalidad o en parte la fraccion del inductor lactosa por otro azucar inductor que sena:
* o bien tan buen inductor pero menos costoso
* o bien mas costoso pero mejor inductor, lo que permitina disminuir todavfa mas el contenido mmimo de inductor en la solucion de alimentacion del protocolo fed-batch.
Asf, por ejemplo, la celobiosa (dfmero de glucosa de p(1^4)) es un inductor natural de la produccion de celulasas en Trichoderma reesei. La celobiosa es el ultimo intermediario en la hidrolisis de la celulosa en glucosa que esta catalizada por la enzima p-glucosidasa. A fin de producir la celobiosa, se puede pensar en utilizar un coctel de celulasas desprovisto de p-glucosidasas a fin de hidrolizar la celulosa en celobiosa. Sin embargo, esta reaccion es de cinetica lenta, ya que las celulasas (celobiohidrolasa y endoglucanasa) estan muy altamente inhibidas por la celobiosa. Por otro lado, tal opcion necesitana producir separadamente un coctel espedfico desprovisto de p- glucosidasa, lo que la hace industrialmente menos rentable.
Otra alternativa consistina en utilizar soforosa (dfmero de glucosa en p(1^2)) que es el inductor mas fuerte conocido, pero su coste sigue siendo todavfa prohibitivo para ser utilizado industrialmente.
Un objetivo de la invencion es por lo tanto proponer unos procedimientos de produccion de azucares, de celulasas, y de alcoholes y/o de disolventes que sean optimizados desde el punto de vista del coste de explotacion, en particular a partir de biomasa lignocelulosica.
El documento US2004/0121446 divulga un procedimiento de produccion de una solucion inductora para la produccion de celulasas por un hongo filamentoso. Se ejemplifica la produccion de una solucion inductora que contiene soforosa, gentiobiosa y glucosa a partir de una solucion esterilizada al 60% p/p de glucosa, por incubacion a 65°C durante 3 dfas en presencia de una preparacion de celulasa entera.
El documento Lo C.-M- et al., Bioresource Technology, vol. 101, n° 2, 1 de enero de 2010, paginas 717-723, divulga la produccion de celulasas por cultivo en continuo sobre un hidrolizado acido que comprende unos oligosacaridos. Este hidrolizado se obtiene por hidrolisis acida corta de serrm de madera (burbujeo durante 15 minutos con acido sulfurico).
Resumen de la invencion
Segun un primer aspecto de la invencion, se propone un procedimiento de produccion de oligosacaridos a partir de biomasa lignocelulosica que comprende al menos las etapas siguientes:
a) se pretrata en un reactor de pretratamiento la biomasa con el fin de proporcionar un efluente que contiene un sustrato pretratado;
b) se efectua, en un reactor, una hidrolisis enzimatica del sustrato pretratado contenido en el efluente procedente de la etapa a) en presencia de celulasas con el fin de producir un hidrolizado que contiene glucosa, celulasas y agua;
c) se extrae al menos una parte del hidrolizado procedente de la etapa b) que comprende una fraccion lfquida;
d) se reduce el contenido en agua de dicha parte del hidrolizado extrafdo en la etapa c) de manera que la fraccion lfquida del hidrolizado presente un contenido en agua inferior al 65% en peso de agua con respecto al peso total de la fraccion lfquida del hidrolizado;
e) se incuba a una temperatura comprendida entre 40 y 70°C el hidrolizado procedente de la etapa d) durante el tiempo necesario para producir un efluente enriquecido en oligosacaridos.
El procedimiento de produccion de oligosacaridos segun la invencion utiliza como materia prima biomasa lignocelulosica que es accesible de manera abundante y que es ademas poco costosa.
Los inventores han observado que es posible promover la formacion de oligosacaridos a partir de un hidrolizado que contiene glucosa y celulasas por incubacion cuando el contenido en agua de la fraccion lfquida del hidrolizado es inferior o igual al 65% en peso con respecto al peso total de la fraccion lfquida del hidrolizado.
Preferentemente, el hidrolizado procedente de la etapa de hidrolisis que se pone en incubacion posee una actividad p-glucosidasa de al menos 1 lU/ml, y preferentemente de al menos 5 lU/ml. Esta actividad p-glucosidasa se mide utilizando como sustrato pNPG (para-nitrofenol-p-glucopiranosa) a 5 mM, en un tampon citrato 50 mM a pH 4,75, con incubacion de 30 minutos a 50°C [Dashtban, Maki, Leung, Mao, y Qin (2010) Cellulase activities in biomass conversion: Measurement Methods and Comparison. Critical Reviews in Biotechnology 30 (4) paginas 302-309]. Se
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mide despues por absorbancia la concentracion en para-nitrofenol, producto de la hidrolisis de pNPG por la p- glucosidasa. La actividad p-glucosidasa se expresa en IU/ml, en el que IU significa pmol/min (por pmol de producto liberado por minuto de reaccion).
Segun un modo de realizacion, la etapa d) de reduccion del contenido en agua de la fraccion Kquida del hidrolizado se realiza por evaporacion a una temperatura inferior a 90°C.
Segun otro modo de realizacion, la etapa d) de reduccion del contenido en agua de la fraccion lfquida del hidrolizado se efectua anadiendo glucosa en el hidrolizado extrafdo en la etapa c).
