KR101449552B1

KR101449552B1 - 목질계 바이오매스로부터 발효당을 제조하는 방법

Info

Publication number: KR101449552B1
Application number: KR1020120156000A
Authority: KR
Inventors: 유주현; 정찬덕; 이승환; 김인철; 홍경식; 엄인용; 제갈종건; 송봉근
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2014-10-13
Also published as: KR20140086017A; US20150353977A1; WO2014104755A1; US10597688B2

Abstract

본 발명은 목질계 바이오매스로부터 여러 가지 산업용 발효 균주의 배양에 유용하게 사용될 수 있는 고농도의 발효당을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 방법은 전처리 전에 바이오매스를 온수로 추출하여 무기염류 등 추출성 물질을 제거함으로써 효소당화 원료의 불순물 함량을 최소화할 수 있고, 온수 추출성 물질을 제거한 바이오매스를 자일란 수율이 최대가 되는 조건에서 전처리함으로써 당 과분해산물의 생성을 최대한 억제하고, 이후 고액분리로 얻은 전처리 고형분을 물로 세척하지 않고 효소당화한 후 얻어진 당용액의 분리막을 이용한 농축만으로도 여러 가지 산업용 발효균주의 배양용 발효당을 저렴한 비용으로 제조할 수 있다.

Description

목질계 바이오매스로부터 발효당을 제조하는 방법{METHOD FOR PREPARING FERMENTABLE SUGAR SOLUTION FROM LIGNOCELLULOSIC BIOMASS}

본 발명은 목질계 바이오매스로부터 여러 가지 산업용 발효 균주의 배양에 유용하게 사용될 수 있는 고농도의 발효당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

근래 전세계적으로 화석연료의 고갈과 온실가스에 의한 지구 온난화에 대처하기 위해, 재생 가능한 바이오매스로부터 수송용 연료와 산업용 화학물질을 생산하고자 많은 연구와 개발이 이루어져 왔다.

태양이 있는 한 인류가 무한히 재생산할 수 있다고 여겨지는 바이오매스에는 지상 식물체를 주로 포함하는 목질계 바이오매스(lignocellulosic biomass)와 물에서 자라는 녹조류를 주로 포함하는 조류 바이오매스(algal biomass) 등이 있다. 이러한 바이오매스를 구성하고 있는 구조적 성분(structural component) 중 하나인 셀룰로오스는 바이오매스의 20% 내지 50%를 차지할 만큼 지구상에서 가장 풍부한 물질이며, 발효균주의 주요한 영양원인 포도당의 고분자 축합물이다. 이러한 셀룰로오스로부터 포도당을 다량으로 그리고 고순도로 생산하는 기술을 개발하고자 많은 연구와 개발이 집중되고 있다.

하지만 목질계 바이오매스는 셀룰로오스 이외에 가수분해에 약하여 과분해되기 쉬운 헤미셀룰로오스(약 15 내지 35%)와, 구조가 복잡하여 특정한 작용기를 가지는 단분자(monomer)로 환원되기 어려운 리그닌(약 10 내지 30%)을 포함하고 있다. 이 외에도, 목질계 바이오매스에는 수용성 전분, 유리당, 단백질, 지질, 펙틴, 탄닌, 다양한 알칼로이드, 유기산 및 각종 무기염 등 물로 추출될 수 있는 성분들이 함유되어 있는데, 초본계 바이오매스에 그 양이 많아서 20 내지 30%, 목본계 바이오매스에서 5 내지 20% 정도로 조금 적은 것이 일반적이다(Michael E. Himmel (2009) Biomass recalcitrance, Blackwell Publishing; Run-Cang Sun (2010) Cereal Straw as a Resource for Sustainable Biomaterials and Biofuels, Elsevier).

목질계 바이오매스가 함유하는 이러한 추출성 성분 중 전분 혹은 유리당은 발효당의 제조에 사용될 수 있지만, 이것들을 제외한 나머지 성분들은 발효당에서 불순물로 작용할 뿐만 아니라 발효당의 제조 과정에서 당수율을 저하시키는 요인이 될 수 있으므로 회수 혹은 제거하여야만 한다.

대한민국 공개공보 제2011-0040367호는 바이오매스의 연속적인 분획의 한 과정으로 고온수를 반응조에 주입하고 일정 시간 교반한 후 증기압을 이용하여 액상물이 배출되게 하는 장치를 개시하고 있다. 상기 발명은 이러한 장치로 온수 추출성 물질을 분획하고자 하지만, 고압에서 밸브를 통한 액상물의 배출이 원활하지 않고, 배출시 내용물 내부의 터널링 현상으로 인하여 수 회 추출과 회수를 반복하여도 총 회수율이 50% 이하로 극히 낮아서 상기 추출성 물질의 실용적 제거에는 사용되기 어려운 기술상의 문제를 가지고 있다.

목질계 바이오매스를 원료로 하여 바이오에탄올을 제조하는 인비콘(Inbicon)사는 바이오매스를 열수전처리한 후 고액분리를 통하여 미생물 저해물질을 다량 함유하는 액상물을 제거한 다음 전처리 고형분을 물로 세척하는 방식을 이용하여 바이오매스 내의 추출성 성분까지 제거하고 있는 것으로 알려져 있다(Jan Larsen 등, 2012, Biomass and Bioenergy, 46, 36-45). 이 방법은 양질의 발효당을 제조할 수 있는 깨끗한 전처리 고형분을 얻을 수 있다는 장점이 있지만, 고액분리와 반복 세척에 따른 제조비용 증가를 피할 수 없다. 또한, 효소당화 혹은 알콜발효에서 젖산균에 의한 오염을 방지하기 위해 미생물 생육 저해물질이 함유되어 있는 전처리 액상물을 다시 일정량 첨가해야하는 공정이 추가되고, 이로 인하여 고온 고압 반응에 의해 한층 조성이 복잡해져 알 수 없게 된 바이오매스의 추출성 성분도 다시 추가될 수 밖에 없다. 여기에 더하여, 바이오매스의 전처리 후 부산물로 얻어지는 액상물은 자일로오스와 자일란을 비롯하여, 퍼퓨랄과 HMF 등 탄수화물의 과분해산물, 190℃ 등 고온에서 마이야르 반응(maillard reaction)에 의해 생성된 단백질 변성체, 각종 유기산, 리그닌 분해물 및 각종 무기염류를 함유하므로 비료와 같은 저급 상품 제조 이외에는 부가가치화하기 어렵게 되고 만다.

목질계 바이오매스로부터 포도당을 제조할 때 바이오매스가 분쇄된 형태만으로는 셀룰로오스가 쉽게 포도당으로 전환되지 않으므로 전처리(pretreatment)와 당화(saccharification) 공정을 순차적으로 행하는 것이 일반적이다. 바이오매스의 전처리는 바이오매스의 각 구조적 성분을 분획이 용이한 상태로 만들기 위해 분쇄 혹은 파쇄된 바이오매스를 이화학적인 방법으로 처리하는 공정을 말한다. 바이오매스의 당화는 이미 전처리 과정에서 셀룰로오스를 둘러싸고 있는 헤미셀룰로오스나 리그닌의 일부 또는 전부가 분해 또는 용해되어 나옴으로써 가수분해가 보다 용이한 상태로 변한 셀룰로오스를 이화학적 혹은 생화학적 방법으로 포도당으로 전환하는 것을 말한다.

상기 당화 과정에서 셀룰로오스의 가수분해 수단으로 효소를 사용하는 것으로 한정하면, 바이오매스의 전처리에 널리 적용되고 있는 기술로 열수전처리(autohydrolysis 혹은 hydrothermolysis), 약산전처리(dilute acid pretreatment), 석회전처리(lime pretreatment), 암모니아 전처리(ARP 등), 폭쇄법(steam explosion) 등을 들 수 있다. 이들 전처리 기술은 바이오매스 중 헤미셀룰로오스 혹은 리그닌을 주로 녹여내는 전처리 효과를 통해 셀룰로오스가 보다 가수분해효소에 잘 반응할 수 있게 만드는데, 바이오매스의 종류와 반응조건에 따라서 전처리 효율이 크게 달라질 뿐만 아니라 전처리 혹은 당화 과정에서 새롭게 생성되는 당 이외의 물질의 종류와 양 또한 크게 달라진다. 최근에는 이러한 기술들 중에서 공정이 단순하여 가장 경제적이고, 동시에 각기 다른 종류의 바이오매스에 적용성이 높은 열수 전처리 기술이 더욱 주목받고 있다.

