PT106959B

PT106959B - Processos para a produção de glicolípidos microbianos do tipo manosileritritolípidos, a partir de materiais lenhocelulósicos e suas aplicações

Info

Publication number: PT106959B
Application number: PT106959A
Authority: PT
Inventors: Simões Da Fonseca César; Ricardo Faria Nuno; Castelo Alves Ferreira Frederico
Original assignee: Inst Superior Tecnico; Laboratorio Nac De Energia E Geologia
Priority date: 2013-05-17
Filing date: 2013-05-17
Publication date: 2020-04-20
Also published as: PT106959A; WO2014185805A1; US20160083757A1

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DE GLICOLÍPIDOS MICROBIANOS, DO TIPO MANOSILERITRITOLÍPIDOS (MEL), A PARTIR DE FONTES DE CARBONO DE ORIGEM LENHOCELULÓSICA. ESTES PROCESSOS SÃO CARACTERIZADOS POR UTILIZAR MATERIAIS LENHOCELULÓSICOS E POR ESTAREM ENVOLVIDOS NA FERMENTAÇÃO PREFERENCIALMENTE FUNGOS DO GÉNERO PSEUDOZYMA OU OUTROS MICRORGANISMOS COMO FUNGOS OU BACTÉRIAS GENETICAMENTE MODIFICADOS E POR SE PRODUZIREM GLICOLÍPIDOS MICROBIANOS DO TIPO MEL. OS PROCESSOS DE PRODUÇÃO DE GLICOLÍPIDOS MICROBIANOS DO TIPO MEL INCLUEM TRÊS ETAPAS: PRÉ-TRATAMENTO DO MATERIAL LENHOCELULÓSICO; HIDRÓLISE ENZIMÁTICA; E FERMENTAÇÃO. A HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E A FERMENTAÇÃO PODEM DECORRER DE FORMA SEQUENCIAL OU EM SIMULTÂNEO COM O AUXÍLIO DE ENZIMAS EXÓGENAS, OU EM SIMULTÂNEO COM ENZIMAS PRODUZIDAS PELO PRÓPRIO MICRORGANISMO. OS GLICOLÍPIDOS MICROBIANOS PRODUZIDOS TÊM APLICAÇÃO PARA PRODUTOS: BIOSURFACTANTES; ANTIMICROBIANOS; ANTICANCERÍGENOS; PARA REGENERAÇÃO EPITELIAL; PARA ESTABILIZAÇÃO E/OU PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS OU VACINAS; PARA ADMINISTRAÇÃO DE FÁRMACOS E GENES; ANTICONGELANTES.

Description

PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DE GLICOLIPIDOS MICROBIANOS DO TIPO MANOSILERITRITOLÍPIDOS, A PARTIR DE MATERIAIS LENHOCELULÓSICOS E SUAS APLICAÇÕES

Campo da invenção

Campo técnico em que a invenção se insere

A presente invenção refere-se a processos de produção de glicolipidos microbianos, do tipo manosileritritolipidos (MEL), a partir fontes de carbono de origem lenhocelulósica, que compreendem celulose e hemicelulose.

A sintese biológica de ácidos gordos tipicamente resulta em lipidos com cadeias de 16 e 18 carbonos, sendo o ácido palmitico e o ácido esteárico os ácidos gordos saturados mais abundantes na natureza, servindo de reserva energética e precursores de componentes celulares como por exemplo fosfolipidos e glicolipidos. Os glicolipidos microbianos têm propriedades únicas por serem constituídos por uma componente glicosidica hidrofilica e uma componente lipidica hidrofóbica. Estas caracteristicas conferem propriedades biosurfactantes aos glicolipidos que são dependentes, entre outros factores, do comprimento da(s) cadeia(s) lipidica(s). A componente lipidica dos glicolipidos microbianos tem tamanho variável e depende do glicolipido formado e do microrganismo que o sintetiza. Assim: os soforolipidos e os celobiolipidos contêm cadeias lipidicas de 16 e 18 carbonos; os ramnolipidos e os manosileriteritolipidos contêm cadeias lipidicas curtas de 6 a 16 carbonos; e os trealolipidos contêm cadeias lipidicas de tamanho variável, tipicamente superiores a 16 carbonos, podendo atingir cerca de 50 carbonos (1) . A produção microbiana de glicolipidos está descrita usando como fonte de carbono óleos, alcanos e, em alguns casos, glicerol ou glucose (1).

O uso de óleos como substrato apresenta problemas no que respeita ao processo tecnológico de produção de glicolipidos, nomeadamente no que se refere aos passos de separação do produto do caldo fermentativo, mais especificamente os glicolipidos dos óleos residuais (1).