De manera alternativa, en la etapa d) se separa el hidrolizado extrafdo en la etapa c) en al menos una primera porcion y una segunda porcion, se concentra la primera porcion de hidrolizado a una temperatura superior a 90°C con el fin de obtener una porcion de hidrolizado concentrado, y se mezcla el hidrolizado concentrado con la segunda porcion de hidrolizado no concentrado.
Segun un modo de realizacion, en la etapa d), se efectua una separacion membranaria del hidrolizado extrafda en la etapa c), por ejemplo por osmosis inversa o nanofiltracion, a fin de recuperar un hidrolizado cuyo contenido en agua esta reducido y una solucion acuosa.
Es tambien posible, en el ambito del procedimiento de produccion de oligosacaridos segun la invencion, efectuar una separacion solido/lfquido del efluente procedente de la etapa a) con el fin de recuperar una fraccion lfquida que contiene unos azucares y una fraccion solida que contiene el sustrato pretratado que se envfa a la etapa b). En cuanto a la fraccion lfquida, esta puede ser o bien tratada en mezcla con el hidrolizado en la etapa d), o bien ser mezclada con el efluente enriquecido en oligosacaridos procedente de la etapa e).
Preferentemente, al final de la etapa e) de incubacion, se obtiene un efluente que comprende unos oligosacaridos seleccionados entre la soforosa y la gentiobiosa sola o en mezcla.
El procedimiento de produccion de oligosacaridos segun la invencion puede el mismo estar integrado en una unidad existente de produccion de alcohol y/o de disolventes, denominada de segunda generacion, que utiliza como materia prima la biomasa lignocelulosica.
Asf, la invencion tiene tambien por objeto un procedimiento de produccion de celulasas a partir de biomasa lignocelulosica que comprende al menos las etapas siguientes:
a) se pretrata en un reactor de pretratamiento la biomasa con el fin de proporcionar un efluente que contiene un sustrato pretratado;
b) se efectua, en un reactor, una hidrolisis enzimatica del sustrato pretratado contenido en el efluente procedente de la etapa a) en presencia de celulasas con el fin de producir un hidrolizado que contiene glucosa, celulasas y agua;
c) se extrae al menos una parte del hidrolizado procedente de la etapa b) que comprende una fraccion lfquida;
d) se reduce el contenido en agua de dicha parte del hidrolizado extrafdo en la etapa c) de manera que la fraccion lfquida del hidrolizado presente un contenido en agua inferior al 65% en peso de agua con respecto al peso total de la fraccion lfquida del hidrolizado;
e) se incuba a una temperatura comprendida entre 40 y 70°C el hidrolizado procedente de la etapa d) durante el tiempo necesario para producir un efluente enriquecido en oligosacaridos;
f) se envfa al menos una parte del hidrolizado enriquecido en oligosacaridos dentro de un reactor que contiene un medio de cultivo y unos microorganismos capaces de producir las celulasas; y
g) se pone en cultivo la mezcla con el fin de producir un efluente enriquecido en celulasas.
Segun la invencion, el efluente procedente de la etapa e) que contiene los oligosacaridos se utiliza como solucion inductora en una unidad de produccion de celulasas.
La invencion se refiere ademas a un procedimiento de produccion de alcoholes, de disolventes o de acidos organicos solos o en mezcla, que comprende las etapas del procedimiento de produccion de celulasas tal como se ha descrito anteriormente y unas etapas suplementarias en las que se envfa una parte del hidrolizado procedente de la etapa b) dentro de un reactor de fermentacion que comprende unos microorganismos a fin de producir un mosto de fermentacion que comprende unos alcoholes, unos disolventes o unos acidos organicos solos o en mezcla y se recicla al menos una parte del efluente enriquecido en celulasas procedente de la etapa g) en el reactor de la etapa b).
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Alternativamente, el procedimiento de produccion de alcoholes, de disolventes o de acidos organicos solos o en mezcla segun la invencion puede utilizar una etapa en la que se envfa una parte del efluente procedente de la etapa
a) dentro de una unidad de hidrolisis y de fermentacion simultaneas a fin de producir unos alcoholes y/o unos disolventes, y se recicla al menos una parte del efluente enriquecido en celulasas procedente de la etapa g) dentro de la unidad de hidrolisis y de fermentacion simultaneas.
La fermentacion segun la invencion permite, por ejemplo, producir etanol como alcohol mayoritario o n-butanol solo o en mezcla con acetona o isopropanol.
El procedimiento de produccion de alcohol y/o de disolvente segun la invencion comprende una etapa de produccion in situ de celulasas a partir de oligosacaridos que son, ellos mismos, sintetizados de manera in situ a partir de azucares ya presentes en el procedimiento.
El procedimiento de produccion de alcohol, de disolventes o de acidos organicos solos o en mezcla segun la invencion presenta la ventaja de que su realizacion se libra de los costes de compra, de transporte y de almacenamiento de oligosacaridos (utilizados como inductores) necesarios para la produccion de las celulasas ya que gracias al procedimiento, los oligosacaridos son producidos in situ a partir de azucares que estan ya disponibles dentro del procedimiento.
Breve descripcion de la figura
Otras caractensticas y ventajas de la invencion se comprenderan mejor y apareceran mas claramente a partir de la lectura de la descripcion realizada a continuacion, refiriendose a los dibujos entre los cuales:
- la figura 1 es una representacion esquematica de un modo de realizacion del procedimiento de produccion de oligosacaridos segun la invencion,
- la figura 2 es una representacion esquematica de un modo de realizacion del procedimiento de produccion de celulasas segun la invencion,
- la figura 3 es una representacion esquematica de un primer modo de realizacion del procedimiento de produccion de alcoholes y/o de disolventes segun la invencion,
- la figura 4 es una representacion esquematica de un segundo modo de realizacion del procedimiento de produccion de alcoholes y/o de disolventes segun la invencion.
