CN111019836B - 丝状真菌生物垫、及其生产方法和使用方法 - Google Patents

丝状真菌生物垫、及其生产方法和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生长真菌的新方法，其使用工程化的人工培养基并产生可以用最少的工艺收获的高密度丝状真菌生物垫，从该丝状真菌生物垫中可以分离出真菌产物例如抗生素、蛋白质和脂质；该方法在能量使用、氧化、用水和废物流产生方面导致降低的真菌培养成本。

Description

丝状真菌生物垫、及其生产方法和使用方法
本申请是申请日为2017年2月28日，申请号为201780027006.X，发明名称为“丝状真菌生物垫、及其生产方法和使用方法”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本申请涉及子囊菌门(Ascomycota)、接合菌门(Zygomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、球囊菌门(Glomermycota)和壶菌门(Chytridiomycota)中分离的丝状真菌菌株，例如镰孢属(Fusarium)物种、曲霉属(Aspergillus)物种、木霉属(Tricoderma)物种、青霉属(Penicillium)物种、毛霉目(Mucorales)中的物种，包括根霉属(Rhizopus)物种、称为MK7的嗜酸性丝状真菌菌株、及其后代，以及进行表面发酵以从这些产生多种有用产物的真菌菌株生产丝状真菌生物垫(biomat)的方法。
背景技术
大多数真菌的细胞生长为管状、细长和线状结构，称为菌丝(hyphae)，其可含有多个细胞核，并通过在其尖端生长而延伸。这与外观类似的生物(例如丝状绿藻)形成对比，丝状绿藻通过重复细胞分裂而生长为细胞链。
构成真菌营养阶段的菌丝集合体称为菌丝体(单数mycelium,复数mycelia)。菌丝体可以被认为是真菌的主体或形式，并且常被描述为丝状。通过菌丝的无性繁殖而生长，菌丝生长成分枝链。菌丝体对真菌非常重要，因为它可以通过土壤或木材游走并使用该基质作为食物(在真菌生产子实体(如胆子果)如蘑菇、檐状菌(bracket)、松露、杯状菌(cup)或羊肚菌时，这将是真菌需要的)。
菌丝体可以分泌能够杀死活组织的胞外酶(死体营养)且然后吸收死亡物质(腐生性营养)，仅仅吸收已经死亡的物质(再次，腐生性营养)，或通过从活组织取食(活体营养)。
虽然据认为真菌界的所有门都含有丝状物种，但是子囊菌门和接合菌门尤其具有大量的丝状真菌物种。这些门的成员生产各种各样的产物，如蛋白质、氨基酸、油、药物(如青霉素)、食品(如豆豉)、食品添加剂、食品防腐剂(如柠檬酸)和工业酶，也用于烘焙和奶酪、啤酒和葡萄酒的生产。
现有技术的固体基质发酵(SSF)具有许多明显的缺点。例如，终产物(即产生的生物质)与固体基质紧密混合，基本上难以将它们彼此分离。通常，SSF以低浓度产生真菌生物质，具有非常低的转换率并最终导致低产率。SSF需要特定的水活度以进行有效发酵。递送和维持正确量的水活度是困难且昂贵的。通气的SSF系统也很难实现，进一步恶化转换效率并限制系统产率。不恰当的水活度以及不良通气对传质和传热造成限制，这导致过热和氧气供应不足。所得生物质的特征在于具有随机取向的细丝，这极大地限制了在某些应用(即食品和/或动物饲料)中的利用。
主要由镰孢霉Fusarium venenatum丝状真菌的生物质组成的产品QuornTM提供相对营养的菌蛋白。QuornTM由现有技术的深层发酵(submerged fermentation)系统生产，该系统能够在分批连续工艺中生产大量产品。虽然具有商业上可行性，但该生产方法存在许多明显的缺点。为了满足商业需求，QuornTM使用价值3500万到4千万美元/个的生物反应器。QuornTM系统在单个反应器中连续运行，直至真菌系统成熟超出关键量度指标或被其它菌种污染。此时，停止生产、清空和消毒反应器和所有相关的管道，这个过程可能需要数周才能完成，并为商业产品供应商带来了许多严重的问题。这些问题包括例如，(1)难以预测生产周期，(2)清洗和停产所造成的成本，(3)难于控制库存等。此外，大型生物反应器中的深层发酵需要极大量的能量来通气和混合。将发酵生物质的液体中分离生物质需要离心，已知这也是需要高成本和高能量投入的过程。该过程还是耗水巨大的，从而需要处理大量废水。所生产的生物质具有短的丝长度，这限制了其在不引入粘合剂以及无随后的工艺步骤的情况下直接转换为食品/饲料产品的能力，所述随后的工艺步骤会导致进一步的成本、以及在有效管理方面的困难和工作。
目前的丝状菌丝体生长方法存在许多缺点。例如，具有适当通气的设施和真菌生长以及随后从生长培养基中分离真菌菌丝体(例如离心)所需的设备，均需要大量资本支出，特别是在以工业规模进行真菌生长的情况下。当前的方法不仅需要大量的能源和水输入，而且还会导致产生大量的废物流。
因此，工业上需要改善的方法进行丝状菌丝体丝状真菌生物垫形成。
发明内容
本公开克服了当前所使用的方法的限制。在此，在将所需真菌菌株接种到新型生长培养基中后，不需要通气，通过表面发酵，产生丝状真菌生物垫。这种表面发酵方法适用于各种真菌物种，这些真菌菌种能够在不同行业中生产各种各样的产品。所开发的培养基造成快速的细胞生长、形成具有长丝的高密度丝状真菌生物垫、产生小的废物流、并允许通过碳源、碳氮比(C:N)和工艺参数的变化来对生产的丝状真菌生物垫进行工程化。如通过水使用、能源使用、设备需求和碳足迹所测量的，总体效果是高生产率和最小的环境影响。
因此，本公开提供了适用于培养丝状真菌并使其能够产生丝状真菌生物垫的人工培养基。该人工培养基至少包含以下的常量营养素(macronutrient)：氮(N)、磷(P)、钙(Ca)、镁(Mg)、碳(C)、钾(K)、硫(S)、氧(O)、氢(H)和以下微量营养素：铁(Fe)、硼(B)、铜(Cu)、锰(Mn)、钼(Mo)和锌(Zn)。在某些情况下，微量营养素中增加以下额外的微量营养素：铬(Cr)、硒(Se)和钒(V)。人工培养基可以具有利于产生具有高蛋白质:脂质比率或高脂质:蛋白质比率的丝状真菌生物垫的变化的C:N比。