Por outro lado, os substratos tipicamente usados para a produção de glicolipidos não contribuem para a sustentabilidade do processo e do produto, pois têm valor comercial elevado (e.g. glucose), competem diretamente com a cadeia de valor alimentar e/ou resultam de culturas vegetais dedicadas com elevado impacto ambiental no uso dos solos para cultivo (e.g. óleos de culturas de soja).

A presente invenção refere-se a processos para a produção de glicolipidos microbianos, do tipo MEL, a partir de fontes de carbono de origem lenhocelulósica. Estas fontes de carbono, obtidas a partir de resíduos agrícolas, florestais e/ou agro-industriais, têm baixo valor comercial e representam uma das opções mais sustentáveis para a produção de produtos de valor acrescentado, como é o caso dos glicolipidos microbianos.

Os referidos processos de produção de glicolipidos microbianos incluem três etapas: pré-tratamento do material lenhocelulósico; hidrólise enzimática; fermentação. A hidrólise enzimática e a fermentação podem decorrer de forma sequencial ou em simultâneo com o auxílio de enzimas exógenas, ou em simultâneo com enzimas produzidas pelo próprio microrganismo. Os microrganismos preferenciais na produção destes glicolipidos são leveduras do género Pseudozyma.

Os glicolipidos assim produzidos poderão ter aplicações em medicina e nas indústrias farmacêutica, química, cosmética, biotecnológica, alimentar, nutracêutica. Estes glicolipidos têm atividade antimicrobiana especificamente contra bactérias gram positivas, atividade indutora de apoptose e/ou diferenciação de células animais, recuperação de viabilidade celular em modelos celulares epiteliais, afinidade elevada para glicoproteínas com potencial aplicação em purificação imunoglobulinas humanas, capacidade de formação de vesículas termodinamicamente estáveis com potencial aplicação em entrega de fármacos e genes e propriedades anticongelantes (1).

Estado da técnica

Os manosileretritolípidos (MEL) são glicolipidos compostos por uma componente glicosídica de manosileritritol, que pode estar desacetilada, ou mono- ou di-acetilada, e com uma componente lipídica tipicamente contendo duas cadeias de 6 a 14 carbonos ligadas à componente glicosídica (2) . Estes glicolipidos são produzidos por fungos dos géneros Pseudozyma e Ustilago (3) . A sua aplicação como biosurfactante é extensa, podendo ser usado em medicina, indústrias farmacêuticas, química, cosmética, biotecnológica, alimentar, nutracêutica (2,4) .

substrato mais usado para produção de MEL por estirpes do género Pseudozyma é o óleo de soja. Outros substratos descritos como adequados para a produção de MEL são óleo de girassol, glicerol e alcanos (5,6,7).

pedido internacional W02004/0020647 refere um processo de produção de glicolipidos que utiliza óleo de soja como substrato (8). No entanto, o uso de óleo de soja, bem como outros óleos, apresenta problemas adicionais no que respeita ao processo tecnológico, mas também no que diz respeito à sustentabilidade do processo e produto. A presença de óleo nas fermentações, bem como os seus produtos de degradação, dificultam os processos de recuperação e purificação do glicolipido produzido, necessitando do recurso adicional a vários passos de extração com solventes orgânicos e que torna o processo mais complexo, com consequente perda de rendimento de recuperação do glicolipido. Não obstante, os óleos vegetais, como o óleo de soja, são também usados na indústria alimentar, significando assim que o seu uso compete diretamente com a cadeia de abastecimento alimentar. Ainda, o uso de culturas vegetais dedicadas para a produção de óleo torna estes substratos pouco sustentáveis de acordo com os atuais critérios de sustentabilidade, os quais incluem as emissões de gases com efeito de estufa relacionados com o uso dos solos para culturas dedicadas.

uso de substratos solúveis em água é uma alternativa para a produção de glicolipidos, com vantagens nos processos de recuperação. Nesse sentido, o uso de glucose como fonte de carbono para a produção de manosileritritolipido já foi reportado (9), com vantagens nos processos de recuperação do glicolipido a partir do caldo fermentativo.

material lenhocelulósico, especificamente a celulose e a hemicelulose, que durante o pré-tratamento e/ou hidrólise enzimática é convertido em mono-, di- ou oligossacáridos, como por exemplo celodextrinas, xilo-oligossacáridos, celobiose, xilobiose, D-glucose, D-manose, D-galactose, Dxilose e L-arabinose, é um substrato que, para além de pouco dispendioso, renovável, com baixos custos de energia, é composto por açúcares fermentáveis. Dependendo da natureza e respetiva composição dos materiais lenhocelulósicos podem ser usados diferentes processos de pré-tratamento físico e/ou químico, com ou sem adição de ácidos, bases, solventes orgânicos e/ou água combinando diferentes temperaturas e tempos de reação, normalmente entre 100 e 250°C e tempos entre 10 e 30 minutos. Dependendo do tipo de material e pré-tratamento, as frações ricas em açúcares, como a celulose e a hemicelulose são libertadas e hidrolisadas com maior ou menor extensão (10). Alguns materiais lenhocelulósicos podem até dispensar o passo de pré-tratamento. A celulose e hemicelulose e/ou respetivos hidrolisados, podem ser sujeitos a hidrólise enzimática resultando em açúcares livres fermentáveis, por exemplo mono- di- ou oligossacáridos, celodextrinas, xilooligossacáridos, celobiose, xilobiose, D-glucose, D-manose, D-galactose, D-xilose e L-arabinose entre outros (10).

