KR101255090B1

KR101255090B1 - 조류 바이오매스의 동시 당화 및 발효공정을 통한 효율적 젖산의 생산방법

Info

Publication number: KR101255090B1
Application number: KR1020110024033A
Authority: KR
Inventors: 김진석; 김진철; 마이 꾸엉 유엔; 황현진; 김재덕
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2011-03-17
Filing date: 2011-03-17
Publication date: 2013-04-16
Also published as: KR20120106136A

Abstract

본 발명은 조류 바이오매스의 동시 당화 및 발효공정을 통한 효율적 젖산의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 본 발명에 따른 본 발명에 따른 젖산의 생산방법은 비식용자원인 조류(algae)를 활용하기 때문에 바이오매스의 산업적 수요가 높아졌을 때 식품 가격 폭등 및 윤리적 문제의 발생 소지가 없고, 안정적으로 자원의 지속적 공급이 가능한 장점이 있으며, 특별한 전처리 없이도 높은 당화율을 나타내며, 단일 반응기에 조류와 함께 당화 효소 및 발효 균주를 동시 또는 연속적으로 투입하여 배양함으로써 경제적이면서 효율적으로 젖산을 제조할 수 있는 장점 뿐 아니라 제조된 젖산을 이용한 바이오플라스틱의 제조 및 생산은 현재 석유계 유래의 플라스틱 소비에 따른 문제점을 해소할 수 있어, 환경오염에 크게 기여할 것이다.

Description

조류 바이오매스의 동시 당화 및 발효공정을 통한 효율적 젖산의 생산방법{Efficient production of lactic acid by the simulataneous saccharification and fermentation of algal biomass}

본 발명은 조류 바이오매스의 동시 당화 및 발효공정을 통한 효율적 젖산의 생산방법에 관한 것이다.

석유자원의 고갈, 에너지 수요 증가, 지구온난화와 CO₂ 배출 문제, 환경규제 강화 등의 여러 문제에 직면한 상황에서 미래 환경과 자원고갈을 슬기롭게 대비하기 위해서는 필수적으로 생물자원(바이오매스)의 효율적 활용기술 개발이 필요하다.

상기 생물자원은 다음의 몇 가지 요인이 구비되어야 하는 바, 1) 식량 또는 사료로의 이용가치가 적어 산업적으로 대량 사용할 경우 식량가격 폭등의 우려가 낮을 것, 2) 생산성이 뛰어나거나 생산물의 산업적 가치가 높아 재배 또는 배양시 경제성이 상대적으로 높을 것, 3) 비농경지에서 재배되거나 비농업용수를 사용함으로서 농산물 생산을 위한 재배요인과 가능한 경합하지 않을 것, 4) 이산화탄소 저감 또는 환경오염을 경감시킬 수 있는 능력이 상대적으로 우수할 것 등이다.

상기 요인을 비교적 높게 만족시키는 생물자원은 조류(algae)이며, 당질/전분계 바이오매스(1세대 바이오매스), 섬유질계 바이오매스(2세대 바이오매스)와는 달리 제3세대 바이오매스로 분류되어 화학산업의 원료물질 공급원(chemical feedstocks)으로서 활발히 검토되고 있다.

조류가 바이오매스로서 보다 적합한 이유들을 볼 것 같으면(Rodolfi 등 Biotechnol. Bioeng. 102: 100-112, 2009) 첫째, 종에 따라 여러 환경조건에서도 자랄 수 있기 때문에 토지 및 기타 자원 이용 효율이 높다. 둘째, 조류는 광합성을 하며 생육주기가 짧고 성장속도가 빨라 바이오매스 생산량이 총체적으로 높다. CO₂ 흡수율도 높아 1 ㎡에서 열대우림은 연간 15 내지 20 ton의 CO₂를 흡수하지만 같은 면적의 미세조류는 30 내지 40 ton을 흡수한다고 한다. 셋째, 조류 배양의 특별한 잇점 중의 하나는 폐이산화탄소를 이용할 수 있다는 것과 재배시 폐수(brackish water, gray water 등)를 영양분 공급원으로 활용함으로서 바이오매스 생산과 물정화 효과를 동시에 얻을 수 있다. 넷째, 조류 종중에는 탄수화물, 단백질, 지질 등 특정 성분이 상대적으로 고함량으로 존재하는 종들이 있어 이들을 잘 활용하면 산업원료물질로서의 자원화 효율이 매우 높다. 다섯째, 조류는 리그닌이 없기 때문에 섬유질계 바이오매스(리그닌 15-30% 함유)보다 전처리과정이 보다 용이한 이유에서 이다.

그러나 3 내지 4만종의 존재가 알려진 조류의 모든 종이 상기의 장점을 보유하고 있는 것은 아니기 때문에 최근 들어 많은 연구자들이 보다 이용가치가 높은 조류종의 발굴 및 개선, 조류바이오매스의 생산, 이의 활용기술 개발에 많은 노력을 투입하고 있다.

한편, 유가 상승 경험 이전 동안 조류(algae)의 산업적 응용은 건강식품 및 기능성의약품, 색소생산, 양식사료, 화장품 소재 등의 분야로(Karina 등, Comparative Biochemistry and Physiology, Part C 146: 60-78, 2007) 제한되어 왔었으나 유가상승 경험 이후의 기술개발 경향을 보면, 대체에너지원 확보를 위한 미세조류 연구가 전세계적으로 대단한 열풍으로 진행되고 있다.

주로 바이오디젤 생산기술 개발에 집중되고 있으며(Scott 등, Current Opinion in Biotechnology 21:1-10, 2010; Mata 등, Renewable and Sustainable Energy Reviews 14 : 217232, 2010), 한편 미세조류 및 해양거대조류를 이용한 바이오에탄올, 바이오부탄올 등의 생산기술이 보고되고 있다(Ge 등, Renewable Energy. 36:84-89, 2011; Harun 등, Renewable and Sustainable Energy Reviews 인쇄중, 2011; Adams 등, J. Appl. Phycol. 21, 569574, 2009; Lee 등, J. Korean Ind. Eng. Chem. 20(3): 290-295, 2009; Isa 등, Journal of the Japan Institute of Energy, 88: 912-917, 2009; Ueno 등, Journal of Fermentation and Bioengineering. 86(1): 38-43, 1998; Brennan과 Owende, Renew. Sustain. Energy Rev. 14, 557577, 2010; Rojan 등, Bioresource Technology 인쇄중, 2011.; Choi 등, Bioresource Technology 101: 5330-5336, 2010; 강 등, 대한민국특허 10-0908425, 2009; 김 등, 대한민국 공개특허번호 10-2009-0025221, 2009; 이 등, 대한민국 공개특허 10-2010-0125104, 2010; 장 등, 대한민국특허 10-0919299, 2009).