本发明还提供培养各种丝状真菌用于丝状真菌生物垫生产的条件，其中一些真菌是嗜酸性的，如镰孢属(Fusarium)、Fusisporium属、假镰孢属(Pseudofusarium)、赤霉属(Gibberella)、Sporotrichella属、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、木霉属(Triocoderma)的菌种和/或菌株、毛霉目(Mucorales)(例如，根霉属(Rhizopus))的菌种、和命名为MK7的丝状真菌菌株。取决于菌种和/或菌株，培养基的pH范围为约0.68至约8.5，并且在一些情况下高至10.5。该方法的一个实施方案包括将一种或多种真菌菌种和/或菌株接种到人工培养基中并生长该真菌菌种和/或菌株以产生含有一种或多种有用产物的丝状生物垫。
产生的丝状真菌生物垫可以通过表面发酵由厌氧、微需氧、需氧条件或其组合来产生。丝状真菌生物垫可以包含分生孢子、小分生孢子、大分生孢子、分生孢子器、厚垣孢子、菌丝、菌丝片段或其任何和所有组合形式的真菌菌种和/或菌株和/或其后代。
本发明还提供用于收获丝状真菌生物垫、分离和/或纯化由丝状真菌产生的有用蛋白质、氨基酸和/或脂质的方法。这些蛋白质、氨基酸和/或脂质可用于食品、鱼饲料、动物饲料、油、脂肪酸、药物、营养保健品、杀真菌剂、除草剂、杀酵母剂、杀虫剂、生物润滑剂、以及作为原料用于转化为其他增值产品。
本发明提供以下内容：
1.一种生产丝状真菌生物垫的方法，包括
(a)将有效量的至少一种丝状真菌的浮游细胞接种到人工生长培养基中；
(b)将接种的生长培养基在不受干扰的状态下孵育一段时间；
(c)生产丝状真菌生物垫；和
(d)任选地收获丝状真菌生物垫。
2.一种生产丝状真菌生物垫的方法，包括
(a)将7.5％(体积:体积)的至少一种丝状真菌的浮游细胞接种到人工生长培养基中；
(b)将接种的生长培养基在不受干扰的状态下孵育一段时间；
(c)生产丝状真菌生物垫；和
(d)任选地收获丝状真菌生物垫。
3.根据项1或2所述的方法，其中所述至少一种丝状真菌选自：命名为MK7的菌株(ATCC保藏号PTA-10698)、镰孢属物种(Fusarium species)和根霉属物种(Rhizopusspecies)。
4.根据项1-3中任一项所述的方法，其中所述至少一种丝状真菌是命名为MK7的菌株(ATCC保藏号PTA-10698)、镰孢Fusarium venenatum或少孢根霉(Rhizopusoligosporus)。
5.根据项1-4中任一项所述的方法，其中所述至少一种丝状真菌是命名为MK7的菌株(ATCC保藏号PTA-10698)。
6.根据项1-5中任一项所述的方法，其中人工培养基的渗透压为约18.6atm。
7.根据项1-6中任一项所述的方法，其中人工培养基的离子强度为约0.368。
8.一种丝状真菌生物垫，其包含至少一个具有生物垫细胞密度为至少25g/L的细胞层(干重/L培养基)。
9.根据项8所述的丝状生物垫，其中所述丝状真菌选自：命名为MK7的菌株(ATCC保藏号PTA-10698)、镰孢属物种和根霉属物种。
10.根据项8或9所述的丝状生物垫，其中所述丝状真菌是命名为MK7的菌株(ATCC保藏号PTA-10698)、镰孢Fusarium venenatum或少孢根霉。
11.根据项8-10中任一项所述的丝状生物垫，其中所述丝状真菌是命名为MK7的菌株(ATCC保藏号PTA-10698)。
12.根据项8-11中任一项所述的丝状生物垫，其中细丝主要组织成与空气:生物垫和/或生物垫:培养基界面平行。
13.根据项8-12中任一项所述的丝状生物垫，其中所述生物垫包含至少两个结构上不同的细胞层，一个与人工培养基接触的细胞层和至少一个其他细胞层。
14.根据项8-13中任一项所述的丝状生物垫，其中细胞层之间的结构差异是所述层内细胞的密度。
15.根据项8-14中任一项所述的丝状生物垫，其中一个细胞层与空气和至少一个其他细胞层接触。
16.根据项8-15中任一项所述的丝状生物垫，其中所述生物垫包含三个结构不同的细胞层。
17.根据项8-16中任一项所述的丝状生物垫，其中所述生物垫的拉伸强度为至少0.2kg/cm垫宽。
18.根据项8-17中任一项所述的丝状生物垫，其中细胞密度为至少50g/l或至少75g/l。
19.根据项8-18中任一项所述的丝状生物垫，其中所述生物垫具有至少40％的蛋白含量。
20.根据项8-19中任一项所述的丝状生物垫，其中所述生物垫具有至少39％的脂质含量。
附图说明
图1.A，B：黄石国家公园温泉环境中的天然菌株MK7；C，D：在不同的人工条件下产生的菌株MK7生物质，显示高密度、高拉伸强度的粘性纯生物质；E：C，D的菌株MK7生物质的横截面。
图2.用于产生接种物的示例性10L生物反应器。
图3.A：显示从第2代归档培养物收集的白色菌丝体垫的环；B：具有菌株MK7菌丝体垫的培养皿。
图4.在10L生物反应器中菌株MK7培养物的生长和pH，该培养物待用于接种盘式反应器。甘油含量为7.5％的MK7-1液体培养基，其中C:N比为7.5:1。当生物质处于指数生长后期时，在72和90小时之间产生用作接种物的最佳培养物(箭头之间)。
图5.A：用作盘式反应器生产生物垫的托盘。托盘中的尺子长31.75cm(12.5英寸)；B：由托盘架系统组成的生物反应器，用于容纳39个塑料托盘。整个反应器用
Figure GDA0002402560150000061
样透明塑料包裹膜包裹。
图6.在具有1.5升MK7-1培养基和125g/L甘油的0.25m2的托盘中表面发酵8天后收获的菌株MK 7生物垫，该生物垫在限制的氮条件下(C:N比为40:1)培养用于高脂质生产。
图7.菌株MK7在浅盘中的典型生长模式，显示延迟期(lag phase)(其中生物质积累速率相对较慢0-1.5天)、以及指数生长开始时生物垫形成的时间(箭头，1.5天)。生物垫在含有7.5％甘油和30:1C:N比的MK7-1培养基中生长。
图8.在三个不同数量级大小的托盘中在甘油上生长的菌株MK7生物垫的干重。
图9.菌株MK7的亚麻酸生产作为培养持续时间和温度的函数。4％甘油表面发酵；pH 2.8和MK7-1培养基。
图10.使用MK7-1培养基+甘油产生的5天龄MK7生物垫的横截面的透射光显微图像。A，B：50X放大，显示三层：气生菌丝层、过渡区层和致密底层；C：50X放大，显示两个不同的层。
图11.使用MK7-尿素培养基生产的5天龄MK7生物垫的横截面显微照片。A：菌株MK7生物垫的顶部表面，显示从致密菌丝体层向外延伸的气生菌丝和菌丝体。使用透射光显微镜以100X放大率产生的图像；B：菌株MK7生物垫的顶部表面，显示从致密菌丝体层向外延伸的气生菌丝和菌丝体。使用透射光显微镜以400X放大率产生的图像；C：菌株MK7生物垫的底部表面，显示菌丝和菌丝体。使用透射光显微镜以400X放大率产生的图像；D：菌株MK7生物垫的致密内部，显示其交织的纤维组成。使用透射光显微镜以400X放大率产生的图像。