전처리물의 효소적 당화(enzymatic hydrolysis)는 보다 효소에 반응하기 쉬운 형태로 전환된 셀룰로오스를 함유하는 전처리물에 셀룰라아제를 가하여 반응시킴으로써 셀룰로오스를 포도당으로 전환하는 공정을 말한다. 이때 사용되는 셀룰라아제는 가수분해 작용을 촉진하기 위해서 이전에 적용한 전처리 기술을 고려하여 헤미셀룰로오스 가수분해효소, 전분 가수분해효소 및 펙틴 가수분해효소 등 여러 가지 효소를 추가로 함유하게 된다.

목질계 바이오매스를 원료로 하여 상기 전처리와 당화 과정을 거쳐 제조된 당 함유물은 크게 구별하여 두 가지 용도로 사용될 수 있다. 먼저, 포도당 위주의 단당류가 녹아있지만 당화 후 잔사(hydrolysis residue, 이하 ‘당화잔사’라 칭함)가 그대로 포함되어 있는 당화물(이하 '당화물'이라 칭함) 혹은 당화 개시 후 얼마 지나지 않아서 약간의 포도당만이 생성된 전처리물에 직접 발효균주와 첨가물을 가하고 발효하는 방법으로 동시당화발효법(simultaneous saccharification and co-fermentation)이 있다. 현재 바이오알콜의 연구와 실증적 제조에는 이러한 방법이 많이 사용되고 있다. 다른 한 가지 방법은 당화가 완료된 후 고액분리(solid-liquid separation)를 통하여 당용액을 제조한 후 발효당으로 사용하는 방법이다.

목질계 바이오매스의 이화학적 전처리와 효소당화로 제조된 당용액은 포도당을 포함한 단당류 외에도 여러 가지 물질들을 불순물로 함유한다. 대표적인 불순물로는 당의 과분해로 생성되는 퍼퓨랄(furfural)과 하이드록시메틸퍼퓨랄(hydroxymethylfurfural, 이하 'HMF'로 약함) 등의 알데히드, 레불린산(levulinic acid), 포름산(formic acid) 등의 유기산, 메탄올 등의 알콜을 들 수 있고, 이 외에도 헤미셀룰로오스의 가수분해시 생성되는 아세트산 및 리그닌의 분해로 생성되는 각종 페놀 화합물을 들 수 있다. 이러한 불순물들은 발효균주의 종류에 따라 미생물 발육 억제물질 혹은 대사산물 생성 억제물질로 작용할 수 있다. 보고된 바에 의하면 당용액에 들어있는 리그닌 분해산물인 페놀성 화합물이 공통적으로 가장 강력한 미생물 저해제이며, 퍼퓨랄과 HMF는 농도에 따라 선택적인 저해제로서 작용할 수 있고, 아세트산 등 각종 산들은 균주마다 생리반응이 달라질 수 있다. 옥수수 줄기로부터 황산을 이용한 약산전처리와 효소당화로 제조한 당용액으로 클로스티리듐 베이제린키(Clostridium beijerinckii)를 배양할 때 퍼퓨랄과 HMF는 상기 균주의 생육을 촉진하였지만, 시린잘데하이드(syringaldehyde) 등의 페놀성 화합물은 그 생육을 저해하였다(Thaddeus Ezeji 등, Biothechnology and Bioengineering, 97(6), 1460-1468, 2007). 인공적으로 조제한 당용액에 각각의 물질을 농도별로 첨가하고 에탄올 발효균주로 효모를 사용하여 생육을 시험한 연구에서는 퍼퓨랄은 에탄올 생산에 영향을 미치지 않은 반면 HMF는 약간의 영향을 미쳤으며, 초산은 농도가 높을수록 뚜렷하게 생육을 저해하였다(Jeffrey D. Keating 등, 2006, Biotechnology and Bioengineering, 93(6), 1196-1206). 또한 페놀성 화합물은 효모의 생육을 크게 저해하였으며, 초산과 퍼퓨랄은 함께 사용되는 경우 단독으로 사용되는 것에 비해 저해력이 더 큰 것으로 보고되었다. 에탄올 발효균주로서 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 경우 퍼퓨랄과 HMF의 농도가 증가할수록 생육이 저해되었으며, 이러한 생육 저해는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis ), 대장균(E. coli) 등에서보다 더 민감한 것으로 나타났다(Shinsuke Sakai 등, Applied and Environmental Microbiology, 2349-2353, 2007). 또한, 시린잘데하이드 등의 페놀성 화합물은 상기 균주의 생육을 심하게 억제하였지만, 초산의 영향은 크지 않은 것으로 보고되었다. 상기와 같이 목질계 바이오매스 당용액이 함유할 수 있는 이러한 미생물 저해물질들은 미생물의 종류에 따라 생육과 대사물질의 생성에 각각 다른 영향을 미칠 수 있으므로 직접적인 적용없이 일반적인 경향을 단정짓는 것은 쉽지 않다.

그러므로 바이오매스로부터 제조된 당화물을 미생물 발효에 그대로 이용하기 위해, 여러 가지 불순물에 영향을 받지 않도록, 또는 대사산물을 효율적으로 생산하도록 발효균주를 분자생물학적으로 개량하거나, 새로운 균주로부터 적합한 미생물을 선발하여 왔다. 오랜 옛날부터 인류가 갖가지 알콜 음료를 제조하기 위해 길들여온 알콜발효균주(ethanologen)인 효모는 미생물 저해물질에 대한 내성이 가장 큰 발효균주 중 하나라고 할 수 있으며, 최근에는 목질계 당용액을 이용한 바이오알콜의 생산에 적합하도록 개량하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 일상생활에서 흔히 볼 수 있는 젖산균도 비교적 영향을 덜 받는 균주로 알려져 있다.

반면, 일반적으로 대장균이나 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 등의 대부분의 산업용 미생물들은 몇 가지 불순물에 의해 생육 혹은 대사산물 생산이 크게 저하된다. 따라서, 목질계 바이오매스로부터 제조된 당용액 내에 함유된 여러 미생물 저해물질들을 무독화(detoxification)하기 위해 과량의 석회 사용(overliming), 리그닌 과산화효소(lignin peroxidase) 등을 이용한 고분자화 등 여러 가지 연구가 수행되어 왔다. 다른 많은 연구자들은 이러한 물질의 제거 연구에 흡착(adsorption)과 분배(partition)를 이용한 각종 크로마토그래피를 적용하고 있다(Villarreal, M.L.M. 등, Enzyme and Micrbial Technology, 40, 17-24, 2006).

한편, 당용액이 함유할 수 있는 미생물 저해물질의 양을 최소화하기 위해서 효소당화 전에 전처리물을 세척하는 방법도 이용되고 있다. 현재 파일럿 플랜트 규모의 바이오알콜 제조공장을 운영하고 있는 인비콘(Inbicon)사는 바이오매스를 열수전처리한 후 고액분리를 통하여 미생물 저해물질을 다량 함유하는 액상물을 제거한 다음 전처리 고형분을 물로 세척하는 방식을 이용하고 있는 것으로 알려져 있다(Jan Larsen 등, 2012, Biomass and Bioenergy, 46, 36-45). 하지만, 전처리물의 세척 후 효소당화 혹은 알콜발효 초기에 젖산균 등 원치 않는 미생물에 오염되기 쉬우므로 이를 방지하기 위해 미생물 생육억제물질을 함유하는 전처리 액상물 중 일부를 다시 첨가하기도 한다. 또한 효소당화와 에탄올 발효가 진행됨에 따라 초산과 페놀성 화합물 등 미생물 저해물질이 전처리물로부터 방출되므로, 이러한 방법은 미생물 저해물질에 대한 내성이 강한 효모를 이용한 알콜 발효에는 매우 유용하지만 이를 범용적 발효당의 제조에 사용한 예는 보고되지 않았다. 또한 분쇄 혹은 전처리로 인해 평균입경이 작아진 전처리물의 경우 세척 과정 중에 미립자화된 전처리물 중 일부가 소실될 수 있어서 당수율이 저하될 위험성도 내포한다.