그러나 바이오연료 이외의 분야에서는 식품 및 사료성분으로서 젖산 이용을 위해 전분 고함유 조류 바이오매스의 발효 연구가 일부 보고되었으나(Ike 등, Journal of Fermentation and Bioengineering. 84(5): 428-433, 1997) 바이오플라스틱과 같은 기타 분야로의 활용에 대한 뚜렷한 성과는 아직 보고된 바 없다.

바이오플라스틱 산업은 2008년 이후 환경규제 강화 및 친환경제품 선호도 증가에 따라 그 시장이 급속히 확대되고 있어, 현재 플라스틱 전체시장의 1%의 점유율을 가졌지만 환경규제가 강한 미국. 유럽, 일본을 중심으로 연간 13%의 성장률로 빠르게 증가하고 있는 상황이다(Nampoothiri 등, Bioresource Technology 101: 84938501, 2010).

그러나 젖산과 같은 바이오플라스틱 모노머 생산의 경우 미생물 발효를 통해 대부분 이루어지는 바, 대부분 발효 원료로서 당질계(사탕수수, 사탕무) 또는 전분계(옥수수, 밀) 바이오매스의 당화물을 이용하고 있어 이들의 원료가 식품과 경쟁하기 때문에 앞으로는 비식용자원(목질계, algae 등)으로부터 원료의 대체 확보가 요구되고 있다.

그러나 이 경우 해결해야할 가장 큰 도전중의 하나는 당화물 생산비용의 절감이다. 식용자원과는 달리 비식용자원의 경우 전처리, 당화가 보다 어렵고 추가 공정이 요구되기 때문이다.

따라서 현재 많은 연구자가 저비용으로 바이오플라스틱 원료물질을 생산하는 기술개발에 노력을 경주하고 있다. 바이오플라스틱 원료물질로서 현재 가장 시장성이 높은 것은 폴리젖산인데 이는 젖산을 모노머로 하고 있다. 현재 젖산의 전세계적 수요는 13만 내지 15만 metric tonnes/year으로 앞으로 지속적으로 그 수요가 증가될 전망이다. 특히 화학제품 생산을 위한 젖산의 활용은 매년 19% 정도 증가될 것으로 전망되고 있다.

그러나 향후 인구가 증가되고 바이오매스 수요가 증가되면 농산물 가격이 폭등될 우려가 있기 때문에 특히 화학제품 원료로서의 젖산은 농산물과 경합되지 않는 바이오매스로 대체하는 것이 바람직하며, 가격 경쟁력을 갖추기 위해 저에너지/저비용 생산공정의 개발이 절실히 요구되고 있다.

그러나 그동안 연구되어 온 젖산의 효율적인 생산공정으로 동시 당화/발효 공정 기술의 경우 당질계/전분계 식용자원을 중심으로 연구되어 왔고, 최근들어 목질계를 가지고 일부 시도된 바 있으나, 젖산의 생산율이 상대적으로 낮은 문제점이 있었다(Rojan 등, Applied Biochemistry and Biotechnology 134: 263-272, 2006; John 등, Biotechnol. Adv. 27, 145152, 2009; Reddy 등, Biotechnology Advances 26: 2234, 2008; John 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 524534, 2007; Moldes 등, Bioprocess Engineering 22:175-180, 2000).

또한, 식품 및 사료성분으로서 젖산 이용을 위해 식용자원을 이용하는 방법과 유사하게 전분 고함유 조류 바이오매스의 발효에 대한 연구가 일부 보고되었으나(Ike 등, Journal of Fermentation and Bioengineering. 84(5): 428-433, 1997; Reddy 등, Biotechnology Advances 26: 2234, 2008; 강과 강, 대한민국 특허출원 KR 2008-0111609) 사용 균주가 제한되어 있고, 또한 화학제품으로 적용하기에는 그 생산성에 대한 문제는 여전히 해결해야 하는 과제로 남아 있다.

본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 조류를 이용한 바이오플라스틱 모노머의 생산과 관련한 연구를 지속하던 중, 그 활용에 대해 아직 보고된 바 없는 탄수화물 고함유 조류 바이오매스로부터 고농도의 젖산을 경제적이면서 효율적으로 제조할 수 있는 방법을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 조류 바이오매스로부터 고농도의 젖산 제조의 어려움과 재현성을 극복하기 위한 것으로, 그 활용에 대해 아직 보고된 바 없는 탄수화물 고함유 조류 바이오매스의 선별; 상기 선별된 조류 바이오매스로부터 동시 당화 및 발효공정 단계;를 포함하는 경제적이면서 효율적인 고농도의 젖산 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 그 활용에 대해 아직 보고된 바 없는 탄수화물 고함유 조류 바이오매스의 선별; 상기 선별된 조류 바이오매스로부터 동시 당화 및 발효공정 단계;를 포함하는 조류 바이오매스로부터 고농도의 젖산 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 고농도의 젖산 제조방법은 화학적, 물리적 전처리 공정이 필요 없고, 발효억제물질이 아주 낮은 조류 바이오매스 즉, 그물말과의 훈장말속(Pediastrum sp.), 소라스트럼속(Sorastrum sp.), 히드로딕티온속(Hydrodictyon sp.); 대마디말과의 염주말속(Chaetomorpha sp.), 대마디말속(Cladophora sp.), 헛뿌리말속(Rhizoclonium sp.); 갈파래과의 파래속(Enteromorpha sp.)과 갈파래속(Ulva sp.);로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 조류를 이용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 고농도의 젖산 제조방법은 단일 반응기 내에 조류, 당화효소 및 발효 균주를 동시 또는 연속적으로 투입 후, 혼합 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는 본 발명에 따른 고농도의 젖산 제조방법은 반응기 내에 조류 및 당화효소를 투입하여 20 내지 60℃에서 1차 당화시키고, 상기 동일 반응기에 연속적으로 발효 균주를 투입하여 25 내지 50℃에서 1 내지 5일 2차 발효시킴으로써 생성되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 고농도의 젖산 제조방법은 단일 반응기 내에 조류, 당화효소 및 발효 균주를 동시에 투입하고, 20 내지 50℃ 온도에서 1 내지 5일 동안 1차 당화 및 2차 발효를 동시에 진행시킴으로써 생성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 고농도 젖산 제조방법의 발효 균주는 락토코커스(Lactococcus), 락도바실러스(Lactobacillus), 스트랩토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코쿠스(Pediococcus), 에로코쿠스(Aerococcus), 카노박테리엄(Carnobacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 오에노코커스(Oenococcus), 테트라제노코코스(Tetragenococcus), 바고코쿠스(Vagococcus), 와이셀라(Weisella), 라이족토니아 오라이제(R. oryzae), 리조푸스 아리주스(R. arrhizus), 락토바실러스 아밀로필러스 GV6(Lactobacillus amylophilus GV6), 락토 바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510, KCTC 3510), 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합균주인 것으로, 보다 바람직하게는 락토 바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510, KCTC 3510), 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104)인 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 단일 반응기 내에 그물말과의 훈장말속(Pediastrum sp.), 소라스트럼속(Sorastrum sp.), 히드로딕티온속(Hydrodictyon sp.); 대마디말과의 염주말속(Chaetomorpha sp.), 대마디말속(Cladophora sp.), 헛뿌리말속(Rhizoclonium sp.); 갈파래과의 파래속(Enteromorpha sp.)과 갈파래속(Ulva sp.);로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 조류, 당화효소 및 발효 균주를 동시 또는 연속적으로 투입 후, 혼합 배양하는 단계;를 포함하는 조류 바이오매스로부터 고농도의 젖산 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 젖산은 반응기 내에 조류 및 당화효소를 투입하여 20 내지 60℃에서 1차 당화시키고, 상기 동일 반응기에 연속적으로 발효 균주를 투입하여 25 내지 50℃에서 1 내지 5일 2차 발효시킴으로써 생성되는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는 상기 젖산은 반응기 내에 조류 및 당화효소를 투입하여 45 내지 55℃에서 1일 동안 1차 당화시키고, 상기 동일 반응기에 연속적으로 발효 균주를 투입하여 30 내지 40℃에서 3일 동안 2차 발효시킴으로써 생성될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 젖산은 단일 반응기 내에 조류, 당화효소 및 발효 균주를 동시에 투입하고, 20 내지 50℃ 온도에서 1 내지 5일 동안 1차 당화 및 2차 발효를 동시에 진행시킴으로써 생성되는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는 상기 젖산은 단일 반응기 내에 조류, 당화효소 및 발효 균주를 동시에 투입하고, 30 내지 40℃에서 2 내지 4일 동안 1차 당화 및 2차 발효를 동시에 진행시킴으로써 생성될 수 있다. 도 1을 참조한다.