图12.A，B：使用具有5％甘油和pH 4.1的MK-7培养基在0.25m2托盘上生长6天的少孢根霉(Rhizopus oligosporus)的生物垫。C：垫中少孢根霉菌丝的400x光学显微镜图像。
图13.A：4天和B：6天后在0.25m2盘式反应器中生长的镰孢Fusarium venenatum的图像。使用pH5.0的MK7-1培养基和12.5％甘油生长生物垫。图像C显示了使用光学显微镜以400x放大率拍摄的F.Venenatum的菌丝形式。在这些条件下，两个托盘中每个托盘的F.Venenatum产生平均71g干生物质。
图14.A：收获通过固态发酵(SSF)培养的菌株MK7生物质，显示菌株MK7完全整合入木质纤维素中，<5g菌株MK7干重生物质/L(培养基：原料混合物)。B：收获的A的菌株MK7生物质的显微照片，显示细丝随机与麦秸整合。C：通过固体基质表面发酵(SSSF)的菌株MK7生物垫，显示致密(180g.L)、粘着、基本上纯的菌株MK7生物质。
图15.在12.7×12.7cm托盘中用各种处理对菌株MK7进行7天培养。误差棒是三个托盘的标准差。
图16.左：8天后在pH 2.7用12.5％甘油培养的菌株MK7的光学显微镜图像。右：尼罗红染色后的荧光图像，表明高百分比的脂质，估计在细胞面积的40-60％之间。
图17.由菌株MK7产生的脂质谱。(左图)在直接转酯(总燃料潜力(total fuelpotential))和可提取脂质级分中总脂肪酸甲酯(FAME)的平均值,作为培养基C:N比的函数(n＝3)。可提取脂质级分柱中的带表示三-、二-和单-酰基甘油酯(TAG，DAG，MAG)和游离脂肪酸(FFA)组分。插图显示了GC-FID色谱图，其中TAG分子占脂质级分的主导。(右图)对于由所有脂肪酸直接转酯成FAME(直接)以及仅自可提取脂质前体产生FAME(可提取)，所产生的脂质的FAME谱。插图显示对于直接和可提取级分而言的GC-MS色谱图。
图18.在酸乳清替代物培养基(AWS)上在4.8的初始pH下生长7天后的菌株MK7生物垫(A，B，C)。生物垫(C)的透射光显微镜图像(400X)，显示该材料的丝状性质。
发明详述
定义
如本文所使用的，动词“包含”及其变形在本说明书和权利要求中以其非限制性意义使用，意味着包括该单词之后的项目，且不排除未明确提及的项目。另外，通过不定冠词“a”或“an”提及的元素不排除存在多于一个元素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅一个元素。因此，不定冠词“a”或“an”通常意味着“至少一个”。
如本文所用，术语“源自”是指来源，可包括天然存在的、重组的、未纯化的或纯化的分子。源自特定的、分离的真菌菌株和/或其后代的真菌可包含某些突变但仍保留其所源自的分离真菌或其后代的一种、两种或更多种或全部区别性形态学和生理学特征。
如本文所用，术语“嗜酸”是指生物的最佳生长条件是在酸性条件下。
如本文所用，术语“原料”(feedstock)是指可以直接用作燃料或转换为另一种形式的燃料或能量产物的任何可再生的生物材料。生物质原料是用于衍生燃料如乙醇、丁醇、生物柴油和其他烃类燃料等的植物和藻类物质。
如本文所用，短语“木质纤维素原料”是指含有木质纤维素的原料。木质纤维素原料的非限制性实例包括农作物残留物(例如，麦秸、大麦秆、稻秸、小籽粒(small grain)秸秆、玉米秸秆、玉米纤维(例如玉米纤维胶(CFG)、干酒糟(DDG)、玉米面筋粉(CGM)、专门种植的草类作物(purpose-grown grass crop)、能源作物、柳枝稷、干草苜蓿(hay-alfalfa)、甘蔗渣(sugarcane bagasse))、玉米浆、甜菜浆、非农业生物质(如藻垫、城市树木残留物)、玉米浆、甜菜浆、林产品和工业残留物(例如，软木第一/第二轧机残留物、硬木第一/第二轧机残留物、再生纸浆泥)，含木质纤维素的废物(例如，新闻纸、废纸、酿造谷物、城市有机废物、庭院废物、临床有机废物、生物燃料生产期间产生的废物(例如，经加工的藻类生物质、甘油、来自纤维素乙醇生产的残留物、来自生物柴油生产的固体残留物)、以及其组合。
除非另有说明，本文所用的术语“碳水化合物”是指碳、氢和氧的化合物，其含有与至少两个羟基组合的醛或酮基。本发明的碳水化合物还可以任选地在一个或多个位置被取代或脱氧。因此，碳水化合物包括取代和未取代的单糖、二糖、寡糖和多糖。糖可以是醛糖或酮糖，并且可以包含3、4、5、6或7个碳。在一个实施方案中，它们是单糖。在另一个实施方案中，它们可以是吡喃糖和呋喃糖。它们可任选地在任何相应的C-位置脱氧，和/或被一个或多个以下部分取代，如氢、卤素、卤代烷基、羧基、酰基、酰氧基、氨基、酰氨基、羧基衍生物、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、巯基、亚胺、磺酰基(sulfonyl)、硫烷基(sulfanyl)、亚硫酰基(sufinyl)、氨磺酰基(sulfamonyl)、酯、羧酸、酰胺、膦酰基、氧膦基、磷酰基、硫酯、硫醚、肟、肼、氨基甲酸酯。这些糖单元可以以任何顺序排列，并且两个糖单元之间的连接可以以约十种不同方式中的任何一种发生。结果，不同的可能立体异构寡糖链的数量是巨大的。在一个实施方案中，所述碳水化合物选自单糖、二糖、寡糖、多糖及其组合。
如本文所用，术语“单糖”是指选自三碳糖(三糖)、四碳糖(四糖)、五碳糖(戊糖)、六碳糖(己糖)等及其组合的糖单体。在一个实施方案中，五碳糖选自戊酮糖(例如核酮糖、木酮糖)、戊醛糖(核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖)、脱氧糖(脱氧核糖)及其组合。在一个实施方案中，六碳糖选自己醛糖(例如，阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖)、环状半缩醛、己酮糖(例如，阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖)。在一个实施方案中，所述单糖选自三糖、四糖、戊糖、己糖、庚糖等、及其组合。
在一个实施方案中，单糖是线性形式；在另一个实施方案中，单糖是环状的。