Generalmente, los elementos parecidos se indican por unas referencias identicas en las figuras.
Descripcion detallada de la invencion
En referencia a la figura 1, el procedimiento de produccion de oligosacaridos segun la invencion comprende una etapa de pretratamiento de la biomasa, previa a la etapa de hidrolisis enzimatica, que se realiza en un reactor 1 de pretratamiento. El objetivo del pretratamiento es hacer accesible la celulosa y eventualmente las hemicelulosas a las enzimas. El pretratamiento tiene como objetivo en particular modificar las propiedades ffsicas y fisicoqmmicas del material lignocelulosico, para mejorar la accesibilidad de la celulosa aprisionada dentro de la matriz de lignina y de hemicelulosa.
Numerosas tecnologfas para realizar este pretratamiento existen. Se puede citar por ejemplo la coccion acida, la coccion alcalina, la explosion con vapor, los procedimientos Organosolv, etc. La eficacia del pretratamiento se mide al mismo tiempo por el balance de materiales al final del pretratamiento (porcentaje de recuperacion de los azucares en forma de monomeros o de oligomeros solubles o polfmeros insolubles) y tambien por la susceptibilidad a la hidrolisis enzimatica de los restos celulosicos y hemicelulosicos.
Preferentemente, se utiliza un pretratamiento por explosion con vapor, tambien conocido bajo el nombre de “steam explosion”, “steam gunning”, “expansion explosiva”, “pretratamiento con vapor”, que se distingue por sus rendimientos en terminos de degradabilidad de la celulosa y su bajo porcentaje de dilucion. En este procedimiento, la biomasa se lleva rapidamente a alta temperatura (l50°C-250°C) por inyeccion de vapor bajo presion. La interrupcion del tratamiento se efectua generalmente por descompresion brutal, denominada expansion o explosion, que desestructura la matriz lignocelulosica. Los tiempos de estancia vanan de 10 segundos a algunos minutos, para presiones que va de 10 a 50 bares. Esta tecnica puede ser realizada o bien en discontinuo o bien en continuo. Algunas tecnologfas proponen una inyeccion de agua para enfriar el medio antes de la descompresion.
La explosion por vapor puede preceder a una impregnacion de acido para favorecer la hidrolisis de las hemicelulosas durante la coccion. Cuando la explosion con vapor se aplica en un sustrato previamente acidificado, por ejemplo con H2SO4, conduce a una solubilizacion y a una hidrolisis casi total de las hemicelulosas en sus monomeros, limitando la degradacion de furfural. Ademas, se mejora la susceptibilidad de la celulosa a la hidrolisis
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enzimatica. La utilizacion de un catalizador acido permite disminuir la temperatura de procedimiento (150 a 200°C frente a 250°C para la explosion con vapor sin catalizador), y asf minimizar la formacion de compuestos de degradacion. La explosion con vapor puede tambien ser precedida de una etapa de coccion acida que tiene como objetivo hidrolizar las hemicelulosas y retirarlas en una solucion Kquida en forma de azucares monomeros y/o de oligomeros.
El efluente que comprende la biomasa pretratada se retira mediante una lmea 2 y esta tratado en el reactor de hidrolisis enzimatico 3 con el fin de obtener unos azucares fermentables por accion de las celulosas sobre la celulosa hecha accesible por la etapa de pretratamiento. Como se muestra en la figura 1, las celulasas son introducidas en la unidad por medio de la lmea 5. Preferentemente, las celulasas utiles para la conversion de la celulosa en azucares monomeros (por ejemplo la glucosa) pertenece a un sistema multi-enzimatico que comprende generalmente:
* endoglucanasas (EG) que cortan la celulosa aleatoriamente al nivel de las zonas amorfas de la celulosa;
* exoglucanasas que actuan de manera progresiva sobre los extremos libres de las cadenas de celulosa;
* p-glucosidasas que hidrolizan en particular las celodextrinas y la celobiosa en glucosa.
Las condiciones de la hidrolisis enzimatica, principalmente el porcentaje de materia seca de la mezcla a hidroliza (determinado segun el metodo ASTM E1756-01) y la cantidad de enzimas utilizada, se seleccionan de tal manera que se obtiene una solubilizacion de la celulosa comprendida entre el 20% y el 99% y de manera preferida entre el 30% y el 95% en peso con respecto al peso total de celulosa, con el fin de proporcionar un hidrolizado que contiene unos azucares monomeros que comprenden en particular glucosa. El agua necesaria para la obtencion del porcentaje de materia seca considerado se anade por un conducto (no representado) en el reactor 3. El porcentaje de materia seca deseada esta generalmente comprendido entre el 5% en peso y el 45% en peso, y preferiblemente entre el 8% en peso y el 40% en peso. La hidrolisis enzimatica se realiza preferiblemente a pH comprendido entre 4 y 5,5 y a una temperatura comprendida entre 40°C y 60°C. Los aditivos necesarios, por ejemplos los nutrimientos, de los reactivos qmmicos como, por ejemplo, la sosa y/o el amoniaco y/o la potasa, son introducidos por un conducto (no representado) dedicado a este proposito.