본 발명에 있어서, 상기 조류 특히, 담수 녹조류 중 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류는 시료의 수집/선별시 단순히 건지개로만 이용해도 될 정도로 손쉽고, 원심분리 또는 여과과정을 거쳐 수집해야만 하는 다른 미세조류의 공정에 비해 저에너지/저비용으로 시료를 공급받을 수 있으며, 세척, 탈수, 건조, 분말화 등의 작업도 매우 간편한 특징을 가진다. 또한, 리그닌이 없고 탄수화물이 보통 50 내지 70% 차지하고 있으며, 특히 발효에 가장 많이 활용되는 글루코오스 함량 비율이 기타 조류 종들에 비해 매우 높은 장점이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조류는 생체; 건조체; 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올로 침출 여과 후 남은 잔사물; 유기물 정제 장치를 이용하여 물, 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올 또는 이들의 연속 용매로 추출 후 남은 잔사물; 유기용매를 이용하여 지질성분을 추출하고 남은 잔사물;로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.

본 발명에서는 수집된 생체 또는 건조체의 본 발명에 따른 조류를 70 내지 100%의 메탄올 또는 에탄올로 추출한 다음, 추출물은 분리정제 과정을 거쳐 여러 생리활성물질(의약 또는 농약용 항균제, 살조제, 기능성 식품용 물질 등)로 활용하고, 추출 후 남은 잔사(고형분)를 고농도의 젖산의 제조에 이용할 수도 있다.

또한, 본 발명에 따른 생체 또는 건조체의 조류를 속슬렛 장치를 이용하여 물 또는 물과 에탄올로 연속하여 추출물을 추출한 다음 추출물(extractives)은 상기에 언급한 용도로 이용하고, 남은 잔사를 고농도의 젖산의 제조에 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명에 따른 생체 또는 건조체의 조류를 유기용매(예, 클로로포름＋메탄올)를 가지고 지질성분을 추출한 다음, 남은 잔사를 고농도의 젖산의 제조에 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조류는 고형분 함량이 1 내지 30 중량%인 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는 고농도의 젖산을 제조하기 위하여, 단일 반응기 내에서 조류, 당화효소 및 발효 균주를 동시 또는 연속적으로 투입 후, 혼합 배양하는 단계;를 포함하며, 상기 조류의 공급은 초기에 모두 공급하거나 또는 분할하여 공급할 수 있으며, 최종 공급된 고형분 함량은 배양액 무게대비 1 내지 30%까지 투입할 수 있다. 효소공급의 경우도 바이오매스 공급 직후에 필요량 모두를 공급할 수 있으나 조건에 따라 분할하여 투입할 수 있다.

또한, 상기 당화효소 및 발효 균주의 혼합 배양에 따른 당화 및 발효공정은 온도조건의 경우 단일 반응기 내에 당화효소 또는 발효 균주를 동시 또는 연속으로 투입하는 투입시기와 배양조건에 따라 달라질 수 있다. 즉, 조류, 당화효소 및 발효 균주를 동시에 넣고 배양할 경우에는 발효 균주의 생육최적온도(20 내지 50℃)에 1 내지 5일 동안 배양함으로써 젖산을 고농도로 생성할 수 있다.

