KR101402164B1 - 조류 바이오매스로부터 고품질 젖산의 생산방법 - Google Patents
조류 바이오매스로부터 고품질 젖산의 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 조류 바이오매스로부터 고품질 젖산의 생산방법에 관한 것으로, 상기 본 발명에 따른 주요 생산방법은 조류 바이오매스를 활용하기 때문에 안정적으로 자원의 지속적 공급이 가능한 장점 뿐 아니라, 생화학적/화학적 당화가 매우 용이한 특징으로 수집 후 생체를 직접 사용할 수 있고, 건조체를 이용할 때에도 특별한 전처리 없이도 높은 당화율 또는 젖산 생산성으로, 생산공정 시 환경오염물질 배출가능성도 낮아 향후 산업바이오화학제품 생산으로의 크게 기여할 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 탄수화물 고함유 조류 바이오매스로부터 고품질 젖산의 생산방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 그물말과 조류 바이오매스로부터 고농도·고품질의 단당류 및 젖산의 동시 생산방법에 관한 것이다.
석유자원의 고갈, 에너지 수요 증가, 지구온난화와 CO2 배출 문제, 환경규제 강화 등의 여러 문제에 직면한 상황에서 미래 환경과 자원고갈을 슬기롭게 대비하기 위해서는 필수적으로 생물자원(바이오매스)의 효율적 활용기술 개발이 필요하다.
상기 생물자원은 다음의 몇 가지 요인이 구비되어야 하는 바, 1) 식량 또는 사료로의 이용가치가 적어 산업적으로 대량 사용할 경우 식량가격 폭등의 우려가 낮을 것, 2) 생산성이 뛰어나거나 생산물의 산업적 가치가 높아 재배 또는 배양시 경제성이 상대적으로 높을 것, 3) 비농경지에서 재배되거나 비농업용수를 사용함으로서 농산물 생산을 위한 재배요인과 가능한 경합하지 않을 것, 4) 이산화탄소 저감 또는 환경오염을 경감시킬 수 있는 능력이 상대적으로 우수할 것 등이다.
상기 요인을 비교적 높게 만족시키는 생물자원은 조류(algae)이며, 당질/전분계 바이오매스(1세대 바이오매스), 섬유질계 바이오매스(2세대 바이오매스)와는 달리 제3세대 바이오매스로 분류되어 화학산업의 원료물질 공급원(chemical feedstocks)으로서 활발히 검토되고 있다.
조류가 바이오매스로서 보다 적합한 이유들을 볼 것 같으면(Rodolfi 등 Biotechnol. Bioeng. 102: 100-112, 2009) 첫째, 종에 따라 여러 환경조건에서도 자랄 수 있기 때문에 토지 및 기타 자원 이용 효율이 높다. 둘째, 조류는 광합성을 하며 생육주기가 짧고 성장속도가 빨라 바이오매스 생산량이 총체적으로 높다. CO2 흡수율도 높아 1 ㎡에서 열대우림은 연간 15 내지 20 ton의 CO2를 흡수하지만 같은 면적의 미세조류는 30 내지 40 ton을 흡수한다고 한다. 셋째, 조류 배양의 특별한 잇점 중의 하나는 폐이산화탄소를 이용할 수 있다는 것과 재배시 폐수(brackish water, gray water 등)를 영양분 공급원으로 활용함으로서 바이오매스 생산과 물정화 효과를 동시에 얻을 수 있다. 넷째, 조류 종중에는 탄수화물, 단백질, 지질 등 특정 성분이 상대적으로 고함량으로 존재하는 종들이 있어 이들을 잘 활용하면 산업원료물질로서의 자원화 효율이 매우 높다. 다섯째, 조류는 리그닌이 없기 때문에 섬유질계 바이오매스(리그닌 15-30% 함유)보다 전처리과정이 보다 용이한 이유에서 이다.
그러나 3 내지 4만종의 존재가 알려진 조류의 모든 종이 상기의 장점을 보유하고 있는 것은 아니기 때문에 최근 들어 많은 연구자들이 보다 이용가치가 높은 조류종의 발굴 및 개선, 조류바이오매스의 생산, 이의 활용기술 개발에 많은 노력을 투입하고 있다.
한편, 유가 상승 경험 이전 동안 조류(algae)의 산업적 응용은 건강식품 및 기능성의약품, 색소생산, 양식사료, 화장품 소재 등의 분야로(Karina 등, Comparative Biochemistry and Physiology, Part C 146: 60-78, 2007) 제한되어 왔었으나 유가상승 경험 이후의 기술개발 경향을 보면, 대체에너지원 확보를 위한 미세조류 연구가 전세계적으로 대단한 열풍으로 진행되고 있다.
주로 바이오디젤 생산기술 개발에 집중되고 있으며(Scott 등, Current Opinion in Biotechnology 21:277-286, 2010; Mata 등, Renewable and Sustainable Energy Reviews 14 : 217232, 2010), 한편 미세조류 및 해양거대조류를 이용한 바이오에탄올, 바이오부탄올 등의 생산기술이 보고되고 있다(Ge 등, Renewable Energy. 36:84-89, 2011; Harun 등, Chemical Engineering Jounal 168:1079-1084, 2011; Adams 등, J. Appl. Phycol. 21, 569574, 2009; Lee 등, J. Korean Ind. Eng. Chem. 20(3): 290-295, 2009; Isa 등, Journal of the Japan Institute of Energy, 88: 912-917, 2009; Ueno 등, Journal of Fermentation and Bioengineering. 86(1): 38-43, 1998; Brennan과 Owende, Renew. Sustain. Energy Rev. 14, 557577, 2010; Choi 등, Bioresource Technology 101: 5330-5336, 2010; 강 등, 대한민국특허 10-0908425, 2009; 김 등, 대한민국 공개특허번호 10-2009-0025221, 2009; 이 등, 대한민국 공개특허 10-2010-0125104, 2010; 장 등, 대한민국특허 10-0919299, 2009).
또한, 상기 바이오연료 이외의 분야에서는 식품 및 사료성분으로서 젖산 이용을 위해 전분 고함유 조류바이오매스의 발효 연구가 일부 보고되고 있다(Ike 등, Journal of Fermentation and Bioengineering. 84(5): 428-433, 1997).
바이오매스를 화학산업의 원료물질 공급원(chemical feedstocks)으로서 활용함에 있어서 가장 비중이 높은 물질은 탄수화물이다. 즉, 바이오매스의 전처리, 화학적 또는 생물학적 당화과정을 통해 얻어진 당용액을 발효나 화학적 전환을 통해 화학제품 생산 원료물질을 제조하게 된다. 그 중에서도 발효가 산업적으로 큰 비중을 차지하고 있으며, 발효를 통해서 생산되는 주요 화학물질로서는 유기산(구연산, 글루콘산, 유산, 이타콘산 등), 아미노산(리신, 트레오닌, 메치오닌, 트립토판, 글루타민산나트륨 등), 비타민(아스코르브산, 리보플라빈, 시아노코발라민, 에리소르빈산염 등), 산업용 효소(리파아제, 셀룰라아제 등) 등이 있다.
현재까지는 발효 원료로서 당질계(사탕수수, 사탕무) 또는 전분계(옥수수, 밀) 바이오매스의 당화물(글루코스, 프락토스, 포도당, 당밀 등)을 가장 많이 이용했으나 이들의 원료가 식품과의 경쟁 때문에 비식용자원(algae, 목질계 등)으로부터 원료를 대체 확보가 요구되고 있다. 그러나 이 경우 해결해야할 가장 큰 도전중의 하나는 당화물 생산비용의 절감이다. 식용자원과는 달리 비식용자원의 경우 전처리, 당화가 보다 어렵고 추가 공정이 요구되기 때문이다.
따라서 현재 많은 연구자가 저비용으로 비식용 바이오매스 유래 당화물을 생산하는 기술개발에 노력을 경주하고 있다. 조류의 경우는 목질계 바이오매스와는 달리 당화를 위해 전처리가 필수적으로 요구되지는 않는다고 보고되고 있으나(Rojan 등, Bioresource Technology 102: 186-193, 2011) 이럴 경우 일반적으로 당수율이 낮아지는 한계점이 있다.
따라서 이를 해결하기 위해 전처리를 통해 당수율을 증가시키는 연구사례가 보고되고 있으며(Chemical Engineering Jounal 168:1079-1084, 2011), 지금까지 보고된 주요 방법으로는 대부분 해조류의 거대조류를 대상으로 산처리(김 등, 대한민국 공개특허번호 10-2009-0025221, 2009; Ge 등, Renewable Energy. 36:84-89, 2011; Thu 등, J. Microbiol. Biotechnol. 19: 161-166, 2009), 과산화수소 처리(Galynkin 등, WO 2010/074610 A1, 2010), NaClO2 처리(Wi 등, Bioresource Technology 100, 66586660, 2009), 고압 액화법(강 등, 대한민국 특허등록 10-0908425, 2009; Zhou 등, Energy Fuels 24(7): 40544061, 2010), 방사선처리(이 등, 대한민국 공개특허 10-2010-0125104, 2010), 산성 이온성 액체 이용(김 등, 대한민국 공개특허 10-2010-0024665, 2010), 초임계 처리(전과 노 등, 2010. 대한민국 공개특허 10-2010-0038905, 2010) 등이 보고된 바 있지만, 상기 전처리 과정을 추가 하면 당연히 비용이 발생되기 때문에 당용액 생산비가 증가되는 단점이 있다.
또한, 상기 전처리 방법에 따라 처리과정중에 비의도적으로 발효 억제물질이 생성될 수도 있는데, 이러할 경우엔 당용액내의 당 농도가 높다 할지라도 발효 미생물 생장에 악영향을 미칠 수 있기 때문에 불량 당용액의 제조가 우려되는 문제점 역시 발생된다.
따라서 전처리 없이 또는 매우 약한 전처리를 통해서도 특정 유용 당성분이 많이 생산되는 조류 바이오매스를 선발하여 저비용, 친환경적으로 고품질의 당화액 제조기술을 개발하는 것이 본 산업 분야에서 지속적으로 추구해야 할 과제이다.
한편, 조류는 육상식물의 섬유소계와는 달리 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 외에 여러 가지 다당류가 생산된다. 따라서 여러 종류의 당들이 복합되어 있는 것이 특징이다. 그러나 발효의 경우 균주에 따라 여러 당을 모두 소화하는 계통이 있기는 하지만 대부분 몇 가지 당(글루코오스, 프락토오스, 포도당 등)을 우선적으로 선호함에 따라 이들 탄수화물이 상대적으로 높게 생산될 수 있는 조류 종을 골라 이로부터 발효용 당용액을 생산해야 하는 점 역시 고려해야 하는 과제이다.
또한, 산업화를 경제성을 맞추기 위해서는 당화액의 당 농도가 가능한 한 높을수록 유리하기 때문에 단당류가 고농도로 함유되는 당용액을 저비용으로 생산하는 방법의 개발은 본 분야에서 지속적으로 추구해야할 과제이다.
한편, 조류 바이오매스 활용에 있어서 상기 바이오연료 이외의 분야에서는 식품 및 사료성분으로서 젖산 이용을 위해 전분 고함유 조류바이오매스의 발효 연구가 일부 보고되고 있으나(Ike 등, Journal of Fermentation and Bioengineering. 84(5): 428-433, 1997; Reddy 등, Biotechnology Advances 26: 2234, 2008; 강과 강, 대한민국 특허출원 KR 2008-0111609) 젖산 기반의 바이오플라스틱 생산 분야로의 조류 바이오매스 활용에 대한 뚜렷한 성과는 아직 보고된 바 없다.
바이오플라스틱 산업은 2008년 이후 환경규제 강화 및 친환경제품 선호도 증가에 따라 그 시장이 급속히 확대되고 있어, 현재 플라스틱 전체시장의 1%의 점유율을 가졌지만 환경규제가 강한 미국. 유럽, 일본을 중심으로 연간 13%의 성장률로 빠르게 증가하고 있는 상황이다(Nampoothiri 등, Bioresource Technology 101: 84938501, 2010).
젖산과 같은 바이오플라스틱 모노머 생산의 경우, 미생물 발효를 통해 대부분 이루어진 바, 대부분 발효 원료로서 당질계(사탕수수, 사탕무) 또는 전분계(옥수수, 밀) 바이오매스의 당화물을 이용하고 있어 이들의 원료가 식품과 경쟁하기 때문에 앞으로는 비식용자원(목질계, algae 등)으로부터 원료의 대체 확보가 요구되고 있다.
그런데 이 경우 해결해야 할 가장 큰 도전중의 하나는 당화물 생산비용의 절감이다. 식용자원과는 달리 비식용자원의 경우 전처리, 당화가 보다 어렵고 추가 공정이 요구되기 때문이다.
따라서 현재 많은 연구자가 저비용으로 바이오플라스틱 원료물질을 생산하는 기술개발에 노력을 경주하고 있으며, 바이오플라스틱 원료물질로서 현재 가장 시장성이 높은 것은 폴리젖산인데 이는 젖산을 모노머로 하고 있다. 현재 젖산의 전 세계적 수요는 13만 내지 15만 metric tonnes/year으로 앞으로 지속적으로 그 수요가 증가될 전망이다. 특히 화학제품 생산을 위한 젖산의 활용은 매년 19% 정도 증가될 것으로 전망되고 있다.
그동안 연구되어 온 젖산의 효율적인 생산공정으로 동시 당화/발효 공정 기술의 경우 당질계/전분계 식용자원을 중심으로 연구되어 왔고, 최근들어 목질계를 가지고 일부 시도된 바 있으나, 젖산의 생산율이 상대적으로 낮은 문제점이 있었다(Rojan 등, Applied Biochemistry and Biotechnology 134: 263-272, 2006; John 등, Biotechnol. Adv. 27, 145152, 2009; Reddy 등, Biotechnology Advances 26: 2234, 2008; John 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 524534, 2007; Moldes 등, Bioprocess Engineering 22:175-180, 2000).
또한, 향후 인구가 증가되고 바이오매스 수요가 증가되면 농산물 가격이 폭등될 우려가 있기 때문에 특히, 화학제품 원료로서의 젖산은 농산물과 경합되지 않는 바이오매스로 대체하는 것이 바람직하며, 가격 경쟁력을 갖추기 위해 저에너지/저비용 생산공정의 개발이 절실히 요구되고 있다.
현재, 식품 및 사료성분으로서 젖산 이용을 위해 식용자원을 이용하는 방법과 유사하게 전분 고함유 조류 바이오매스의 발효에 대한 연구가 일부 보고 되었으나(Ike 등, Journal of Fermentation and Bioengineering. 84(5): 428-433, 1997; Reddy 등, Biotechnology Advances 26: 2234, 2008; 강과 강, 대한민국 특허출원 KR 2008-0111609) 사용 균주가 제한되어 있고, 또한 화학제품으로 적용하기에는 그 생산성에 대한 문제는 여전히 해결해야 하는 과제로 남아 있다.
Ike 등, Journal of Fermentation and Bioengineering. 84(5): 428-433, 1997
Ge 등, Renewable Energy. 36:84-89, 2011
본 발명자들은 조류 바이오매스로부터 발효에 가장 많이 사용되고 있는 고농도·고품질의 단당류와 바이오플라스틱 제조에 많이 활용되는 젖산을 경제적이면서 효율적으로 제조할 수 있는 방법에 대한 연구를 지속하던 중, 아직 보고된 바 없는 탄수화물 고함유 조류 바이오매스로부터 고농도·고품질의 단당류 및 젖산을 경제적이면서 효율적으로 제조할 수 있는 방법을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 조류 바이오매스로부터 고농도·고품질의 젖산 및 당농축액 제조의 어려움과 재현성을 극복하기 위한 것으로, 아직 보고된 바 없는 탄소화물 고함유 조류 바이오매스로부터 특별한 전처리 없이 당화 또는 당화 및 발효 공정을 통해 경제적이면서 효율적인 단당류 및 젖산의 동시 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 탄소화물 고함유 조류 바이오매스로부터 특별한 전처리 없이 당화 또는 당화 및 발효 공정을 통해 경제적이면서 효율적인 고농도·고품질의 젖산의 생산방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 총 탄수화물의 함량이 30 내지 90%인 조류 바이오매스를 준비하는 단계;
2) 반응기 내에 다당류 분해효소, 촉매, 발효 균주, 또는 이들의 혼합물을 상기 조류 바이오매스에 첨가하여 반응시키는 단계; 및
3) 상기 반응물로부터 젖산 또는 당화액을 수득하는 단계;
를 포함하는 젖산 또는 단당류의 생산방법을 제공한다. 도 1을 참고한다.