Os resíduos lenhocelulósicos, nomeadamente de origem agrícola, florestal ou agro-industrial, são, de facto, uma opção sustentável e de crescente interesse económico e ambiental para a produção de biocombustíveis, biopolímeros e outros bioprodutos, um conceito de biorrefinaria onde se poderá incluir a produção de biosurfactantes, e mais especificamente de glicolípidos (11,12, 13) .

Sumário da invenção

A presente invenção refere-se a processos para a produção de glicolipidos microbianos, do tipo manosileritritolipidos (MEL), a partir de fontes de carbono de origem lenhocelulósica que compreendem, mas não se limitam a celulose, hemicelulose ou mono-, di- ou oligossacáridos resultantes das suas hidrólises, como por exemplo celodextrinas, xilo-oligossacáridos, celobiose, xilobiose, D-glucose, D-manose, D-galactose, D-xilose e L-arabinose.

processo de produção de glicolipidos tem três etapas: o pré-tratamento do material lenhocelulósico; a hidrólise enzimática; e a fermentação. A hidrólise enzimática e o processo fermentativo podem decorrer: (i) de forma sequencial, em vasos reacionais diferentes ou no mesmo vaso reacional com o auxilio de enzimas exógenas; (ii) simultaneamente no mesmo vaso reacional, sem adição de enzimas exógenas, ou seja, por ação das enzimas endógenas do microrganismo utilizado no processo fermentativo ou (iii) simultaneamente, no mesmo vaso reacional, com adição de enzimas exógenas.

objetivo da presente invenção carbono renováveis e de baixo material lenhocelulósico, na glicolipidos microbianos do tipo é o de utilizar fontes de valor comercial, como o produção sustentável de MEL.

Descrição detalhada da invenção

A presente invenção refere-se a processos de produção de glicolipidos microbianos, do tipo manosileritritolipidos (MEL) a partir fontes de carbono renováveis e de baixo valor comercial, como as de origem lenhocelulósica, que compreendem celulose e hemicelulose.

Os MEL são caracterizados por possuir uma componente glicosídica do tipo manosileritritol, ou variantes acetiladas, à qual estão ligadas, tipicamente, duas cadeias lipídicas compostas por 6 a 14.

Os processos de produção de MEL são caracterizados por utilizar materiais lenhocelulósicos que compreendem, mas não se limitam a palha de trigo, palha de cana, folhelho/palha de milho, corolo de milho, palha de arroz, casca de arroz, palha de sorgo, palha de sorgo doce, palha de cevada, palha de aveia, palha de centeio, palha de triticale, casca de algodão, palha de café, casca de café, bambu, madeira de pinheiro, casca de pinheiro, outras madeiras de coníferas (cipreste, cedro, araucária, abeto, píceas, espruces), madeira de eucalipto, casca de eucalipto, outras madeiras de angiospérmicas (freixo, faia, bétula, choupo, carvalho, salgueiro, bordo, oliveira), biomassa herbácea (feno, capim, sargaço), bagaço de cana, bagaço de azeitona, dreche cervejeira (bagaço de cevada), resíduos da indústria transformadora de madeira (aparas de madeira, cerradura), resíduos de papel (jornais, papel de escritório), lamas de papel reciclado, resíduos da indústria produtora de pasta e papel (lamas primárias, licores de sulfito) e resíduos sólidos municipais.