만약, 단일 반응기에 조류 및 당화효소를 투입하여 1차 당화를 진행한 후, 연속적으로 발효 균주를 투입하는 경우는 당화효소의 당화 최적온도(20 내지 60℃)에서 1차적으로 신속히 당화를 시킨 후, 이어 발효 균주를 투입하고 균주 생육 최적온도로 조정한 다음 1 내지 5일 동안 추가 배양함으로써 전산을 고농도로 생성할 수 있다. 그리고 당화/발효 공정시 사용되는 균주 특성에 따라 호기배양 또는 혐기배양을 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 당화효소는 셀룰라아제, β-글루코시다제, β-아가라제, β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, 라미나린나아제, α-D-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, 수크라아제, 말타아제, 이소말타아제, 락타아제, 드리할라제, 울바나아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 분해효소를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발효 균주는 락토코커스(Lactococcus), 락도바실러스(Lactobacillus), 스트랩토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코쿠스(Pediococcus), 에로코쿠스(Aerococcus), 카노박테리엄(Carnobacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 오에노코커스(Oenococcus), 테트라제노코코스(Tetragenococcus), 바고코쿠스(Vagococcus), 와이셀라(Weisella), 라이족토니아 오라이제(R. oryzae), 리조푸스 아리주스(R. arrhizus), 락토바실러스 아밀로필러스 GV6(Lactobacillus amylophilus GV6), 락토 바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510), 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합균주를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 락토 바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510, KCTC 3510), 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP) 또는 이들의 혼합 균주를 사용하는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는 본 발명에 따른 젖산은 단일 반응기에서, 조류와 셀룰라아제, β-글루코시다제, β-아가라제, β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, 라미나린나아제, α-D-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, 수크라아제, 말타아제, 이소말타아제, 락타아제, 드리할라제, 울바나아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 당화효소를 이용하여 20 내지 60℃ 온도에서 조류 바이오매스를 0.5 내지 2일 동안 1차 당화시켜고, 상기 동일 반응기에 연속적으로 락토코커스(Lactococcus), 락도바실러스(Lactobacillus), 스트랩토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코쿠스(Pediococcus), 에로코쿠스(Aerococcus), 카노박테리엄(Carnobacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 오에노코커스(Oenococcus), 테트라제노코코스(Tetragenococcus), 바고코쿠스(Vagococcus), 와이셀라(Weisella), 라이족토니아 오라이제(R. oryzae), 리조푸스 아리주스(R. arrhizus), 락토바실러스 아밀로필러스 GV6(Lactobacillus amylophilus GV6), 락토 바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510, KCTC 3510), 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합균주를 투입하여 25 내지 50℃에서 1 내지 5일 2차 발효시킴으로써 생성될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP)는 본 발명자들이 분리·선별한 신규한 균주로 2011년 3월 2일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터로부터 기탁번호 제 KCTC 11883BP를 부여 받았다.

또한 본 발명에 따른 젖산은 단일 반응기에서, 조류; 셀룰라아제, β-글루코시다제, β-아가라제, β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, 라미나린나아제, α-D-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, 수크라아제, 말타아제, 이소말타아제, 락타아제, 드리할라제, 울바나아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 당화효소; 및 락토코커스(Lactococcus), 락도바실러스(Lactobacillus), 스트랩토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코쿠스(Pediococcus), 에로코쿠스(Aerococcus), 카노박테리엄(Carnobacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 오에노코커스(Oenococcus), 테트라제노코코스(Tetragenococcus), 바고코쿠스(Vagococcus), 와이셀라(Weisella), 라이족토니아 오라이제(R. oryzae), 리조푸스 아리주스(R. arrhizus), 락토바실러스 아밀로필러스 GV6(Lactobacillus amylophilus GV6), 락토 바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510, KCTC 3510), 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합균주; 를 동시에 투입하고, 20 내지 50℃ 온도에서 1 내지 5일 동안 1차 당화 및 2차 발효를 동시에 진행시킴으로써 생성될 수 있다.

상기 균주는 락토 바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510, KCTC 3510), 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP) 또는 이들의 혼합 균주를 사용하는 것이 바람직하며, 균주 특성에 따라 호기배양 또는 혐기배양을 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명에 따른 조류로부터의 화학물질 생산은 옥수수, 밀과 같은 식용자원이 아닌 비식용자원인 조류(algae)를 활용하기 때문에 바이오매스의 산업적 수요가 높아졌을 때 식품 가격 폭등 및 윤리적 문제의 발생 소지가 없고, 안정적으로 자원의 지속적 공급이 가능한 장점이 있다.

본 발명에 따른 조류는 생화학적/화학적 당화가 매우 용이한 특징을 가져 수집 후 생체를 직접 사용할 수 있고, 건조체를 이용할 때에도 특별한 전처리 없이도 높은 당화율을 나타내며, 단일 반응기에 조류와 함께 당화 효소 및 발효 균주를 동시 또는 연속적으로 투입하여 배양함으로써 경제적이면서 효율적으로 젖산을 제조할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 고농도의 젖산 제조방법으로 제조된 젖산은 바이오플라스틱의 제조 및 생산에 있어 현재 석유계 유래의 플라스틱 소비에 따른 문제점을 해소할 수 있어, 환경오염 예방에 크게 기여할 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 조류 바이오매스로부터 고농도의 젖산 제조방법에 대한 공정을 모식화한 것이고,
(A: 연속 당화/발효 공정, B: 동시 당화/발효 공정)
도 2는 그물말(HR), 헛뿌리말(RHI) 및 구멍갈파래(UPer)로부터 본 발명의 젖산 제조방법 따른 젖산의 생성량을 상대적으로 비교한 그래프를 나타낸 것이다. 여기서 ES는 조류 시료의 공급없이 효소액만 추가하여 발효한 것이며, 아울러 상대비교를 위해 시약용 글루코오스를 사용하여 균주의 발효능을 나타내었다.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[실시예 1] 담수조류 중 그물말(HR)로부터 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산의 생산

그물말 시료를 가지고 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산성을 조사하였다.

식물재료로서 온실에서 배양한 그물말 조류를 수확하여 탈수시킨 다음, 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후, 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다. 당농축액 제조는 그물말 건조시료를 직접 사용하거나 물/에탄올 추출성분이 제거된 고형물(Extractive-free solid)을 이용하였다.

발효 균주로서 한국생물자원은행에서 분양받은 락토 바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, KCTC 3510)과, 본 발명자들이 선별한 새로운 신균주인 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, 기탁 균주번호 KCTC 11883BP)를 이용하였다. 상기 균주들은 각각 L-lactic acid를 93±1, 94±1%, D-lactic acid를 7±1, 6±1% 생산하는 특징을 가진다.

효소당화를 위해 4가지 당화효소(E1＋E2＋E3＋E4)를 조합하여 사용하였다. 즉, E1은 셀룰라아제(Celluclast 1.5L CCN03110, Novozymes A/S), E2는 β-글루코시다제(Novozyme-188, Sigma C6105), E3는 α-아밀라아제(Sigma A8220), E4는 아밀로글루코시다아제(Sigma A7095)를 사용하였다.

젖산 생산을 위한 공정은 50 mL 규모로 실시하였다. 배지는 MRS medium 2를 사용하였다. 발효공정은 두 가지를 설정하였는 바, 조류 바이오매스 건조시료를 일정량 넣고 배지와 당화효소를 공급한 다음, 1일 후에 발효 균주를 첨가하거나(연속공정, A process), 배지/당화효소/발효 균주를 동시에 공급하여 발효를 진행하였다(동시공정, B process).

가) 연속공정(A process):

하기 표 1과 같은 조성의 MRS medium 2(pH 4.8)가 50 mL 포함된 500 mL 삼각플라스크에 그물말 건조시료 5.0 g 또는 7.5 g을 넣고, 121℃에서 20분 동안 고압멸균 하였다.

상기 고압멸균된 시료를 실온까지 식힌 다음, 0.45 um membrane filter에 여과시킨 효소 복합물 E1＋E2＋E3＋E4(1.0＋0.2＋1.0＋1.0 mL)을 모든 처리구에 첨가하고 50℃, 170 rpm에서 24시간동안 당화시켰다.