본 발명은
1) 히드로딕티온속(Hydrodictyon sp.); 대마디말과의 염주말속(Chaetomorpha sp.), 대마디말속(Cladophora sp.), 헛뿌리말속(Rhizoclonium sp.); 갈파래과의 파래속(Enteromorpha sp.)과 갈파래속(Ulva sp.)으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 조류 바이오매스를 준비하는 단계;
2) 반응기 내에 다당류 분해효소, 발효 균주, 또는 이들의 혼합물을 상기 조류 바이오매스에 첨가하여 반응물을 생산하는 단계; 및
3) 상기 반응물로부터 젖산을 수득하는 단계;
를 포함하는 젖산의 생산방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 2) 단계의 반응물 생산시 촉매를 더 투입하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 생산방법은 총 탄수화물의 함량이 30 내지 90%인 조류를 다당류 분해효소에 의해 당화시키는 당화공정, 또는 촉매에 의해 당화시키는 당화공정, 또는 다당류 분해효소 및 촉매에 의해 당화시키는 당화공정을 통하여 고농도의 단당류를 생산할 수 있다.
본 발명자들은 담수 녹조류 중 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류가 탄수화물 함량이 30 내지 90%까지 되는 조류로서 특히, 주요 단당류는 글루코오스와 만노오스가 주성분이고, 효소 당화시 글루코오스 함량이 바이오매스 중량대비 20 내지 60%까지 생산될 수 있는 탄수화물 고함유 바이오매스로의 이용 가능성을 발견하였다.
상기 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류는 시료의 수집/선별시 단순히 건지개로만 이용해도 될 정도로 손쉽고, 원심분리 또는 여과과정을 거쳐 수집해야만 하는 다른 미세조류의 공정에 비해 저에너지/저비용으로 시료를 공급받을 수 있으며, 세척, 탈수, 건조, 분말화 등의 작업도 매우 간편한 특징을 가진다. 또한, 리그닌이 없고 탄수화물이 보통 30 내지 70% 차지하고 있으며, 특히 발효에 가장 많이 활용되는 글루코오스 함량 비율이 기타 조류 종들에 비해 매우 높은 장점이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조류 바이오매스는 생체; 건조체; 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올로 침출 여과 후 남은 잔사물; 유기물 정제 장치를 이용하여 물, 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올 또는 이들의 연속 용매로 추출 후 남은 잔사물; 유기용매를 이용하여 지질성분을 추출하고 남은 잔사물;로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.
보다 상세하게는 본 발명에 적용되는 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류는 야외에서 직접 수집하거나 또는 배양과정을 통해서 얻어진 생체 또는 건조체를 고운 입자를 마쇄하여 이용할 수 있으며, 시료에 따라서는 마쇄 없이 직접 당화에 적용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 적용되는 그물말과 조류는 부가가치를 높이면서 고품질의 당화액 또는 젖산을 제조하기 위하여 다음과 같이 별도의 추출과정을 거칠 수 있다.
본 발명에 있어서 “고품질의 당화액”이란 당화액 내에 6탄당(글루코오스, 만노오스 등) 함량이 높고 발효에 저해역할을 하는 억제물질의 함량이 낮아서 발효에 용이하도록 제조된 반응물을 말한다.
이를 위해 본 발명에서는 수집된 생체 또는 건조체의 본 발명에 따른 조류 바이오매스를 70 내지 100%의 메탄올 또는 에탄올로 추출한 다음, 추출물은 분리정제 과정을 거쳐 여러 생리활성물질(의약 또는 농약용 항균제, 살조제, 기능성 식품용 물질 등)로 활용하고, 추출 후 남은 잔사(고형분)를 고농도의 단당류 또는 젖산의 제조에 이용할 수도 있다.
또한, 본 발명에 따른 생체 또는 건조체의 조류 바이오매스를 속슬렛 장치를 이용하여 물 또는 물과 에탄올로 연속하여 추출물을 추출한 다음 추출물(extractives)은 상기에 언급한 용도로 이용하고, 남은 잔사를 고농도의 단당류 또는 젖산의 제조에 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명에 따른 생체 또는 건조체의 조류 바이오매스를 유기용매(예, 클로로포름＋메탄올)를 가지고 지질성분을 추출한 다음, 남은 잔사를 고농도의 단당류 또는 젖산의 제조에 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 고농도 당용액을 경제적으로 생산하기 위해서는 당화액 내의 고형분 함량(solid loading)이 높을수록 바람직하다. 그러나 고형분 함량이 너무 높으면 물리적으로 교반이 어려워질 뿐 아니라 효소의 조직 내 침투가 어렵고 또한, 생성된 고농도의 당은 피드백 저해(feedback inhibition)에 의해 효소의 활성을 억제하기도 하여 오히려 비효율적일 수 있으며, 그 정도는 식물종류 및 조직 상태에 따라 다른 것으로 알려져 있다.
본 발명에 따른 조류는 고형분 함량이 1 내지 30 중량%인 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 5 내지 20 중량%로 함유한다.
보다 상세하게는 글루코오스 고함유 당화액을 제조하기 위하여, 우선 조류 바이오매스의 공급을 초기에 모두 공급하거나 또는 분할하여 공급할 수 있으며, 최종 공급된 고형분 함량은 배양액 무게대비 1 내지 30%까지 투입할 수 있다. 효소공급의 경우도 바이오매스 공급 직후에 필요량 모두를 공급할 수 있으나 조건에 따라 분할하여 투입할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 생산방법은 단일 반응기 내에 총 탄수화물의 함량이 30 내지 90%인 조류, 다당류 분해효소 및 발효 균주를 동시 또는 연속적으로 투입하거나 또는 반응물 생산시 촉매를 더 투입하여 배양함으로써 고농도의 젖산을 생산할 수 있다.
상기 반응물은 촉매를 투입함으로써 고수율의 단당류를 수득할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 반응물은
ⅰ) 조류에 다당류 분해효소를 가하여 증류수 또는 0.01 mM 내지 1.0 M 범위의 완충액에서 20 내지 60℃, 0.5 내지 5일 반응시킴으로써 제조되거나 또는,
ⅱ) 조류에 촉매를 가하여 20 내지 200℃의 온도에서 1 내지 6시간 동안 1차 가수분해 후 2차 가수분해시킴으로써 제조되거나 또는,
ⅲ) 조류를 열수처리한 후 다당류 분해효소를 가하여 증류수 또는 0.01 mM 내지 1.0 M 범위의 완충액에서 20 내지 60℃, 0.5 내지 5일 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
보다 상세하게는 상기 조류에 대하여 셀룰라아제, β-글루코시다제, β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, α-D-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, 수크라아제, 말타아제, 이소말타아제, 락타아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 분해효소를 이용하여 증류수 또는 0.01 mM 내지 1.0 M 범위의 완충액에서 20 내지 60℃, 0.5 내지 5일 반응시킴으로써 당화액이 생성될 수 있다.
또한, 당화과정중의 온도조절은 분해효소 투입시기와 효소 반응 최적조건에 따라 달라질 수 있으며, 20 내지 60℃에 0.5 내지 5일 동안 반응할 수 있다. 그리고 품질이 좋은 고농도 당화액을 제조하기 위해 효소 반응시 완충액 염 농도가 최소화되도록 당화를 실시하며, 바람직하게는 증류수 또는 0.01 mM 내지 1.0 M 범위의 완충액에서 당화를 실시할 수 있다. 한편 화학적 가수분해의 경우는 발효억제물질 생성을 최소화하기 위해서 낮은 반응온도와 반응시간을 설정하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 촉매는 황산, 염산, 브롬산, 질산, 아세트산, 포름산, 과염소산, 인산, 파라-톨루엔설폰산(p-toluenesulfonic acid, PTSA) 및 고체산으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 산 촉매 또는 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼슘, 암모니아 수용액으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 알카리 촉매를 사용할 수 있다.
보다 상세하게는 본 발명의 당화액은 촉매에 의한 2 단계의 가수분해(two-step hydrolysis) 단계로 고농도 고수율의 단당류를 수득할 수 있는 장점이 있다.
보다 상세하게는 조류에 촉매를 가하여 20 내지 200℃의 온도에서 1 내지 6시간 동안 1차 가수분해 후 2차 가수분해시킴으로써 고수율의 단당류를 수득할 수 있다.
상기 2 단계의 가수분해(two-step hydrolysis)는 상기 조류 대하여, 황산, 염산, 브롬산, 질산, 아세트산, 포름산, 과염소산, 인산, 파라-톨루엔설폰산(p-toluenesulfonic acid, PTSA) 및 고체산으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 산 촉매 또는 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼슘, 암모니아 수용액으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 알카리 촉매를 이용하여 20 내지 200℃의 온도에서 1 내지 6시간 동안 1차 가수분해 후, 혼합 분해효소를 공급하여 2차 가수분해를 진행하는 2 단계의 가수분해(two-step hydrolysis)를 통해 생성될 수 있다.
상기 조류의 공급은 초기에 모두 공급하거나 또는 분할하여 공급할 수 있으며, 최종 공급된 고형분 함량은 배양액 무게대비 1 내지 30%까지 투입할 수 있다. 효소공급의 경우도 조류 공급 직후에 필요량 모두를 공급할 수 있으나 조건에 따라 분할하여 투입할 수 있다.
상기 본 발명의 생산방법을 통해 수득되는 단당류는 갈락토오스, 갈락토오스 유도체, 3,6-안하이드로갈락토오스, 크실로오스, 글루코오스, 람노오스, 크실로오스 및 만노오스로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 단당류인 것으로, 보다 바람직한 것은 글루코오스, 만노오스 또는 이들의 혼합 단당류인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 단당류는 하이드록시메틸풀푸랄(Hydroxymethylfurfural, HMF), 풀푸랄(furfural) 또는 이들의 혼합물이 5% 글루코오스 함량 당 0.07% 이하로서, 최종 목적으로 하는 글루코오스 함량이 1 내지 20%의 화학적 전환용 또는 생물학적 전환을 위한 발효용 당농축액을 제조할 수 있는 특징이 있다.
본 발명의 생산방법은 상기 단당류를 이용하여 고농도 당농축액을 제조하기 위해서, 1차적으로 당화한 당화액을 2회 이상 원심분리를 하거나 여과방법을 통해 모은 다음, 이를 감압건조, 여과 또는 막투과증발법 등을 더 진행하여 농축시킬 수 있다.
본 발명에 따른 생산방법은 조류를 특별한 전처리를 하지 않고도 고농도의 단당류를 수득할 수 있음으로써 보다 저비용으로 당화할 수 있는 경제성 뿐 아니라 당화공정 시 환경오염물질 배출가능성도 낮은 장점이 있다.
본 발명에 따른 젖산의 생산방법은 단일 반응기에 조류와 함께 다당류 분해효소, 발효 균주 또는 이들의 혼합물을 동시 또는 연속적으로 투입하여 배양함으로써 경제적이면서 효율적으로 D형 또는 L형의 젖산을 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 L형 또는 D형의 젖산은
ⅰ) 조류에 다당류 분해효소 및 발효 균주를 동시에 투입하고, 20 내지 50℃ 온도에서 1 내지 5일 동안 1차 당화 및 2차 발효를 동시에 진행시킴으로써 제조되거나 또는,
ⅱ) 조류에 다당류 분해효소를 투입하여 20 내지 60℃에서 1차 당화시키고, 상기 동일 반응기에 연속적으로 발효 균주를 투입하여 25 내지 50℃에서 1 내지 5일 2차 발효시킴으로써 제조될 수 있다.
보다 상세하게는 상기 L형 또는 D형의 젖산은 단일 반응기 내에 조류, 다당류 분해효소 및 발효 균주를 동시에 투입하고, 30 내지 40℃에서 2 내지 4일 동안 1차 당화 및 2차 발효를 동시에 진행시킴으로써 생성될 수 있다.
또한, 상기 L형 또는 D형의 젖산은 반응기 내에 조류 및 다당류 분해효소를 투입하여 45 내지 55℃에서 1일 동안 1차 당화시키고, 상기 동일 반응기에 연속적으로 발효 균주를 투입하여 30 내지 40℃에서 3일 동안 2차 발효시킴으로써 생성될 수 있다. 도 2를 참조한다.
또한, 상기 다당류 분해효소 및 발효 균주의 혼합 배양에 따른 당화 및 발효공정은 온도조건의 경우 단일 반응기 내에 다당류 분해효소 또는 발효 균주를 동시 또는 연속으로 투입하는 투입시기와 배양조건에 따라 달라질 수 있다. 즉, 조류, 다당류 분해효소 및 발효 균주를 동시에 넣고 배양할 경우에는 발효 균주의 생육최적온도(20 내지 50℃)에 1 내지 5일 동안 배양함으로써 젖산을 고농도로 생성할 수 있다.
만약, 단일 반응기에 조류 및 다당류 분해효소를 투입하여 1차 당화를 진행한 후, 연속적으로 발효 균주를 투입하는 경우는 다당류 분해효소의 당화 최적온도(20 내지 60℃)에서 1차적으로 신속히 당화를 시킨 후, 이어 발효 균주를 투입하고 균주 생육 최적온도로 조정한 다음 1 내지 5일 동안 추가 배양함으로써 전산을 고농도로 생성할 수 있다. 그리고 당화/발효 공정시 사용되는 균주 특성에 따라 호기배양 또는 혐기배양을 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명에 있어서. 상기 발효 균주는 L형의 젖산을 생산하기 위하여, 락토코커스(Lactococcus), 락도바실러스(Lactobacillus), 스트랩토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코쿠스(Pediococcus), 에로코쿠스(Aerococcus), 카노박테리엄(Carnobacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 오에노코커스(Oenococcus), 테트라제노코코스(Tetragenococcus), 바고코쿠스(Vagococcus), 와이셀라(Weisella), 라이족토니아 오라이제(R. oryzae), 리조푸스 아리주스(R. arrhizus), 락토바실러스 아밀로필러스 GV6(Lactobacillus amylophilus GV6), 락토바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510, KCTC 3510), 락토바실러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 균주인 것으로, 보다 바람직하게는 락토 바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510, KCTC 3510), 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP)을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP)는 본 발명자들이 분리·선별한 신규한 균주로 2011년 3월 2일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터로부터 기탁번호 제 KCTC 11883BP를 부여 받았다.
보다 상세하게는 본 발명의 L형의 젖산 제조는 단일 반응기에서, 조류와 셀룰라아제, β-글루코시다제, β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, α-D-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, 수크라아제, 말타아제, 이소말타아제, 락타아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 다당류 분해효소를 이용하여 20 내지 60℃ 온도에서 조류 바이오매스를 0.5 내지 2일 동안 1차 당화시키고, 상기 동일 반응기에 연속적으로 락토코커스(Lactococcus), 락도바실러스(Lactobacillus), 스트랩토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코쿠스(Pediococcus), 에로코쿠스(Aerococcus), 카노박테리엄(Carnobacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 오에노코커스(Oenococcus), 테트라제노코코스(Tetragenococcus), 바고코쿠스(Vagococcus), 와이셀라(Weisella), 라이족토니아 오라이제(R. oryzae), 리조푸스 아리주스(R. arrhizus), 락토바실러스 아밀로필러스 GV6(Lactobacillus amylophilus GV6), 락토 바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510, KCTC 3510), 락토바실러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 균주를 투입하여 25 내지 50℃에서 1 내지 5일 2차 발효시킴으로써 생성될 수 있다. 이 때 조류의 고형분 함량이 높을 경우 효소당화에 앞서 촉매를 가하여 1차 가수분해 시키는 과정을 추가할 수 있다.
보다 상세하게는 본 발명의 젖산 제조는 조류; 셀룰라아제, β-글루코시다제, β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, α-D-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, 수크라아제, 말타아제, 이소말타아제, 락타아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 다당류 분해효소; 및 락토코커스(Lactococcus), 락도바실러스(Lactobacillus), 스트랩토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코쿠스(Pediococcus), 에로코쿠스(Aerococcus), 카노박테리엄(Carnobacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 오에노코커스(Oenococcus), 테트라제노코코스(Tetragenococcus), 바고코쿠스(Vagococcus), 와이셀라(Weisella), 라이족토니아 오라이제(R. oryzae), 리조푸스 아리주스(R. arrhizus), 락토바실러스 아밀로필러스 GV6(Lactobacillus amylophilus GV6), 락토바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510, KCTC 3510), 락토바실러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 균주; 를 동시에 투입하고, 20 내지 50℃ 온도에서 1 내지 5일 동안 1차 당화 및 2차 발효를 동시에 진행시킴으로써 생성될 수 있다.