El hidrolizado procedente del reactor de hidrolisis enzimatica comprende una fraccion lfquida que contiene agua, una mezcla de azucares monomeros de los cuales glucosa, un coctel enzimatico y una fraccion solida que comprende unas materias solidas no hidrolizadas (entre ellas la lignina). Preferentemente, el hidrolizado utilizado a continuacion en el procedimiento presenta una actividad p-glucosidasa de al menos 1 lU/ml, y preferentemente de al menos 5 lU/ml. Generalmente, el contenido en agua de la fraccion lfquida del hidrolizado procedente de la etapa de hidrolisis esta comprendido entre el 85 y el 95% con respecto al peso total de la fraccion lfquida del hidrolizado.
Como se indica en la figura 1, el hidrolizado se evacua de dicho reactor 3 por el conducto 7 y una porcion (o fraccion) del hidrolizado se envfa, a traves de la lmea 8, a una unidad de tratamiento que permite reducir el contenido en agua de la fraccion lfquida del hidrolizado con el fin de llevar este contenido a un valor inferior o igual al 65% en peso con respecto al peso total de la fraccion lfquida, preferentemente inferior al 60% en peso, y de manera aun mas preferida inferior al 50%.
El contenido en agua de la fraccion lfquida del hidrolizado se determina filtrando una muestra de hidrolizado en un medio filtrante de porosidad 1,2 |im a fin de recuperar una fraccion lfquida. Dicha fraccion lfquida se somete despues al ensayo segun la norma ASTM E1756-01 que consiste en medir la perdida de masa de la fraccion lfquida por secado a 105°C hasta obtener una masa constante del residuo. La masa perdida durante el secado corresponde asf a la masa de agua presente inicialmente en la muestra y la masa restante corresponde a las materias solidas y solubles contenidas en la fraccion lfquida.
La etapa de reduccion del contenido en agua se puede efectuar mediante todas las tecnicas de concentracion conocidas por el experto en la tecnica, como por ejemplo por separacion membranaria (por ejemplo osmosis inversa, nanofiltracion), por evaporacion de una parte del agua, por extraccion lfquido-lfquido. Segun una variante no representada, la reduccion del contenido en agua se obtiene por mezcla del hidrolizado con una solucion de azucares mas concentrada, como por ejemplo un jarabe de glucosa.
De manera preferida, el tratamiento de concentracion implica al menos una etapa de evaporacion del agua. Se detallaran ahora, en referencia a la figura 1, tres modos de realizacion.
Segun un primer modo de realizacion preferido, esta etapa de reduccion del contenido en agua del hidrolizado se realiza en un evaporador a fin de extraer el agua y asf concentrar el hidrolizado en azucares. Al menos una parte del hidrolizado extrafdo del reactor de hidrolisis 3 se envfa a traves de la lmea 8, 8a a un evaporador 9 a fin de evaporar el agua. Esta evaporacion se lleva a cabo calentando el hidrolizado a una temperatura inferior a 90°C y preferentemente comprendida entre 40 y 70°C bajo presion atmosferica o a vacm. La temperatura de realizacion se selecciona con el fin de no desnaturalizar las celulasas presentes en el hidrolizado y que son utiles para la operacion
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siguiente de incubacion como se explica a continuacion. El efluente empobrecido en agua procedente del evaporador 9 se transfiere despues por la lmea 10 a un reactor de incubacion 11.
Segun un segundo modo de realizacion, como se indica en la figura 1, el hidrolizado extrafdo por la lmea 8 se divide en dos flujos respectivamente por las lmeas 12 y 13. El flujo de hidrolizado retirado por la lmea 12 se envfa hacia un evaporador 14 que opera a una temperature superior a 90°C, a fin de extraer el agua y asf concentrar el hidrolizado en azucares y en particular en glucosa. Al final de la etapa de evaporacion, el hidrolizado se envfa a la incubadora 11 gracias a la lmea 15. En cuanto al flujo de hidrolizado retirado por la lmea 13, este se envfa directamente a la incubadora 11 con el fin de aportar las celulasas necesarias para la conversion de la glucosa en oligosacaridos.
Segun un tercer modo de realizacion, que combina los dos primeros modos de realizacion descritos antes, el hidrolizado extrafdo por la lmea 8 se divide en tres flujos que son enviados respectivamente por las lmeas 8a, 12 y 13 al evaporador 9, al evaporador 14 y a la incubadora 11.
Conforme a la invencion, el procedimiento de produccion de oligosacaridos comprende una etapa de incubacion del hidrolizado cuya fraccion lfquida comprende un contenido en agua inferior o igual al 65% en peso. El objetivo de esta etapa es realizar la conversion de al menos una parte de la glucosa en oligosacaridos que tienen unas propiedades inductoras de expresion de genes que codifican unas celulasas en los hongos. En particular, la etapa de incubacion permite producir soforosa, dfmero de moleculas de glucosas unidas por una union p-1-2 y/o gentiobiosa, dfmero de moleculas de glucosas unidas por una union p-1-6. Preferentemente, la solucion de oligosacaridos contiene una mezcla de soforosa y de gentiobiosa a una concentracion total (soforosa + gentiobiosa) generalmente inferior a 30 g/l. Estos dos oligosacaridos (o disacaridos) son potentes inductores para la secrecion de celulasas en hongos filamentosos y en particular en Trichoderma reesei.
Esta etapa de incubacion consiste en calentar el hidrolizado a una temperatura comprendida entre 40 y 70°C, preferentemente entre 50 y 65°C durante un tiempo comprendido entre 0,1 y 100 horas, preferentemente durante al menos 24 horas, y de manera muy preferida entre 24 y 72 horas.