상기 당화중인 시료를 꺼내어 37℃로 낮춘 다음, 사전에 준비된 발효 균주(LAB3510, LA104) 농축액을 0.5 mL 접종하여 37℃에서 3일간 교반배양하면서 당화/발효시켰다.

발효 균주의 농축을 위해서는 하기 표 2의 MRS broth medium에 1일간 사전배양(37℃, 150 rpm)한 균주를 원심분리하여(9000 rpm, 15분, 4℃) 모은 것을 사용하였다.

상기 3일간 당화/발효시킨 시료를 꺼내어 동일 배지로 10배 희석한 후 원심분리를(8000 rpm, 20분, 4℃) 통해 탄산칼슘, 세포, 시료 잔유물 등을 제거하였다. 상등액을 취해 pH를 2로 조정한 다음 적당히 희석하여 글루코오스 및 젖산 함량을 biochemistry analyzer(YSI 2700)로 분석하였다.

나) 동시공정 1 (B process 1, one-step feeding):

상기 표 1과 같은 조성의 medium 2(pH 4.8)가 50 mL 포함된 500 mL 삼각플라스크에 그물말 건조시료 5.0 g 또는 7.5 g을 넣고, 121℃에서 20분 동안 고압멸균 하였다.

상기 고압멸균된 시료를 실온까지 식힌 다음, 0.45 um membrane filter에 여과시킨 효소 복합물 E1＋E2＋E3＋E4(1.0＋0.2＋1.0＋1.0 mL)와 사전에 준비된 발효 균주(LA104, LAB3510) 농축액을 0.5 mL 접종하여 37℃에서 3일간 교반배양하면서 당화/발효시켰다. 기타 방법은 가) 연속공정 실험에서와 동일하였다.

다) 동시공정 2 (B process 2, two-step feeding):

상기 표 1과 같은 조성의 medium 2(pH 4.8)가 50 mL 포함된 500 mL 삼각플라스크에 그물말 건조시료 5.0 g을 넣고, 121℃에서 20분 동안 고압멸균 하였다.

상기 고압멸균 된 시료를 실온까지 식힌 다음, 0.45 um membrane filter에 여과시킨 효소 복합물 E1＋E2＋E3＋E4(1.0＋0.2＋1.0＋1.0 mL)와 사전에 준비된 발효 균주(LA104, LAB3510) 농축액을 0.5 mL 접종하여 37℃에서 교반배양(170 rpm) 하였다. 그 후 배양 1일째에 고압멸균된 그물말 건조시료 5.0 g을 추가한 다음, 계속적으로 2일간 37℃에서 교반배양(170 rpm) 하면서 당화/발효시켰다. 기타 방법은 가) 연속공정 실험에서와 동일하였다.

라) 그물말의 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산 결과

그물말 시료의 일회 공급((one-step feeding)을 통한 연속 또는 동시 당화/발효공정에 있어서 고형분 함량을 5 g/53.7 mL(9.3%, w/v)로 하여 당화/발효시킬 경우, 하기 표 3에서도 확인할 수 있듯이, 두 공정 모두에서 발효 종료 이후 남아있는 당이 매우 낮았다. 이는 생성된 당이 거의 모두 전환되었음을 의미하며 생성된 젖산 함량은 47 내지 51 g/L 수준이었다. 그리고 그물말 건조시료의 고형분 함량을 7.5 g/53.7 mL(14.0%, w/v)로 하여 당화/발효시킬 경우에도 두 공정 모두에서 발효 종료 이후 남아있는 당은 매우 낮았고, 이 때 생성된 젖산 함량은 64 내지 71 g/L 수준이었다. 본 실시예에서 사용된 그물말 건조시료는 사전 당화실험에서 건물중의 약 40%가 글루코오스로 전환될 수 있는 능력을 가진 시료였고, 효소액 단독 처리구에서 LA104균주에 의한 젖산 생성이 16 내지 19 g/L 였던 바(효소 내에는 안정제로서 당이 포함되어 있었음), 보통 균주에 의한 글루코오스의 젖산으로의 전환율이 약 70 내지 80% 정도임을 감안하면 그물말 건조시료의 당화 산물 거의 모두가 젖산으로 전환되었음을 확인할 수 있었다.

결국 상기 실시예는 당화된 글루코오스가 뚜렷한 장애 없이 젖산으로 직접 전환되었다는 결과를 보여주는 것으로서, 이는 리그노셀룰로오스(Lignocellulose)계 다른 바이오매스에 비해 생산경비를 절감하는데 있어서 매우 좋은 장점을 가짐을 확인한 결과이며, 또한 접종한 균주간의 젖산 생산성에 있어서의 차이는 거의 관찰되지 않았다.

또한, 그물말 시료의 2회 공급(two-step feeding)을 통한 연속 또는 동시 당화/발효공정에 있어서 고형분을 5 g/53.7 mL(9.31%, w/v)씩 2회 공급하여 LA104 균주를 가지고 당화/발효시킬 경우는 하기 표 4에서도 확인할 수 있듯이, 발효 종료 이후 남아있는 당이 매우 낮았고 생성된 젖산 함량은 88.5 g/L 수준이었다. 본 실시예에서 사용된 그물말 건조시료는 사전 당화실험에서 건물중의 약 40%가 글루코오스로 전환될 수 있는 능력을 가진 시료였고, 효소액 단독 처리구에서 LA104균주에 의한 젖산 생성이 20.1g/L 였던 바(효소 내에는 안정제로서 당이 포함되어 있었음), 보통 균주에 의한 글루코오스의 젖산으로의 전환율이 약 80% 정도임을 감안하면 담수조류 중 그물말 과(HR) 건조시료의 당화 산물 거의 모두가 젖산으로 전환되었음을 확인할 수 있었다.

한편 LAB3510 균주를 가지고 당화/발효시킬 경우 발효 종료 이후 남아있는 글루코오스가 25. 6 g/L 였고, 생성된 젖산 함량은 47.9 g/L 수준이었다. 효소액 단독 처리구에서의 LAB3510 균주에 의한 젖산 생성이 1.4 g/L 이였기 때문에 그물말 건조시료로부터 실제 46.5 g/L의 젖산이 생성되었고, 아직 젖산으로 전환되지 않은 글루코오스가 25.6 g/L이었으며, 이는 전환율 80%를 감안해 볼 때 21.8 g/L의 젖산이 생성될 가능성이 있음을 보여주는 것으로, 이들을 합하면 결국 68.3 g/L의 젖산이 그물말 건조시료로부터 순수하게 생성되어 LA104에서의 젖산 생성량과 비슷해 질 것으로 예상된다. 즉, 조사 당시 LAB3510 처리구에서는 당화는 이루어졌지만 균주에 의한 젖산 생성이 아직 완결되지 않은 상태였다고 보여지며, 보다 시간을 두어 배양하면 균주 생장과 더불어 젖산 생성도 완성될 수 있을 것이다.