如本文所用，短语“可发酵糖”是指可以转换为有用的增值发酵产物的糖化合物，该增值发酵产物的非限制性实例包括氨基酸、蛋白质、糖、碳水化合物、脂质、核酸、聚酮化合物、维生素、药物、动物饲料补充剂、专用化学品、化学原料、塑料、溶剂、燃料或其他有机聚合物、乳酸和乙醇。可通过所公开的方法生产的特定增值产品，包括但不限于β-葡聚糖、乳酸；专用化学品；有机酸，包括柠檬酸、琥珀酸和马来酸；溶剂；鱼饲料和动物饲料补充剂；药物；维生素；氨基酸，如赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸、类胡萝卜素、人食物、营养保健品和天冬氨酸；工业酶，如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶和木聚糖酶；和化学原料。
如本文所用，术语“真菌”是指具有吸收性营养方式和缺乏叶绿素的一组独特的真核生物。
如本文所用，术语“酸化物质”是指任何材料、化学化合物、试剂和/或组合物，当其加入溶剂(例如水)中时，得到氢离子活性大于纯溶剂(如水)的溶液。该物质可以是气体、液体或固体形式。该物质可以是有机和/或无机的。酸化物质的非限制性实例包括包含以下的任何材料：卤化氢及其溶液(例如，盐酸(HCl)、氢溴酸(HBr)和氢碘酸(HI))、卤代含氧酸(例如，次氯酸、氯酸、高氯酸、高碘酸及相应的溴和碘的化合物)、硫酸(H2SO4)、氟硫酸、硝酸(HNO3)、磷酸(H3PO4)、氟锑酸、氟硼酸、六氟磷酸、铬酸(H2CrO4)、磺酸(sufonic acid)、甲磺酸(又名mesylic acid，MeSO3H)、乙磺酸(又名esylic acid，EtSO3H)、苯磺酸(又名besylicacid，C6H5SO3H)、对甲苯磺酸(又名tosylic acid，CH3C6H4SO3H)、三氟甲磺酸(又名triflicacid，CF3SO3H)、羧酸(例如乙酸、柠檬酸、甲酸、葡萄糖酸、乳酸、草酸、酒石酸、插烯类(Vinylogous)羧酸(例如抗坏血酸、米氏酸(meldrum’s acid))、酸式盐(例如，碳酸氢钠(NaHCO3)、硫氢化钠(NaHS)、硫酸氢钠(NaHSO4)、磷酸二氢钠(NaH 2PO4)和磷酸二钠(Na2HPO4))。
如本文所用，术语“中和(neutralize)”、“中和(neutralizing)”和“中和(neutralization)”是指在水性溶液中的化学反应，其中酸和碱反应形成水和盐，并且其中溶液的pH恢复至初始pH。
如本文所用，术语“锰供体”是指可在水性溶液中提供锰离子(例如，锰(I)、锰(II)和锰(III))的组合物或化合物。锰供体的非限制性实例包括Mn2(CO)10,K5Mn(CN)6NO,MnCl,MnF2,MnBr2,MnO,MnO2,MnCh,MnF3,MnBr3,MnCO3,Mn(CH3COO)2,C6H9MnO6,MnTiO3,[CH3COCH＝C(O)CH3]2Mn,[C6H11(CH2)3CO2]2Mn,(HCO2)2Mn,Mn(C5HF6O2)2,Mn(PH2O2)2,MnI,(C3H5O3)2Mn,MnMoO4,Mn(NO3)2,Mn(ClO4)2,C32H16MnN8,MnSO4,(CH3COO)3Mn,C32H16ClMnN8,C48H28ClMnN4O8,C5H4CH3Mn(CO3),Mn(C5H4C2H5)2,和C16H22Mn。
如本文所用，术语“pH缓冲材料”是指当在液体混合物中加入时，可以维持所述液体混合物的pH的组合物，其中pH被保持在约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0。例如，液体混合物的pH在约0.5至约3.0的范围内。对于丝状嗜酸性MK7菌株的优选pH为约2.2至约3.0。这种组合物可包含如酸、酸式盐、碱和碱式盐的化合物，例如HCl,H2NO3,H2SO4,NaHCO3,NaHS,NaHSO4,NaH2PO4,Na2HPO4,NaHSO3,KHCO3,KHS,KHSO4,KH2PO4,K2HPO4,KHSO3.NaOH,KOH,Mg(OH)2,Na2CO3,K2CO3,KHCO3,CaCO3,MgCO3,Na2S,K2S等。
如本文所用，术语“需氧条件”是指其中提供足够氧气的条件，在这种条件下生长的微生物中的厌氧呼吸被阻止，并且厌氧代谢途径被抑制以防止厌氧呼吸。
如本文所用，术语“微需氧”和“喜微氧”可互换使用，指其中氧供应有限的条件，但生物中的细胞呼吸占优势的是需氧呼吸。
如本文所用，术语“脂肪酸”是指长链分子，其一端具有甲基，另一端具有羧酸基团。
如本文所用，术语“分离的真菌”是指包含从天然来源获得的真菌群体的任何组合物。
如本文所用，术语“碳源”通常是指适合用作原核或真核细胞生长的碳来源的物质。碳源包括但不限于生物质水解产物、酸乳清、甜乳清、碳水化合物(例如淀粉、蔗糖、多糖和单糖)、纤维素、半纤维素、木糖和木质素、以及这些物质的单体组分和/或其组合。碳源可包括各种形式的各种有机化合物，包括但不限于聚合物、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽等。这些包括例如各种单糖如葡萄糖、右旋糖(D-葡萄糖)、麦芽糖、寡糖、多糖、饱和或不饱和脂肪酸、琥珀酸盐、乳酸盐、乙酸盐、乙醇等、或其混合物。碳源也可以是原料或木质纤维素原料，如甜菜浆。光合生物也可以产生碳源作为光合作用的产物。
如本文所用，术语“生物催化剂”是指这样的任何类型的活的系统或细胞，其通过降低反应的活化能来加速化学反应，并且在该过程中其既不被消耗也不被改变。生物催化剂可包括但不限于微生物，如酵母、真菌、细菌和古细菌。例如，本发明的分离的真菌菌种和/或菌株可用作生物催化剂用于蛋白质和脂质生产中，或用于蛋白质和脂质生产中降解碳基质或有机分子。
如本文所用，术语“发酵”或“发酵过程”是指，在含有原材料(如碳源和营养素)的培养基中培养生物或生物催化剂的过程，其中所述生物或生物催化剂将这些原材料转换为产物。
如本文所用，术语“生物质”是指源自活的或最近活的生物的生物物质，例如绿色植物的茎、叶和含淀粉部分，或木材，废物，森林残留物(死树、树枝和树桩)，庭院修剪物，木屑、或源自藻类或动物的材料和/或工业副产物和废物流，食物废物/废料、和其他简单的糖。在一些情况下，生物质含有相当大部分的蛋白质和/或脂质。在其他情况下，其主要由淀粉、木质素、果胶、纤维素、半纤维素和/或果胶组成。
如本文所用，术语“纤维素生物质”是指主要由植物纤维组成的生物质，所述植物纤维是人不可食用或几乎不可食用的并且具有纤维素作为主要成分。可以将这些纤维水解以产生可以被微生物发酵的各种糖。纤维素生物质的实例包括草、木材、和由农业或林产品工业产生的富含纤维素的残留物。