따라서, 본 발명의 목적은 산업용 발효균주의 생육 저해물질 발생을 최대한 억제할 수 있으면서 동시에 당수율을 극대화할 수 있는 일련의 전처리와 효소당화공정을 이용하면서 미생물 저해물질을 최소화하고, 발효용 배지의 제조에 적합하도록 발효당을 고농도로 농축할 수 있는, 목질계 바이오매스로부터 발효당을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 목질계 바이오매스 조분쇄물 혹은 분말에 물을 가하고 50 내지 140℃에서 1 내지 60분간 가열한 후 탈수함으로써 온수 추출성 물질의 대부분을 제거하는 단계(온수추출 단계); 2) 단계 1에서 얻어진 고형분에 물을 가하고, 전처리물의 전량 효소당화에서 자일로오스 등의 헤미셀룰로오스 당 수율이 최대가 되도록 170 내지 210℃에서 1분 내지 30분간 전처리하는 단계(열수 전처리 단계); 3) 단계 2에서 얻어진 열수 전처리물로부터 고액분리에 의해 소량의 액상물을 포함하는 고형분을 얻는 단계(고액분리 단계); 4) 단계 3에서 얻어진 고형분을 셀룰라아제 복합 효소에 의해 45 내지 55℃의 고온에서 효소당화하는 단계(효소당화 단계); 5) 단계 4에서 얻어진 당화물로부터 고액분리와 추출의 반복 과정을 통해 당 용액을 회수하는 단계(당 용액 회수 단계); 및 6) 단계 5에서 얻어진 당 용액을 여과, 농축 및 불순물을 제거하는 단계(농축 단계)를 포함하는, 목질계 바이오매스로부터 산업용 미생물의 발효에 유용한 발효당을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 전처리 전에 바이오매스를 온수로 추출하여 단백질과 무기염류 등 추출성 물질을 대부분 제거함으로써 효소 당화 원료의 불순물 함량을 최소화할 수 있고, 온수 추출성 물질을 제거한 바이오매스를 헤미셀룰로오스 당 수율이 최대가 되는 조건에서 전처리함으로써 이후 고액분리로 얻은 전처리 고형분을 물로 세척하지 않고 분리막을 이용한 농축만으로도 여러 가지 산업용 발효균주의 배양용 발효당을 제조할 수 있다. 또한, 이후의 추가 정제과정에서 불순물 부하량이 줄어들어 정제비용이 절감되고, 효소당화 전 전처리물의 세척에 의한 셀룰로오스의 손실이 없어 높은 당수율을 유지하는 동시에, 전처리물에 최소한으로 존재하는 미생물 생육억제물질과 고온에서 이루어지는 효소당화에 의해 효소당화 기간 동안 젖산균 등 원치 않는 미생물 오염 걱정 없이 발효당을 제조할 수 있다. 나아가, 원료 바이오매스에 함유되어 있는 온수 추출성 성분과, 식이섬유 혹은 자일리톨의 원료가 될 수 있는 자일로올리고당을 함유하는 비교적 순수한 전처리 액상물을 각각 회수하여 원료화함으로써 바이오매스 이용효율을 극대화할 수 있다.

본 발명의 발효당 제조 방법은 바이오매스의 온수 추출성 물질의 제거 단계, 열수 전처리 단계, 고액분리 단계, 효소 당화 단계, 당 용액 회수 단계 및 농축 단계를 포함하는 일련의 공정을 통하여 미생물 저해물질 등의 불순물 함유량을 최소화함으로써 결과적으로 여러 가지 산업 미생물의 발효에 두루 사용될 수 있는 고농도의 발효당을 제조하는 것을 기술구성상 특징으로 한다.

본 발명의 방법에서, 첫 번째 공정인 온수 추출성 물질 제거 단계는 목질계 바이오매스 조분쇄물 혹은 분말에 물을 가하고 50 내지 140℃에서 1 내지 60분간 가열한 후 탈수하는 단계이다. 상기 공정은 이후 전처리물의 효소당화시 초본계 바이오매스에 다량 함유되어 있는 무기염류 등 셀룰로오스 가수분해효소의 활성을 저해할 수 있는 물질의 양을 최소화함으로써 당화율(saccharification rate)과 당수율(sugar yield)을 증대시킴과 동시에, 효소당화 후 당용액의 정제 공정에서 불순물 부하량을 줄임으로써 공정비용을 낮추는 데 효과적이다. 또한, 이 공정은 바이오매스 중에 추출성 물질로 함유되어 있는 녹말과 유리당, 단백질, 지질, 펙틴, 탄닌, 다양한 생리활성을 나타낼 수 있는 알칼로이드, 유기산 및 무기염류 등 유용물질을 회수하여 자원화하는 동시에, 전처리 과정 중에 이러한 물질들이 분해, 축합, 변형 등의 반응으로 쓸모없게 변하거나 마이야르 반응(maillard reaction) 등으로 단백질이 독성 물질로 변할 가능성을 낮춘다.

상기 공정은 바이오매스를 물에 침지한 다음 통상적으로 물질의 수용해도가 극대가 되는 온도의 물로 추출하여 추출성 성분을 회수 혹은 제거할 수 있다. 바람직하게는, 바이오매스를 물에 침지한 다음 80 내지 105℃의 온도에서 1 내지 60분간 교반하여 추출성 물질의 용출이 극대가 되는 시점에서 식기 전에 고액분리를 통하여 수용액을 제거할 수 있다. 이 과정에서 바이오매스가 함유하고 있던 추출성 성분들이 대부분 제거될 수 있는데, 이 공정에는 향류 추출(counter-current extraction), 병류 추출(co-current extraction), 반-회분식 추출(semi-batch type extraction) 및 회분식 추출(batch type extraction) 등의 다양한 추출 방식이 사용될 수 있다.

이 공정의 목적은 바이오매스로부터 최소한의 온수로 추출성 물질을 최대한 추출 제거하는 것이다. 회분식 추출의 경우, 바이오매스 분쇄물을 추출기에 넣고 온수를 가하여 추출한 후 고액분리하여 액상물을 제거하는데, 이때 추출성 물질의 제거효율은 대략 1:4의 중량비부터 시작하는 고액비(바이오매스와 물의 비율)가 증가함에 따라 높아진다. 예컨대, 바이오매스 1 kg을 물 20 L에 넣고 95℃로 가열한 후 고액분리를 수행하여 3 kg의 건더기와 18 L의 수용액을 얻은 경우 추출성 성분의 90%가 제거되고 나머지 10%만이 후속 전처리 공정에 들어간다. 그러나 바이오매스 분획의 측면에서 추출물을 이용하고자 할 때 탈수비용과 수처리 비용을 고려하여 고액비는 1:20을 넘지 않는 것이 바람직하다.

바이오매스의 온수추출에 의한 추출성 물질의 제거 효율은 추출시 온도와 고액분리시 온도가 높아질수록 증가한다. 이는 대부분의 물질이 온도에 비례하여 수용해도가 증가하기 때문이다. 따라서 추출과 고액분리는 50 내지 140℃, 바람직하게는 80 내지 105℃와 같은 고온에서 이루어지는 것이 바람직하다. 또한 바이오매스의 입도가 고울수록 침지시간이 단축되지만, 분쇄시 에너지 비용과 향류 추출의 효율을 감안할 때 바이오매스의 전처리용 원료로 사용될 수 있는 크기, 예를 들면 평균입경 0.1 mm 내지 50 mm를 가지도록 먼저 파쇄 혹은 분쇄하는 것이 유리하다.