Os processos de produção de glicolípidos incluem três etapas. A primeira etapa diz respeito ao pré-tratamento do material lenhocelulósico, por forma a aumentar a acessibilidade da celulose e/ou hemicelulose às enzimas hidrolíticas utilizadas na segunda etapa; a utilização de alguns materiais lenhocelulósicos poderá dispensar o primeiro passo. A segunda etapa diz respeito à hidrólise enzimática das componentes de celulose e hemicelulose pro enzimas celuloliticas e/ou hemiceluloliticas. A terceira etapa diz respeito à fermentação, utilizando preferencialmente fungos do género Pseudozyma. Consideramse três tipos de configurações do processo na produção de glicolipidos do tipo MEL, no que diz respeito à segunda e terceira etapas, hidrólise enzimática e fermentação, respetivamente: (i) Hidrólise e fermentação em separado (SHF - separated hydrolysis and fermentation) , onde a segunda e terceira etapas ocorrem de forma sequencial em vasos reacionais diferentes ou no mesmo vaso, e onde as condições ótimas para cada etapa são usadas de forma a otimizar cada etapa individualmente e a interação entre estas; (ii) Sacarificação e fermentação simultâneas (SSF simultaneous saccharification and fermentation) , no qual a segunda e terceira etapas ocorrem em simultâneo no mesmo vaso reacional, com vantagens inerentes à intensificação de processo como por exemplo a de poder reduzir a inibição pelo produto da hidrólise enzimática devido ao consumo simultâneo do mesmo durante a fermentação, e a de poder reduzir o tempo do processo em relação ao SHF, no entanto podendo comprometer a operação nas condições ótimas para cada um das etapas individuais; (iii) Processo de bioconversão consolidada (CBP - consolidated bioprocessing), no qual a segunda e terceira etapas ocorrem em simultâneo no mesmo vaso reacional, mas sem adição de enzimas exógenas, tirando proveito de enzimas produzidas pelo próprio microrganismo.

Na presente invenção podem ser usados diferentes processos de pré-tratamento fisico e/ou quimico, com ou sem adição de ácidos, bases, solventes orgânicos e/ou água combinando diferentes temperaturas e tempos de reação, normalmente entre 100 e 250°C e tempos de residência que, dependendo do processo, variam entre 0 e 300 minutos.

O material lenhocelulósico, especificamente os polissacáridos celulose e hemicelulose, que após o prétratamento com ácidos, bases, solventes orgânicos e/ou água, e/ou hidrólise enzimática são convertidos em mono-, di- ou oligossacáridos, como por exemplo celodextrinas, xilo-oligosacáridos, celobiose, xilobiose, D-glucose, Dmanose, D-galactose, D-xilose e L-arabinose, que por sua vez são utilizados como fonte de carbono para a fermentação.

Quando enzimas exógenas ou suas misturas são utilizadas no processo pode ou não existir a necessidade de ocorrer uma etapa de purificação, por exemplo por um processo de membrana, tal como diálise, de forma a remover compostos inibitórios da atividade celular, multiplicação celular e/ou bioconversão, dos fungos usados.

O processo fermentativo da presente invenção pode utilizar microrganismos, neste caso, fungos de diferentes géneros, que compreendem, mas não se limitam a Pseudozyma, Ustilago, Sporisorium, Moesziomyces, Macalpinomyces, preferencialmente do género Pseudozyma, e mais preferencialmente das espécies Pseudozyma antarctica e Pseudozyma aphidis, ou suas variantes geneticamente modificadas, ou outros microrganismos como fungos ou bactérias geneticamente modificados que compreendem, mas não se limitam aos géneros Saccharomyces, Pichia, Pseudozyma, Ustilago, Escherichia e Bacillus.

Os glicolipidos microbianos do tipo MEL são produzidos por fungos, preferencialmente do género Pseudozyma, e mais preferencialmente das espécies Pseudozyma antarctica e Pseudozyma aphidis, a partir de material lenhocelulósico, em condições aeróbias, a temperaturas entre 4-40°C, preferencialmente a 27°C, usando uma fonte de azoto, preferencialmente nitrato, em modo descontínuo ou semidescontínuo. A hidrólise enzimática e o processo fermentativo podem ocorrer de forma sequencial, em vasos reacionais diferentes ou no mesmo vaso, ou simultaneamente no mesmo vaso reacional com ou sem adição de enzimas exógenas, que incluem mas não se limitam a celulases, celobio-hidrolases, glucosidases, xilanases, xilosidases e arabinofuranosidase. A adição de enzimas exógenas pode ser minimizada devido à capacidade dos microrganismos produzirem as próprias enzimas hidrolíticas.

Com vista à aplicação industrial, para produção de MEL, este processo apresenta as seguintes vantagens comparativamente a outros processos já existentes:

- Possibilidade de produção de glicolipidos, do tipo MEL, a partir de fontes de carbono de baixo custo e sustentáveis como são os materiais lenhocelulósicos: palha de trigo, bagaço de cana, palha de cana, palha de milho, palha de arroz, casca de arroz, dreche cervejeira, lamas da pasta de papel.

- Para além da glucose proveniente da celulose, este processo permite converter uma fração da biomassa lenhocelulósica, a xilose resultante da hemicelulose, em glicolipidos com rendimentos semelhantes aos descritos para a glucose.

- Os microrganismos com capacidade de produção de glicolipidos do tipo MEL podem ser utilizados como produtores das suas próprias enzimas hidroliticas que incluem mas não se limitam a xilanases e xilosidases, reduzindo o custo da adição de enzimas exógenas para o processo de hidrólise enzimática.