상기 균주는 락토바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510, KCTC 3510), 락토바실러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP) 또는 이들의 혼합 균주를 사용하는 것이 바람직하며, 균주 특성에 따라 호기배양 또는 혐기배양을 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 젖산 제조는 D형의 젖산이 선택적으로 제조할 수 있다.
보다 상세하게는 상기 D형의 젖산은 락토바실러스 코니포미스 톨퀸스 ATCC 25600(Lactobacillus coryniformis subsp. torquens ATCC 25600)을 이용하는 생산할 수 있다.
보다 상세하게 D형 젖산의 생산은 그물 말 시료 50 내지 300 g/ℓ에 대하여, 효모 추출물 0.1 내지 50 g/ℓ에 펩톤 0.1 내지 50 g/ℓ을 혼합하여 제조한 배지(0.05 g MnSO4, 2 g K2HPO4, 5 g CH3COONa, 0.2 g MgSO4, 2 g triammoniumcitrate, 1 g Tween80으로 구성되는 무기염 포함)에 4가지 다당류 분해효소 즉, 셀룰라아제 : β-글루코시다제 : α-아밀라아제 : 아밀로글루코시다아제의 부피비가 1 : 0.1 내지 1 : 0 내지 0.5: 0.1 내지 1인 효소 복합체를 이용하여 당화 후, 락토바실러스 코니포미스 톨퀸스 ATCC 25600(Lactobacillus coryniformis subsp. torquens ATCC 25600)을 이용하여 발효시킴으로써 고농도의 D형의 젖산을 가장 효과적으로 생산할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
상기 당화는 20 내지 50℃ 온도에서 1 내지 5일 동안 진행될 수 있으며, 상기 발효는 25 내지 50℃에서 1 내지 5일 동안 진행될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 젖산의 생산방법은 발효 균주를 통한 발효 공정 이전, 촉매 및 효소 복합체를 이용하여 순차적인 가수반응을 진행함으로써 D형의 젖산 생산성이 더욱 효율화 시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
보다 상세하게는 단일 반응기 내에 조류와 촉매를 가하여 20 내지 200℃의 온도에서 1 내지 6시간 동안 가수분해시킴으로써 1차 당화를 시킨 다음 다당류 분해효소를 투입하여 45 내지 55℃에서 1일 동안 2차 당화시키고, 상기 동일 반응기에 연속적으로 발효 균주를 투입하여 20 내지 50℃에서 3일 동안 발효시킴으로써 경제적이면서 효율적으로 D형의 젖산을 고수율로 생산할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 조류는 생화학적/화학적 당화가 매우 용이한 특징을 가져 수집 후 생체를 직접 사용할 수 있고, 건조체를 이용할 때에도 특별한 전처리 없이도 높은 당화율을 나타내며, 단일 반응기에 조류와 함께 다당류 분해효소, 또는 다당류 분해효소 및 발효 균주를 동시 또는 연속적으로 투입하여 배양함으로써 경제적이면서 효율적으로 젖산 및 단당류를 고농도로 제조할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 젖산의 생산방법은 단일 반응기에 조류와 함께 다당류 분해효소 및 발효 균주 또는 이들의 혼합물을 동시 또는 연속적으로 투입하여 배양함으로써 경제적이면서 효율적으로 D형 또는 L형의 젖산을 선택적으로 제조할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 생산방법은 보다 저비용으로 당화할 수 있는 경제성 뿐 아니라 당화공정시 환경오염물질 배출가능성도 낮아 향후 산업바이오화학제품 생산으로의 크게 기여할 것이다.
본 발명에 따른 생산방법은 옥수수, 밀과 같은 식용자원이 아닌 비식용자원인 조류(algae)를 활용하기 때문에 바이오매스의 산업적 수요가 높아졌을 때 식품 가격 폭등 및 윤리적 문제의 발생 소지가 없고, 안정적으로 자원의 지속적 공급이 가능한 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 조류 바이오매스로부터 고농도의 젖산 또는 단당류를 수득하는 방법을 모식화한 도면이고,
도 2는 본 발명에 따른 조류 바이오매스로부터 고농도의 젖산 생산방법에 대한 공정을 모식화한 것이며,
(A: 연속 당화/발효 공정, B: 동시 당화/발효 공정)
도 3은 본 발명에 따른 그물말의 주요 당 조성을 가스크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과이고,
도 4는 본 발명에 따른 그물말의 주요 당 조성 및 함량을 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과이며,
도 5는 본 발명에 따른 그물말의 당화에 미치는 효소조합 처리량의 효과를 조사한 결과이고,
(V1: E1＋E2=0.02＋0.004 mL/g DM, V2: 0.04＋0.008 mL/g DM, V3: 0.1＋0.02 mL/g DM, V4: 0.2＋0.04 mL/g DM)
도 6은 본 발명에 따른 그물말의 효소당화에 있어서 완충용액의 염 농도(buffer strength)별 당화정도를 비교한 결과이며,
도 7은 본 발명에 따른 그물말의 효소당화에 있어서 당화시간에 따른 글루코오스 생성정도를 확인한 결과이고,
도 8은 본 발명에 따른 그물말의 효소당화에 있어서 당화온도에 따른 글루코오스 생성정도를 확인한 결과이며,
도 9는 본 발명에 따른 그물말의 시료 형태(생체 시료, 건조체 시료)에 따른 효소 당화율을 확인한 결과이고,
도 10은 본 발명에 따른 그물말 건조시료의 분말화 여부에 따른 효소 당화율을 확인한 결과이며,
도 11은 본 발명에 따른 그물말의 효소당화 시 첨가되는 고형분 함량에 따른 효소 당화율을 확인한 결과이고,
도 12는 본 발명에 따른 고농도 그물말 고형분의 2차 가수분해시 글루코오스 생성량 및 기대치를 나타내는 그래프이며,
도 13은 그물말(HR), 헛뿌리말(RHI) 및 구멍갈파래(UPer)로부터 본 발명의 젖산 생산방법 따른 젖산의 생성량을 상대적으로 비교한 그래프이고,
(ES: 조류 시료의 공급 없이 효소액만 추가하여 발효한 것이며, 아울러 상대비교를 위해 시약용 글루코오스를 사용하여 균주의 발효능을 나타내었다.)
도 14는 본 발명에 따른 그물말의 발효에 미치는 효소 처리량의 효과를 조사한 결과이며,
(RS: 환원당)
도 15는 본 발명에 따른 그물말의 발효시 발효 조건의 변화(발효시간, pH, 배양균 수)로 인한 글루코오스, 젖산, 환원당(RS)의 농도, 조건에 따른 효과를 조사한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 조류 바이오매스로부터 고농도의 젖산 생산방법에 대한 공정을 모식화한 것이며,
(A: 연속 당화/발효 공정, B: 동시 당화/발효 공정)
도 3은 본 발명에 따른 그물말의 주요 당 조성을 가스크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과이고,
도 4는 본 발명에 따른 그물말의 주요 당 조성 및 함량을 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과이며,
도 5는 본 발명에 따른 그물말의 당화에 미치는 효소조합 처리량의 효과를 조사한 결과이고,
(V1: E1＋E2=0.02＋0.004 mL/g DM, V2: 0.04＋0.008 mL/g DM, V3: 0.1＋0.02 mL/g DM, V4: 0.2＋0.04 mL/g DM)
도 6은 본 발명에 따른 그물말의 효소당화에 있어서 완충용액의 염 농도(buffer strength)별 당화정도를 비교한 결과이며,
도 7은 본 발명에 따른 그물말의 효소당화에 있어서 당화시간에 따른 글루코오스 생성정도를 확인한 결과이고,
도 8은 본 발명에 따른 그물말의 효소당화에 있어서 당화온도에 따른 글루코오스 생성정도를 확인한 결과이며,
도 9는 본 발명에 따른 그물말의 시료 형태(생체 시료, 건조체 시료)에 따른 효소 당화율을 확인한 결과이고,
도 10은 본 발명에 따른 그물말 건조시료의 분말화 여부에 따른 효소 당화율을 확인한 결과이며,
도 11은 본 발명에 따른 그물말의 효소당화 시 첨가되는 고형분 함량에 따른 효소 당화율을 확인한 결과이고,
도 12는 본 발명에 따른 고농도 그물말 고형분의 2차 가수분해시 글루코오스 생성량 및 기대치를 나타내는 그래프이며,
도 13은 그물말(HR), 헛뿌리말(RHI) 및 구멍갈파래(UPer)로부터 본 발명의 젖산 생산방법 따른 젖산의 생성량을 상대적으로 비교한 그래프이고,
(ES: 조류 시료의 공급 없이 효소액만 추가하여 발효한 것이며, 아울러 상대비교를 위해 시약용 글루코오스를 사용하여 균주의 발효능을 나타내었다.)
도 14는 본 발명에 따른 그물말의 발효에 미치는 효소 처리량의 효과를 조사한 결과이며,
(RS: 환원당)
도 15는 본 발명에 따른 그물말의 발효시 발효 조건의 변화(발효시간, pH, 배양균 수)로 인한 글루코오스, 젖산, 환원당(RS)의 농도, 조건에 따른 효과를 조사한 결과이다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
[실시예 1] 그물말의 탄수화물 함량 및 조성 분석
1) 화학적 성분조성 조사
수집된 담수조류 중 그물말 과의 대표적인 히드로딕티온 속(Hydrodictyon sp.) 그물말에 대하여 총탄수화물, 단백질, 조지질, 회분의 상대적 함량 비율을 조사하기 시험하였다.
우선, 수집된 그물말은 2회 이상 수돗물로 세척하였다. 이를 45℃ 컨벤션 오븐에 1일 이상 두어 건조시킨 다음 분쇄기를 이용하여 1 mm 이하의 분말로 조제하여 분석용 시료로 사용하였다.
건조시료의 성분분석은 한국식품연구원에 의뢰하여 실시하였으며, 수분은 식품공전(2009) 상압가열건조법, 조지질은 식품공전(2009) 에테르추출법, 단백질은 Kjeldahl법, 회분은 식품공전(2009) 회분시험법에 준하여 정량하였다.
그 결과, 그물말은 수분 5.3%, 조지질 1.9%, 단백질 12.9%, 총 탄수화물 64.6%, 회분 15.3%의 화학적 조성을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 일반적으로 성분조성은 생육단계 및 환경에 따라 다소 변화가 있는 것으로 보고되기 있기 때문에 향후 분석시 이를 참고하였다.
2) 그물말의 탄수화물 조성 및 함량 조사
조류 바이오매스 내 총 탄수화물 함량 뿐 아니라 어떤 종류의 당이 어느 정도 함유되어있는지를 안다는 것은 당화처리 조건의 효율성, 발효 균주 선택, 발효에 의한 특정성분으로의 전환율 등을 판단하는데 있어서 근간이 된다. 바이오매스의 탄수화물 조성 및 함량은 일반적으로 산 가수분해를 통해 조사되는데 보다 정확한 데이터를 얻기 위해서는 바이오매스 각 종류별로 온도, 산농도, 처리시간, 압력 등 제반 처리조건의 최적화가 필요하다. 본 연구에서는 그물말 내의 주요 탄수화물 조성과 그 함량을 알아보기 위하여 실험하였다.
① 그물말의 탄수화물의 조성을 알기위한 GC분석
그물말 조류의 탄수화물 조성을 알기 위해서 먼저 산 가수분해를 실시하였다. 바이오매스 준비, 바이오매스 내의 추출성분(extractives) 제거, 시료의 1차/2차 산 가수분해 등은 “NREL protocol(NREL, 2009, Laboratory anayltical procedure)”에 준하여 실험하였다.
그물말의 산처리에 의해 단당류로 변환된 당용액을 GC를 이용하여 단당류의 종류를 파악하였다. 정성분석은 0.5 g 정도의 시료를 취하여 동결 건조한 후 실리레이션(silylation)하여 분석하였다. 실릴화제(silylating agent)는 헥사메틸디실라젠(Hexamethyldisilazane), 클로로트리메틸실란(Chlorotrimethylsilane), 피리딘(pyridine)을 각각 3:1:9의 부피비로 혼합한 것으로, 0.5 ㎖의 동결 건조된 샘플에 투입하여 30분 교반한 후 상부의 맑은 액만 사용하여 분석을 진행하였다.
정성분석에 사용된 기기는 Agilent사의 GC(model : 6890N)을 사용하였다. 검출기는 FID, 컬럼은 DB-1HT(30 m×0.32 ㎜×0.1 ㎛)을 사용하였다. 온도조건은 주입구와 검출기는 250℃를 유지하였으며, 오븐의 온도는 초기 100℃에서 분당 5℃씩 250℃까지 승온하여 5분간 대기하였다. 그리고 표준당과 시료의 체류시간을 비교하여 시료의 당 성분을 정성 분석하였다.
② 그물말 효소가수분해물의 단당류 정량분석
그물말의 효소가수분해를 통해 얻어진 당류의 정량분석을 위해 HPLC 분석을 실시하였으며, 제반 분석조건은 NREL protocol(NREL, 2009, Laboratory anayltical procedure)을 참고하였다.
효소당화의 기본적인 실험방법은 건조 분말시료 0.5 g을 125 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 0.1M citrate buffer(pH 4.8) 23.9 ㎖과 1% NaN3의 1.1 ㎖를 가한 다음, 120℃에서 20분 고압살균하였다. 무균상에서 효소를 가한 후 50℃, 150 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 시켰다. 사용된 효소는 셀룰라아제(Celluclast Conc. BG, Novozymes사 제품, 5배 희석하여 사용, E1으로 표시)와 β-글루코시다제(Sigma C6105, E2로 표시) 이었고, Celluclast Conc. BG의 경우는 1g의 효소분말을 5 mL 1 M citrate buffer(pH 4.8)에 녹여 원심분리한 후 상등액을 취하여 이를 효소액(E1)으로 사용하였다. 사용된 기본 효소량은 E1, E2, E3, E4 각각 건조물 1 g 당 0.2, 0.04, 0.2, 0.2 ㎖ 이었다.
그 결과, 그물말 건조시료를 속슬렛 추출시 물 추출성분(water-extractive) 무게는 29.5%, 물 추출성분 제거 후 남은 고형분(WEFS)은 건조시료 전체 무게의 70.5%를 차지하였다. 상기 시료에 대해 고압멸균기를 이용하여 1차, 2차 가수분해를 실시한 다음 얻어진 가수분해물을 GC 정성분석한 결과, 도 3에서도 확인할 수 있듯이, 그물말 시료의 주요 당성분은 글루코오스와 만노오스인 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과를 기반으로 하여 그물말 조류에 대한 효소 가수분해물의 당조성 및 함량을 HPLC(RI detector)로 분석하였다. 그 결과 도 4에서 확인할 수 있듯이, 글루코오스와 만노오스가 주요 성분임을 재확인 할 수 있었으며, 각각의 함량은 건조된 바이오 매스 100 g 당 46.82±0.46 g, 10.56±0.48 g이었다.
이는 그물말의 총탄수화물이 64.6%이었던 것을 감안할 때 효소가수분해에 의한 육탄당(glucose＋mannose) 수득율은 총탄수화물 기준 88.8%였고, 바이오매스 건물중 기준 57.4%였다. 이는 조류로부터의 당생성율에 있어서 현재까지 보고된 결과들 중에서 매우 높은 수준임을 확인할 수 있었다.
이상의 결과는 그물말 시료가 발효용, 바이오리파이너리 또는 바이오에너지용 바이오매스로서 매우 우수한 품질의 재료가 될 수 있음을 확인한 결과이다. 왜냐하면 대부분의 상업용 발효균주는 오탄당보다 육탄당을 잘 이용하며 육탄당 중에서도 글루코오스가 다량 함유된 시료를 가장 선호하기 때문이다.
[실시예 2] 바이오매스 종류간 효소당화 용이성의 상대비교
본 발명의 온실조건에서 생장된 그물말이 다른 조류종에 비해 동일조건의 효소당화에서 어느 정도 글루코오스 생성량이 높은지를 상대비교해 보고자 실험하였다. 일반적으로 당화율은 가수분해에 의한 바이오매스내 당 모노머의 회수율로 평가되며 이때 보다 온화한 조건에서 높은 당화율을 보일 때 당화가 용이한 재료라고 평가된다. 그러나 본 실험에서는 당화조건을 고정시키고 당해 조건에서 목표하는 당 모노머가 얼마나 많이 생성되는지를 기준으로 재료 간 상대 비교하였다.