如本文所用，术语“丝状生物垫”和“丝状真菌生物垫”可互换使用，是指由丝状真菌产生并含有丝状真菌的生物垫。
如本文所用，术语“淀粉”是指易被消化酶(例如淀粉酶)水解的葡萄糖聚合物。淀粉通常集中在植物的特化部分，如马铃薯、玉米粒、米粒、小麦籽粒和甘蔗茎。
如本文所用，术语“木质素”是指一种聚合物质，其主要由连接的酚类单体化合物(如对羟基肉桂醇、松柏醇和芥子醇)组成，其形成植物结构刚性的基础并常被称为植物的木质部分。木质素也被认为是植物细胞壁的非碳水化合物部分。
如本文所用，术语“纤维素”是指式(C6H10O5)n的β-葡萄糖的长链聚合物多糖碳水化合物，通常存在于植物细胞壁中与木质素和任何半纤维素组合。
如本文所用，术语“半纤维素”是指一类植物细胞壁多糖，其可以是几种杂聚物中的任何一种。这些包括木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、葡糖醛酸木聚糖、葡甘聚糖(lucomannan)和半乳甘露聚糖。半纤维素的单体组分包括但不限于：D-半乳糖、L-半乳糖、D-鼠李糖(rnannose)、L-鼠李糖、L-岩藻糖、D-木糖、L-阿拉伯糖和D-葡糖醛酸。这类多糖与纤维素一起存在于几乎所有细胞壁中。半纤维素的重量低于纤维素，不能用热水或螯合剂提取，但可以用碱水溶液提取。在形成大多数植物细胞的细胞壁的交联纤维网络中，半纤维素的聚合物链与果胶和纤维素结合。
如本文所用的术语“果胶”是指一类植物细胞壁异质多糖，可通过用酸和螯合剂处理来提取。通常，发现70-80％的果胶作为α-(1-4)-连接的D-半乳糖醛酸单体的线性链存在。较小的果胶RG-1级分由交替的(1-4)-连接的半乳糖醛酸和(1-2)-连接的L-鼠李糖组成，具有从鼠李糖残基发出的大量阿拉伯半乳聚糖分支。其他单糖，如D-岩藻糖、D-木糖、芹菜糖、aceric acid、Kdo、Dha、2-O-甲基-D-岩藻糖和2-O-甲基-D-木糖，可在RG-II果胶级分中找到(<2％)，或作为RG-1级分中的微量组分。这些单糖每一种与D-半乳糖醛酸的比率根据个体植物及其微环境、物种和生长周期中的时间而变化。出于相同的原因，同聚半乳糖醛酸和RG-I级分，在GalA残基上的甲基酯含量方面以及在GalA和中性糖的C-2和C-3位置的乙酰基残基酯的含量方面，可以有很大差异。
如本文所用，术语“兼性厌氧生物”或“兼性厌氧微生物”或“兼性厌氧生物催化剂”定义为，能够在氧存在或不存在的情况下生长的生物，如在本发明中分离的真菌菌株。
如本文所用，术语“干酒糟”，缩写为DDG，是指发酵后剩余的固体，通常由未消耗的原料固体、剩余营养素、蛋白质、纤维和油以及生物催化剂细胞碎片组成。该术语还可包括来自发酵的可溶性残留物质，又称为“干酒糟和可溶物”(DDGS)。
如本文所用，术语“营养素”定义为生物或生物催化剂生长和存活所使用的化学化合物。例如，营养素可以是有机化合物，如碳水化合物和氨基酸，或无机化合物，如金属盐。
如本文所用，术语“复合营养素”定义为营养素源，其主要含有单体有机化合物，被生物或生物催化剂用于产生蛋白质、DNA、脂质和碳水化合物。术语“丰富营养素”通篇可与术语复合营养素互换使用。通常，复合营养素或丰富营养素来自生物物质，如屠宰场废物、乳制品废物或农业残留物。复合营养素或丰富营养素包括但不限于：酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、大豆提取物、玉米浆、大豆蛋白和酪蛋白。
如本文所用，术语“需氧代谢”是指生物化学过程，其中氧用于从碳水化合物产生能量，通常以ATP形式。典型的需氧代谢通过糖酵解和TCA循环发生，其中单个葡萄糖分子在氧气存在下完全代谢成二氧化碳。
如本文所用，短语“厌氧代谢”是指生物化学过程，其中氧不是NADH中包含的电子的最终受体。厌氧代谢可分为厌氧呼吸(其中由氧以外的化合物充当末端电子受体)和发酵(其中来自NADH的电子被用于通过“发酵途径”产生还原产物)。
如本文所用，术语“微生物发酵”是指有机物质被微生物降解并重新组装成产品的过程。所述物质可包括但不限于葡萄糖、蔗糖、甘油、淀粉、麦芽糖糊精、乳糖、脂肪、烃、蛋白质、氨、硝酸盐和磷源。产品可包括但不限于，特色产品(包括但不限于霉菌蛋白产品、豆制品、豆豉等)、传统产品(包括但不限于面包、啤酒、葡萄酒、烈酒、奶酪、乳制品、发酵肉类和蔬菜、蘑菇、酱油和醋)、农产品(包括但不限于赤霉素、杀真菌剂、杀虫剂、青贮饲料、氨基酸如L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸(+)、L-芳基甘氨酸)、酶(包括但不限于碳水化合物、纤维素、脂酶、果胶酶、蛋白酶)、燃料和化学原料(包括但不限于丙酮、丁醇、丁二醇、异丙醇、乙醇、甘油、甲烷、甘油、丁酸、甲烷、柠檬酸、富马酸、乳酸、丙酸、琥珀酸和L-戊二酸、或任何这些酸的盐)、核苷酸、有机酸、药物和相关化合物(包括但不包括限于，生物碱、抗生素、激素、免疫抑制剂、干扰素、类固醇、疫苗、维生素)和聚合物(包括但不限于，藻酸盐、葡聚糖、结冷胶、聚羟基丁酸盐、硬葡聚糖(scleroglucan)和黄原胶)。用于发酵的微生物可包括原核微生物(包括细菌、蓝细菌(cyanobacteria))和真核微生物(包括酵母、真菌和藻类)。
如本文所用，短语“能源作物”是指收获用于制造生物燃料、或直接利用其能量含量的植物，其以低成本生长和维持。商业能源作物通常是密集种植的高产作物物种，其中能源作物可以被燃烧以产生能量。木本作物(如柳树或杨树)以及热带草本(如芒草(Miscanthus)和紫狼尾草(Pennisetum purpureum)(称为象草))被广泛使用。
如本文所用，术语“表面发酵”是指，其中使用的微生物在发酵培养基表面上生长而没有任何进一步支持的那些发酵。培养基通常是自由流动的水性培养基。不受理论束缚，认为丝状生物垫可以由需氧、微需氧和/或厌氧代谢的某种组合产生。例如，认为生物垫的表面依赖于需氧呼吸，而生物垫的底部可以是微需氧至高度厌氧的。
如本文所用，术语“固体基质表面发酵”是指，其中使用的微生物使用浸没在发酵培养基中的固体提供的碳和营养素、在发酵培养基表面上生长的那些发酵。在一些实施方案中，生物垫的某些部分可以是部分浸没的。
如本文所用，术语“深层发酵”是指其中使用的微生物在发酵培养基中以浸没状态生长的那些发酵。许多发酵属于这一类，例如青霉素深层发酵技术。
如本文所用，术语“固态发酵”是指，在为此目的选择的固体支持物上生长微生物的培养物。例如，在用微生物接种后，将固体培养基质如稻或小麦麸放置在扁平发酵床上；然后将基质放在温控室中数天。固态发酵使用具有低水含量(降低的水活度)的培养基质。培养基(例如稻或小麦麸)用水饱和，但很少是自由流动的。固体培养基包含基质和固体支持物，发酵发生在其上。