- Comparativamente com o processo de produção de glicolipidos a partir de óleos, nomeadamente o óleo de soja, a produção de glicolipidos do tipo MEL a partir de açúcares permite a separação da fração dos glicolipidos do meio de cultura de forma mais eficiente.

- Comparativamente com glicolipidos intracelulares ou constituintes da membrana celular, estes são excretados, oferecendo vantagens ao nivel do aumento do rendimento e isolamento destes do caldo fermentativo.

Exemplos

1. Produção de glicolipidos a partir de xilose

l.A. Pré-cultura para crescimento celular.

Meio:

Glucose, 40 g/L;

NaNO₃, 3 g/L;

KH₂PO₄, 0,3 g/L;

MgSO₄.7H₂O, 0,3 g/L;

Extrato de levedura, 1 g/L;

Todos os compostos foram preparados em soluções concentradas e autoclavados a 121°C por 20 minutos. Após arrefecer, os referidos compostos foram adicionados, juntamente com água destilada estéril, num balão de Erlenmeyer estéril de forma a perfazer as concentrações descritas anteriormente, em condições de assepsia. 0 meio foi inoculado com biomassa de Pseudozyma antarctica PYCC 5084^T fornecido pela Coleção Portuguesa de Culturas de Leveduras (PYCC), CREM, FCT/UNL, e inoculado durante 2 dias em condições aeróbias, com agitação constante e à temperatura de fermentação de 27°C.

l.B. Processo fermentativo para produção de glicolípidos

Meio:

Xilose, 40 g/L;

KH₂PO₄, 0,3 g/L;

MgSO₄.7H₂O, 0,3 g/L;

Extrato de levedura, 1 g/L;

O meio de cultura para o processo fermentativo foi preparado em água estéril, com pH inicial igual a 6. O meio de cultura foi inoculado com 10% (v/v) da pré-cultura preparada em I.A., e incubado em condições aeróbias, com agitação constante e à temperatura de 27°C, durante 14 dias. A biomassa foi quantificada através das medições do peso da biomassa seca. A cultura atingiu o seu valor máximo de biomassa (aprox. 10 g/L) às 48 horas, a partir da qual se manteve constante. A produção de MEL foi quantificável ao fim de 4 dias, atingindo o valor máximo, ao dia 14, igual a 4,5 g/L (valor médio de 3 experiências), e um rendimento de 0,11 (gMEL/gsubstrato) < representando aproximadamente 30% do valor máximo teórico esperado.

2. Produção de glicolipidos a partir de misturas de glucose e xilose

2.A. Pré-cultura

A pré-cultura foi preparada como descrito em l.A.

2.B. Processo fermentativo para produção de glicolipidos

Meio:

Xilose, 20 g/L;

Glucose, 20 g/L;

KH₂PO₄, 0,3 g/L;

MgSO₄.7H₂O, 0,3 g/L;

Extrato de levedura, 1 g/L;

O meio de cultura para o processo fermentativo foi preparado em água estéril, com pH inicial igual a 6. No entanto, foi usada uma mistura de xilose e glucose como substrato, representando os monossacáridos mais abundantes na constituição da maioria do material lenhocelulósico. O meio de cultura foi inoculado com 10% (v/v) da pré-cultura preparada em 2.A., e incubado em condições aeróbias, com agitação constante e à temperatura de 27°C, durante 14 dias. A produção de MEL foi quantificável ao fim de 4 dias, atingindo o valor máximo, ao dia 14, igual a 4,6 g/L, e um rendimento de 0,12 (gMEL/gsubstrato) , representando aproximadamente 30% do valor máximo teórico esperado.

3. Produção de glicolipidos a partir de glucose com adição de substrato ao dia 4 de fermentação

3.A. Pré-cultura

A pré-cultura foi preparada como descrito em l.A.

3.B. Processo fermentativo para produção de glicolipidos

Meio:

Glucose, 40 g/L;

KH₂PO₄, 0,3 g/L;

MgSO₄.7H₂O, 0,3 g/L;

Extrato de levedura, 1 g/L;

NaNO₃, 3 g/L;

O meio de cultura para o processo fermentativo foi preparado em água estéril, com pH inicial igual a 6. O meio de cultura foi inoculado com 10% (v/v) da pré-cultura preparada em 3.A., e incubado em condições aeróbias, com agitação constante e à temperatura de 27°C, durante 14 dias. A biomassa foi quantificada através das medições do peso da biomassa seca. A cultura atingiu o seu valor máximo de biomassa (aprox. 10 g/L) às 48 horas, a partir da qual se manteve constante até ao dia 4. Ao dia 4, foi adicionada glucose (40 g/L) aos cerca de 7 g/L ainda presentes em cultura. A produção de MEL foi quantificável ao fim de 4 dias (ao tempo da adição), aumentando gradualmente até ao dia 14, atingindo 8,3 g/L de MEL, valor superior aos 5,0 g/L obtidos em 14 dias em culturas sem adição ao dia 4 (condições do exemplo 1, usando glucose, em vez de xilose, como fonte de carbono).