본 실험을 위해서는 그물말, 스피룰리나(Spirulina), 클로렐라(Chlorella), 세네데스무스(Scenedesmus), 클라도포라(Cladophora), 옥수수대(Corn stover) 등 총 6가지 바이오매스가 공시되었다. 효소당화 용이성의 상대비교는 산 가수분해 대비 효소당화에 의해 얻어진 글루코오스 수득율로 평가하였다. 산 가수분해는 바이오매스내 당모노머 함량조사를 위한 NREL에 의해 제시된 방법을(NREL, 2009, Laboratory anayltical procedure) 약간 변형시켜 실시하였다. 즉, 0.1 g의 건조분말시료를 취한 다음 72% sulphuric acid 1.5 ㎖를 넣고, 60℃ bath에 1시간 두었다가(1차 가수분해), 이후 증류수 23.5 ㎖를 가하여 마개를 한 후, 위 아래로 흔들어 혼합시킨 후 121℃에서 1시간 가수분해하였다(2차 가수분해). 이어서 가수분해물을 탄산칼슘으로 중화, 원심분리 후 얻어진 상등액을 가지고 글루코오스(glucose) 함량을 측정하였다. 한편 공시 바이오매스들의 효소당화는 건조 분말시료 0.5 g을 125 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 0.1M citrate buffer(pH 4.8) 23.9 ㎖과 1% NaN3의 1.1 ㎖를 가한 다음, 120℃에서 20분 고압살균 하였다. 무균상에서 효소 E1＋E2 용액을 각각 건조물 1 g 당 0.2, 0.04 ㎖ 양으로 가한 후 50℃, 150 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 시키고, 당화가 끝난 시료는 원심분리를 통해 잔사를 제거시켰다. 상기 사용된 효소는 셀룰라아제(Celluclast Conc. BG, Novozymes사 제품, 5배 희석하여 사용, E1로 표시)와 β-글루코시다제(Sigma C6105, E2로 표시) 이었고, Celluclast Conc. BG의 경우는 1 g의 효소분말을 5 ㎖ 1M citrate buffer(pH 4.8)에 녹여 원심분리한 후 상등액을 취하여 이를 효소액(E1)으로 사용하였다.
잔사 제거 후 상등액을 취하여 Biochemistry analyzer(YSI 2700 SELECT)를 통해 글루코오스 함량을 정량하였고, 상기 사용된 효소 용액 중에는 단백질 안정화를 위해 당이 소량 포함된 경우도 있는 바, 이를 감하여 결과로 나타내었다.
그 결과 하기 표 1에서도 확인할 수 있듯이, 그물말 재료의 경우는 상대적으로 당 함량이 낮은 시료에서는 산 가수분해 대비 효소 당화율이 100% 이상이었고, 당 함량이 높은 시료에서는 효소 당화율이 95 내지 100% 정도였다. 당 함량이 낮은 재료에서 효소 당화율이 100% 이상 높은 이유는 가수분해되어야 할 탄수화물량에 비하여 산농도가 상대적으로 높기 때문에 일부 내용물이 산으로 인해 더 반응이 진전되어 당 이외의 산물(예, HMF)로 전환되었기 때문이라고 추정된다.
그러나 공시된 다른 바이오매스의 경우 스피룰리나, 클로렐라, 세네데스무스 SM1은 산가수분해 대비 효소당화율이 80% 내외, 세네데스무스 SM2는 42.0%, 사상 담수조류인 클라도포라는 30.3%, 초본성 식물인 옥수수대 분말은 49.1%에 불과하였다.
상기의 표 1의 결과는 본 발명의 그물말이 다른 공지의 바이오매스들에 비해 효소당화가 매우 용이함을 보여주는 결과이다.
[실시예 3] 그물말 효소당화에 미치는 여러 요인들의 효과
그물말의 당화에 미치는 여러 요인들의 영향을 알아보기 위하여 일반적으로 널리 사용하는 2% 고형분 함량에서의 효소 당화율을 조사하였다.
식물재료는 온실배양을 통해 수확한 그물말을 45℃에서 건조시킨 후, 믹서기로 분말화 시킨 시료를 사용하였다.
효소당화의 기본적인 실험방법은 건조 분말시료 0.5 g을 125 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 0.1M citrate buffer(pH 4.8) 23.9 ㎖과 1% NaN3의 1.1 ㎖를 가한 다음, 120℃에서 20분 고압살균 하였다. 무균상에서 효소를 가한 후 50℃, 150 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 시켰다. 사용된 효소는 셀룰라아제(Celluclast Conc. BG, Novozymes사 제품, 5배 희석하여 사용, E1로 표시)와 β-글루코시다제(Sigma C6105, E2로 표시) 이었고, Celluclast Conc. BG의 경우는 1g의 효소분말을 5 mL 1M citrate buffer(pH 4.8)에 녹여 원심분리한 후 상등액을 취하여 이를 효소액(E1)으로 사용하였다. 사용된 기본 효소량은 E1, E2, E3, E4 각각 건조물 1 g 당 0.2, 0.04, 0.2, 0.2 ㎖ 이었다.
당화가 끝난 시료는 원심분리를(8000rpm, 20분) 통해 잔사를 제거한 후 상등액을 취하여 Biochemistry analyzer(YSI 2700 SELECT)를 통해 글루코오스 함량을 정량하였고, 상기 사용된 효소 용액 중에는 단백질 안정화를 위해 당이 소량 포함된 경우도 있는 바, 이를 감하여 결과로 나타내었다.
1) 다당류 분해효소의 조합 및 처리 농도별 당화
효소당화 정도는 다당류 분해효소의 종류 및 조합, 처리 농도에 따라 많이 달라질 수 있다. 본 실험은 그물말 시료의 당화 최적화를 위한 효소조합을 탐색하고자 수행하였다. 사전실험에서 E1의 경우 0.2 mL/g DM 처리가 가장 좋았기 때문에 E1을 0.2 mL/g DM으로 고정시키고, 이에 E2를 0.02 내지 0.4 mL/g DM로 혼합시켜 처리했을 때, E1 단독처리에 비해 E2의 추가는 당화율을 증가시켰으며, 0.02 mL/g DM 추가로도 충분하였다.
한편 E1＋E2를 0.2＋0.04 mL/g DM로 고정시키고, 이에 전분분해와 관련된 E3, E4를 각각 0.2 mL/g DM로 혼합시켜 처리했을 때 당화율의 증가 여부를 알아보았다.
그 결과 하기 표 2에서도 확인할 수 있듯이, E1＋E2 혼합처리에 비해 E3＋E4의 추가는 당화속도를 아주 미약하게 증가시키는 경향이었으나 당화정도를 현저히 높이지는 않았다. 따라서 당화율과 효소비용 측면을 종합적으로 고려해 볼 때 HR의 당화에는 E1＋E2의 혼합만으로도 충분할 것으로 판단되었다.
한편 E1＋E2 효소조합의 처리농도를 달리하여 글루코오스 수득율을 확인하였다. 그 결과 도 5에서도 확인할 수 있듯이, 효소량을 최적 조합농도(V4)의 1/2(V3), 1/5(V2), 1/10(V1) 농도로 감소시킴에 따라 글루코오스 최종 생성량은 낮아지는 경향이나 1/10 저농도(V1)로 처리해도 공시된 그물말 시료 종에 따라 약간씩 다르지만 최적처리의 70-80% 정도는 글루코오스가 생성되었다. 최적조건 처리(V4)에서 시료 종류에 따라 생성된 글루코오스량이 달랐던 것은 시료내 탄수화물 함량이 다른 재배환경으로 인해 처음부터 차이가 있었기 때문이다.
2)
Buffer
strength
차이에 따른
당화
Buffer strength는 당화중의 pH 변동과 관련이 있어 효소 당화시 중요하게 고려되어야 한다. Buffer strength가 높으면 고농도 당 농축액을 조제할 때 염도가 높아져 발효에 부정적으로 작용할 수 있다. 따라서 당화율에 영향을 미치지 않는 범위에서 buffer strength가 낮으면 낮을수록 바람직한데 이를 알아보기 위하여 실험하였다.
그 결과 도 6에서도 확인할 수 있듯이, 0.0 내지 0.1M 범위의 buffer strength간에 효소당화로 인해 생성된 글루코오스 함량에 있어서는 차이가 없음을 확인할 수 있었다. 이는 그물말 시료의 경우 0.1 mM 또는 증류수만을 가지고서도 당화가 충분히 이루어지기 때문에 필요한 경우 본 조건을 활용함으로서 고품질의 당화액을 조제할 수 있음을 확인한 결과이기도 하다.
3) 당화 수행 전 온도처리에 따른 당화
단단한 바이오매스의 경우 조직의 연화를 통해 당화가 잘되도록 유도하기 위해서 고온 전처리를 수행하게 된다. 그물말의 경우 어느 정도의 사전 온도처리가 필요한지를 알아보고자 실험하였다. 예비실험에서 그물말 고형분 함량을 2%로 하고 25 내지 120℃ 온도범위 조건에서 20분 전처리를 할 경우, 120℃ 처리에 비해 그 이하의 온도처리에서는 글루코오스 생성량이 약간 낮은 경향을 보였으나 그 정도는 10% 내외였다. 한편 처리온도를 55℃와 120℃로 고정하고 처리 시간을 달리하여 실험한 결과, 도 7에서도 확인할 수 있듯이 처리시간 간에 유의성이 관찰되지 않았다.
상기의 결과로부터 그물말은 필요에 따라 실온조건에서도 당화를 진행시킬 수 있는 재료임이 알 수 있었으며, 일반적으로 당화 도중의 오염을 막기 위해서 멸균과정을 거치는데 이러한 처리로도 그물말의 최적당화는 쉽게 이루어지는 것으로 인정되었다.
또한, 상기의 결과로부터 그물말은 특별한 온도 전처리가 없어도 당화가 잘 이루어지는 매우 흥미로운 특징을 가진 것을 확인할 수 있었다.
4) 당화온도 및 당화액 pH의 차이에 따른 당화 정도
당화시의 온도는 효소활력과 밀접한 관련이 있다. 특히 당화/발효를 동시에 하기 위해서는 발효균주의 활성온도(일반적으로 37℃ 내외)에서 효소당화가 잘 이루어지는 것이 필요하기에, 이를 확인하고자 실험하였다.
그 결과 도 8에서 확인할 수 있듯이, 그물말 시료를 가지고 40℃와 50℃ 조건에서 효소당화를 실시하였을 때 당화 정도차이는 없이 건조물 100 g당 45 g 내외의 글루코오스가 생산되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 통상의 발효미생물의 경우 일반적인 생육온도에서도 당화가 잘 이루어지기 때문에 상기 실시예 3 내지 실시예 6의 당화/발효 공정에 유용한 조건임을 확인한 결과이다.
한편, 당화시의 pH도 효소활력과 밀접한 관련이 있다. 특히 당화/발효를 동시에 하기 위해서는 발효 균주의 적정 pH(예를 들면, 젖산 균주는 pH 4.5 내지 5.0, 숙신산 균주는 pH 6.0 내지 7.0)에서 효소당화가 잘 이루어지는 것이 필요하기에, 적용 pH 범위를 알아보고자 실험한 결과, 하기 표 3에서도 확인할 수 있듯이, 당화를 위한 반응액의 pH가 6.5일 때에도 pH 4.8일 때와 동일한 글루코오스 생성율을 나타내었다.
상기 표 3의 결과는, pH가 6.5에서 생육이 잘되는 발효 미생물을 가지고서도 전처리 및 당화과정을 별도로 하지 않고 발효공정과 통합시켜 당화를 진행할 수 있어 생산비가 매우 절약되는 공정개발이 가능한 재료로서 화학제품 원료물질 생산에 있어서 경제성 확보에 매우 유리한 특성을 가짐을 확인한 결과이기도 하다.
5) 생체시료와 건조시료간의 당화정도 비교
일반적으로 당화는 건조된 시료를 가지고 원하는 시간에 수행하는 것이 편리 하겠지만 때에 따라서는 건조과정 없이 수집된 생체시료 자체를 직접 당화시킬 필요도 있을 것이다. 특히 경제성 측면에서는 건조과정을 두지 않는 것이 더 유리할 수 있기 때문에 그물말 생체시료 자체로도 당화가 잘 이루어지는지를 실험하였다. 본 실험에서는 전 실험과는 달리 6월 야외에서 확보한 후 물기만 제거된 생체시료와 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조한 것을 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 것을 시료로 사용하였다.
상기 시료의 최종 건물중이 1.0 g이 되도록 생체 및 건조체 시료를 250 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 최종적으로 용액부피가 50 ㎖되도록 0.1M citrate buffer(pH 4.8)＋1% NaN3를 가한 다음, 120℃에서 20분 고압 살균하였다. 기타는 상기 기본 효소당화방법과 같았다.
그 결과 도 9에서도 확인할 수 있듯이, 당화 후 2시간째에는 생체 보다는 건조체 시료에서 글루코오스 함량이 보다 높게 나타났는데 이는 건조조직이 효소 작용에 적합한 환경조건으로 빨리 변화될 수 있었기 때문으로 추정된다.
그러나 4시간 이후부터는 건조체 시료보다 생체시료에서 글루코오스 생성량이 높았으며 16시간째에는 두 시료 모두 당화가 거의 완료되는 경향을 보였다. 이는 그물말 시료가 생체 조건에서도 당화가 충분히 진행될 수 있기 때문에 보다 폭 넓은 당화공정 기술을 개발할 수 있음을 확인한 결과이기도 하다.
6) 조직 분쇄여부에 따른 당화정도
일반적으로 곱게 분쇄된 바이오매스일수록 효소 당화효율이 높다고 알려져 있다. 그러나 분쇄의 경우도 조직에 따라 에너지가 많이 소요되기 때문에 경제적 당화를 위해서는 분쇄과정이 생략될수록 유리하다. 본 실시예에서는 그물말 시료의 분쇄여부에 따른 당화정도에 차이가 있는지를 알아보고자 실험하였다.
그 결과 도 10에서도 확인할 수 있듯이 당화 개시 후 24시간과 48시간째의 것을 취하여 생성된 글루코오스함량을 측정한 결과, 그물말 시료를 분쇄한 것과 분쇄하지 않은 것 간에 함량차이가 거의 없음을 확인할 수 있었다.
이는 그물말을 수확한 다음 조직을 분쇄하지 않고 그대로 당화시킬 수 있음을 의미하므로 당용액을 경제적으로 생산하는데 있어서 우수한 특징을 가짐을 확인한 결과이기도 하다.
7) 물 또는 알코올 추출물 제거에 따른 그물말의 당화
식물세포 내에는 탄수화물 뿐 아니라 단백질, 지질, 무기물, 기타 이차대사산물 등의 다양한 화합물이 존재한다. 그리고 그들은 세포내에 자유롭게 존재할 수도 있지만 조직 구성물 내에 치밀하게 존재할 수도 있어 어떤 식으로든 조직의 와해 및 셀룰로오스의 당화에 직간접적으로 영향을 미친다.
따라서 본 실험에서는 그물말 시료에 대해 물 또는 알코올로 추출될 수 있는 성분이 제거된 조직이 그렇지 않은 것에 비해 당화효율이 우수한지 여부를 알아보고자 실험하였다.
식물재료로는 온실에서 배양한 그물말을 수확하여 탈수시킨 다음 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말 또는 분말화 하지 않은 건조체를 실험재료로 사용하였다.
속슬렛 장치를 이용한 물 추출성분이 제거된 고형분(Water-extractive free solid, WEFS) 제조의 경우, 2 g의 건조 분말시료를 thimble(28×100 mm)에 넣고 190 ㎖의 물을 이용하여 맨틀온도 250℃에서 약 8시간 추출한 다음, 잔사를 취하여 45℃에 1일 동안 건조시켜 조제하였다.
물 및 에탄올 추출성분이 제거된 고형분(Waterðanol-extractive free solid, EFS) 제조의 경우는 2 g의 건조 분말시료를 thimble(28×100 mm)에 넣고 190 ㎖의 물을 이용하여 맨틀온도 250℃에서 약 8시간 추출한 후, 이를 다시 190 ㎖ 에탄올로 맨틀온도 150℃에서 3 내지 4시간 추출한 후, 잔사를 취하여 45℃에 1일 동안 건조시켜 조제하였다.
70% 메탄올 추출성분이 제거된 고형분(70% methanol-extractive free soild, MEFS) 제조는 상기 건조체 미분말 시료를 70% 메탄올에 실온에서 1주일 담가 추출하였다. 즉 100 g의 건조체 미분말 시료를 대형병에 넣고 4 L의 70% 메탄올을 이용하여 실온에서 3일 추출한 다음, 잔사를 취하여 다시 70% 메탄올로 3일 동안 한 번 더 추출하였다. 추출 후 남은 잔사를 취하여 45℃에 1일 동안 건조시켜 실험에 사용하였다.