추출성 물질 추출 후의 고형분의 함수율은 사용하는 방식과 적용기기에 따라 달라지지만 50% 내지 90% 정도가 바람직하다. 필요한 경우 추출 공정 후의 고액분리에 최대한 탈수된 고형분을 얻기 위해서 연속원심분리기(continuous centrifugal separator), 필터프레스(filter press), 드럼 필터(drum filter) 혹은 스크류 프레스(screw press) 등도 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 두 번째 공정인 바이오매스의 열수 전처리 단계는 미생물 저해물질의 생성을 최소화하는 동시에 당수율을 극대화하기 위한 것으로서, 열수전처리 결과 얻어진 전처리물 모두를 효소당화하였을 때 자일로오스와 자일란 등 헤미셀룰로오스 당 수율이 최대가 되는 조건에서 물을 가하여 수행하는 열수 전처리이다. 상기 공정은 단계 1에서 얻어진 고형분에 물을 가하고 170 내지 210℃에서 1분 내지 30분간 전처리함으로써 달성될 수 있다. 상기 열수 전처리는 회분식(batch type)이나 연속식 전처리(continuous pretreatment)에 의해 수행될 수 있다. 열수 전처리에서 원료에 대한 수분 첨가량, 즉 고액비는 바이오매스의 가수분해 반응을 수행하기에 적당한 양 이상이면 크게 한정되지는 않지만, 본 발명에서는 전처리 후 반응물을 별도로 세척하지 않으므로 전처리 효율과 전처리 중에 생성된 미생물 생육저해 물질의 후속 공정으로의 이월을 고려할 때 원료 대 수분의 비율이 1:3 내지 1:15의 중량비인 것이 바람직하다. 예를 들어, 범용적 발효당 제조를 위하여 초본계 바이오매스를 회분식 열수 전처리하는 경우, 해바라기 줄기 분말로부터 전술한 단계 1을 거쳐 회수한 고형분에 물 혹은 물과 점토광물을 가하여 고형분 비율을 8%로 맞춘 다음 이를 고압반응기에 넣고 190℃에서 5분간 반응시킬 수 있다(대한민국 공개공보 제2012-73087호 및 국제공개공보 제WO/2012/087068호 참조). 이 온도에서 헤미셀룰로오스의 가수분해에 의해 생성되는 자일로오스와 자일란의 수율은 최대가 되는 반면, 과분해되기 쉬운 퍼퓨랄과 셀룰로오스의 과분해로 인해 생성되는 HMF의 양은 최소가 된다. 한편, 전처리 후 효소당화에서 생성될 수 있는 포도당의 수율은 더 격렬한 조건에서 전처리한 경우보다 낮으므로 당수율을 증대하기 위해 효소당화시 점토광물(대한민국 공개공보 제2012-73087호 및 국제공개공보 제WO/2012/087068호) 혹은 폴리에틸렌글리콜(미국 특허 제7,972,826호)등을 사용하는 기술을 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 세 번째 공정인 고액분리 단계는 단계 2에서 얻어진 열수 전처리물로부터 고액분리에 의해 소량의 액상물을 포함하는 고형분을 얻는 단계이다. 상기 고액분리 과정은 당업계에 통상적으로 사용되는 모든 고액분리 공정에 따라 수행될 수 있으며, 그 예로서 원심분리, 흡인 여과 및 가압여과 등을 들 수 있다. 상기 고액분리로 얻은 전처리 고형분은 건물중의 약 2 내지 4배의 전처리 액상물을 함유할 수 있는데, 본 발명의 발효당 제조 방법에서는 많은 연구논문에서처럼 온수로 전처리 고형분을 세척하지 않고 그대로 후속 셀룰라아제 복합효소에 의한 당화공정에 투입된다. 고액분리 후의 고형분에 함유되어 있는 전처리 액상물은 전처리 직후 전처리물에 포함되어 있는 액상물의 5% 내지 30%를 함유하도록 조절되는 것이 바람직하다. 상기 액상물은 셀룰로오스 가수분해효소의 최적 작용온도인 50℃ 내외에서 젖산균 등 공기 중으로부터 흔히 오염될 수 있는 미생물의 생장을 억제하기에 적당한 양의 미생물 생육억제 물질을 함유하고 있어서 별도의 멸균처리 없이 전처리물을 72시간 이상 효소당화할 수 있는 장점을 가지고 있다. 또한, 상기 액상물은 효소당화 후 효소의 회수 혹은 제거, 분리막을 이용한 농축 공정에서도 당용액의 온도를 50℃ 이상으로 유지해줌으로써 미생물에 의한 오염을 억제할 수 있게 해준다.

상기 고액분리에 의해 회수된 전처리 액상물은 헤미셀룰로오스의 가수분해로 생성된 소량의 자일로오스, 다량의 자일로올리고당, 아세트산, 미량의 퍼퓨랄 및 수용성 리그닌 분해산물을 함유하면서, 전술한 본 발명의 단계 1에 의해 불순물이 대부분 제거되어 자일리톨 혹은 식이섬유 등으로의 재가공을 위한 우수한 원료로 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 네 번째 단계인 효소당화 단계는 단계 3에서 얻어진 고형분을 45 내지 55℃, pH 4.8 내지 5.2의 산도에서 효소당화하는 단계이다. 상기 공정은 전처리된 바이오매스에 함유되어 있는 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스를 포도당(glucose)과 자당(xylose) 등의 단당류로 전환하는 공정이다.

상기 공정에 있어서, 단계 3에서 얻어진 고형분에 셀룰라아제 복합효소를 첨가하고 당화할 때 물을 추가로 사용할 수 있지만 당화 후 고농도의 당용액을 얻기 위해서 그 양을 제한하는 것이 좋다. 따라서 효소당화시 고형분에 대한 물의 비율은 고형분의 건조중으로 환산하여 1:3 내지 1:10의 중량비가 바람직하다.

상기 전처리물의 효소당화에는 헤미셀룰라아제를 함유하는 셀룰라아제 복합효소가 사용되며, 그 예로는 셀루클라스트(Celluclast®) 1.5L 혹은 Celluclast® conc BG와 Novozyme^TM 188의 혼합제제, Cellic CTec2와 Cellic HTec2의 혼합물 혹은 Cellic CTec3와 헤미셀룰라아제와의 혼합물, 셀루자임(Celluzyme®), 세레플로(Cereflo®) 및 울트라플로(Ultraflo®)의 혼합제제(이상 덴마크 Novozymes 제품), 액셀러라제(Acellerase^TM), 라미넥스(Laminex®) 및 스페자임(Spezyme®) 혼합물(이상 Genencor Int. 제품), 로하멘트(Rohament®; Rohm GmbH 제품) 등을 들 수 있다. 열수전처리물이 약간의 헤미셀룰로오스를 함유하므로 가수분해속도를 촉진하기 위해서 헤미셀룰라아제를 첨가할 수 있으며, 셀룰라아제와 헤미셀룰라아제의 혼합비는 대략 9:1 내지 10:0 정도가 바람직하다. 또한 바이오매스 건조중 1 g당 셀룰라아제 복합효소의 사용량은 0.001 g 내지 0.5 g이 바람직하다.