Al final de la etapa de incubacion, una solucion acuosa que comprende unos oligosacaridos se retira de la incubadora 11 por el conducto 16.
Segun un modo de realizacion alternativo del procedimiento de smtesis de oligosacaridos (no representado en la figura 1), el hidrolizado retirado por el conducto 8 se trata en una unidad de separacion solido/solido del cual se evacua una fraccion solida y una fraccion lfquida de hidrolizado que contiene glucosa y celulasas. La fraccion lfquida de hidrolizado se trata despues segun uno de los tres modos de realizacion descritos anteriormente, con el fin de reducir su contenido en agua antes de la etapa de incubacion. Esta separacion solido/lfquido puede utilizar una de las tecnicas siguientes: la centrifugacion, el drenaje, el prensado, la filtracion, la decantacion.
En referencia a la figura 1, el procedimiento segun la invencion puede comprender una etapa opcional de separacion solido/lfquido, mediante la unidad 17, efectuada en el efluente procedente del reactor de pretratamiento. Esta etapa permite asf extraer:
* una fraccion lfquida que contiene unos azucares procedentes de la hemicelulosa (por ejemplo xilosa, arabinosa, galactosa y manosa) por la lmea 18; y
* una fraccion que contiene unos solidos (la biomasa pretratada) que se envfa al reactor de hidrolisis 3 por la lmea 2a.
Conforme a la figura 1, todo o parte de la fraccion lfquida 18 esta o bien directamente mezclada con el efluente procedente de la incubadora 11 a traves de la lmea 20, o bien se envfa por la lmea 19 al evaporador 14 sola o en mezcla con el hidrolizado procedente de la etapa de hidrolisis a fin de evaporar el agua, o bien (por una lmea no representada) al evaporador 9 sola o en mezcla con el hidrolizado.
Segun la invencion, para reducir el contenido en agua en el hidrolizado, se puede utilizar otro metodo, alternativo o complementario a los descritos anteriormente, que consiste en anadir azucar en el hidrolizado.
En referencia a la figura 2, el procedimiento de produccion de celulasas segun la invencion utiliza ademas unas etapas ya descritas anteriormente, una etapa de produccion de celulasas mediante un fermentador 4 y que utiliza los oligosacaridos que son sintetizados in situ. La produccion de enzimas se utiliza en el fermentador 4 mediante un microorganismo que se aporta a traves de la lmea 6. Los microorganismos se seleccionan preferentemente entre las bacterias celulolfticas que pertenecen al genero Ruminococus, Clostridium, Cellulomonas, Thermonospora, Streptomyces o entre los hongos celuloltticos del genero Aspergillus, Penicillium, Trichoderma. Entre estos, Trichoderma reesei es la especie preferida ya que es capaz de segregar unas concentraciones importantes de celulasas muy activas.
Como se representa en la figura 2, todo o parte del efluente que se extrae por la incubadora 11 a traves la lmea 16
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Estas cepas se cultivan en fermentadores agitados y aireados en condiciones compatibles con su crecimiento y la produccion de enzimas. Se puede utilizar todo tipo de procedimiento de produccion adaptado al microorganismo conocido por el experto en la materia. En particular, se realiza un procedimiento de tipo “alimentacion sin trasiego” (o “fed-batch” segun la terminologfa anglosajona) como se describe en el documento FR 2 555 603.
Para este fin, se prepara un precultivo que contiene el microorganismo y un medio de cultivo que contiene sales minerales y complementos vitammicos habituales y una fuente de carbono y de energfa, preferentemente en forma de azucares solubles (por ejemplo la lactosa, la glucosa, la xilosa, la arabinosa). El precultivo se transfiere despues a un fermentador de produccion de enzimas que comprende un medio de cultivo que contiene al menos un azucar y suplementado de manera regular con la solucion inductora de oligosacaridos. Se procede despues a la produccion de las enzimas en el fermentador manteniendo el contacto necesario entre el microorganismo, el medio de cultivo y aportando regularmente (por ejemplo en continuo) la solucion inductora de oligosacaridos.
La solucion acuosa que contiene los oligosacaridos inductores se inyecta, despues del agotamiento de la fuente de carbono inicial, de manera regular o en continuo con el fin de aportar una cantidad optimizada, comprendida entre 35 y 135 mg de azucares totales (que contienen los oligosacaridos inductores) por gramo de celulas y por hora, y preferentemente entre 35 y 45 mg.
Como se indica en la figura 2, todo o parte del mosto de fermentacion que contiene las celulasas de interes se retira del fermentador 4 por la lmea 5 para alimentar el reactor de hidrolisis 3.
La figura 3 es una representacion de un modo de realizacion del procedimiento de produccion de alcoholes, de disolventes o de acidos organicos que integra una unidad de produccion de celulasas mediante oligosacaridos producidos a partir de un flujo interno al procedimiento.
En referencia a la figura 3, la fraccion (o porcion) del hidrolizado que no se utiliza para la smtesis in situ de oligosacaridos se envfa a traves de la lmea 21 a una unidad de fermentacion 22 de los azucares presentes en el hidrolizado.