당화/발효시 작업에 불편이 없는 이상 고형분 함량을 가능한 한 높일수록 공정경비가 경감된다. 본 실시예의 경우에서도 시료 1회 공급 보다 2회 공급을 통해 고형분 함량을 높일 수 있었고 아울러 젖산 생산성을 향상시킬 수 있었는 바, 상기의 결과로부터 그물말 건조시료의 분할 공급 방법을 통해 젖산 생산성을 더욱 효율화 시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

[실시예 2] 해조류 중 헛뿌리말(RHI)로부터 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산

해조류 중 대마디말과의 헛뿌리말(RHI) 시료를 가지고 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산성을 조사하였다.

식물재료는 야외에서 수집한 헛뿌리말을 수확하여 탈수시킨 다음, 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다(이하 RHI powder라고 함). 한편, 물 추출물 또는 물/에탄올 추출성분이 제거된 고형물(extractive-free solid)을 제조하여 실험재료로 사용하였다.

상기 물/에탄올 추출성분이 제거된 고형물(Extractive-free solid)은 속슬렛 장치의 thimble(28×100 mm)에 헛뿌리말 건조시료를 넣고 일정량의 물을 이용하여 250℃에서 약 8시간 추출한 다음, 잔사를 취하여 45℃에 1일 동안 건조시켜 분말화 하였다(Water-extractive free solid, 이하 RHI-WEFS라고 함).

발효 균주로서 락토 바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510, KCTC 3510), 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP)를 이용하였다. 상기 균주들은 각각 L-lactic acid를 93±1, 94±1%, D-lactic acid를 7±1, 6±1% 생산하는 특징을 가진다.

젖산 생산 공정은 50 mL 규모로 2반복 실험하였다. 배지는 MRS를 사용하였고 효모 추출물(yeast extract)을 충분히 공급해 주었다. 발효공정은 두 가지를 설정하였는 바, 조류의 건조시료를 일정량 넣고 배지와 당화효소를 공급한 다음 1일 후에 발효 균주를 첨가하거나(연속공정, A process), 배지/당화효소/발효 균주를 동시에 공급하여 발효를 진행하였다(동시공정, B process).

가) 연속공정:

상기 표 1과 같은 조성의 medium 2(pH 4.8)가 50 mL 포함된 500 mL 삼각플라스크에 RHI powder 또는 RHI-WEFS 시료 7.5 g 을 넣고, 121℃에서 20분 동안 고압멸균 하였다.

상기 고압멸균 된 시료를 실온까지 식힌 다음, 0.45 um membrane filter에 여과시킨 효소 복합물 E1＋E2＋E3＋E4(4.5＋0.6＋3.0＋3.0 mL)을 모든 처리구에 첨가하고 50℃, 170 rpm에서 24시간 동안 당화시켰다. 이하는 상기 실시예 1에서와 같았다.

나) 동시공정 1(one-step feeding):

상기 표 1과 같은 조성의 medium 2(pH 4.8)가 50 mL 포함된 500 mL 삼각플라스크에 RHI powder 또는 RHI-WEFS 시료 7.5 g을 넣고, 121℃에서 20분 동안 고압멸균 하였다.

상기 고압멸균 된 시료를 실온까지 식힌 다음, 0.45 um membrane filter에 여과시킨 효소 복합물 E1＋E2＋E3＋E4(4.5＋0.6＋3.0＋3.0 mL)에 사전에 준비된 발효 균주(LA104, LAB3510) 농축액을 0.5 mL 접종하여 37℃에서 3일간 교반배양하면서 당화/발효시켰다. 기타 방법은 상기 실시예 1의 연속공정 실험에서와 동일하였다.

다) 헛뿌리말(RHI)로부터 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산 결과

RHI powder의 고형분 함량을 7.5 g/61.6 mL(12.2%, w/v)로 하여 당화/발효시킬 경우, 하기 표 5에서도 확인할 수 있듯이, 두 공정 모두에서 발효 종료 이후 남아있는 당이 매우 낮았다. 이는 생성된 당이 거의 모두 전환되었음을 의미하며 생성된 젖산 함량은 RHI powder는 57 내지 61.5 g/L, RHI-WEFS는 56 내지 65 g/L 수준이었다. 본 실시예에서 사용된 헛뿌리말 건조시료는 사전 당화실험에서 건물중의 약 35 내지 40%가 글루코오스로 전환될 수 있는 능력을 가진 시료였고, 효소 단독 처리구에서 LA104와 LAB3510 균주에 의한 젖산 생성이 각각 28.4 g/L, 11.5 g/L 였던 바, 보통 균주에 의한 글루코오스의 젖산으로의 전환율이 약 70 내지 80% 정도임을 감안하면 헛뿌리말 건조시료의 당화 산물 거의 모두가 젖산으로 전환되었음을 확인할 수 있었다.

또한, 발효균주를 LA104를 이용할 경우, 실제 기대되는 젖산 함량보다 낮게 검출되었는데 이는 탄산칼슘 투여량의 제한 때문이라고 추측된다.

한편 RHI-WEFS의 시료를 가지고 실험한 경우는 RHI powder에서보다 약간 높은 젖산 생성량을 보였다. 이는 물 추출성분의 제거로 인해 WEFS 시료내의 탄수화물 함량 자체가 약간 상승하였기 때문으로 추정된다.

결국 상기 실시예는 당화된 글루코오스가 뚜렷한 장애 없이 젖산으로 직접 전환되었다는 결과를 보여주는 것으로서, 이는 리그노셀룰로오스(Lignocellulose)계 다른 바이오매스에 비해 생산경비를 절감하는데 있어서 매우 좋은 장점을 가짐을 확인한 결과이기도 하다.

[ 실시예 3] 구멍갈파래 ( UPer )로부터 연속 또는 동시 당화 /발효공정을 통한 젖산 생산

해조류인 구멍갈파래(UPer)를 가지고 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산성을 조사하였다.

식물재료로서 야외에서 수집한 구멍갈파래를 탈수시킨 다음 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다(이하 UPer powder라고 함). 한편, 물 추출성분 또는 물/에탄올 추출성분이 제거된 고형물(extractive-free solid)을 제조하여 실험재료로 사용하였다.