4.Produção de glicolipidos a partir de celulose em SHF

4.A. Pré-cultura

A pré-cultura foi preparada como descrito em l.A.

4.B. Preparação solução de enzimas

Para as fermentações em SHF foi preparada uma solução de enzimas exógenas contendo as misturas enzimáticas comerciais Celluclast 1.5L e Novozyme 188 (Novozymes), descritas como dispondo atividade enzimáticas que incluem mas não se limitam a celulase, celobio-hidrolase e betaglucosidase, respetivamente. A solução de enzimas foi preparada numa concentração 3 vezes superior à concentração a usar em fermentação, 0,25% (v/v) e 1,75% (v/v) respetivamente. A solução de enzimas foi dialisada durante 24 horas a 4°C de forma a eliminar possíveis inibidores ao crescimento presentes nas misturas enzimáticas comerciais.

4.C. Hidrólise enzimática da celulose

O processo de bioconversão em SHF iniciou-se com a hidrólise enzimática da celulose (40 g/L) na presença de uma solução de enzimas, preparada como descrita no ponto B. O processo de hidrólise enzimática decorreu com agitação constante e à temperatura de 50°C, durante 48 horas.

4.D. Processo fermentativo para produção de glicolipidos em SHF

Findo o processo descrito em 4.C., O processo de bioconversão em SHF prosseguiu com a adição dos restantes constituintes do meio de fermentação à solução proveniente do processo de hidrólise do ponto 4.C., com as seguintes concentrações finais:

Fonte de carbono (celulose adicionada no ponto 4.D.), 40 g/L;

KH₂PO₄, 0,3 g/L;

MgSO₄.7H₂O, 0,3 g/L;

Extrato de levedura, 1 g/L

O meio para o processo fermentativo foi preparado em água estéril, com pH inicial igual a 6. O meio de cultura foi inoculado com 10% (v/v) da pré-cultura preparada em 4.A. e incubado em condições aeróbias, com agitação constante e à temperatura de 27°C, durante 10 dias. O processo descrito em 4.C. permitiu que se obtivessem 25,2 g/L de glucose (por hidrólise da celulose), sendo este o valor de açúcar fermentável que a cultura possuía como valor inicial no passo de fermentação, não obstante a hidrólise da celulose possa continuar embora com menor eficiência. A produção de MEL foi quantificável ao fim de 4 dias, atingindo o valor máximo ao dia 10, 4,2 g/L de MEL.

5. Produção de glicolípidos a partir de celulose em SSF

5.A. Pré-cultura

A pré-cultura foi preparada como descrito em 4.A.

5.B. Preparação da solução de enzimas

Para as fermentações em SHF, foi preparada uma solução de enzimas exógenas contendo as misturas enzimáticas comerciais Celluclast 1,5 L e Novozyme 188 (Novozymes), como descrito em 4.B.

5. C. Processo fermentativo para produção de glicolípidos em SSF

Meio:

Celulose, 40 g/1

KH₂PO₄, 0,3 g/L

MgSO₄.7H₂O, 0,3 g/L

Extrato de levedura, 1 g/L

O processo de bioconversão em SSF não contou com o passo de hidrólise enzimática a 50°C. Em vez, a hidrólise enzimática e a fermentação foram iniciadas com simultânea adição da solução de enzimas preparada em 7.C. e do inoculo composto por 10% (v/v) da pré-cultura preparada em 7.A., com incubação em condições aeróbias, com agitação constante e à temperatura de 27°C, durante 10 dias. A produção de MEL foi quantificável ao fim de 4 dias, atingindo o valor máximo ao dia 10, 2,94 g/L de MEL.

6. Produção de glicolipidos a partir de xilano/hemicelulose sem adição de enzimas exógenas em CBP

6.A. Pré-cultura

A pré-cultura foi preparada como descrito em l.A.

6.B. Processo fermentativo para produção de glicolipidos em SHF

Meio :

Xilano, 40 g/L;

KH₂PO₄, 0,3 g/L;

MgSO₄.7H₂O, 0,3 g/L;

Extrato de levedura, 1 g/L;

O meio para o processo fermentativo foi preparado em água estéril, com pH inicial igual a 6. O meio de cultura foi inoculado com 10% (v/v) da pré-cultura preparada em 5.A. e incubado em condições aeróbias, com agitação constante e à temperatura de 27°C, durante 10 dias. O processo descrito no exemplo anterior abrangia a utilização de misturas de enzimas exógenas permitindo que as fermentações decorressem com concentrações iniciais de açúcar fermentável superiores a 20 g/L (SHF). O processo descrito no presente exemplo não conta com a adição de misturas de enzimas exógenas, explorando o potencial hidrolitico das células. Foi verificada uma acumulação de 2,9 g/L de xilose ao fim de 48 horas, denotando a capacidade das células em hidrolisar xilano em açúcares simples. A produção de MEL foi quantificável ao fim de 4 dias, atingindo o valor máximo ao dia 10, 1,0 g/L de MEL.