효소당화는 상기 가수분해효소가 최대의 활성을 나타내는 조건, 즉 Cellic CTec2와 Cellic HTec2 혼합물의 경우 pH 4.8 내지 5.2, 온도 50±1℃를 유지하는 것이 좋으며, 미생물의 오염이 없는 한 당화는 24시간 내지 96시간 이상 지속하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 고형분 중에 일부 잔류하여 효소당화 공정에 들어간 전처리 액상물은 자이로오스와 자일로올리고당 등 셀룰로오스 가수분해효소의 활성을 일부 억제할 수 있는 물질을 함유하므로 효소당화에서 당수율이 약간 저하될 수 있다. 따라서 본 발명에서는 전처리물의 효소 가수분해에서 당수율을 증대시키기 위해서 공지된 다음의 두 가지 방법을 사용할 수 있다. 첫 번째 방법은 효소당화시 셀룰로오스 가수분해효소의 활성을 증대할 수 있다고 알려진 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 첨가하는 방법(미국 특허 제7,972,826호 참조)이다. 이는 효소가 전처리물 표면의 리그닌에 비가역적으로 흡착되는 현상을 억제함으로써 당수율을 향상시킬 수 있다. 하지만 발효당의 제조시 불순물로 남지 않게 하기 위해 당화 후 분리막 공정으로 회수할 수 있도록 분자량이 30,000 이상인 PEG를 사용한다. 다른 한 가지 방법은 열수전처리 혹은 효소당화시 특정 점토광물을 소량 첨가하는 방법이다(대한민국 공개공보 제2012-73087호 및 국제공개공보 제WO/2012/087068호 참조). 이 방법은 전처리 고형분을 물로 씻지 않고도 당수율을 증대할 수 있을 뿐만 아니라 생성되는 당용액이 첨가물을 함유하지 않으므로 발효당의 제조에 유리하다.

본 발명의 방법에서, 다섯 번째 단계인 당 용액 회수 단계는 단계 4에서 얻어진 당화물로부터 고액분리와 추출의 반복 과정을 통해 당 용액을 회수하는 단계이다. 상기 회수 단계에는 연속식 원심분리, 필터프레스(filter press), 회분식 원심분리 등의 방법이 사용될 수 있다. 회분식 회수과정을 예로 들면, 당화물을 원심분리하여 상징액을 회수하고, 당화잔사는 동일 부피의 물에 희석한 다음 원심분리하여 당용액을 회수하기를 3 내지 5회 반복함으로써 효소당화로 생성된 당을 99% 이상 회수할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 여섯 번째 단계인 농축 단계는 단계 5에서 얻어진 당 용액을 여과, 농축, 및 불순물을 제거하는 단계이다. 단계 5에서 얻어진 당용액의 최종 당 농도는 당의 회수과정에서 희석되어 초기 농도의 50% 내외까지 낮아져서 약 60 g/L 내지 150 g/L가 되는데, 이렇게 낮은 농도의 당용액은 막분리 기술을 이용한 농축공정을 통하여 30% 이상의 당 농도까지 높아질 수 있다. 상기 농축 공정은 당해 기술분야에 널리 알려진 역삼투 여과(reverse osmosis), 나노여과(nanofiltration) 등을 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 당용액 중에 함유되어 있는 효소를 재사용하기 위하여 한외여과(ultrafiltration)를 이용하여 회수하거나, 가열하여 변성시켜 침전물을 만든 후 고액분리 기술을 이용하여 제거할 수도 있다.

본 발명에서 발효당의 보관 중에 미생물의 오염으로 변질되는 것을 막기 위해 포도당 농도로서 30% 이상 고농도로 제조된 당용액은 헤미셀룰로오스의 가수분해로 생성된 낮은 농도의 초산과 개미산 등 유기산, 극미량의 퍼퓨랄과 HMF, 리그닌의 분해로 생성된 페놀성 화합물 및 바이오매스로부터 유래하는 소량의 무기염류를 함유한다. 그러나 당을 제외한 이러한 불순물의 농도는 매우 낮아서 정상적으로 대사산물을 만들 수 있는 농도로 당용액이 희석되었을 때, 여러 가지 화학물질과 바이오연료의 생산에 범용적인 균주로 사용되는 대장균 및 효모, 부탄올과 아세톤 등의 생산에 사용되는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 및 클로스트리듐 베이제린키(Clostridium beijerinckii), 젖산을 주로 생산하는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 및 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.), 아미노산의 생산에 주로 사용되는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 등 많은 산업용 미생물의 생육에 큰 지장을 초래하지 않는다.

본 발명의 발효당 제조 방법에 원료로서 사용될 수 있는 목질계 바이오매스의 예로는 초본계 바이오매스 및 목본계 바이오매스를 들 수 있다. 하지만, 상기 목질계 바이오매스 외에도 미세조류와 해조류를 포함하는 조류 바이오매스와 같이 셀룰로오스를 주요 당원으로 함유하는 바이오매스가 제한없이 사용될 수 있다. 초본계 바이오매스의 예로는 오일팜(oil palm)의 수간(trunk), 잎자루(frond), 공과방(empty fruit bunch), 해바라기 줄기, 볏짚, 보릿짚, 밀짚, 옥수수 줄기, 갈대, 억새, 스위치그래스, 유채 줄기, 단수수 줄기, 수수 줄기, 부들 등을 들 수 있으며, 목본계 바이오매스의 예로는 백합나무, 버드나무, 아카시아, 유칼립투스, 가문비 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 목질계 바이오매스를 원료로 하여 발효당을 제조하는 방법은 가장 단순화된 방법으로 바이오매스를 분별처리(fractionation)하여 여러 가지 산업용 원료를 제조하는 동시에, 높은 수율로 산업용 미생물의 발효에 사용할 수 있는 정제된 고농도 당용액을 제조할 수 있으므로 바이오매스의 이용효율을 극대화할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 해바라기 줄기를 원료로 하는 발효당의 제조

성분 조성을 알고 있는 해바라기 줄기 분말을 건물중으로 360 g을 칭량하여 광목자루에 넣은 다음, 상기 광목자루를 증류수 3,600 g이 들어있는 95℃ 찜통에 넣어 10분간 가열하였다. 이후 상기 광목자루를 원심분리 탈수기에 넣고 탈수하였다. 탈수 후 광목자루를 다시 증류수 2,400 g이 들어있는 95℃ 찜통에 넣어 물을 충분히 흡수시킨 다음 건져내어 탈수기로 탈수하였다. 광목자루 내용물을 3등분하여 2 L용 반응기(Parr reactor; Parr Instrument Co. Ltd., 미국) 병(jar)에 넣고 증류수를 가하여 내용물 무게가 각각 1,500 g이 되게 하였다. 상기 반응기를 가열하여 190℃에서 5분간 열수 전처리하였다. 반응이 끝난 후 반응기 병을 흐르는 물에 담가 급속 냉각한 다음 내용물을 광목자루에 옮겨 담았다. 상기 과정을 5회 더 반복하여 총 720 g의 바이오매스를 전처리한 후 모두 모아 광목자루에 넣어 탈수기로 탈수하였다. 탈수가 완료된 고형물을 발효기(BioTron, 한국)의 발효조로 옮긴 후 비이온수를 가하여 총량을 4 kg이 되게 하였다. 여기에 규조토 분말((주)렉셈 제품, 포항, 한국) 72 g을 가하고 교반하였다. 이후, 셀룰로오스 가수분해 효소로서 Cellic CTec2 64.8 mL 및 Cellic HTec2 7.2 mL을 가한 후, 50±1℃ 및 pH 5.0±0.1에서 150 rpm으로 교반하였다. 당화 시작 3일 후 당화를 완료하여 당용액 원액을 제조하고 당화물의 양을 측정한 다음, 1 mL의 시료를 채취하여 조성 분석용 시료로 사용하였다. 발효조 내의 당화물을 광목자루에 옮겨담고 탈수기로 탈수하여 당용액을 회수하였다. 당용액을 한번 회수한 광목자루를 800 mL의 증류수가 담겨있는 비이커에 넣어 물을 흡수시킨 후 12시간 이상 냉장 보관하였다가 다시 탈수하여 당용액을 분리하였다. 이 과정을 2회 더 반복하여 당용액을 모은 후 당용액 원액과 합하였다. 이 당용액을 121℃에서 20분간 가열하여 효소를 변성시켜 침전시킨 다음 원심분리하고 여과지로 걸러서 맑은 당용액을 얻었다. 이후, 상기 당용액을 역삼투 막모듈(RE1812-80, (주)웅진 제품, 한국)이 장치되어 있는 농축기(자체 제작)에 넣어 농축함으로써 포도당 농도가 300 g/L 이상인 당용액을 제조하였다(이하 '발효당 1'이라 함). 상기 발효당을 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계(refractive index detector)가 장착된 워터스(Waters) HPLC로 분석하여 포도당과 기타 당 및 아세트산의 농도를 산출하고 이로부터 수율을 환산하였다. 퍼퓨랄과 HMF의 농도를 측정하여 농축 전 당용액의 수율을 하기 표 2에, 농축 후의 발효당 농도를 하기 표 3에 나타내었다. 또한 해바라기 줄기 전처리물로부터 추출하여 조제한 페놀성 물질을 표준물질로 하고, 발효당을 200배 희석하여 분광광도계(spectrophotometer, Beckmann, 독일 제품)로 320nm에서 흡광도를 측정하여 산출한 당용액 중 페놀성 물질의 농도를 표 3에 나타내었다. 고농도 발효당의 무기염류 함유량은 Plasma-Atomic Emission Spectrometer(ICP-AES, Thermo Scientific, 미국)로 측정한 다음 각 성분들을 합하여 표시하였다.