상기 물/에탄올 추출성분이 제거된 고형물(Extractive-free solid)은 속슬렛 장치의 thimble(28×100 mm)에 UPer powder를 넣고 일정량의 물을 이용하여 250℃에서 약 8시간 추출한 다음, 잔사를 취하여 45℃에 1일 동안 건조시켜 분말화 하였다 (Water-extractive free solid, 이하 UPer-WEFS라고 함).

UPer powder를 상기와 같이 물로 1차 추출한 후, 이를 다시 에탄올로 150℃에서 3 내지 4시간 추출한 다음, 잔사를 취하여 45℃에 1일 동안 건조시켜 분말화 하였다 (Water & ethanol-extractive free solid, 이하 UPer-EFS라고 함).

발효 균주로서 락토 바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510, KCTC 3510), 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP)를 이용하였다. 상기 균주들은 각각 L-lactic acid를 93±1, 94±1%, D-lactic acid를 7±1, 6±1% 생산하는 특징을 가진다.

효소당화를 위해 4가지 당화효소(E1＋E2＋E3＋E4)를 조합하여 사용하였다. 즉, E1은 셀룰라아제(Celluclast 1.5L CCN03110, Novozymes A/S), E2는 β-글루코시다제(Novozyme-188, Sigma C6105), E3은 α-아밀라아제(Sigma A8220), E4는 아밀로글루코시다아제(Sigma A7095)를 사용하였다.

젖산 생산 공정은 50 mL 규모로 실시하였다. 배지는 MRS를 사용하였고 효모 추출물을 충분히 공급해 주었다. 발효공정은 두 가지를 설정하였는 바, 조류의 건조시료를 일정량 넣고 배지와 당화효소를 공급한 다음 1일 후에 발효 균주를 첨가하거나(연속공정, A process), 배지/당화효소/젖산 생산균주를 동시에 공급하여 발효를 진행하였다(동시공정, B process).

가) 연속공정:

상기 표 1과 같은 조성의 medium 2(pH 4.8)가 50 mL 포함된 500 mL 삼각플라스크에 UPer powder를 7.5 g 넣고, 121℃에서 20분 동안 고압멸균 하였다.

상기 고온멸균 된 시료를 실온까지 식힌 다음, 0.45 um membrane filter에 여과시킨 효소 복합물 E1＋E2＋E3＋E4(2.25＋0.3＋1.5＋1.5 mL)를 모든 처리구에 첨가하고 50℃, 170 rpm에서 24시간동안 당화시켰다. 이하 과정은 실시예 1에서와 같았다.

나) 동시공정 1( one - step feeding ):

상기 표 1과 같은 조성의 medium 2(pH 4.8)가 50 mL 포함된 500 mL 삼각플라스크에 UPer powder, UPer-WEFS, UPer-EFS 각각을 7.5 g 넣고, 121℃에서 20분 동안 고압멸균 하였다.

상기 고압멸균 된 시료를 실온까지 식힌 다음, 0.45 um membrane filter에 여과시킨 효소 복합물 E1＋E2＋E3＋E4(2.25＋0.3＋1.5＋1.5mL)에 사전에 준비된 발효 균주(LA104, LAB3510) 농축액을 0.5 mL 접종하여 37℃에서 3일간 교반배양하면서 당화/발효시켰다. 기타 방법은 실시예 1의 연속공정 실험에서와 동일하였다.

다) 구멍갈파래(UPer)로부터 연속 또는 동시 당화 /발효공정을 통한 젖산 생산 결과

① UPer powder로부터 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산

상기 구멍갈파래로부터 연속 또는 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산은 UPer powder의 고형분의 함량을 7.5 g/55.55 mL(13.5%, w/v)로 하여 당화/발효시킬 경우, 하기 표 6에서도 확인할 수 있듯이, 두 공정 모두에서 발효 종료 이후 남아있는 당이 매우 낮았다. 이는 생성된 당이 거의 모두 전환되었음을 의미하며 이로 인해 생성된 젖산 함량은 LA104균주에서는 45 내지 48 g/L, LAB3510 균주에서는 30 내지 31 g/L 수준이었다.

본 실시예에서 사용된 구멍갈파래 건조시료는 사전 당화실험에서 건물중의 약 25%가 글루코오스로 전환될 수 있는 능력을 가진 시료였고, 효소 단독 처리구에서 LA104와 LAB3510 균주에 의한 젖산 생성이 각각 33.1 g/L, 7.6 g/L 였던 바, 보통 균주에 의한 글루코오스의 젖산으로의 전환율이 약 70 내지 80% 정도임을 감안하면 UPer powder 시료의 당화/발효가 LAB3510 발효 균주에서는 기대치만큼 생산되었다. 그러나 LA104 발효 균주에서는 약간 저조한 경향이었는데 이는 탄산칼슘 투여량의 한도로 인해 LA104에서의 실제 젖산 함량이 충분히 검출되지 못했기 때문으로 예상된다.

② UPer WEFS와 UPer EFS로부터 동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산

상기 ①의 실험에서 UPer powder를 이용한 연속 또는 동시 당화/발효 공정간에는 젖산 생성 차이가 없었고, 또한 젖산 생성 정도가 LA104 발효 균주에서 기대치 보다 낮은 편이었다. 그 원인중의 하나가 세포내 추출물의 당화/발효 간섭 때문이거나 탄산칼슘 투여량의 제한 때문일 수 있으므로 본 실험에서는 추출물이 제거된 시료를 가지고 탄산칼슘 투여량을 충분히 높인 다음(40 g/L) 동시 당화/발효 실험을 비교 실시해 보았다.

상기 표 7에서도 확인할 수 있듯이, UPer-WEFS 및 UPer-EFS는 UPer powder에 비해 젖산 생성이 약간 증가되는 경향이었다. 발효 균주간의 젖산 생산능력의 경우는 LA104 균주가 LAB3510 균주에 비해 높았는데 이는 효소내 당 이용능력이 LA104 균주에서 높은 것으로, 구멍갈파래 시료로부터 순수하게 생성된 젖산은 두 균주간에 차이가 없이 거의 동일하게 20 내지 25 g/L 수준이었다.

본 실시예에서 사용된 구멍갈파래 건조 시료는 사전 당화실험에서 건물중의 약 25% 정도가 글루코오스로 전환될 수 있는 능력을 가진 시료였고, 효소 단독 처리구에서 LA104와 LAB3510 균주에 의한 젖산 생성이 각각 29.0 g/L, 4.9 g/L 였던 바, 보통 균주에 의한 글루코오스의 젖산으로의 전환율이 약 70-80% 정도임을 감안하면 UPer powder 건조시료의 당화 산물 대부분이 젖산으로 전환되었음을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 4] 그물말 ( HR ), 헛뿌리말 ( RHI ), ( UPer )로부터의 동시 당화 /발효공정을 통한 젖산 생산성 비교

동시 당화/발효공정을 통한 젖산 생산성에 있어서, 3 가지 조류종[(그물말 (HR), 헛뿌리말(RHI), 구멍갈파래(UPer)] 간의 차이를 비교하고자 실시하였다.