상기와 같이 조제된 고형분 WEFS, EFS, MEFS의 효소당화 후 생성된 글루코오스 함량을 분석한 결과, 하기 표 4에서도 확인할 수 있듯이 100 g 건조 바이오매스 중량당 35.2, 41.6, 42.0, 47.8 g으로서 무처리 < WEFS, MEFS < EFS 순으로 글루코오스 생성량이 증가되었다.
WEFS와 EFS의 증가된 글루코오스 생성은 당화효율이 증가 되었다기 보다는 추출물이 제거된 상태에서 셀룰로오스 성분을 가진 조직이 상대적으로 높게 포함되었기 때문으로 해석된다. 이는 그물말의 경우 당화율을 높이기 위해 추출과 같은 다른 처리가 필수적으로 필요치 않음을 의미하는 것으로서 경제적 당용액 생산에 유리한 특성을 보여 주는 결과이기도 하다.
[
실시예
4]
그물말
고형분 함량에 따른
당화율과
발효억제물질 함량조사
1) 그물말 고형분 함량에 따른 당화율 변화
고농도 당용액을 경제적으로 생산하기 위해서는 당화액 내의 고형분 함량(solid loading)이 높을수록 바람직하다. 그러나 고형분 함량이 너무 높으면 물리적으로 교반이 어려워질 뿐 아니라 효소의 조직 내 침투가 어렵고 또한 생성된 고농도의 당은 피드백 저해(feedback inhibition)에 의해 효소의 활성을 억제하기도 하여 오히려 비효율적일 수 있으며, 그 정도는 식물종류 및 조직 상태에 따라 다른 것으로 알려져 있다.
따라서 고형분 함량에 따른 당화정도를 실험하여 적정조건을 탐색하는 것은 고품질 당용액 생산에 있어서 매우 중요하다. 본 실시예에서는 그물말 시료에 대해 고형분 함량에 따른 당화 및 글루코오스 생성 패턴을 파악하기 위해 실험하였다.
식물재료는 온실에서 배양한 그물말을 수확하여 탈수시킨 다음 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다(HR-d3). 본 시료는 글루코오스 함량이 약 40 내지 45% 함유되는 것으로 조사되었다.
125 ㎖ 삼각 플라스크에 상기 건조시료를 고형분 함량이 2 내지 10%(w/v) 되도록 넣고 0.1M citrate buffer(pH 4.8) 23.9 ㎖와 1% NaN3의 1.1 ㎖를 가한 다음, 120℃에서 20분 고압살균하였다.
무균상에서 효소용액을 고형분 함량에 비례하여 가하였는 바, 사용된 효소량은 E1＋E2＋E3＋E4를 건조물 1 g당 0.2＋0.04＋0.2＋0.2 ㎖ 수준이었다. 이후 50℃, 150 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 시키고, 당화액내의 글루코오스 생성정도를 biochemistry analyzer(YSI 2700 SELECT)로 분석, 정량하였다.
그 결과 도 11에서도 확인할 수 있듯이, 그물말 건조시료의 고형분 함량이 10% 될 때 까지는 어떠한 장애 없이 비례적으로 글루코오스 생성량이 증가되어 10%(w/v) 고형분 함량 처리구에서는 약 4.1% 내외의 글루코오스가 함유된 당용액이 생산되는 것을 확인할 수 있었다.
본 그물말 시료의 경우는 건조물 100 g당 약 45 g 전후의 글루코오스가 생성될 수 있는 시료로서 10%의 고형분 함량까지도 당화율에 있어서는 큰 변함이 없는 것으로 나타났다.
2) 당화시료 내의 발효억제 물질(HMF, furfurals) 함량조사
바이오매스 기원 당용액으로부터 화학제품 원료물질을 생산하기 위해서는 고농도 당용액을 제조하여 생물학적 전환을 위한 발효용 기질로서 제공하여야 한다. 이때 중요하게 고려되어야 할 사항은 발효에 유용한 당이 가능한 한 최대로 많이 함유되면서 발효 균주의 생육을 저해하는 물질이 최소화되어야 한다.
그런데 일반적으로 당화효율을 높이기 위해 바이오매스를 고온/고압처리 하거나, 산 가수분해 처리를 하게 되는데 이 작업과정에서 당이 화학적 전환을 일으켜 하이드록시메틸풀푸랄(Hydroxymethylfurfural, HMF) 및 풀푸랄(furfural)이 생성되고, 이는 발효 균주의 강력한 저해제로 보고되고 있다.
본 실시예에서는 그물말 시료를 가지고 고형분 함량별 효소당화 과정에서 HMF와 풀푸랄가 어느 정도 생성되는지를 알아보고 발효 균주의 억제여부를 예측해 보고자 실험하였다.
발효억제물질의 분석은 HPLC(Waters)로 HMF와 풀푸랄를 정량하였다. 컬럼은 Comosil 5C18-MS-II(4×150 mm)을 사용하였고, 이동상은 100% 증류수(Pump A)와 100% 메탄올(Pump B)로 시간별 구배를 두었으며, 유량은 0.6 ㎖/min, 측정 파장은 280 nm이었다.
고형분 함량이 2 내지 10%(w/v)이 되도록 하여 효소당화시킨 시료의 퓨란 유도체를 분석한 결과, 하기 표 5에서도 확인할 수 있듯이, HMF는 미량 검출되었으나 furfurals는 검출되지 않았다.
상기의 결과를 바탕으로, 그물말 건조시료로부터 10% 글루코오스 함량의 당농축액을 제조했을 때 포함될 수 있는 HMF의 농도가 15 내지 28.3 ppm(0.12 내지 0.23 mM)임을 확인할 수 있었다. 보고에 의하면 HMF의 경우 대장균(E. coli)에 대해 0.265% 농도에서 50% 생육을 저해하고, 기타 균주에 대해서 0.1 내지 0.5%에서 저해하는 것으로 보고된 바(Almeida. Appl. Microbiol. Biotechnol, 82:625-638(2009)), 이에 준하면 본 그물말 유래 당용액(10% 글루코오스 함량)은 HMF의 생육저해활성 농도 보다 50배 이상 낮게 함유되어 있기 때문에 발효 균주를 전혀 저해하지 않음을 예측할 수 있었다.
[실시예 5] 그물말로부터 효소가수분해를 통한 글루코오스 고함유 당용액 생산
바이오매스 기원 당용액으로부터 화학제품 원료물질을 생산하기 위해서는 당 자체를 고순도로 분리정제하여 화학적 전환용으로 사용하든지, 또는 고농도 당용액을 제조하여 생물학적 전환을 위한 발효용 기질로서 제공하여야 한다.
이를 위해서는 유용한 당이 가능한 최대로 많이 함유되면서 화학적 간섭 또는 생육억제물질이 최소화되도록 조제하는 기술이 확보되어야 한다. 하기 실험에서는 효소가수분해를 통한 고농도 당용액 생산방법에 관하여 검토하였다.
1) 여러 형태의 그물말 바이오매스를 이용한 고농도 당농축액 생산
본 실험에서는 몇 가지 처리된 그물말 시료를 가지고 효소당화 및 농축과정을 통해 고농도 당용액을 제조하는 방법을 실험하고자 하였다.
식물재료는 온실에서 배양한 그물말을 수확하여 탈수시킨 다음 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후, 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다(HR-d2 및 HR-d16).
당농축액 제조는 그물말 건조시료, 물 추출물이 제거된 잔사(WEFS) 및 물/에탄올 추출물이 제거된 잔사(EFS)를 가지고 제조하였다. 물 및 에탄올로의 추출은 실시예 1에서와 같았다.
상기와 같이 조제된 건조분말시료(분말, WEFS 및 EFS)를 가지고 당화액을 제조하기 위해서는 건조시료(6 g)를 500 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 0.05 M 시트레이트 완충용액(pH 4.8) 100 ㎖을 가한 다음(고형분 함량 6%, w/v), 120℃에서 20분 고압살균하였다.
사용된 효소는 셀룰라아제(Celluclast Conc. BG., Novozymes사 제품, 5qo 희석하여 사용, 하기 ‘E1’로 표시) 및 β-글루코시다아제(Sigma C6105, 하기 ‘E2’로 표시)이다. 무균상에서 여과 멸균된 다당류 분해효소 E1＋E2 용액을 각각 건조물 1 g 당 0.2＋0.04 ㎖ 양으로 가한 후 50℃, 170 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 하였다.
당화가 끝난 시료는 원심분리를(8000 rpm, 20분) 통해 1차 상등액을 취하고, 이어 멸균수를 넣고 부유시킨 다음 동일한 조건으로 원심분리하여 2차 상등액을 취하였다. 1차 및 2차 상등액을 수집하여 혼합한 다음 적당량의 알코올을 가하면서 감압건조기로 물 및 용매를 건조시켰다. 당농축액 내의 글루코오스 함량은 시료를 증류수에 희석하여 생화학 분석기(YSI 2710 SELECT)로 분석 및 정량하였다.
상기 표 6에서도 확인할 수 있듯이, HR-d16 건조시료의 양을 6%(w/v)로 하여 당화시킨 다음 이로부터 당농축액을 제조할 경우, 120 g의 건조 HR에서 약 133.8 g의 당농축액을 얻을 수 있었다. 이에 동일 무게의 멸균수와 혼합하여 글루코오스 함량이 15.6%인 당농축액을 제조할 수 있었다.
한편 WEFS 및 EFS 48 g을 동일한 방법으로 조제하였을 때 약 40 g 내외의 당농축액을 얻을 수 있었고, 이를 동일 무게의 멸균수와 혼합하여 얻어진 당용액(약 70 ㎖)의 글루코오스 함량은 각각 15.8 및 18% 정도였다. 이는 WEFS 및 EFS를 이용했을 때 직접 분말화한 건조시료 보다 약간 더 높은 고농도 당용액을 제조할 수 있음을 시사해 준다.
그러나 물/에탄올 추출 경비 등을 고려한다면 그 효과가 낮을 수 있겠으나 물/에탄올 추출물이 어떤 추가 공정에 따른 경비를 고려한다면 본 방법이 매우 유용할 것으로 판단된다. 한편 물/에탄올 추출물 제거 없이 직접 분말화한 그물말과 시료를 가지고 당용액을 조제하여도, 적어도 글루코오스 함량이 10% 이상이 되면서 발효에 직접 적용할 수 있는 정도의 용액을 손쉽게 확보할 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 한편 대량의 당화액 생산을 가정해서 보다 효율적으로 당농축액을 얻고자 1차적으로 당화액내의 물을 여과하는 방안을 검토하였다. 즉, HR-d23 건조시료 6 g을 500 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 50 mM 시트레이트 버퍼(pH 4.8) 100 ㎖을 가한 다음, 120℃에서 20분 동안 고압살균하고, 상기와 같은 방법으로 당화를 실시한 후 원심분리를 통해 당화액을 수득하였다. 수회 실험을 통해 수집한 당화액(MFHS 라고 명명함) 10.6 L를 4“ PVDF 중공사 모듈을 통해 여과하고 일부 물을 제거시킨 것을 상기와 같이 적당량의 알코올을 가하면서 감압건조기로 물 및 용매를 건조시켰다.
그 결과 초기 당화액(글루코오스 함량 1.14%)을 중공사 모듈로 여과했을 때의 글루코오스 함량은 2.14%로서 약 2배로 농축되었고, 여과된 용액 내의 당 함량은 거의 무시할 정도였다. MFHS 1차 농축액 2,500 ㎖만을 취하여 감압건조기를 사용하여 추가 농축한 결과, 완전 농축시 128.5 g 얻어졌으며 여기에 동일 무게의 멸균수를 넣어 섞어준 다음(총 257.0 g) 발효용 당용액을 조제(MFHS 2차 농축액)한 경우, 이때의 글루코오스 함량은 13.5±1.6%(w/w) 이었다.
따라서 본 방법을 통해 대량의 당화액을 적어도 글루코오스 함량이 10% 이상이 되면서 발효에 직접 적용할 수 있는 정도의 당농축액을 보다 빠르게 확보할 수 있음을 확인할 수 있었다.
2) 고농도 그물말 고형분에서의 당화액 제조
당함량이 높으면서 발효억제 물질이 낮은 소위 “고품질 당용액”을 경제적으로 얻기 위해서는 우선 고농도 고형분 함량을 가지고 당화할 수 있어야 하며 이후, 당화율이 높으면서 당화시간이 짧은 공정을 개발하는 것이 필요하다.
그러나 일반적으로 고농도 고형분 함량에서의 가수분해는 여러 원인에 의해 당화율이 감소된다. 본 실험에서는 열(heat) 및 효소가수분해를 겸용함으로서 그물말의 고농도 함량을 가지고 보다 효율적으로 당화액을 생산하는 방법을 개발하고자 실험하였다.
식물재료는 온실에서 배양한 그물말을 수확하여 탈수시킨 다음 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다(HR-d23 및 HR-d31). 본 시료(25% 고형분)는 글루코오스 함량이 각각 35% 및 45% 내외 함유되는 것으로 조사되었다.
125 ㎖ 삼각 플라스크에 상기 건조시료 5 g 및 20 ㎖ 증류수에 넣어 25%(w/v) 고형분 함량이 되도록 한 다음 121℃에서 20분 고압살균 하였다. 그 후 NaN3가 포함된 0.1 M 시트레이트 버퍼(1% NaN3 8.4 ㎖ 및 버퍼 91.6 ㎖, pH 4.8) 23.88 ㎖를 주입한 다음, 1 M HCl 용액을 가하여 pH를 4.8 내지 5.0으로 조정해 주었다. 효소는 셀룰라아제(Celluclast Conc BG, Novozymes사 제품, 5배 희석하여 사용, 하기 ‘E1’로 표시) 및 β-글루코시다아제(Sigma C6105, 하기 ‘E2’로 표시)를 사용하였다.
무균상에서 이들 시료에 여러 농도의 효소용액 E1＋E2(5:1)를 가하였는바, 사용된 효소량은(E1＋E2) 건조물 1 g당 0.024 내지 0.24 ㎖ 수준이었다. 이후 50℃, 170 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해하고, 당화액 내의 글루코오스 생성정도를 생화학 분석기(YSI Incorporated, YSI 2700 SELECT)로 분석 및 정량하였다. 아울러 동일 시료에 대해 환원당 함량을 보고된 방법에(T. Matrai et al. Inter. J. Food. Microbiol. 61:187-191(2000)) 따라 분석하였다.
그 결과, 상기 표 7에서도 확인할 수 있듯이, 공급된 효소량이 그물말 건조시료 g당 0.12 ㎖ 미만으로 낮을 때는 당의 생성 정도도 낮고, 생성 속도도 느려져 48시간 동안 당화를 하여야 했으나, 효소량이 0.12 ㎖ 이상일 때는 당화가 24시간 반응으로 거의 종료되었으며, 효소량이 0.24 ㎖ 처리된 것과 당 농도의 차이가 없었다.
상기 결과를 통해서 본 방법을 통해서도 농축과정 없이 HR-d23 및 HR-d31 시료를 가지고 각각 3.1 및 4.2% 내외의 글루코오스 함유 당용액(환원당 기준으로 볼 때는 3.8 및 5.0% 당용액)을 생산할 수 있었다. 그리고 효소량을 초기 결정농도의 절반으로 감소시켜도 당화에는 큰 지장이 없었으며, 보다 고농도의 고형분 함량을(25% S/L) 한꺼번에 고압살균 할 수 있음으로써 보다 경제적인 당화공정을 수립할 수 있음을 확인할 수 있었다.
[실시예 6] 그물말로부터 촉매를 통한 당용액 제조
바이오매스 가수분해 방법 중에서 효소 가수분해는 비용이 높은 것으로 알려지고 있다. 본 실험에서는 촉매를 통해 그물말 시료를 효율적으로 가수분해 할 수 있는 보다 효율적인 방법 및 최적조건을 알아보기 위해 실험하였다.
(1) 황산을 이용한 당용액 제조
온실조건에서 재배하여 수확한 그물말을 건조시켜 분말로 만든 다음, 이를 실험재료로 사용하였다(HR-d13). 촉매로서 사용된 산은 황산 및 염산이며, 가수분해 방법 및 조건(고형분 함량, 산농도, 온도 및 시간 등)은 결과에 제시되어 있다. 산 가수분해 효과를 알기 위해서 가수분해물 내의 글루코오스, 환원당, 하이드록시메틸풀푸랄(HMF) 및 풀푸랄 함량을 실시예 2 및 실시예 3에서와 같은 방법으로 조사하였다.