En la unidad de fermentacion 22, el hidrolizado se pone en contacto con uno o varios micro-organismos de fermentacion, introducidos por la lmea 23. Los azucares fermentables se transforman asf en alcoholes, disolventes o acidos organicos solos o en mezcla por los microrganismos. La etapa de fermentacion en la unidad 22 se puede realizar a una temperatura entre 30°C y 40°C, a un pH comprendido entre 3 y 6,5. Al final de la etapa de fermentacion, se obtiene un mosto de fermentacion, evacuado por el conducto 24 de la unidad 22, que comprende unas materias en suspension y una fase lfquida en la que se encuentra el o los productos buscados (alcoholes y/o disolventes).
El mosto procedente de la unidad de fermentacion 22 se introduce mediante el conducto 24 en una unidad de separacion (no representada) que permite separar el mosto en diferentes productos: los alcoholes y/o los disolventes, una vinaza lfquida que contiene unos azucares no fermentados y un residuo solido que comprende principalmente la lignina, asf como celulosa, hemicelulosa que no se han hidrolizado.
Por ejemplo, la fermentacion puede ser del tipo:
a) “etanolica” que corresponde a la produccion de etanol como alcohol mayoritario mediante levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae) o de bacterias (por ejemplo, Z. mobilis) u otros micro-organismos.
b) “butilica”, que a su vez agrupa aqrn:
* una fermentacion que produce n-butanol solo;
* una fermentacion “ABE” que corresponde a la produccion de una mezcla que comprende acetona, n-butanol (producto mayoritario), etanol. Tambien pueden estar presentes unas trazas de isopropanol.
* una fermentacion “IBE” que corresponde a la produccion de isopropanol, de n-butanol (producto mayoritario) y de etanol.
Estas fermentaciones se realizan generalmente mediante microorganismos del genero Clostridium y se llevan a cabo es estricta anaerobiosis.
* una fermentacion “isobutflica” que corresponde, en general, a la produccion de isobutanol solo. Numerosos microorganismos, todos geneticamente modificados, tienen la posibilidad de realizar esta conversion (por ejemplo E. coli, Corynebacterium, S. cerevisiae) a partir de la via de los aminoacidos.
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c) “propflica”, que corresponde a la produccion de propanol o de isopropanol.
Segun un modo de realizacion del procedimiento de produccion de alcohol y/o de disolvente que integra una unidad de produccion de celulasas mediante oligosacaridos producidos a partir de un flujo interno al procedimiento, la fermentacion de los azucares en alcoholes y/o disolventes se realiza de manera concomitante a la etapa de hidrolisis enzimatica (modo de realizacion ”SSF” por Simultaneous Saccharification and Fermentation). En referencia a la figura 4, el efluente procedente de la unidad de pretratamiento 1 se divide en dos flujos a traves de las lmeas 2 y 25. El flujo 2 que contiene la biomasa pretratada se envfa a la unidad de produccion in situ de celulasa tal como se describe en la figura 2. En cuanto al flujo 25, este se transfiere hacia la unidad de fermentacion SSF 26 que realiza simultaneamente:
* la hidrolisis de la celulosa gracias a las celulasas aportadas por la lmea 27 que proviene de la unidad de produccion in situ de celulasas 4, y
* la fermentacion de los azucares fermentables liberados durante la hidrolisis enzimatica gracias a los microorganismos que son introducidos por la lmea 23.
Cuando la hidrolisis enzimatica y la fermentacion alcoholica se realizan en una misma y unica operacion (procedimiento SSF), la temperatura esta generalmente comprendida entre 30 y 45°C, y el pH comprendido entre 4 y 6.
Cabe senalar que es muy posible combinar los modos de realizacion descritos en relacion con el procedimiento de produccion de oligosacaridos y de celulasas en el ambito del procedimiento de produccion de alcoholes y/o de disolventes segun la presente invencion.
Ejemplos
En lo que sigue, se designa bajo la abreviatura “MS” las materias secas (solidas y solubles) presentes en un medio. El porcentaje de materias secas (o “Total Solids”) se determina segun el metodo ASTM E1756-01 que consiste en una perdida de masa a 105°C hasta la obtencion de una masa constante de residuo.
Ejemplo 1 (no conforme):
Se realiza una hidrolisis enzimatica de paja pretratada por coccion acida en un medio que comprende un 15% en peso de MS (15 g de masa seca de paja para 100 g de masa total) mediante un coctel de celulasas producido por Trichoderma reesei. La cantidad de celulasas utilizada para la hidrolisis se ha fijado en 10 mg de celulasas por gramo de materia seca (MS). La mezcla se pone en hidrolisis a una temperatura de 50°C y bajo agitacion durante 72 horas. Al final de la hidrolisis, se recupera un hidrolizado bruto que tiene una concentracion en glucosa de 75 g/l, una actividad p-glucosidasa de 10 lU/ml. Ademas, la fraccion lfquida tiene un contenido en agua del 92% en peso con respecto al peso de la fraccion lfquida.
El hidrolizado bruto se pone despues a incubar durante 24 horas a 50°C bajo agitacion. Al final de la fase de incubacion, el hidrolizado se pone a hervir durante 5 minutos a fin de desnaturalizar las enzimas, despues se analiza por HPLC. El analisis indica que el hidrolizado no contiene oligosacaridos.
El ejemplo 1 no conforme a la invencion muestra que la incubacion de un hidrolizado que tiene un contenido en agua superior al 65% en peso no permite transformar al menos una parte de la glucosa en oligosacaridos, y en particular en soforosa y/o gentiobiosa.