7. Produção de glicolipidos a partir de palha de trigo (resíduo agrícola) (SHF)

7.A. Pré-cultura

A pré-cultura foi preparada como descrito em l.A. No entanto, a espécie usada foi P. aphidis em vez de P. antarctica.

7.Β. Preparação do substrato

A palha de trigo foi submetida a um pré-tratamento de autohidrólise num reator Parr. A proporção entre substrato e água no reator de 1:7 e a média da taxa de aumento de temperatura no reator foi de 6°C por minuto e agitação de 150 rpm. Uma vez atingida a temperatura de 210°C o reator foi arrefecido usando água fria a circular em serpentina e o reator colocado em banho de gelo. O conteúdo do reator arrefeceu até aos 100°C em 1 minuto e 30 segundos. Depois do arrefecimento o material foi filtrado para a recuperação das frações sólidas e liquidas. A fração sólida, rica em celulose, foi usada para os processos seguintes de bioconversão. A quantidade total de glucanos e xilanos presentes na fração sólida foi de 0,59 e 0,11 (g/g), respetivamente.

7.C. Preparação solução de enzimas

Para as fermentações em SHF, foi preparada uma solução de enzimas exógenas contendo as misturas enzimáticas comerciais Celluclast 1.5L e Novozyme 188 (Novozymes), como descrito em 4.B.

7.D Hidrólise enzimática da fração sólida da palha de trigo.

O processo de bioconversão em SHF iniciou-se com a hidrólise enzimática da fração sólida de palha de trigo (7% (p/v) - peso de massa seca por volume final do processo fermentativo descrito em 6.E) preparada em 6.B., na presença de uma solução de enzimas preparada como descrita no ponto 6.C. O processo de hidrólise enzimática decorreu com agitação constante e à temperatura de 50 °C, durante 48 horas.

7.E. Processo fermentativo para produção de glicolipidos em SHF .

O processo de bioconversão em SHF prosseguiu com a adição dos restantes constituintes do meio de fermentação à solução proveniente do processo de hidrólise do ponto 6.D., com as seguintes concentrações finais:

Fonte de carbono (celulose adicionada no ponto 6.D.), 40 g/L;

KH₂PO₄, 0,3 g/L;

MgSO₄.7H₂O, 0,3 g/L;

Extrato de levedura, 1 g/L;

O meio para o processo fermentativo foi preparado em água estéril, com pH inicial igual a 6. O meio de cultura foi inoculado com 10% (v/v) da pré-cultura preparada em 6.A. e incubado em condições aeróbias, com agitação constante e à temperatura de 27°C, durante 10 dias. O processo descrito em 6.D. permitiu que se obtivessem 24,8 g/L de glucose, sendo este o valor de açúcar fermentável que a cultura possuia como valor inicial no passo de fermentação, não obstante a hidrólise da fração de palha de trigo possa continuar, embora com menor eficiência. A produção de MEL foi quant if icável ao fim de 4 dias, atingindo o valor máximo ao dia 10, 0,8 g/L de MEL.

8. Produção de glicolipidos a partir de palha de trigo (resíduo agrícola) em SSF

8.A. Pré-cultura

A pré-cultura foi preparada como descrito em 6.A.

8. B. Preparação do substrato

A preparação do substrato foi realizada como descrito em 8 .B.

8.C. Preparação solução de enzimas

8.D. Processo fermentativo para produção de glicolipidos em SSF

Meio:

Fração sólida palha de trigo, 7% (p/v) (peso de massa seca por volume final)

KH₂PO₄, 0,3 g/L

MgSO₄.7H₂O, 0,3 g/L

Extrato de levedura, 1 g/L

O processo de bioconversão em SSF não contou com o passo de hidrólise enzimática a 50°C. Em vez, a hidrólise enzimática e a fermentação foram iniciadas com simultânea adição da solução de enzimas preparada em 7.C. e do inoculo composto por 10% (v/v) da pré-cultura preparada em 7.A., com incubação em condições aeróbias, com agitação constante e à temperatura de 27°C, durante 10 dias. Em processo de SSF foi possivel observar a acumulação de 6 g/L de glucose ao fim de 48 horas, sendo fermentado nos dias seguintes. A produção de MEL foi quantificável ao fim de 4 dias, atingindo o valor máximo ao dia 10, 1,2 g/L de MEL.