사전 실험에서 실용적으로 의미가 있는 고형분 함량(2% w/v 이상)에서의 산 농도별 및 반응온도별 산 가수분해 효과를 실험한 결과, 2% 산농도에서 120℃, 1시간 반응의 경우 가장 바람직한 것을 확인하였다. 그리하여 그물말(HR d13) 2 내지 8% 고형분 함량에서 2% 황산으로 산 가수분해(1단계 가수분해, one-step hydrolysis)를 실시하였다.
그 결과 하기 표 8에서 확인할 수 있듯이, 고형분 함량 증가에 따라 글루코오스 생성량에는 큰 차이가 없었으나 4% 고형분 함량에서의 글루코오스 생성량이 27.4 g/100g DW로 가장 높은 경향을 나타내었다.
그러나 상기의 방법에서는 산 가수분해를 이용한 당화방법이 효소당화 방법(고형분 함량이 2% 및 8% S/L 이었을 때 생성된 글루코오스 함량이 각각 40.8±2.52 및 37.47±0.31 g/100g DM 이었음)보다 상당히 낮은 결과를 보여주어 산 가수분해 자체만으로는 당화율이 효소당화의 73% 정도에 그치는 경향이었다.
상기 문제점을 개선하기 위해 2단계 가수분해(two-step hydrolysis)를 수행하였다. 즉 여러 무게의 그물말 건조시료에 72% 황산 1 ㎖을 넣고 30℃에서 1시간동안 1차 가수분해 한 후, 24 ㎖ 증류수를 가한 다음 120℃에서 1시간 반응하였다.
그 결과 도 12에서도 확인할 수 있듯이, 기대수치에는 미치지 못하지만 4% 고형분 함량까지는 글루코오스 생성량이 29.3 g/100g DM 이상으로서 1단계 가수분해에 비해 당화가 더 잘 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과를 바탕으로 2단계 가수분해를 보다 최적화시키기 위하여 그물말 고형분 함량을 4% (w/v)로 고정시키고 1차 가수분해시의 산처리 부피 및 온도를 조정하였다.
그 결과 상기 표 9에서도 확인할 수 있듯이, 1차 가수분해 시 그물말 건조중 : 72% 황산의 비를 1 g : 1.5 ㎖로 하여 60℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 증류수 23.5 ㎖를 가한 후 4% 고형분 함량에서 120℃ 1시간 가수분해하면 가장 바람직한 결과를 얻게 되었다.
이 경우, 1.1 내지 2.2%의 글루코오스 및 1.8 내지 2.9%의 환원당 함량을 가진 당용액을 수득할 수 있었고, 그물말 건물중 기준으로 볼 때 30 내지 35%가 글루코오스로, 50 내지 54%가 환원당으로 전환될 수 있는 조건이었으며(고형분 함량을 낮추어 최적 조건에서 산가수분해 했을때의 85 내지 90% 수준임), 이 때 생성되는 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄 함량은 227.5 ㎎/L 및 40 ㎎/L 이하 수준 이었다
한편 HR-d13의 효소당화의 경우, 고형분 함량이 2% 및 8% S/L 이었을 때, 생성된 글루코오스 함량이 각각 40.8±2.52 및 37.47±0.31 g/100g DM 이었는데 결국, 4% 고형분 함량에서 당화시킬 경우(2차 가수분해 기준), 산 가수분해만을 통해서도 글루코오스를 효소당화의 90 내지 95%까지 수득할 수 있기 때문에 상기의 결과로부터, 본 발명의 2단계 산 가수분해를 통한 당화 공정은 저비용 당화액 조제에 충분히 적용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
(2) 염산을 이용한 당용액 제조
상기 (1)의 당용액 제조에 있어서, 황산 대신 염산을 이용한 것을 제외하고는 상기 (1)의 당용액 제조방법과 동일한 방법으로 제외한다.
그 결과, 황산과 유사한 결과를 확인할 수 있었다.
[실시예 7] 고농도 그물말 고형분으로부터 다당류 분해효소와 촉매의 혼합 가수분해를 통한 당용액 제조
당함량이 높으면서 발효억제 물질이 낮은 소위 “고품질 당용액”을 경제적으로 얻기 위해서는 우선, 고농도 고형분 함량을 가지고 당화할 수 있어야 하며 이후 당화율이 높으면서 당화시간이 짧은 공정을 개발하는 것이 필요하다.
그러나 일반적으로 고농도 고형분 함량에서의 가수분해는 여러 원인에 의해 당화율이 감소된다. 본 실험에서는 촉매 및 효소가수분해를 겸용함으로써 그물말 시료 고농도 함량을 가지고 보다 효율적으로 당화액을 생산하는 방법을 개발하고자 실험하였다.
식물재료는 온실에서 배양한 그물말을 수확하여 탈수시킨 다음 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 2일 동안 건조시킨 후 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다(HR-d23). 본 시료는 글루코오스 함량이 35% 내외 함유되는 것으로 조사되었다.
125 ㎖ 삼각 플라스크에 상기 건조시료 5 g을 2% 염산 20 ㎖에 넣어 25%(w/v) 고형분 함량이 되도록 한 다음 121℃에서 20분 고압살균 하였다. 그 후 NaN3가 포함된 0.1 M 시트레이트 버퍼(1% NaN3 8.4 ㎖ ＋ 버퍼 91.6 ㎖, pH 4.8) 23.88 ㎖를 주입한 다음, 10 N NaOH 용액을 가하여 pH를 4.8 내지 5.0으로 조정해 주었다.
효소가수분해를 위해 사용된 효소는 셀룰라아제(Celluclast Conc BG, Novozymes사 제품, 5배 희석하여 사용, 하기 ‘E1’로 표시) 및 β-글루코시다아제(Sigma C6105, 하기 ‘E2’로 표시)이다. 무균상에서 시료에 여러 농도의 효소용액 E1＋E2(5:1)를 가하였는바, 사용된 효소량(E1＋E2)은 건조물 1 g당 0.024 내지 0.24 ㎖ 수준이었다. 이후 50℃, 170 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 시키고, 당화액내의 글루코오스 생성정도를 생화학 분석기(YSI Incorporated, YSI 2700 SELECT)로 분석 및 정량하였다. 아울러 동일 시료에 대해 환원당 함량, 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄 함량을 실시예 5 및 실시예 4에서와 같은 방법으로 조사하였다.
그 결과 상기 표 10에서도 확인할 수 있듯이, 24시간 반응까지는 증류수 보다 약산처리 이후, 효소 처리한 샘플에서 글루코오스의 생성량이 높게 나타났다. 그러나 48시간 반응의 경우는 E1＋E2 효소처리량이 g 건물중 당 0.06 ㎖ 이하에서만 대조구(증류수 처리) 보다 약산처리에서 글루코오스 생성량이 높게 나타났고 효소처리량 0.12 ㎖ 이상에서는 두 처리 간에 차이가 없었다. 이는 약산처리로 인해 보다 적은 효소량으로 보다 빨리 당화시킬 수 있음을 나타낸다.
또한, 상기 표 11에서도 확인할 수 있듯이, 약산처리 된 시료의 당화는 효소 첨가량에 관계없이 24시간이면 당화가 거의 종료되는 특징을 보였다. 그리고 24시간 반응한 당화액내의 글루코오스 및 환원당 농도는 각각 3.4 내지 3.6% 및 5.2 내지 5.4%로, 효소 가수분해만을 실시했던 것과 비교하여 유사하거나 오히려 높은 결과를 보여주었다.
상기의 결과로부터 HR-d23 보다 탄수화물 함량이 높은 시료(예, HR-d31)를 가지고 당화시킬 경우는 이보다 더 높은 당 농도의 당화액을 얻을 수 있음을 추측할 수 있었다.
한편, 당화액내의 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄 농도를 조사하였다.
상기 표 12에서도 확인할 수 있듯이, 효소처리량에 상관없이 하이드록시메틸풀푸랄 농도는 0.016 내지 0.018% 정도였고, 풀푸랄 함량은 이보다 훨씬 낮은 0.0015 내지 0.0022%를 나타내었다.
상기의 결과는 2단계의 산 가수분해에서 HMF가 0.022% 이었던 것 보다(실시예 6) 낮은 수치이며, 보고에 의하면 하이드록시메틸풀푸랄의 경우 대장균(E. coli)에 대해 0.265% 농도에서 50% 생육을 저해하고, 기타 균주에 대해서 0.1 내지 0.5%에서 저해하는 것으로 보고된 바(Almeida. Appl. Microbiol. Biotechnol, 82:625-638(2009)), 이에 준하면 본 방법의 그물말 유래 당용액은 하이드록시메틸풀푸랄의 생육저해활성 농도 보다 50배 이상 낮게 함유되어 있기 때문에 발효 균주를 저해하지 않을 가능성이 매우 높음을 예측할 수 있었다.
실제로 본 실험에서 생산된 당화액을 가지고 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 젖산 균주 생장에 미치는 영향을 관행방법으로 조사를 했을 때 정상적으로 증식됨을 확인하였다.
따라서 촉매로서 약산과 효소가수분해를 겸용하는 본 방법은 25% 고형분 함량 조건에서 당화수득율의 감소 없이 보다 빠르게 시료를 당화시키면서 고품질의 당화액을 얻을 수 있는 유용한 방법임을 확인할 수 있었다.
[실시예 8] 담수조류 중 그물말(HR)로부터 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산의 생산
상기 실시예 3의 결과들로부터 그물말 시료가 당화하기 쉬운 특성이 있음을 확인하였으며, 이는 그물말 바이오매스를 직접 이용하여 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통해서 특정 유용물질을 생산할 수 있음을 시사한다. 따라서 본 실시예에서는 한 반응기에 그물말 바이오매스와 당화효소 및 발효균주를 혼합하여 젖산을 생산하는 방법을 조사하였다.
식물재료로서 온실에서 배양한 그물말 조류를 수확하여 탈수시킨 다음, 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후, 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다. 필요에 따라서는 물/에탄올 추출성분이 제거된 고형물(Extractive-free solid, WEFS, EFS)도 이용하였다.
발효 균주로서 한국생물자원은행에서 분양받은 락토 바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, KCTC 3510)과, 본 발명자들이 선별한 새로운 신균주인 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, 기탁 균주번호 KCTC 11883BP)를 이용하였다. 상기 균주들은 각각 L-lactic acid를 93±1, 94±1%, D-lactic acid를 7±1, 6±1% 생산하는 특징을 가진다.
효소당화를 위해 4가지 다당류 분해효소(E1＋E2＋E3＋E4)를 조합하여 사용하였다. 즉, E1은 셀룰라아제(Celluclast 1.5L CCN03110, Novozymes A/S), E2는 β-글루코시다제(Novozyme-188, Sigma C6105), E3은 α-아밀라아제(Sigma A8220), E4는 아밀로글루코시다아제(Sigma A7095)를 사용하였다.
젖산 생산을 위한 공정은 50 mL 규모로 실시하였다. 배지는 MRS medium 2를 사용하였다. 발효공정은 두 가지를 설정하였는 바, 조류 바이오매스 건조시료를 일정량 넣고 배지와 다당류 분해효소를 공급한 다음, 1일 후에 발효 균주를 첨가하거나(연속공정, A process), 배지/다당류 분해효소/발효 균주를 동시에 공급하여 발효를 진행하였다(동시공정, B process).
가) 연속공정(A process):
하기 표 13과 같은 조성의 MRS medium 2(pH 4.8)가 50 mL 포함된 500 mL 삼각플라스크에 그물말 건조시료 5.0 g 또는 7.5 g을 넣고, 121℃에서 20분 동안 고압멸균 하였다.
상기 고압멸균된 시료를 실온까지 식힌 다음, 0.45 um membrane filter에 여과시킨 효소 복합물 E1＋E2＋E3＋E4(1.0＋0.2＋1.0＋1.0 mL)를 모든 처리구에 첨가하고 50℃, 170 rpm에서 24시간 동안 당화시켰다.
상기 당화중인 시료를 꺼내어 37℃로 낮춘 다음, 사전에 준비된 발효 균주(LAB3510, LA104) 농축액을 0.5 mL 접종하여 37℃에서 3일간 교반배양하면서 당화/발효시켰다.
발효 균주의 농축을 위해서는 하기 표 14의 MRS broth medium에 1일간 사전배양(37℃, 150 rpm)한 균주를 원심분리하여(9000 rpm, 15분, 4℃) 모은 것을 사용하였다.
상기 3일간 당화/발효시킨 시료를 꺼내어 동일 배지로 10배 희석한 후 원심분리를(8000 rpm, 20분, 4℃) 통해 탄산칼슘, 세포, 시료 잔유물 등을 제거하였다. 상등액을 취해 pH를 2로 조정한 다음 적당히 희석하여 글루코오스 및 젖산 함량을 biochemistry analyzer(YSI 2700)로 분석하였다.
나) 동시공정 1 (B process 1, one-step feeding):
상기 표 13과 같은 조성의 medium 2(pH 4.8)가 50 mL 포함된 500 mL 삼각플라스크에 그물말 건조시료 5.0 g 또는 7.5 g을 넣고, 121℃에서 20분 동안 고압멸균 하였다.
상기 고압멸균된 시료를 실온까지 식힌 다음, 0.45 um membrane filter에 여과시킨 효소 복합물 E1＋E2＋E3＋E4(1.0＋0.2＋1.0＋1.0 mL)와 사전에 준비된 발효 균주(LA104, LAB3510) 농축액을 0.5 mL 접종하여 37℃에서 3일간 교반배양하면서 당화/발효시켰다. 기타 방법은 가) 연속공정 실험에서와 동일하였다.
다) 동시공정 2 (B process 2, two-step feeding):
상기 표 13과 같은 조성의 medium 2(pH 4.8)가 50 mL 포함된 500 mL 삼각플라스크에 그물말 건조시료 5.0 g을 넣고, 121℃에서 20분 동안 고압멸균 하였다.
상기 고압멸균 된 시료를 실온까지 식힌 다음, 0.45 um membrane filter에 여과시킨 효소 복합물 E1＋E2＋E3＋E4(1.0＋0.2＋1.0＋1.0 mL)와 사전에 준비된 발효 균주(LA104, LAB3510) 농축액을 0.5 mL 접종하여 37℃에서 교반배양(170 rpm) 하였다. 그 후 배양 1일째에 고압멸균된 그물말 건조시료 5.0 g을 추가한 다음, 계속적으로 2일간 37℃에서 교반배양(170 rpm) 하면서 당화/발효시켰다. 기타 방법은 가) 연속공정 실험에서와 동일하였다.
라) 그물말의 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산 결과
그물말 시료의 일회 공급((one-step feeding)을 통한 연속 또는 동시 당화/발효공정에 있어서 고형분 함량을 5 g/53.7 mL(9.3%, w/v)로 하여 당화/발효시킬 경우, 하기 표 15에서도 확인할 수 있듯이, 두 공정 모두에서 발효 종료 이후 남아있는 당이 매우 낮았다. 이는 생성된 당이 거의 모두 전환되었음을 의미하며 생성된 젖산 함량은 47 내지 51 g/L 수준이었다. 그리고 그물말 건조시료의 고형분 함량을 7.5 g/53.7 mL(14.0%, w/v)로 하여 당화/발효시킬 경우에도 두 공정 모두에서 발효 종료 이후 남아있는 당은 매우 낮았고, 이 때 생성된 젖산 함량은 64 내지 71 g/L 수준이었다. 본 실시예에서 사용된 그물말 건조시료는 사전 당화실험에서 건물중의 약 40%가 글루코오스로 전환될 수 있는 능력을 가진 시료였고, 효소액 단독 처리구에서 LA104균주에 의한 젖산 생성이 16 내지 19 g/L 였던 바(효소 내에는 안정제로서 당이 포함되어 있었음), 보통 균주에 의한 글루코오스의 젖산으로의 전환율이 약 70 내지 80% 정도임을 감안하면 그물말 건조시료의 당화 산물 거의 모두가 젖산으로 전환되었음을 확인할 수 있었다.
결국 상기 실시예는 당화된 글루코오스가 뚜렷한 장애 없이 젖산으로 직접 전환되었다는 결과를 보여주는 것으로서, 이는 리그노셀룰로오스(Lignocellulose)계 다른 바이오매스에 비해 생산경비를 절감하는데 있어서 매우 좋은 장점을 가짐을 확인한 결과이며, 또한 접종한 균주간의 젖산 생산성에 있어서의 차이는 거의 관찰되지 않았다.