비교예 1: 열수 전처리물을 세척하여 제조한 해바라기 줄기 원료 당용액

상기 실시예 1에서 사용한 해바라기 줄기 분말을 건물중으로 120 g을 칭량하여 2 L용 반응기(Parr reactor; Parr Instrument Co. Ltd., 미국)의 병에 넣고 증류수를 가하여 내용물 무게가 각각 1,500 g이 되게 하였다. 이후 상기 혼합물을 190℃에서 5분간 열수 전처리하였다. 반응이 끝난 후 반응기 병을 흐르는 물에 담가 급속 냉각한 다음 내용물을 광목자루에 옮겨 담았다. 상기 과정을 5회 더 반복하여 총 720 g의 바이오매스를 전처리한 후 모두 모아 광목자루에 넣어 탈수기로 탈수하였다. 탈수가 완료된 고형물을 20 L의 끓는 물에 담갔다가 원심분리 탈수기로 탈수하였다. 탈수된 전처리 고형분을 발효기(BioTron, 한국)의 발효조로 옮기고 비이온수를 가하여 총량이 4 kg이 되게 하였다. 여기에 규조토 분말 72 g을 가하고 교반하였다. 이후, 상기 발효조를 밀봉한 다음 오토클레이브에 넣고 121℃에서 60분간 멸균하였다. 셀룰로오스 가수분해 효소로서 Cellic CTec2 64.8 mL 및 Cellic HTec2 7.2 mL을 초순수 430 mL에 녹이고 0.22 ㎛ 멤브레인 필터가 부착된 필터 시스템(Corning 제품, 미국)으로 여과한 다음 클린벤치 내에서 발효조에 가하였다. 상기 발효조를 50±1℃ 및 pH 5.0±0.1로 유지하면서 150 rpm으로 교반하였다. 젖산균의 발생 여부를 조사하기 위하여 효소 가수분해 개시 후 3일 동안 교반하면서 1일 간격으로 당화물을 채취하여 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계(refractive index detector)가 장착된 워터스(Waters) HPLC로 포도당과 기타 당, 젖산 및 아세트산의 수율을 산출하고, 퍼퓨랄 및 HMF의 농도를 측정하여 하기 표 2에 나타내었다. 발효조 내의 당화물을 광목자루에 옮겨담고 탈수기로 탈수하여 당용액을 회수하였다. 당용액을 한번 회수한 광목자루를 800 mL의 증류수가 담겨있는 비이커에 넣어 물을 흡수시킨 후 12시간 이상 냉장보관하였다가 다시 탈수하여 당용액을 분리하였다. 이 조작을 2회 더 반복하여 당용액을 모은 후 당용액 원액과 합하였다. 이 당용액을 121℃에서 20분간 가열하여 효소를 변성시켜 침전시킨 다음 원심분리하고 여과지로 걸러서 맑은 당용액을 얻었다. 상기 당용액을 역삼투 막모듈이 장치되어 있는 농축기(자체 제작)에 넣고 농축함으로써 포도당 농도가 300 g/L 이상인 발효당(이하 '발효당 2'라 함)을 제조하였다. 이 당용액을 HPLC로 분석하여 당을 포함한 각 성분들의 농도를 측정하고, 그 결과를 표 3에 나타내었다. 또한 실시예 1과 같은 방법으로 페놀성 물질과 무기염 농도를 측정하여 표 3에 나타내었다.

비교예 2: 추출성 물질을 제거하지 않은 해바라기 줄기를 원료로 하는 발효당의 제조

상기 실시예 1에서 사용한 해바라기 줄기 분말을 건물중으로 120g을 칭량하여 2 L용 반응기(Parr reactor; Parr Instrument Co. Ltd., 미국)의 병에 넣고 증류수를 가하여 내용물 무게가 각각 1,500 g이 되게 하였다. 이후 상기 혼합물을 190℃에서 5분간 열수 전처리하였다. 반응이 끝난 후 반응기 병을 흐르는 물에 담가 급속 냉각한 다음 내용물을 광목자루에 옮겨 담았다. 상기 과정을 5회 더 반복하여 총 720 g의 바이오매스를 전처리한 후 모두 모아 광목자루에 넣어 탈수기로 탈수하였다. 탈수된 전처리 고형분을 발효기(BioTron, 한국)의 발효조로 옮기고 비이온수를 가하여 총량이 4kg이 되게 하였다. 여기에 규조토 분말 72g을 가하고 교반하였다. 이후, 셀룰로오스 가수분해 효소로서 Cellic CTec2 64.8 mL 및 Cellic HTec2 7.2 mL을 가하고, 발효조를 50±1℃ 및 pH 5.0±0.1로 유지하면서 150 rpm으로 교반하였다. 효소 가수분해 개시 후 3일 동안 교반하여 당화를 완료하여 당용액 원액을 제조하고, 시료 1 ml를 취하여 조성분석에 사용하였다. 당용액 원액을 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계(refractive index detector)가 장착된 워터스(Waters) HPLC로 분석하여 포도당과 기타 당 및 아세트산의 수율을 산출하고, 퍼퓨랄 및 HMF의 농도를 측정하여 하기 표 2에 나타내었다. 발효조 내의 당화물을 광목자루에 옮겨담고 탈수기로 탈수하여 당용액을 회수하였다. 당용액을 한번 회수한 광목자루를 800 mL의 증류수가 담겨있는 비이커에 넣어 물을 흡수시킨 후 12시간 이상 냉장보관하였다가 다시 탈수하여 당용액을 분리하였다. 이 조작을 2회 더 반복하여 당용액을 모은 후 당용액 원액과 합하였다. 이 당용액을 121℃에서 20분간 가열하여 효소를 변성시켜 침전시킨 다음 원심분리하고 여과지로 걸러서 맑은 당용액을 얻었다. 상기 당용액을 역삼투 막모듈이 장치되어 있는 농축기(자체 제작)에 넣고 농축함으로써 포도당 농도가 300 g/L 이상인 발효당(이하 '발효당 3'이라 함)을 제조하였다. 이 당용액을 HPLC로 분석하여 당을 포함한 각 성분들의 농도를 측정하고, 그 결과를 표 3에 나타내었다. 또한 실시예 1과 같은 방법으로 페놀성 물질과 무기염 농도를 측정하여 표 3에 나타내었다.

상기 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 발효당 제조 과정을 하기 표 1과 같이 정리하였다.