Ejemplo 2 (segun la invencion):
El hidrolizado bruto obtenido en el ejemplo 1 se complementa con jarabe de glucosa al 60% en peso a fin de obtener una fraccion lfquida que tiene una concentracion en glucosa de 500 g/l y un contenido en agua del 57,5% en peso de agua con respecto al peso total de la fraccion lfquida de hidrolizado. La mezcla se pone a incubar durante 24 horas a 50°C bajo agitacion. Al final de la fase de incubacion, la mezcla se pone a hervir durante 5 minutos a fin de desnaturalizar las enzimas, despues se analiza por HPLC. El hidrolizado obtenido contiene 22 g/l de una mezcla de soforosa y de gentiobiosa y 477 g/l de glucosa (es decir, un 4,4% de conversion de la glucosa en oligosacaridos).
Ejemplo 3 (segun la invencion):
El hidrolizado bruto obtenido en el ejemplo 1 se filtra mediante un filtro de porosidad 100 |im, a fin de separar:
* una fraccion lfquida que contiene un 12% en peso de materia seca (MS);
* una fraccion solida que contiene un 35% en peso de materia seca (MS).
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La fraccion Ifquida contiene 75 g/l de glucosa y tiene una actividad p-glucosidasa de 6 lU/ml y un contenido en agua de aproximadamente un 90% en peso.
La fraccion lfquida se complementa despues con jarabe de glucosa al 60% en peso a fin de obtener una fraccion lfquida que tiene una concentracion en glucosa de 500 g/l y un contenido en agua del 57,5% en peso. La mezcla se pone a incubar durante 24 horas a 50°C bajo agitacion. Al final de la fase de incubacion, la mezcla se pone a hervir durante 5 minutos a fin de desnaturalizar las enzimas y despues se analiza por HPLC. El analisis indica que el hidrolizado contiene aproximadamente 11 g/l de una mezcla de soforosa y de gentiobiosa y 488 g/l de glucosa (es decir un 2,2% de conversion de la glucosa en oligosacaridos).
Ejemplo 4 (segun la invencion):
Se prepara una solucion acuosa que contiene 300 g/l de glucosa, 300 g/l de xilosa y 10 lU/ml de actividad p- glucosidasa y cuyo contenido en agua es de aproximadamente un 50% en peso. Esta solucion se pone a incubar durante 24 horas a 50°C bajo agitacion. Despues de la incubacion, la mezcla se pone a hervir durante 5 minutos a fin de desnaturalizar las enzimas y despues se analiza por HPLC. El hidrolizado contiene asf 21 g/l de mezcla soforosa y gentiobiosa (es decir un 7% de conversion de glucosa en oligosacaridos), 278 g/l de glucosa y 300 g/l de xilosa.
Los ejemplos 2 a 4 segun la invencion muestran que es posible producir unos oligosacaridos por incubacion de un hidrolizado de biomasa lignocelulosico cuando su fraccion lfquida tiene un contenido en agua inferior al 65% en peso con respecto al peso total de la fraccion lfquida.
El ejemplo 4 indica ademas que es posible sustituir al menos una parte de la glucosa por unas pentosas en la solucion de incubacion para producir unos oligosacaridos inductores.
Ejemplo 5 (segun la invencion):
Cuatro biorreactores Dasgip de volumen util de 750 ml que contienen un medio salino (5 g/l KH2PO4, 2,8 g/l (NH4)2SO4, 0,6 g/l MgSO4,7H2O, 0,6 g/l CaCh,2H2O, 60 mg/l FeSO4,7H2O, 13 mg/l MnSO4, 4H2O, 17 g/l ZnSO4, 7H2O 1 g/l cornsteep) y 15 g/l de glucosa son esterilizados, despues inoculados con un precultivo de Trichoderma reesei en frasco. A lo largo del cultivo, el pH se mantiene a 4,8 por adicion de base amoniaco NH4OH o de acido sulfurico H2SO4. Despues del agotamiento de la glucosa (despues de aproximadamente 30 horas), se realiza una smtesis de celulasas segregadas por Trichoderma reesei en modo semi-continuo (o “fed-batch”) mediante soluciones acuosas que contienen cada una un contenido total en azucares de 250 g/l pero de composicion diferentes en azucar:
* la solucion 1 contiene solo glucosa sola a 250 g/l;
* la solucion 2 es la fraccion lfquida del ejemplo 2 diluida con agua de tal manera que contiene 11 g/l de una mezcla soforosa y gentiobiosa y 239 g/l de glucosa;
* la solucion 3 es la fraccion lfquida del ejemplo 3 diluida con una solucion acuosa de glucosa a 100 g/l, de manera que contiene 6 g/l de una mezcla soforosa y gentiobiosa y 244 g/l de glucosa;
* la solucion 4 contiene solo lactosa sola a 250 g/l.
La concentracion en protemas (celulasas) en el medio de cultivo se mide mediante el metodo de Lowry [Lowry, Rosenbrough, Farr, Randall (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biochemical Chemistry 193 (1) paginas 265-275].
Con la solucion 1, no se observa ninguna induccion de la produccion de protemas. La concentracion en protemas sigue estable a aproximadamente 1 a 2 g/l despues de 250 horas de cultivo.
Cuando se utilizan las soluciones 2, 3 y 4 (segun la invencion) para el cultivo, se observa una produccion de protemas. Despues de 250 horas de cultivo, el medio de cultivo contiene respectivamente 35 g/l, 36 g/l y 34 g/l de protemas. El procedimiento segun la invencion permite por lo tanto producir unas celulasas por microorganismos a partir de una solucion inductora, que contiene una mezcla de soforosa y de gentiobiosa, obtenida a partir de un hidrolizado de material lignocelulosico.