또한, 그물말 시료의 2회 공급(two-step feeding)을 통한 연속 또는 동시 당화/발효공정에 있어서 고형분을 5 g/53.7 mL(9.31%, w/v)씩 2회 공급하여 LA104 균주를 가지고 당화/발효시킬 경우는 하기 표 16에서도 확인할 수 있듯이, 발효 종료 이후 남아있는 당이 매우 낮았고 생성된 젖산 함량은 88.5 g/L 수준이었다. 본 실시예에서 사용된 그물말 건조시료는 사전 당화실험에서 건물중의 약 40%가 글루코오스로 전환될 수 있는 능력을 가진 시료였고, 효소액 단독 처리구에서 LA104균주에 의한 젖산 생성이 20.1g/L 였던 바(효소 내에는 안정제로서 당이 포함되어 있었음), 보통 균주에 의한 글루코오스의 젖산으로의 전환율이 약 80% 정도임을 감안하면 담수조류 중 그물말 과(HR) 건조시료의 당화 산물 거의 모두가 젖산으로 전환되었음을 확인할 수 있었다.
한편 LAB3510 균주를 가지고 당화/발효시킬 경우 발효 종료 이후 남아있는 글루코오스가 25. 6 g/L 였고, 생성된 젖산 함량은 47.9 g/L 수준이었다. 효소액 단독 처리구에서의 LAB3510 균주에 의한 젖산 생성이 1.4 g/L 이였기 때문에 그물말 건조시료로부터 실제 46.5 g/L의 젖산이 생성되었고, 아직 젖산으로 전환되지 않은 글루코오스가 25.6 g/L이었으며, 이는 전환율 80%를 감안해 볼 때 21.8 g/L의 젖산이 생성될 가능성이 있음을 보여주는 것으로, 이들을 합하면 결국 68.3 g/L의 젖산이 그물말 건조시료로부터 순수하게 생성되어 LA104에서의 젖산 생성량과 비슷해 질 것으로 예상된다. 즉, 조사 당시 LAB3510 처리구에서는 당화는 이루어졌지만 균주에 의한 젖산 생성이 아직 완결되지 않은 상태였다고 보여지며, 보다 시간을 두어 배양하면 균주 생장과 더불어 젖산 생성도 완성될 수 있을 것이다.
당화/발효시 작업에 불편이 없는 이상 고형분 함량을 가능한 한 높일수록 공정경비가 경감된다. 본 실시예의 경우에서도 시료 1회 공급 보다 2회 공급을 통해 고형분 함량을 높일 수 있었고 아울러 젖산 생산성을 향상시킬 수 있은 바, 상기의 결과로부터 그물말 건조시료의 분할 공급 방법을 통해 젖산 생산성을 더욱 효율화 시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
[실시예 9] 해조류 중 헛뿌리말(RHI)로부터 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산
해조류 중 대마디말과의 헛뿌리말(RHI) 시료를 가지고 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산성을 조사하였다.
식물재료는 야외에서 수집한 헛뿌리말을 수확하여 탈수시킨 다음, 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다(이하 RHI powder라고 함). 한편, 물 추출물 또는 물/에탄올 추출성분이 제거된 고형물(extractive-free solid)을 제조하여 실험재료로 사용하였다.
상기 물/에탄올 추출성분이 제거된 고형물(Extractive-free solid)은 속슬렛 장치의 thimble(28×100 mm)에 헛뿌리말 건조시료를 넣고 일정량의 물을 이용하여 250℃에서 약 8시간 추출한 다음, 잔사를 취하여 45℃에 1일 동안 건조시켜 분말화 하였다(Water-extractive free solid, 이하 RHI-WEFS라고 함).
발효 균주로서 락토 바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510, KCTC 3510), 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP)를 이용하였다. 상기 균주들은 각각 L-lactic acid를 93±1, 94±1%, D-lactic acid를 7±1, 6±1% 생산하는 특징을 가진다.
효소당화를 위해 4가지 다당류 분해효소(E1＋E2＋E3＋E4)를 조합하여 사용하였다. 즉, E1은 셀룰라아제(Celluclast 1.5L CCN03110, Novozymes A/S), E2는 β-글루코시다제(Novozyme-188, Sigma C6105), E3은 α-아밀라아제(Sigma A8220), E4는 아밀로글루코시다아제(Sigma A7095)를 사용하였다.
젖산 생산 공정은 50 mL 규모로 2반복 실험하였다. 배지는 MRS를 사용하였고 효모 추출물(yeast extract)을 충분히 공급해 주었다. 발효공정은 두 가지를 설정하였는 바, 조류의 건조시료를 일정량 넣고 배지와 다당류 분해효소를 공급한 다음 1일 후에 발효 균주를 첨가하거나(연속공정, A process), 배지/다당류 분해효소/발효 균주를 동시에 공급하여 발효를 진행하였다(동시공정, B process).
가) 연속공정:
상기 표 13과 같은 조성의 medium 2(pH 4.8)가 50 mL 포함된 500 mL 삼각플라스크에 RHI powder 또는 RHI-WEFS 시료 7.5 g 을 넣고, 121℃에서 20분 동안 고압멸균 하였다.
상기 고압멸균 된 시료를 실온까지 식힌 다음, 0.45 um membrane filter에 여과시킨 효소 복합물 E1＋E2＋E3＋E4(4.5＋0.6＋3.0＋3.0 mL)을 모든 처리구에 첨가하고 50℃, 170 rpm에서 24시간 동안 당화시켰다. 이하는 상기 실시예 8에서와 같았다.
나) 동시공정 1(one-step feeding):
상기 표 13과 같은 조성의 medium 2(pH 4.8)가 50 mL 포함된 500 mL 삼각플라스크에 RHI powder 또는 RHI-WEFS 시료 7.5 g을 넣고, 121℃에서 20분 동안 고압멸균 하였다.
상기 고압멸균 된 시료를 실온까지 식힌 다음, 0.45 um membrane filter에 여과시킨 효소 복합물 E1＋E2＋E3＋E4(4.5＋0.6＋3.0＋3.0 mL)에 사전에 준비된 발효 균주(LA104, LAB3510) 농축액을 0.5 mL 접종하여 37℃에서 3일간 교반배양하면서 당화/발효시켰다. 기타 방법은 상기 실시예 8의 연속공정 실험에서와 동일하였다.
다) 헛뿌리말(RHI)로부터 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산 결과
RHI powder의 고형분 함량을 7.5 g/61.6 mL(12.2%, w/v)로 하여 당화/발효시킬 경우, 하기 표 17에서도 확인할 수 있듯이, 두 공정 모두에서 발효 종료 이후 남아있는 당이 매우 낮았다. 이는 생성된 당이 거의 모두 전환되었음을 의미하며 생성된 젖산 함량은 RHI powder는 57 내지 61.5 g/L, RHI-WEFS는 56 내지 65 g/L 수준이었다. 본 실시예에서 사용된 헛뿌리말 건조시료는 사전 당화실험에서 건물중의 약 35 내지 40%가 글루코오스로 전환될 수 있는 능력을 가진 시료였고, 효소 단독 처리구에서 LA104와 LAB3510 균주에 의한 젖산 생성이 각각 28.4 g/L, 11.5 g/L 였던 바, 보통 균주에 의한 글루코오스의 젖산으로의 전환율이 약 70 내지 80% 정도임을 감안하면 헛뿌리말 건조시료의 당화 산물 거의 모두가 젖산으로 전환되었음을 확인할 수 있었다.
또한, 발효균주를 LA104를 이용할 경우, 실제 기대되는 젖산 함량보다 낮게 검출되었는데 이는 탄산칼슘 투여량의 제한 때문이라고 추측된다.
한편 RHI-WEFS의 시료를 가지고 실험한 경우는 RHI powder에서보다 약간 높은 젖산 생성량을 보였다. 이는 물 추출성분의 제거로 인해 WEFS 시료내의 탄수화물 함량 자체가 약간 상승하였기 때문으로 추정된다.
결국 상기 실시예는 당화된 글루코오스가 뚜렷한 장애 없이 젖산으로 직접 전환되었다는 결과를 보여주는 것으로서, 이는 리그노셀룰로오스(Lignocellulose)계 다른 바이오매스에 비해 생산경비를 절감하는데 있어서 매우 좋은 장점을 가짐을 확인한 결과이기도 하다.
[실시예 10] 구멍갈파래(UPer)로부터 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산
해조류인 구멍갈파래(UPer)를 가지고 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산성을 조사하였다.
식물재료로서 야외에서 수집한 구멍갈파래를 탈수시킨 다음 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다(이하 UPer powder라고 함). 한편, 물 추출성분 또는 물/에탄올 추출성분이 제거된 고형물(extractive-free solid)을 제조하여 실험재료로 사용하였다.
상기 물/에탄올 추출성분이 제거된 고형물(Extractive-free solid)은 속슬렛 장치의 thimble(28×100 mm)에 UPer powder를 넣고 일정량의 물을 이용하여 250℃에서 약 8시간 추출한 다음, 잔사를 취하여 45℃에 1일 동안 건조시켜 분말화 하였다 (Water-extractive free solid, 이하 UPer-WEFS라고 함).
UPer powder를 상기와 같이 물로 1차 추출한 후, 이를 다시 에탄올로 150℃에서 3 내지 4시간 추출한 다음, 잔사를 취하여 45℃에 1일 동안 건조시켜 분말화 하였다(Water & ethanol-extractive free solid, 이하 UPer-EFS라고 함).
발효 균주로서 락토 바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510, KCTC 3510), 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP)를 이용하였다. 상기 균주들은 각각 L-lactic acid를 93±1, 94±1%, D-lactic acid를 7±1, 6±1% 생산하는 특징을 가진다.
효소당화를 위해 4가지 다당류 분해효소(E1＋E2＋E3＋E4)를 조합하여 사용하였다. 즉, E1은 셀룰라아제(Celluclast 1.5L CCN03110, Novozymes A/S), E2는 β-글루코시다제(Novozyme-188, Sigma C6105), E3은 α-아밀라아제(Sigma A8220), E4는 아밀로글루코시다아제(Sigma A7095)를 사용하였다.
젖산 생산 공정은 50 mL 규모로 실시하였다. 배지는 MRS를 사용하였고 효모 추출물을 충분히 공급해 주었다. 발효공정은 두 가지를 설정하였는 바, 조류의 건조시료를 일정량 넣고 배지와 다당류 분해효소를 공급한 다음 1일 후에 발효 균주를 첨가하거나(연속공정, A process), 배지/다당류 분해효소/젖산 생산균주를 동시에 공급하여 발효를 진행하였다(동시공정, B process).
가) 연속공정:
상기 표 13과 같은 조성의 medium 2(pH 4.8)가 50 mL 포함된 500 mL 삼각플라스크에 UPer powder를 7.5 g 넣고, 121℃에서 20분 동안 고압멸균 하였다.
상기 고온멸균 된 시료를 실온까지 식힌 다음, 0.45 um membrane filter에 여과시킨 효소 복합물 E1＋E2＋E3＋E4(2.25＋0.3＋1.5＋1.5 mL)를 모든 처리구에 첨가하고 50℃, 170 rpm에서 24시간동안 당화시켰다. 이하 과정은 실시예 8에서와 같았다.
나) 동시공정 1(one-step feeding):
상기 표 13과 같은 조성의 medium 2(pH 4.8)가 50 mL 포함된 500 mL 삼각플라스크에 UPer powder, UPer-WEFS, UPer-EFS 각각을 7.5 g 넣고, 121℃에서 20분 동안 고압멸균 하였다.
상기 고압멸균 된 시료를 실온까지 식힌 다음, 0.45 um membrane filter에 여과시킨 효소 복합물 E1＋E2＋E3＋E4(2.25＋0.3＋1.5＋1.5mL)에 사전에 준비된 발효 균주(LA104, LAB3510) 농축액을 0.5 mL 접종하여 37℃에서 3일간 교반배양하면서 당화/발효시켰다. 기타 방법은 실시예 8의 연속공정 실험에서와 동일하였다.
다) 구멍갈파래(UPer)로부터 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산 결과
① UPer powder로부터 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산
상기 구멍갈파래로부터 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산은 UPer powder의 고형분의 함량을 7.5 g/55.55 mL(13.5%, w/v)로 하여 당화/발효시킬 경우, 하기 표 18에서도 확인할 수 있듯이, 두 공정 모두에서 발효 종료 이후 남아있는 당이 매우 낮았다. 이는 생성된 당이 거의 모두 전환되었음을 의미하며 이로 인해 생성된 젖산 함량은 LA104균주에서는 45 내지 48 g/L, LAB3510 균주에서는 30 내지 31 g/L 수준이었다.
본 실시예에서 사용된 구멍갈파래 건조시료는 사전 당화실험에서 건물중의 약 25%가 글루코오스로 전환될 수 있는 능력을 가진 시료였고, 효소 단독 처리구에서 LA104와 LAB3510 균주에 의한 젖산 생성이 각각 33.1 g/L, 7.6 g/L 였던 바, 보통 균주에 의한 글루코오스의 젖산으로의 전환율이 약 70 내지 80% 정도임을 감안하면 UPer powder 시료의 당화/발효가 LAB3510 발효 균주에서는 기대치만큼 생산되었다. 그러나 LA104 발효 균주에서는 약간 저조한 경향이었는데 이는 탄산칼슘 투여량의 한도로 인해 LA104에서의 실제 젖산 함량이 충분히 검출되지 못했기 때문으로 예상된다.
② UPer WEFS와 UPer EFS로부터 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산
상기 ①의 실험에서 UPer powder를 이용한 연속 또는 동시 당화/발효 공정간에는 젖산 생성 차이가 없었고, 또한 젖산 생성 정도가 LA104 발효 균주에서 기대치 보다 낮은 편이었다. 그 원인중의 하나가 세포내 추출물의 당화/발효 간섭 때문이거나 탄산칼슘 투여량의 제한 때문일 수 있으므로 본 실험에서는 추출물이 제거된 시료를 가지고 탄산칼슘 투여량을 충분히 높인 다음(40 g/L) 동시 당화/발효 실험을 비교 실시해 보았다.
상기 표 19에서도 확인할 수 있듯이, UPer-WEFS 및 UPer-EFS는 UPer powder에 비해 젖산 생성이 약간 증가되는 경향이었다. 발효 균주간의 젖산 생산능력의 경우는 LA104 균주가 LAB3510 균주에 비해 높았는데 이는 효소내 당 이용능력이 LA104 균주에서 높은 것으로, 구멍갈파래 시료로부터 순수하게 생성된 젖산은 두 균주간에 차이가 없이 거의 동일하게 20 내지 25 g/L 수준이었다.
본 실시예에서 사용된 구멍갈파래 건조 시료는 사전 당화실험에서 건물중의 약 25% 정도가 글루코오스로 전환될 수 있는 능력을 가진 시료였고, 효소 단독 처리구에서 LA104와 LAB3510 균주에 의한 젖산 생성이 각각 29.0 g/L, 4.9 g/L 였던 바, 보통 균주에 의한 글루코오스의 젖산으로의 전환율이 약 70-80% 정도임을 감안하면 UPer powder 건조시료의 당화 산물 대부분이 젖산으로 전환되었음을 확인할 수 있었다.
[실시예 11] 그물말(HR), 헛뿌리말(RHI), 구멍갈파래(UPer)로부터의 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산성 비교
동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산성에 있어서, 3 가지 조류종[(그물말 (HR), 헛뿌리말(RHI), 구멍갈파래(UPer)] 간의 차이를 비교하고자 실시하였다.
식물재료는 그물말, 헛뿌리말, 구멍갈파래를 수확하여 탈수시킨 다음, 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다.
발효 균주로서 락토 바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510, KCTC 3510), 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP)를 이용하였다. 상기 균주들은 각각 L-lactic acid를 93±1, 94±1%, D-lactic acid를 7±1, 6±1% 생산하는 특징을 가진다.
효소당화를 위해 4가지 다당류 분해효소(E1＋E2＋E3＋E4)를 조합하여 사용하였다. 즉, E1은 셀룰라아제(Celluclast 1.5L CCN03110, Novozymes A/S), E2는 β-글루코시다제(Novozyme-188, Sigma C6105), E3은 α-아밀라아제(Sigma A8220), E4는 아밀로글루코시다아제(Sigma A7095)를 사용하였다.