如本文所用，术语“营养保健品”是指具有健康或药用益处的物质。在一些情况下，营养保健品不仅补充膳食而且还有助于预防和/或治疗疾病和/或病症。术语“营养保健品”是由医学创新基金会(FIM)的创始人兼主席StepenDeFelice,MD在1989年从“营养”和“药物”中创造出来的。
如本文所用，“后代”是指源自菌株的谱系的任何和所有后代，无论其是如何或在哪儿产生。本文中，“后代”的定义包括分离/保藏菌株及其后代的任何和所有突变体，其中这些突变体具有分离/保藏菌株及其后代的至少一种生理和/或形态特征。
用于丝状真菌生物垫生长的人工培养基
人工培养基用于产生丝状真菌生物垫。与在自然界中的相比，人工培养基提供增加的细胞周期时间所需的营养素(即增加的生长速率)并导致增加的细胞密度。人工培养基至少包含以下常量营养素：氮(N)、磷(P)、钙(Ca)、镁(Mg)、碳(C)、钾(K)、硫(S)。微量营养素如铁(Fe)、硼(B)、铬(Cr)、铜(Cu)、硒(Se)、锰(Mn)、钼(Mo)、钒(V)和锌(Zn)也可以添加到培养基中以补充碳源。碳源如木质纤维素原料、甜乳清和/或酸乳清通常提供足够的微量营养素，因此不需要额外的微量营养素。
可以向人工培养基中添加额外的营养素添加物。其实例是碳水化合物(例如，单糖、多糖)、氨基酸供体(例如，氨基酸、多肽)及其组合。此外，还可以将可促进木质纤维素碳源预处理的化合物添加到人工培养基中。这些化合物包括但不限于酸化物质、锰供体、营养素和pH缓冲物质。
人工培养基可以是浸渍液体的固体、液体或凝胶的形式。人工培养基也可以是覆盖固体碳基质如木质纤维素原料或其他固体碳基质的液体形式。在此，固体基质浸没在液体表面下，由此生物垫生长在液体表面上并使用源自浸没固体的碳，该方法称为固体基质表面发酵(SSSF)。从真菌分泌的胞外酶可以降解固体碳基质，释放可溶性碳，该可溶性碳可以在生物垫/水界面上或附近被生物垫吸收。所得到的生物垫在浸没的固体基质上方在液体层上形成垫。通常，位于浸没的碳源上方的液体层应为约0.01-1.0cm深。液体太少会导致没有垫形成以及随后的固态发酵和/或深层发酵。液体太多会导致效率低下的转化和阻抑的生物垫生长周期。
有多种物质可用作人工培养基的碳源。其包括糖(例如，葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、果糖等)、甘油、淀粉、碳水化合物、甘油、乳清、木质纤维素原料、废物流(例如酸乳清)及其组合。合适的木质纤维素原料包括例如柳枝稷、能源作物、森林硬木和其他产品、啤酒麦糟(brewers spent grain)、小麦秸、草、叶、AFEX作物残留物、厌氧消化物、农作物残留物(例如，大麦秆、稻秸、小籽粒秸秆、玉米秸秆、玉米纤维(例如玉米纤维胶(CFG)、干酒糟(DDG)、玉米面筋粉(CGM))、干草苜蓿、甘蔗渣、非农业生物质(例如藻垫、城市树木残留物)、工业残留物(例如软木第一/第二轧机残留物、硬木第一/第二轧机残留物、再生纸、纸浆泥)、含木质纤维素的废物(如新闻纸、废纸、酿造谷物、城市有机废物、庭院废物)、临床有机废物、生物燃料生产期间产生的废物(例如，加工的藻类生物质、来自纤维素乙醇生产的残留物、来自生物柴油生产的固体残留物)、以及其组合。合适的废物流包括农业废物、城市有机废物、来自生物燃料生产的废物(例如，纤维素乙醇生产的残留物)、藻类生物质、啤酒麦糟和/或废物流(例如糖蜜、玉米糖浆等)、工业废物(例如，有机分子，如苯酚和其他芳族化合物)和纤维，如β-葡聚糖、纤维素、几丁质、半纤维素和polydextros、单糖、二糖、寡糖、多糖、以及其任何组合。单糖包括三糖、四糖、戊糖、己糖、庚糖等，以及其任何和所有组合，戊糖包括核酮糖、木酮糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、脱氧核糖及其任何和所有组合，而己糖可以选自下组：阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、葡萄糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖、及其任何和所有组合。二糖包括蔗糖、乳糖、麦芽糖及其任何和所有组合，多糖包括淀粉、糖原、纤维素、几丁质及其任何和所有组合。
用于生长分离的真菌菌株的碳源可包含纤维素，纤维素的量占碳源干重的约5％至约100％、约10％至约95％、约20％至约90％、约30％至约85％、约40％至约80％、约50％至约75％、或约60％至约70％。或者，纤维素碳源可以包含碳源干重的至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、或至少约70％的纤维素量。在其他情况下，用于生长分离的真菌菌株的纤维素碳源包含约1％至约50％、约5％至约40％、或约10％至约30％重量的、选自木质素、半纤维素或其组合的组分。在本发明的一些实施方案中，用于生长微生物的纤维素碳源包含至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、或至少约30％重量的选自木质素、半纤维素或其组合的组分。
合适的氮源包括尿素、硝酸铵(NH4NO3)、硫酸铵(NH4SO4)、硝酸盐(例如KNO3)、氨盐(即NH4SO4)和有机N(例如蛋白质、肽)、高氮工业废物流、玉米浆、及其组合。使用纯尿素氮源制备的人工培养基比使用尿素和硝酸铵的组合制备的人工培养基，提供快约25％的丝状真菌生长(即，分别为70g/m2/天和52g/m2/天)。也可以使用尿素和硝酸铵的组合。当使用硫酸铵作为唯一的氮源时，生长也会发生，但比单独使用尿素或尿素组合产生的生长慢得多。虽然也可以单独使用硝酸铵，但是这种氮源不会产生使用尿素组合时可见的强劲生长。
在人工培养基中操纵碳与氮的比率(C:N)对由真菌菌种和/或菌株产生的生物垫的组成具有显著影响。通常，与脂质相比，低C:N比，如7.5:1或更低的C:N比，更有利于蛋白质和氨基酸的产生。另一方面，与蛋白质相比，大于7.5:1的C:N比更有利于脂质的产生。当人工培养基具有至少10:1、15:1、20:1、26:1、30:1、40:1或50:1的C:N比时，通常特别有利于脂质形成。