식물재료는 그물말, 헛뿌리말, 구멍갈파래를 수확하여 탈수시킨 다음, 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다.

젖산 생산 공정은 50 mL 규모로 실시하였다. 배지는 MRS를 사용하였고 효모 추출물을 충분히 공급해 주었다. 조류의 건조시료를 6 g 넣고 배지/당화효소/젖산 생산균주를 동시에 공급하여 발효를 3일간 진행하였다

상기 3 가지 조류종의 건조시료를 멸균한 후 멸균된 시료를 실온까지 식힌 다음, 0.45 um membrane filter에 여과시킨 효소 복합물 E1＋E2＋E3＋E4를 그물말의 경우 (1.0＋0.2＋1.0＋1.0 mL), 헛뿌리말과 구멍갈파래의 경우 (2.25＋0.3＋1.5＋1.5 mL)를 첨가한 후, 곧바로 사전에 준비해 둔 발효 균주 농축액(LA104, LAB3510)을 0.5 mL 접종하여 37℃에서 3일간 교반배양하면서 당화/발효시켰다. 이하 모든 과정은 상기 실시예 1에서와 같았다.

가) 그물말 ( HR ), 헛뿌리말 ( RHI ), 구멍갈파래(UPer)로부터의 동시 당화 /발효공정을 통한 젖산 생산성 비교

3 가지 조류종의 고형분 함량을 6.0 g/50 mL(12%, w/v)로 일정하게 하고 동일조건에서 동시 당화/발효시킬 경우, 도 2에서도 확인할 수 있듯이 모든 처리에서 실험 종료 이후 남아있는 당이 매우 낮았다. 이는 생성된 당이 거의 모두 전환되었음을 의미하며 이로 인해 생성된 젖산 함량은 두 균주 공히 그물말(HR) > 헛뿌리말(RHI) > 구멍갈파래(UPer) 순으로 높았다.

한편, 그물말과 헛뿌리말에서는 두 균주간에 젖산 생성량 차이가 없었으나 구멍갈파래의 경우는 LAB3510 균주보다 LA104 균주에서 젖산이 높게 생산됨을 확인할 수 있었는데 이는 두 균주의 기질이용성 차이 때문임을 확인하였다.

상기 실시예의 실험 결과를 종합해 보면, 1) 공시 시료 그물말, 헛뿌리말, 구멍갈파래 간에 젖산 생산정도는 그물말 > 헛뿌리말 > 구멍갈파래 순으로 좋았다. 2) 특정시료의 powder와 WEFS/EFS간의 젖산 생성 정도는 WEFS/EFS 시료에서 약간 높은 경향이나 그 차이가 크지 않았다. 3) 젖산 생산을 위한 당화/발효 공정에 있어서 연속공정과 동시공정 간에는 동일한 젖산 생산성을 보였다. 4) 원료 투입에 있어서는 모두 한꺼번에 투입하는 것보다는 여러 번 나누어 투입 하는 것이 고형분 함량을 높일 수 있을 뿐만 아니라 보다 고농도로 젖산을 생산할 수 있었고, 완전 혐기조건하에서는 젖산생성이 보다 이른시기에 완료됨을 확인할 수 있었다.

한국생명공학연구원

KCTC11883BP

20110302

Claims

단일 반응기 내에 그물말과의 훈장말속(Pediastrum sp.), 소라스트럼속(Sorastrum sp.), 히드로딕티온속(Hydrodictyon sp.); 대마디말과의 염주말속(Chaetomorpha sp.), 대마디말속(Cladophora sp.), 헛뿌리말속(Rhizoclonium sp.); 갈파래과의 파래속(Enteromorpha sp.)과 갈파래속(Ulva sp.);로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 조류, 당화효소 및 발효 균주를 동시 또는 연속적으로 투입 후, 혼합 배양하는 단계;를 포함하고,
상기 발효 균주가 락토바실러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP)인 것을 특징으로 하는 젖산의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 젖산은 반응기 내에 조류 및 당화효소를 투입하여 20 내지 60℃에서 1차 당화시키고, 상기 동일 반응기에 연속적으로 발효 균주를 투입하여 25 내지 50℃에서 1 내지 5일 2차 발효시킴으로써 생성되는 것을 특징으로 하는 젖산의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 젖산은 단일 반응기 내에 조류, 당화효소 및 발효 균주를 동시에 투입하고, 20 내지 50℃ 온도에서 1 내지 5일 동안 1차 당화 및 2차 발효를 동시에 진행시킴으로써 생성되는 것을 특징으로 하는 젖산의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 조류는 생체; 건조체; 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올로 침출 여과 후 남은 잔사물; 유기물 정제 장치를 이용하여 물, 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올 또는 이들의 연속 용매로 추출 후 남은 잔사물; 유기용매를 이용하여 지질성분을 추출하고 남은 잔사물;로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 젖산의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 당화효소는 셀룰라아제, β-글루코시다제, β-아가라제, β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, 라미나린나아제, α-D-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, 수크라아제, 말타아제, 이소말타아제, 락타아제, 드리할라제, 울바나아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 분해효소인 것을 특징으로 하는 젖산의 제조방법.
삭제
제 1항 내지 제 5항에서 선택되는 어느 한 항에 있어서,
상기 젖산은 단일 반응기에서,
조류와 셀룰라아제, β-글루코시다제, β-아가라제, β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, 라미나린나아제, α-D-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, 수크라아제, 말타아제, 이소말타아제, 락타아제, 드리할라제, 울바나아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 당화효소를 이용하여 20 내지 60℃ 온도에서 조류 바이오매스를 0.5 내지 2일 동안 1차 당화시키고,
상기 동일 반응기에 연속적으로 락토바실러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP)를 투입하여 25 내지 50℃에서 1 내지 5일 2차 발효시킴으로써 생성되는 것을 특징으로 하는 젖산의 제조방법.
제 1항 내지 제 5항에서 선택되는 어느 한 항에 있어서,
상기 젖산은 단일 반응기에서,
조류; 셀룰라아제, β-글루코시다제, β-아가라제, β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, 라미나린나아제, α-D-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, 수크라아제, 말타아제, 이소말타아제, 락타아제, 드리할라제, 울바나아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 당화효소; 및 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LA104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LA104, KCTC 11883BP);를 동시에 투입하고, 20 내지 50℃ 온도에서 1 내지 5일 동안 1차 당화 및 2차 발효를 동시에 진행시킴으로써 생성되는 것을 특징으로 하는 젖산의 제조방법.
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