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    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento de produccion de oligosacaridos a partir de biomasa lignocelulosica que comprende al menos las etapas siguientes:
    a) se pretrata en un reactor de pretratamiento la biomasa con el fin de proporcionar un efluente que contiene un sustrato pretratado;
    b) se lleva a cabo, en un reactor, una hidrolisis enzimatica del sustrato pretratado contenido en el efluente procedente de la etapa a) en presencia de celulasas con el fin de producir un hidrolizado que contiene glucosa, celulasas y agua;
    c) se extrae al menos una parte del hidrolizado procedente de la etapa b) que comprende una fraccion lfquida;
    d) se reduce el contenido en agua de dicha parte del hidrolizado extrafdo en la etapa c) de manera que la fraccion lfquida del hidrolizado presente un contenido en agua inferior al 65% en peso de agua con respecto al peso total de la fraccion lfquida del hidrolizado;
    e) se incuba a una temperatura comprendida entre 40 y 70°C el hidrolizado procedente de la etapa d) durante el tiempo necesario para producir un efluente enriquecido en oligosacaridos.
  2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que, en la etapa d) se concentra por evaporacion a una temperatura inferior a 90°C el hidrolizado extrafdo en la etapa c).
  3. 3. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que en la etapa d) se anade glucosa en el hidrolizado extrafdo en la etapa c).
  4. 4. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que en la etapa d) se efectua una separacion membranaria del hidrolizado extrafdo en la etapa c) a fin de separar al menos una parte del agua de la fraccion lfquida.
  5. 5. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que en la etapa d) se separa el hidrolizado extrafdo en la etapa c) en al menos una primera porcion y una segunda porcion, se concentra la primera porcion de hidrolizado a una temperatura superior a 90°C y se mezcla la porcion de hidrolizado concentrado con la segunda porcion de hidrolizado.
  6. 6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores, en el que se efectua una separacion solido/lfquido del efluente procedente de la etapa a) con el fin de recuperar una fraccion lfquida que contiene unos azucares y una fraccion solida que contiene el sustrato pretratado, siendo dicha fraccion solida enviada en la etapa b).
  7. 7. Procedimiento segun la reivindicacion 6, en el que en la etapa d) se trata el hidrolizado en mezcla con la fraccion lfquida.
  8. 8. Procedimiento segun la reivindicacion 6, en el que se mezcla la fraccion lfquida con el efluente enriquecido en oligosacaridos procedente de la etapa e).
  9. 9. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores, en el que el efluente procedente de la etapa e) comprende soforosa y/o gentiobiosa.
  10. 10. Procedimiento de produccion de celulasas a partir de biomasa lignocelulosica que comprende un procedimiento de produccion de oligosacaridos segun una de las reivindicaciones 1 a 9 y ademas las etapas:
    f) se envfa al menos una parte del hidrolizado enriquecido en oligosacaridos a un reactor que contiene un medio de cultivo y unos microorganismos capaces de producir las celulasas; y
    g) se pone en cultivo la mezcla obtenida en la etapa f) con el fin de producir un efluente enriquecido en celulasas.
  11. 11. Procedimiento de produccion de celulasas segun la reivindicacion 10, en el que el microorganismo utilizado en la etapa f) es del genero Trichoderma reseei.
  12. 12. Procedimiento de produccion de celulasas segun una de las reivindicaciones 10 u 11, en el que la etapa g) se realiza en modo semi-continuo.
  13. 13. Procedimiento de produccion de celulasas segun una de las reivindicaciones 10 a 12, en el que se efectua una separacion solido/lfquido del efluente procedente de la etapa g) con el fin de recuperar una fraccion lfquida que contiene las celulasas y se recicla dicha fraccion lfquida en el reactor de la etapa b).
  14. 14. Procedimiento de produccion de alcoholes, de disolventes o de acidos organicos solos o en mezcla que comprende las tapas del procedimiento de produccion de celulasas segun una de las reivindicaciones 10 a 13, y en el que se envfa una parte del hidrolizado procedente de la etapa b) a un reactor de fermentacion que comprende unos microorganismos a fin de producir un mosto de fermentacion que comprende unos alcoholes y/o unos
    5 disolventes.
  15. 15. Procedimiento de produccion de alcoholes, de disolventes o de acidos organicos solos o en mezcla que comprende las etapas del procedimiento de produccion de celulasas segun una de las reivindicaciones 10 a 13, y en el que se envfa una parte del efluente procedente de la etapa a) a una unidad de hidrolisis y de fermentacion
    10 simultaneas.
  16. 16. Procedimiento segun la reivindicacion 14 o 15, en el que se efectua una fermentacion etanolica a fin de producir etanol como alcohol mayoritario.
    15 17. Procedimiento segun la reivindicacion 14 o 15 en el que se efectua una fermentacion butflica a fin de producir n-
    butanol solo o en mezcla con acetona o iso-propanol.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003298577A1 (en) * 2002-09-10 2004-05-04 Genencor International, Inc. Induction of gene expression using a high concentration sugar mixture
US7781191B2 (en) * 2005-04-12 2010-08-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Treatment of biomass to obtain a target chemical
CN101160409B (zh) * 2005-04-12 2013-04-24 纳幕尔杜邦公司 获得可发酵糖的生物质处理方法
JP2010536390A (ja) * 2007-08-30 2010-12-02 アイオジェン エナジー コーポレイション セルラーゼを生成するための方法
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