基于所需产物和所用的真菌菌种和/或菌株确定人工培养基的pH。Fusisporium属、假镰孢属(Pseudofusarium)、赤霉属(Gibberella)、Sporotrichella属、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、木霉属(Triocoderma)、毛霉目(Mucorales)(例如，根霉属(Rhizopus))的菌种、和命名为MK7的分离的丝状嗜酸性真菌菌株、及其组合，高脂质生产发生在pH范围2.0-7.0，最佳在小于3.5的pH。高蛋白质生产，虽然主要受C:N比的影响，但需要pH至少为2.7，优选pH为4.5-5.5。
包含分离的真菌菌种和/或菌株的培养物和组合物
本发明使用分离的真菌菌种和/或菌株的纯培养物、或两种真菌菌种和/或菌株的纯共培养物、或由三种或更多种真菌菌种和/或菌株的基本上纯的培养物组成。多种分离的丝状真菌菌种和/或菌株均可以使用，如Fusisporium属、假镰孢属(Pseudofusarium)、赤霉属(Gibberella)、Sporotrichella属、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、木霉属(Triocoderma)、毕赤酵母属(Pichia spp)的菌种和/或菌株、毛霉目(Mucorales)(例如，根霉属(Rhizopus))的菌种、及其组合。该生物纯培养物/共培养物/基本上纯的培养物还可包含命名为MK7的分离的丝状嗜酸性真菌菌株(其已以ATCC保藏号PTA-10698保藏)或其活性突变体。也可以使用遗传修饰的丝状真菌的生物纯培养物。纯真菌菌种和/或菌株和/或其后代通常为分生孢子、小分生孢子、大分生孢子、分生孢子器、厚垣孢子、菌丝、菌丝片段和菌丝体或其组合的形式。
丝状嗜酸性MK7真菌菌株是嗜酸性真菌的新菌株，其可以直接将碳源(如木质纤维素碳源、碳水化合物(例如酸乳清)和藻类生物质)转化为包含蛋白质和脂质的丝状真菌生物垫。
使用人工培养基和分离的真菌菌株和/或其后代产生有用产品的方法，其包括：
a)将一种或多种真菌菌种或菌株和/或其后代接种到容器中的具有碳源的人工培养基中，所述碳源选自糖、甘油、木质纤维素原料、含碳农业、工业和城市废物、碳水化合物、酵母提取物、酪蛋白氨基酸、酸乳清、甜乳清和/或其组合，其中人工培养基可支持所述分离的真菌菌株通过表面发酵生长；
b)在所述人工培养基中生长所述分离的真菌菌株以产生丝状真菌生物垫；
c)收获丝状真菌生物垫；和
d)任选地从丝状真菌生物垫中分离、纯化和/或产生产品。
在需氧条件下进行生长。在另一个实施方案中，在微需氧条件下进行生长。或者，在需氧条件、微需氧条件和厌氧条件的任何组合下、如通过表面发酵，进行生长。
有用产品可以是富含蛋白质的生物质、生物垫和/或丝状真菌生物垫。例如，使用所公开的真菌和方法生产的有用产品可以包括但不限于，用于食品、鱼饲料产品、动物饲料产品、生物塑料和/或其前体的蛋白质生物垫。在此，生长可以通过需氧条件、微需氧条件和厌氧条件或其任何组合而发生。
许多嗜酸性真菌菌种和/或菌株可以在没有抗生素、几乎没有或没有污染的情况下培养，如Fusisporium属、假镰孢属(Pseudofusarium)、赤霉属(Gibberella)、Sporotrichella属、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、木霉属(Triocoderma)、毛霉目(Mucorales)(例如，根霉属(Rhizopus))的菌种、和命名为MK7的分离的丝状嗜酸性真菌菌株及其组合，和/或它们的后代。通常，人工培养基中的污染是由其他生物引起的，如细菌、其他不需要的真菌(例如酵母、霉菌)、藻类、植物、昆虫及其混合物。
本发明还公开了至少一种组合物，其包含分离的真菌菌种和/或菌株，所述真菌菌种和/或菌株为Fusisporium属、假镰孢属(Pseudofusarium)、赤霉属(Gibberella)、Sporotrichella属、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、木霉属(Triocoderma)、毛霉目(Mucorales)(例如，根霉属(Rhizopus))物种、能够产生细丝的酵母(即耶氏酵母(Yarrowia))的真菌菌种和/或菌株、或命名为MK7的分离的丝状嗜酸性真菌菌株、或其组合。所述组合物可进一步包含支持真菌菌种和/或菌株生长的人工培养基，以及任选地以下之一种或多种：酸化物质、锰供体、营养素添加物和/或其混合物。
表面发酵
本公开通过用所需丝状真菌菌种和/或菌株的浮游细胞悬浮液接种人工培养基来启动表面发酵。将来自接种物反应器的接种培养物以一定浓度加入人工培养基中，该浓度将在所需的时间内产生成熟的生物垫。理论上，可以用单细胞接种培养基；然而，这种接种需要非常严格的无菌条件和显著延长的时间来产生成熟的生物垫。通常，每升生长培养基接种0.5-1.0g细胞将在3至6天内产生生物垫。例如，以所用培养基的7.5％(体积比体积)加入含有约10g/L细胞的接种物，将在3至6天内产生生物垫。不通过鼓泡或其他方式向人工培养基引入外部氧气，可以从环境或接近环境条件采集足够的氧气。
不受理论的束缚，认为由于在氧气存在下细胞生长更快，因此在存在更多氧气的人工培养基表面上的分生孢子将迅速生长并开始形成菌丝体生物垫。据信，在人工培养基表面下方仅几微米处，氧浓度低得多，这将造成位于这些区域中的真菌细胞被置于应激环境中。已知应激可以增加胞外多糖的分泌，这些多糖具有“粘性”表型，由此通过粘着在该表面增殖的细胞而有助于快速形成丝状真菌生物垫。然而，基质浓度也具有显著影响。例如，当碳基质浓度低于4％时，将不会形成丝状真菌生物垫。应该注意的是，形成垫的初始环境应激不必然导致形成应激垫，即含有由应激的生物分泌的毒素的垫。
通常，使用含有人工培养基的浅盘，在对所用的真菌菌种和/或菌株适宜的温度、湿度和气流的受控条件下进行表面发酵。为了最佳的丝状真菌生物垫生长，保持无菌条件。保持足够的气流以去除由微生物呼吸产生的热量和二氧化碳，并供应氧气而不搅动人工培养基的表面和破坏真菌菌丝的生长。
通常，在接种后第2天，在人工培养基的表面上开始形成“皮肤”。这种“皮肤”是初始丝状真菌生物垫，其常包括气生菌丝以及与人工培养基接触的菌丝，其继续生长并增加细胞密度。通常，在接种后三至六天，所得的丝状真菌生物垫厚度为1至30mm并且具有足够的拉伸强度和结构完整性，可以被无撕裂地操作。