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Claims

1. Processo para a produção de glicolípidos microbianos, do tipo manosileritritolipidos, caracterizado por:

a) utilizar fontes de carbono de origem lenhocelulósica que compreendem, mas não se limitam a celulose, hemicelulose ou mono-, di- ou oligossacáridos resultantes das suas hidrólises

como por exemplo, celodextrinas, xilooligosacáridos, celobiose, xilobiose, D- glucose, D-manose, D-galactose, D-xilose e L- arabinose; b) utilizar fungos de diferentes géneros, que compreendem, mas não se limitam a Pseudozyma, Ustilago, Sporisorium, Moesziomyces, Macalpinomyces, bem como fungos ou bactérias

geneticamente modificados que compreendem, mas não se limitam aos géneros Saccharomyces, Pichia, Pseudozyma, Ustilago, Escherichia e Bacillus;

c) utilizar três etapas, com pré-tratamento, hidrólise enzimática e fermentação, em que as duas últimas acontecem sequencialmente em separado ou simultaneamente, com ou sem adição de enzimas exógenas ou suas misturas.

2. Processo para a produção de glicolípidos microbianos, do tipo manosileritritolipidos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os materiais lenhocelulósicos utilizados compreenderem, mas não se limitarem a palha de trigo, bagaço de cana, palha de cana, palha de milho, palha de arroz, casca de arroz, dreche cervejeira, lamas da pasta de papel.

3. Processo para a produção de glicolípidos do tipo manosileritritolípidos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os microrganismos preferenciais na bioconversão serem do género Pseudozyma.

4. Processo para a produção de glicolípidos microbianos do tipo manosileritritolípidos, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por os microrganismos preferenciais na bioconversão serem Pseudozyma antarctica, Pseudozyma aphidis ou as suas variantes geneticamente modificadas.

5. Processo para a produção de glicolípidos microbianos do tipo manosileritritolípidos, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o material lenhocelulósico ser submetido a um tratamento físico e/ou químico, que compreende mas não se limita ao uso de ácidos, bases, solventes orgânicos e/ou água combinando temperaturas entre 100 a 250°C e tempos que variam entre 0 e 300 minutos.

6. Processo para a produção de glicolípidos microbianos do tipo manosileritritolípidos, de acordo com as reivindicações 1, 2 e 5 caracterizado por o material lenhocelulósico ser tratado com enzimas exógenas ou as suas misturas com atividades que compreendem mas não se limitam a celulase, celobio-hidrolase, glucosidase, xilanase, xilosidase e arabinofuranosidase.

7. Processo de acordo com reivindicação 6, caracterizado por as enzimas exógenas ou as suas misturas sofrerem uma etapa de purificação.

8. Processo para a produção de glicolípidos microbianos do tipo manosileritritolípidos, de acordo com as reivindicações 1 a 7, caracterizado por a hidrólise enzimática e o processo fermentativo decorrerem de forma sequencial em vasos reacionais diferentes, ou no mesmo vaso reacional, com a hidrólise enzimática a decorrer a temperatura entre 20 e 80°C e pH entre 3 e 7, e a fermentação a decorrer a temperatura entre 4°C e 40°C, e pH entre 3 e 7.

9. Processo para a produção de glicolípidos microbianos do tipo manosileritritolípidos, de acordo com as reivindicações 1 a 8, caracterizado por a hidrólise enzimática e o processo fermentativo decorrerem de forma sequencial em vasos reacionais diferentes, ou no mesmo vaso reacional, com a hidrólise enzimática a decorrer preferencialmente a temperatura de 50°C e pH 5,5, e a fermentação a decorrer preferencialmente a temperatura de 27°C e pH 5,5.

10. Processo para a produção de glicolípidos microbianos do tipo manosileritritolípidos, de acordo com as reivindicações 1 a 7, caracterizado por a hidrólise enzimática e o processo fermentativo ocorrerem simultaneamente no mesmo vaso reacional, a temperatura entre 4°C e 40°C e pH entre 3 e 7.

11. Processo para a produção de glicolípidos microbianos do tipo manosileritritolípidos, de acordo com as reivindicações 1 a 7 e 10, caracterizado por a hidrólise enzimática e o processo fermentativo ocorrerem simultaneamente no mesmo vaso reacional, preferencialmente a temperatura de 27°C e pH de 5,5.

12. Processo para a produção de glicolipidos microbianos do tipo manosileritritolipidos, de acordo com as reivindicações 1 a 5 e 10, caracterizado por a hidrólise enzimática ocorrer por ação das enzimas endógenas do microrganismo utilizado no processo fermentativo.

13. Processo para a produção de glicolipidos microbianos do tipo manosileritritolipidos, de acordo com as reivindicações 1 a 7, 10 e 12, caracterizado por a hidrólise enzimática ocorrer por acção combinada das enzimas endógenas do microrganismo utilizado no processo fermentativo com as enzimas exógenas ou suas misturas.