젖산 생산 공정은 50 mL 규모로 실시하였다. 배지는 MRS를 사용하였고 효모 추출물을 충분히 공급해 주었다. 조류의 건조시료를 6 g 넣고 배지/다당류 분해효소/젖산 생산균주를 동시에 공급하여 발효를 3일간 진행하였다
상기 3 가지 조류종의 건조시료를 멸균한 후 멸균된 시료를 실온까지 식힌 다음, 0.45 um membrane filter에 여과시킨 효소 복합물 E1＋E2＋E3＋E4를 그물말의 경우 (1.0＋0.2＋1.0＋1.0 mL), 헛뿌리말과 구멍갈파래의 경우 (2.25＋0.3＋1.5＋1.5 mL)를 첨가한 후, 곧바로 사전에 준비해 둔 발효 균주 농축액(LA104, LAB3510)을 0.5 mL 접종하여 37℃에서 3일간 교반배양하면서 당화/발효시켰다. 이하 모든 과정은 상기 실시예 8에서와 같았다.
가) 그물말(HR), 헛뿌리말(RHI), 구멍갈파래(UPer)로부터의 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산성 비교
3 가지 조류종의 고형분 함량을 6.0 g/50 mL(12%, w/v)로 일정하게 하고 동일조건에서 동시 당화/발효시킬 경우, 도 12에서도 확인할 수 있듯이 모든 처리에서 실험 종료 이후 남아있는 당이 매우 낮았다. 이는 생성된 당이 거의 모두 전환되었음을 의미하며 이로 인해 생성된 젖산 함량은 두 균주 공히 그물말(HR) > 헛뿌리말(RHI) > 구멍갈파래(UPer) 순으로 높았다.
한편, 그물말과 헛뿌리말에서는 두 균주간에 젖산 생성량 차이가 없었으나 구멍갈파래의 경우는 LAB3510 균주보다 LA104 균주에서 젖산이 높게 생산됨을 확인할 수 있었는데 이는 두 균주의 기질이용성 차이 때문임을 확인하였다.
상기 실시예의 실험 결과를 종합해 보면, 1) 공시 시료 그물말, 헛뿌리말, 구멍갈파래 간에 젖산 생산정도는 그물말 > 헛뿌리말 > 구멍갈파래 순으로 좋았다. 2) 특정시료의 powder와 WEFS/EFS간의 젖산 생성 정도는 WEFS/EFS 시료에서 약간 높은 경향이나 그 차이가 크지 않았다. 3) 젖산 생산을 위한 당화/발효 공정에 있어서 연속공정과 동시공정 간에는 동일한 젖산 생산성을 보였다. 4) 원료 투입에 있어서는 모두 한꺼번에 투입하는 것보다는 여러 번 나누어 투입 하는 것이 고형분 함량을 높일 수 있을 뿐만 아니라 보다 고농도로 젖산을 생산할 수 있었고, 완전 혐기조건하에서는 젖산생성이 보다 이른시기에 완료됨을 확인할 수 있었다.
[실시예 12] 그물말의 D형 젖산 생산에 미치는 여러 요인들의 효과
상기 실시예 8의 결과들로부터 단일 반응기에 그물말 바이오매스와 당화효소 및 발효균주를 혼합하여 D형의 젖산을 생산하는 방법을 조사하였다.
식물재료로서 온실에서 배양한 그물말 조류를 수확하여 탈수시킨 다음, 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후, 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다. 필요에 따라서는 물/에탄올 추출성분이 제거된 고형물(Extractive-free solid, WEFS, EFS)도 이용하였다.
발효 균주로서 락토바실러스 코니포미스 톨퀸스 ATCC 25600(Lactobacillus coryniformis subsp. torquens ATCC 25600)을 사용하였다.
효소당화를 위해 4가지 다당류 분해효소(E1＋E2＋E3＋E4)를 조합하여 사용하였다. 즉, E1은 셀룰라아제(Celluclast 1.5L CCN03110, Novozymes A/S), E2는 β-글루코시다제(Novozyme-188, Sigma C6105), E3은 α-아밀라아제(Sigma A8220), E4는 아밀로글루코시다아제(Sigma A7095)를 사용하였다.
젖산 생산을 위한 공정은 50 mL 규모로 실시하였다. 배지는 MRS medium 2를 사용하였다. 발효공정에 있어 조류 바이오매스 건조시료를 일정량 넣고, 배지와 다당류 분해효소, 발효 균주를 동시에 공급하여 발효를 진행하였다(동시공정, B process).
(1) 효소의 처리 농도별 발효
본 실험은 그물말 시료(80 g/ℓ)의 발효 최적화를 위한 효소의 처리 농도별(S1~S6) 젖산 및 환원당(reducing sugar; RS)의 생산량과 환원당의 전환률(%)을 조사하였다. 하기 4가지 다당류 분해효소(E1＋E2＋E3＋E4)는 부피비로 혼합하였다.
배지의 조성은 질소원으로 효모 추출물 10 g/ℓ, 펩톤 0.05 g/ℓ, 무기염으로 0.05 g MnSO4, 2 g K2HPO4, 5 g CH3COONa, 0.2 g MgSO4, 2 g triammoniumcitrate, 1 g Tween80을 함유하고, 배양 조건은 34℃, 220 rpm, 48h 배양하였다.
- S1 효소 복합체(E1:E2:E3:E4)=> 2:2:2:2
- S2 효소 복합체(E1:E2:E3:E4)=> 2:2:0:2
- S3 효소 복합체(E1:E2:E3:E4)=> 2:0:0:2
- S4 효소 복합체(E1:E2:E3:E4)=> 2:1:0:1
- S5 효소 복합체(E1:E2:E3:E4)=> 2:0:0:0
- S6 효소 복합체(E1:E2:E3:E4)=> 1:1:0:1
그 결과 도 14의 결과에서도 확인할 수 있듯이, S3, S5, S6의 효소 복합체 보다 S1, S2, S4의 효소 복합체 특히, S4가 고농도의 젖산을 대량 생산할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
(2) 발효 균주의 배지 내 질소원의 대체 가능성
발효 균주의 배지 내 성분 중 산업적 생산시 제조원가 상승요인인 효모 추출물(yeast extract)을 저가의 펩톤으로의 대체가능성을 확인하였다.
상기 표 20의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 효모 추출물 3 g/ℓ에 펩톤 3 g/ℓ을 혼합하여 사용하였을 때 수득되는 젖산의 생산량이 36.72 g/ℓ(45.9%)로 가장 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과는 적은 량의 효모 추출물에 펩톤을 혼합하여 사용함으로써 젖산의 생산원가를 절감시킬 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
상기 (1) 및 (2)의 결과들로부터 발효 균주 락토바실러스 코니포미스 톨퀸스 ATCC 25600(Lactobacillus coryniformis subsp. torquens ATCC 25600)에 의한 D형 젖산의 생산은 그물 말 시료 80 g/ℓ에 대하여, 효모 추출물 3 g/ℓ에 펩톤 3 g/ℓ을 혼합하여 제조한 배지(0.05 g MnSO4, 2 g K2HPO4, 5 g CH3COONa, 0.2 g MgSO4, 2 g triammoniumcitrate, 1 g Tween80으로 구성되는 무기염 포함)에 S4 효소 복합체(E1:E2:E3:E4= 2:1:0:1)를 이용하여 발효시킴으로써 고농도의 D형의 젖산을 가장 효과적으로 생산할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
(3) 발효 조건에 따른 발효 생산물 비교
그물 말 시료 80 g/ℓ에 대하여, 효모 추출물 3 g/ℓ에 펩톤 3 g/ℓ을 혼합하여 제조한 기본 배지(무기염 무첨가)에 S4 효소 복합체(E1:E2:E3:E4= 2:1:0:1), 발효 균주 락토바실러스 코니포미스 톨퀸스 ATCC 25600(Lactobacillus coryniformis subsp. torquens ATCC 25600)을 이용하여 발효 조건에 따른 글로코오스, 젖산 환원당의 생산량을 조사하였다.
그 결과, 도 15에서도 확인할 수 있듯이, 평균 생산량, 최대 생산량 및 수득률(%)은 1 시간당 1.02 g/l h, 2.38 g/l h 및 45.78%인 것을 확인할 수 있었다.
또한 잔여 환원당은 12 시간 이후 2.91 g/ℓ로 발효 시간이 길어지더라도 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다. 환원당은 36시간 이후 젖산으로 가장 많이 전환되었다.
상기 결과들로부터 바이오 매스인 그물말을 대상으로 락토바실러스 코니포미스 톨퀸스 ATCC 25600(Lactobacillus coryniformis subsp. torquens ATCC 25600)을 이용하여 경제적이면서도 효율적으로 고농도의 D형의 젖산을 대량으로 생산할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 13] 그물말 고농도 고형분 함량에서 촉매 사용 추가에 의한 젖산 생산 증진
(1) L형의 젖산 생산
본 실험에서는 단일 반응기에 동일한 조건에서 실시예 7에서처럼 촉매의 사전 처리 유무에 따라 당화/발효시에 젖산 생성의 증진 효과를 확인하였다.
250 ㎖ Erlemyer flask에 2%의 염산 또는 증류수 40 ㎖를 넣고 그물 말 건조시료 10 g을 첨가한 후(25% 고형분 함량) 120℃, 20분간 반응시켜 1차 가수분해 시켰다. 상기 1차 가수분해가 끝난 반응물에 0.1M sodium citrate buffer 47.76 ㎖를 추가 주입한 다음 10 N NaOH를 소량씩 주의깊게 넣어 pH를 4.8-5.0으로 맞추었다. 그 후 효소 E1과 E2를 각각 2.0 ㎖, 0.4 ㎖ 가한 후 50℃, 150 rpm에 2일 동안 배양하면서 2차 가수분해 시켰다. 상기 2차 가수분해가 끝난 반응물에 효모 추출물 5 g/ℓ, MnSO4 0.05 g/L, CaCO3 15 g/L을 넣고 발효 균주 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP)을 첨가한 후 37℃, 200 rpm, 72h 배양하였다.
배양이 종료된 다음 상기 배양물을 동일 배지로 10배 희석한 후 원심분리를(8000 rpm, 20분, 4℃) 통해 탄산칼슘, 세포, 시료 잔유물 등을 제거하였다. 상등액을 취해 pH를 2로 조정한 다음 적당히 희석하여 젖산 함량을 biochemistry analyzer(YSI 2700)로 분석하였다.
상기 표 21의 결과에서 보는 바와 같이 발효 균주를 통한 발효 공정 이전, 효소 복합체 및 촉매를 이용하여 순차적인 가수반응을 진행함으로써 젖산(L형이 96% 정도였음) 생산성이 더욱 효율화 시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
(2) D형의 젖산 생산
상기 (1)의 L형 젖산 생상방법과 유사한 방법으로 D형의 젖산 생산성도 실험하였다. 이 경우에는 실시예 12에서처럼 S4 효소 복합체(E1:E2:E3:E4= 2:1:0:1)를 가한 후 50℃, 150 rpm에 가수분해시켰고, 이어서 효모 추출물과 펩톤을 각각 3 g/ℓ 수준으로 넣음과 동시에 발효 균주 락토바실러스 코니포미스 톨퀸스 ATCC 25600(Lactobacillus coryniformis subsp. torquens ATCC 25600)를 첨가한 후 34℃, 220 rpm, 48h 배양하였다. 그 결과 촉매 첨가에 따른 상기 L형의 젖산 생산 증가율과 유사하게 D형의 젖산 생산 역시 촉매를 추가했을 때가 약 20% 정도 D형 젖산이 더 많이 생성됨을 확인할 수 있었다.
Claims (9)
1) 히드로딕티온속(Hydrodictyon sp.); 대마디말과의 염주말속(Chaetomorpha sp.), 대마디말속(Cladophora sp.), 헛뿌리말속(Rhizoclonium sp.); 갈파래속(Ulva sp.)으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 조직와해 전처리가 되지 않은 조류 바이오매스를 준비하는 단계;
2) 동일 반응기 내에 다당류 분해효소 및 발효 균주를, 상기 조류 바이오매스에 첨가하여 반응물을 생산하는 단계; 및
3) 상기 반응물로부터 젖산을 수득하는 단계;
를 포함하는 젖산 생산방법.
2) 동일 반응기 내에 다당류 분해효소 및 발효 균주를, 상기 조류 바이오매스에 첨가하여 반응물을 생산하는 단계; 및
3) 상기 반응물로부터 젖산을 수득하는 단계;
를 포함하는 젖산 생산방법.
제 1항에 있어서,
상기 2) 단계의 반응물 생산시 촉매를 더 투입하는 젖산의 생산방법.
상기 2) 단계의 반응물 생산시 촉매를 더 투입하는 젖산의 생산방법.
제 2항에 있어서,
상기 촉매는 황산, 염산, 브롬산, 질산, 아세트산, 포름산, 과염소산, 인산, 파라-톨루엔설폰산(p-toluenesulfonic acid, PTSA) 및 고체산으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 산 촉매 또는 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼슘, 암모니아 수용액으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 알카리 촉매인 생산방법.
상기 촉매는 황산, 염산, 브롬산, 질산, 아세트산, 포름산, 과염소산, 인산, 파라-톨루엔설폰산(p-toluenesulfonic acid, PTSA) 및 고체산으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 산 촉매 또는 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼슘, 암모니아 수용액으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 알카리 촉매인 생산방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 젖산은 D형의 젖산이 선택적으로 제조되는 생산방법.
상기 젖산은 D형의 젖산이 선택적으로 제조되는 생산방법.
제 4항에 있어서,
상기 D형의 젖산은 락토바실러스 코니포미스 톨퀸스 ATCC 25600(Lactobacillus coryniformis subsp. torquens ATCC 25600)을 이용하는 생산방법.
상기 D형의 젖산은 락토바실러스 코니포미스 톨퀸스 ATCC 25600(Lactobacillus coryniformis subsp. torquens ATCC 25600)을 이용하는 생산방법.
삭제
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 젖산은
ⅰ) 조류에 다당류 분해효소 및 발효 균주를 동시에 투입하고, 20 내지 50℃ 온도에서 1 내지 5일 동안 당화 및 발효를 동시에 진행시킴으로써 제조되거나 또는,
ⅱ) 조류에 다당류 분해효소를 투입하여 20 내지 60℃에서 당화시키고, 상기 동일 반응기에 연속적으로 발효 균주를 투입하여 25 내지 50℃에서 1 내지 5일 발효시킴으로써 제조되거나 또는,
ⅲ) 조류에 촉매를 가하여 일차 가수분해시킨 다음 다당류 분해효소를 투입하여 20 내지 60℃에서 당화시키고, 상기 동일 반응기에 연속적으로 발효 균주를 투입하여 25 내지 50℃에서 1 내지 5일 발효시킴으로써 제조되는 생산방법.
상기 젖산은
ⅰ) 조류에 다당류 분해효소 및 발효 균주를 동시에 투입하고, 20 내지 50℃ 온도에서 1 내지 5일 동안 당화 및 발효를 동시에 진행시킴으로써 제조되거나 또는,
ⅱ) 조류에 다당류 분해효소를 투입하여 20 내지 60℃에서 당화시키고, 상기 동일 반응기에 연속적으로 발효 균주를 투입하여 25 내지 50℃에서 1 내지 5일 발효시킴으로써 제조되거나 또는,
ⅲ) 조류에 촉매를 가하여 일차 가수분해시킨 다음 다당류 분해효소를 투입하여 20 내지 60℃에서 당화시키고, 상기 동일 반응기에 연속적으로 발효 균주를 투입하여 25 내지 50℃에서 1 내지 5일 발효시킴으로써 제조되는 생산방법.
제 7항에 있어서,
상기 발효 균주는 락토 바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510, KCTC 3510), 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP) 또는 이들의 혼합균주인 생산방법.
상기 발효 균주는 락토 바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510, KCTC 3510), 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP) 또는 이들의 혼합균주인 생산방법.
제 1항에 있어서,
상기 조류 바이오매스는 생체; 건조체; 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올로 침출 여과 후 남은 잔사물; 유기물 정제 장치를 이용하여 물, 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올 또는 이들의 연속 용매로 추출 후 남은 잔사물; 유기용매를 이용하여 지질성분을 추출하고 남은 잔사물;로부터 선택되는 1종 또는 2종인 생산방법.
상기 조류 바이오매스는 생체; 건조체; 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올로 침출 여과 후 남은 잔사물; 유기물 정제 장치를 이용하여 물, 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올 또는 이들의 연속 용매로 추출 후 남은 잔사물; 유기용매를 이용하여 지질성분을 추출하고 남은 잔사물;로부터 선택되는 1종 또는 2종인 생산방법.
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