	실시예 1	비교예 1	비교예 2
온수 추출을 이용한 원료 바이오매스 중 추출성 물질의 제거	95℃에서 10분간 가열 후 탈수 (총 2회)	-	-
열수 전처리	190℃에서 5분간 처리	190℃에서 5분간 처리	190℃에서 5분간 처리
전처리물 처리	냉각 후 탈수로 액상물 부분 제거	냉각 후 고형분 온수 세척	냉각 후 탈수로 액상물 부분 제거
전처리물 멸균	-	121℃에서 60분	-
여과를 이용한 효소 무균화	-	0.22 ㎛ 멤브레인 필터링	-
고형분의 효소 당화	50±1℃, pH 5.0±0.1, 150 rpm	50±1℃, pH 5.0±0.1, 150 rpm	50±1℃, pH 5.0±0.1, 150 rpm
효소 제거	121℃, 20분 가열 후 여과	121℃, 20분 가열 후 여과	121℃, 20분 가열 후 여과
농축	역삼투 막모듈	역삼투 막모듈	역삼투 막모듈

성분명	수율(g/100g) 및 생성량
성분명	실시예 1	비교예 1	비교예 2
포도당	29.6	26.3	30.3
기타 당	8.5	6.9	9.8
초산	1.3	1.0	1.1
젖산	0.0	0.1	0.0
HMF	0.01	0.00	0.02
퍼퓨랄	0.02	0.00	0.02

본 실험에 바이오매스로 사용한 해바라기 줄기는 셀룰로오스가 포도당 전환치로 35.1 g, 헤미셀룰로오스는 단당류 전환치로 18.8 g, 초산은 4.5 g이다. 상기 표 1에서 보는 바와 같이, 본 발명의 발효당 제조 방법에 의해 제조한 실시예 1의 당용액은 72시간까지 젖산균의 오염없이 효소당화를 지속하여 포도당 수율이 29.6 g에 달하였으며, 당 과분해산물의 생성 또한 거의 없었다. 또한, 전처리 결과 생성된 미생물 억제물질을 함유하는 소량의 액상물을 전처리 고형분에 남겨서 효소당화에 투입함으로써 멸균하지 않고도 젖산균의 오염없이 당화함으로써 당수율을 높일 수 있었다.

반면에 전처리 고형분을 온수로 세척한 후 효소당화를 시작한 비교예 1은 당화 24시간 후부터 젖산이 생성되기 시작하였으며, 48시간 후에는 그 농도가 급격히 증가하였다. 따라서 효소당화를 48시간 후에 중지하였다. 비교예 1의 포도당 수율이 본 발명의 실시예 1의 당용액보다 현저히 낮은 것은 효소당화 시간이 짧아진 데에도 일부 원인이 있지만, 전처리물의 온수 세척 과정에서 전처리물 중 일부가 미세한 입자로 소실되었기 때문이다. 이와 같이 전처리물이 함유하는 당 과분해산물과 리그닌 분해산물을 제거하기 위해 온수로 세척하는 것은 효소당화 결과 생성되는 당용액의 순도를 높일 수 있는 하나의 방법이 될 수 있지만 효소당화 과정에서 젖산균 등 미생물의 오염을 피하기 어려우므로 발효당의 산업적 제조에 있어서 큰 장애물이라는 것을 알 수 있다.

또한, 바이오매스를 그대로 전처리하고 전처리물을 고액분리하여 얻은 고형분을 효소당화하여 얻은 비교예 2는 당수율이 30.3 g으로 가장 높게 나왔지만, 이는 바이오매스를 온수로 추출하지 않고 그대로 사용하였으므로 바이오매스에 함유된 유리당이 당용액 내에 포함되었기 때문이다. 그러나 이러한 유리당은 쉽게 과분해될 수 있으므로 상기 표 2에서 보는 바와 같이 HMF와 퍼퓨랄의 생성을 피할 수 없다. 이러한 과분해산물은 여러 가지 미생물에 고루 적용할 수 있는 고농도 발효당을 제조하기 위해서 반드시 제거하여야 하는 불순물이기 때문에, 후속 분리 정제 과정 중 크로마토그래피 공정의 비용을 크게 증가시키는 요인이 될 수 있다.

성분명	시험용 고농도 발효당의 조성(%)
성분명	발효당 1	발효당 2	발효당 3
포도당	30.0	30.1	30.5
기타 당	8.7	7.2	9.1
초산	0.6	0.5	0.4
젖산	0.0	0.1	0.0
HMF	0.03	0.01	0.02
퍼퓨랄	0.02	0.00	0.01
페놀성물질	0.72	0.31	0.58
무기염류	0.31	0.16	0.82

해바라기 줄기의 열수 전처리와 효소당화로 얻은 당용액을 분리막을 이용하여 농축하여 제조한 발효당의 조성을 보면 표 3과 같다. 포도당 농도를 30% 내외로 조절하였을 때 본 발명의 발효당 1과 비교예 2의 발효당 3은 극소량의 HMF와 퍼퓨랄을 함유하고 있지만, 전처리물을 온수로 세척한 후 효소당화하여 얻은 발효당 2에는 이러한 물질이 거의 함유되어 있지 않다. 페놀성 물질의 농도는 본 발명의 발효당 1과 비교예 2의 발효당 3이 큰 차이를 보이지 않아 이 물질이 전처리 결과 생성된 것을 나타내고 있다. 전처리물을 온수로 세척한 비교예 1의 발효당 2도 페놀성 물질을 함유하고 있어서 온수 세척 후에도 효소당화 과정을 거치면서 페놀성 물질이 당용액 중에 방출되므로 세척효과가 제한적임을 보여준다.

전처리물이 함유하는 이러한 불순물의 적당한 농도가 50℃ 내외의 효소당화 온도와 함께 작용하여 젖산균의 발생을 억제하는데, 전처리물을 온수로 세척하여 HMF, 퍼퓨랄 및 페놀성 물질의 농도가 낮은 발효당 2는 효소당화 과정에서 젖산균에 쉽게 오염되므로 효소당화 후 젖산을 함유하게 되는 것이다.

표 3에서 볼 수 있는 가장 두드러진 특징 중 하나는 무기염류의 함유량인데, 바이오매스의 온수추출로 추출성 물질의 90%를 제거한 본 발명의 발효당 1에 비해 온수추출 과정을 생략한 발효당 3이 약 2.6배 이상의 무기염을 함유하고 있다. 이러한 무기염 농도는 산업미생물의 배양시 첨가하는 무기염의 농도와 비교할 때 매우 높은 수준이며, 미생물의 종류에 따라 생육을 억제할 수 있는 것으로 추정된다.

비교예 3: 연속분획방법으로 추출성 물질을 제거하여 제조된 발효당과의 비교

본 발명의 방법을 대한민국 공개공보 제2011-0040367호에 개시된 연속분획에 의해 추출성 물질을 제거하는 방법과 비교하였다.

선행기술로서 대한민국 공개공보 제2011-0040367호의 실시예 2와 시험예 1에는 연속분획에 의해 온수 추출성 물질을 제거하고, 열수 전처리와 효소 당화에 의해 발효당을 제조하는 방법과 당수율이 개시되어 있다. 상기 선행기술에서 얻어진 발효당의 당수율은 해바라기줄기 건물중 100 g 당 각각 자일로오스 10.1 g과 포도당 28.2 g이었다. 이는 전처리 후 얻어진 전처리 액상물과 고형물의 당화로 얻은 총 당수율이었다.

반면, 본 발명의 실시예 1에서, 선행기술과 동일한 바이오매스를 전처리한 다음, 액상물을 30% 이내로 함유하는 전처리 고형물을 효소당화하여 얻은 당용액의 당수율은 자일로오스 8.5 g과 포도당 29.6 g이었다. 상기 자일로오스 함량을 전처리물로부터 원심분리하여 얻은 액상물을 효소로 당화하여 얻을 수 있는 자일로오스 함량 7.5 g과 합하여 총 자일로오스 수율을 산출하면 총 16.0 g에 해당하여 본 발명의 방법이 상기 선행기술보다 당수율면에서 훨씬 우수함을 알 수 있다. 이는 선행기술이 연속분획기를 이용하여 해바라기 줄기로부터 헤미셀룰로오스를 가수분해하고, 생성된 액상물을 밸브를 통하여 회수하였을 때 액상물의 회수가 불완전하였기 때문이다. 즉, 이어지는 전처리에 헤미셀룰로오스 가수분해물이 다량 함유되고 고온에서 자일로오스가 과분해되어 소실됨으로써 상기 결과가 야기된다. 또한, 이로 인해 과분해산물인 퍼퓨랄이 다량 생성되므로, 상기 선행기술로 발효당을 제조할 경우 정제에 많은 비용이 추가되어야 할 것으로 추정된다.

이러한 결과를 고찰해 보면 선행기술의 바이오매스 연속분획기를 이용한 방법은 고온 반응 후 액상물을 완전히 회수하는데 그다지 효과적이지 않음을 알 수 있다. 이에 반해, 본 발명에서는 바이오매스의 온수 추출 혹은 전처리 후 원심분리 등 적극적인 고액분리 기술을 사용하여 바이오매스의 분획을 효과적으로 달성함으로써 가장 경제적인 방법으로 발효당을 제조할 수 있게 되었다.

시험예 1: 본 발명의 발효당을 영양원으로 하는 발효균주 생육시험

실시예 1, 비교예 1 및 2의 발효당 1, 2 및 3을 이용하여 발효균주의 배양시험을 수행하였다. 먼저 2 mL의 LB, MRS 및 2YTG 배지에 각각 대장균(Esterichia coli) XB, 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 13169 및 클로스트리듐 베이제린키(Clostridium beijerinckii) N8052(pKBE4112ADH)를 배양하여 종균(seed)을 제조하였다. 이후 P2, MR 및 LAB 배지에서 포도당 대신 실시예 1, 비교예 1 및 2의 발효당 1, 2 및 3을 사용하여 배지를 제조하였다. 구체적으로, P2 배지는 발효당 20 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 비타민 1.5배량, 무기염류 1.5배량 및 완충액 1.5배량을 첨가하여 제조하였고; MR 배지는 발효당 20 g/L, KH₂PO₄ 6.67 g/L, (NH₄)₂HPO₄ 4 g/L, 구연산 0.8 g/L 및 황산철, 염화칼슘, 황산아연, 황산망간, 황산구리, 몰리브덴염 및 보론염을 소량씩 함유하는 미량 금속 수용액 5 ml/L를 혼합하여 제조하였으며; LAB 배지는 발효당 20 g/L, 폴리펩톤 5 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 0.1 g/L 및 MgSO₄ 0.5 g/L 첨가하여 제조하였다. 이후, 상기 각 배지에 0.2%의 종균을 접종하여 대장균XB와 락토바실러스 파라카세이 13169는 호기 조건 하에서 그리고 클로스트리듐 베이제린키 N8052(pKBE4112ADH)는 혐기 조건 하에서 37±1℃에서 배양하였다. 배양 중 일정 시간 간격으로 시료를 채취하여 탁도(optical density)를 측정함으로써 미생물의 생육도를 조사하였다. 시험은 각각 2 반복으로 수행한 후 결과치를 평균하였다. 각 배지를 시약용 포도당으로 제조하여 대조구를 만든 다음 동일한 방법으로 발효시험을 수행하고 그 결과를 표 4 내지 6에 나타내었다.

배양시간	대장균 XB 배양액의 탁도 변화
배양시간	포도당대조구	발효당 1	발효당 2	발효당 3
0	0.05	0.39	0.37	0.63
24	2.30	2.69	1.98	0.63
48	2.21	3.47	2.82	1.28
72	2.33	3.63	3.01	1.91
96	2.36	-	3.28	2.03

배양시간	락토바실러스 파라카세이 13169 배양액의 탁도 변화
배양시간	포도당대조구	발효당 1	발효당 2	발효당 3
0	0.20	0.46	0.55	0.48
24	2.23	5.87	6.54	6.35
48	2.54	6.88	7.50	6.86
72	2.70	7.09	7.86	6.57
96	2.80	-	-	7.77

배양시간	클로스트리듐 베이제린키 N8052(pKBE4112ADH) 배양액의 탁도 변화
배양시간	대조구	발효당 1	발효당 2	발효당 3
0	0.03	0.26	0.27	0.53
24	1.30	0.45	0.31	0.54
48	2.38	2.84	0.34	1.29
72	3.50	3.03	0.34	2.87
96	3.31	-	0.34	3.13

상기 표 4에서 보는 바와 같이 대장균 XB는 시약용 포도당으로 조제한 대조구보다 발효당 1에서 우수한 생육을 나타내었다. 대장균 XB는 젖산이 소량 생성된 발효당 2에서도 대조구보다 잘 자랐지만 발효당 1보다 약간 생육이 저조하였으며, 무기염과 불순물이 가장 많은 발효당 3에서는 생육이 대조구보다 불량하였다.

한편, 표 5에서 보는 바와 같이, 락토바실러스 파라카세이 13169는 모든 발효당에서 비교적 잘 생육하여 불순물에 가장 둔감하였다.

반면, 표 6에서 보는 바와 같이, 클로스트리듐 베이제린키 N8052(pKBE4112ADH)는 젖산이 소량 생성된 발효당 2에서는 거의 자라지 않았으며, 발효당 1에서는 대조구와 거의 대등한 생육을 나타내었다. 또한, 무기염을 가장 많이 함유하는 발효당 3은 본 발명의 발효당 1에 비해 생육속도가 약간 느린 것으로 나타났다.

Claims

1) 목질계 바이오매스 조분쇄물 혹은 분말에 물을 가하고 50 내지 140℃에서 1 내지 60분간 가열한 후 탈수하는 단계;
2) 단계 1에서 얻어진 고형분에 물을 가하고 170 내지 210℃에서 1분 내지 30분간 열수전처리하는 단계;
3) 단계 2에서 얻어진 열수전처리물로부터 고액분리에 의해 전처리 결과 생성된 총 액상물 중 5 내지 30 중량%의 액상물을 포함하는 고형분을 얻는 단계;
4) 단계 3에서 얻어진 고형분을 셀룰라아제 복합 효소에 의해 45 내지 55℃의 고온에서 효소당화하는 단계;
5) 단계 4에서 얻어진 당화물로부터 고액분리와 추출의 반복 과정을 통해 당 용액을 회수하는 단계; 및
6) 단계 5에서 얻어진 당 용액을 여과, 농축, 및 불순물을 제거하는 단계
를 포함하는, 목질계 바이오매스로부터 산업용 미생물의 발효에 유용한 당을 제조하는 방법.

제1항에 있어서, 단계 1의 목질계 바이오매스 조분쇄물 혹은 분말 및 물이 1:4 내지 1:20의 중량비로 사용되는 것을 특징으로 하는, 목질계 바이오매스로부터 산업용 미생물의 발효에 유용한 당을 제조하는 방법.

삭제

제1항에 있어서, 단계 2의 온도 및 반응시간이 단계 2로부터 얻은 전처리물 모두를 효소당화하였을 때 헤미셀룰로오스 당의 수율이 최대가 되게 하는 범위인 것을 특징으로 하는, 목질계 바이오매스로부터 산업용 미생물의 발효에 유용한 당을 제조하는 방법.

제1항에 있어서, 단계 3의 고액분리가 원심여과, 흡인여과 및 가압여과에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 목질계 바이오매스로부터 산업용 미생물의 발효에 유용한 당을 제조하는 방법.

삭제

제1항에 있어서, 단계 3 이후에 별도의 멸균 처리 공정을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 목질계 바이오매스로부터 산업용 미생물의 발효에 유용한 당을 제조하는 방법.

제1항에 있어서, 단계 5의 당용액의 회수가 회분식 혹은 연속식 원심분리, 필터프레스(filter press) 또는 스크류 프레스(screw press)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 목질계 바이오매스로부터 산업용 미생물의 발효에 유용한 당을 제조하는 방법.

제1항에 있어서, 단계 6의 당용액 여과, 농축, 및 불순물의 제거에 역삼투막을 포함하는 막분리 기술을 적용하는 것을 특징으로 하는, 목질계 바이오매스로부터 산업용 미생물의 발효에 유용한 당을 제조하는 방법.

제1항에 있어서, 단계 6에서 얻어진 당이 포도당을 30% 이상 함유하는 것을 특징으로 하는, 목질계 바이오매스로부터 산업용 미생물의 발효에 유용한 당을 제조하는 방법.

제1항에 있어서, 단계 6에서 얻어진 당이 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 베이제린키(Clostridium beijerinckii), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 에스피(Lactobacillus sp.) 및 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물의 배양에 사용되는 것을 특징으로 하는, 목질계 바이오매스로부터 산업용 미생물의 발효에 유용한 당을 제조하는 방법.