所产生的丝状真菌生物垫具有在自然界中不存在的所述结构。首先，天然形成的丝状真菌生物垫不是由纯培养物/共培养物/基本上纯的培养物组成。通常，天然形成的生物垫除了至少一种丝状真菌菌种之外，还含有各种类型的藻类和/或细菌，并形成人工微生态系统。在自然界形成的真菌生物垫的实例是菌根真菌垫，其以很大程度的分散形式存在于土壤中，并与植物的根、地衣(例如驯鹿苔藓(Reindeer moss)和壳状地衣)和蘑菇(例如奥氏蜜环菌(Armillaria ostoyae))结合。
其次，使用本文所述的方法和技术形成的生物垫比天然存在的那些生物垫具有显著更高的细胞密度，即使考虑到在天然形成的生物垫中存在的多种菌种。所产生的丝状真菌生物垫倾向于非常致密，通常每升50-200克。用于丝状真菌生长的天然和浸没过程通常导致生物质密度为约15克/升。固态发酵过程导致基质与少量百分比真菌的混合物，即小于5％的真菌组合物。从固体百分比的角度来看，本文公开的方法产生的丝状真菌生物垫通常为5-20％的固体。相反，用于丝状真菌生长的天然和浸没过程通常导致小于1.5％的固体百分比范围。由达到的该密度、丝状性质以及这些致密生物垫中的胞外基质可以导致的一个结果是，在干燥时作为粘性垫保持的能力。这与在其他干燥的丝状真菌生物垫中通常出现的粉末状和/或非粘性形式形成鲜明对比。
第三，与天然存在的生物垫相比，使用本文所述的方法和技术形成的生物垫具有高的拉伸强度，允许它们被提升和移动而不会断裂。
第四，本发明的生物垫具有确定的结构，在某些情况下包含由长丝组成的单个致密层，该致密层通常与空气:生物垫界面平行。在一些丝状真菌生物垫中，存在至少两层：(a)致密的底层和(b)气生菌丝层。在一些丝状真菌生物垫中，可见至少三个结构上不同的层：(a)致密的底层，(b)气生菌丝层和(c)过渡区层(参见图10A和B)。对于具有气生菌丝的系统和具有三层的系统，气生菌丝层通常最明显占优势，其次是致密底层，而过渡区层(如果存在)最小。与其他层相比，每个层通常具有与其相关的特征性细胞密度。例如，气生菌丝层显著不如生物垫的底层致密(参见图10A)。如果产生气生菌丝，其取向主要是垂直于生物垫:空气和/或生物垫:培养基界面。对于所有生物垫，致密层由长丝组成，所述长丝倾向于与生物垫:空气和/或生物垫:培养基界面平行排列。此外，所得生物垫的组成至少大部分是真菌生物质，并且在优选的实施方案中，基本上不含残余原料，并且基本上是纯的真菌生物质。
在形成气生菌丝的情况下，如当甘油用作基质时，在气生菌丝层和致密底层之间也存在许多关键的区别因素。在长度方面，气生菌丝倾向于比致密底层中的更长。气生菌丝的密度和分布小于与致密层菌丝体相关的密度和分布。气生菌丝倾向于在近大气的末端处垂直取向。也就是说，气生菌丝倾向于相对垂直于表面培养基生长。另一方面，致密层的菌丝倾向于以主要平行于空气:生物垫和/或生物垫:培养基界面的取向进行生长。气生菌丝的相对低密度与其较长的长度和垂直取向组合，表明氧气获取的最大化。此外，在气生菌丝层中几乎没有或完全没有胞外基质。相反，在致密底层中可以发现大量的细胞外基质。
生物垫的气生层，如果形成，看起来可以加速生物垫的生长。对气生层的破坏负面影响生物垫的加速生长。破坏包括与固体物体接触、与水滴接触、以及由搅动生长生物垫的液体培养基引起的裂缝或裂纹。通常，破坏的生物垫区在去除破坏的原因后不再生长。一般地，通过需氧条件、微需氧条件和厌氧条件或其任何组合，进行生物垫生长。
取决于所使用的菌种/菌株和所需产品，通常在接种后第3天和第12天之间收获生物垫，尽管更迟的收获时间也是可以的。丝状真菌生物垫可以通过许多不同的方法收获，包括：漂洗、物理处理(尺寸减小、压力处理、脱水等)、存活力失活步骤、温度循环、生物质组分的提取和/或分离、以及转化和/或纳入到不同系统中。在一些实施方案中，收获丝状真菌生物垫，用水漂洗，然后在温控烘箱中干燥以使许多酶失活并限制生物垫内的生化转化，或者冷冻。
丝状真菌被认为是对于重组蛋白生产和表达平台非常有用的宿主细胞，导致在生物质和/或丝状真菌生物垫中表达的有用产品。目前使用或建议用于此类方法的丝状真菌的实例包括粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产黄顶孢霉(Acremonium chrysogenum)、地生弯颈霉(Tolypocladium geodes)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。此外，用于产生所公开的生物垫的微生物菌种可以进行遗传修饰以通过操纵基因表达(包括转录)来表达/抑制系统，使得其过表达或不表达在其天然或未改变形式下存在的化合物或化学物质。使用和操作真菌系统以过表达现有的化学物质、表达非天然存在的系统、或抑制通常在天然形式中存在的系统，是本领域已知的，例如曲霉属(Aspergillus spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、根霉属(Rhizopus spp.)、木霉属(Trichoderma spp.)、以及酵母如毕赤酵母属(Pichia spp.)。使用所公开的生物垫和方法生产的有用产品包括但不限于，用于表达药物、营养保健品、工业应用的基础构件化学品、药物、酶和/或其前体的生物质和/或生物质生物垫。
嗜酸性真菌菌种和/或菌株
本发明中使用的嗜酸性真菌菌种和/或菌株是降解木质纤维素、至少具有以下识别特征的丝状真菌菌株和/或其后代：
a)分离的菌株是嗜酸性的，并且可以在约0.68至约8.5的pH范围内生长；和
b)在需氧条件、微需氧条件、厌氧条件或其任何组合下通过表面发酵从人工培养基中产生含有蛋白质和脂质的丝状生物垫。在此，人工培养基的碳源包括碳水化合物、木质纤维素原料、含碳废物(例如酸乳清)、或其组合。
分离的菌种和/或菌株通常进一步包含一种或多种以下额外的识别特征：
c)产生蛋白质、脂质、氨基酸、酶、核酸(核苷酸)、碳水化合物、纤维如β-葡聚糖、聚酮化合物、生物碱、色素和抗生素的能力。实例包括但不限于酯、谷氨酸、天冬氨酸、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂酶、过氧化物酶、锰过氧化物酶、核酸/核苷酸：DNA/RNA、嘌呤、嘧啶、油酸、棕榈油酸、β-葡聚糖、几丁质、β-胡萝卜素、糖苷、酚类、萜类化合物，在各种厌氧、需氧、微需氧条件和/或其任何组合条件下，产生自前文第17页所述的碳源和藻类原料以及产生自生物燃料生产期间产生的废物(例如，加工的藻类生物质、甘油)；
d)包含18S rRNA和与SEQ ID NO：1具有至少98％同一性的ITS区DNA序列。
合适的丝状嗜酸性真菌菌种和/或菌株包括Fusisporium、假镰孢(Pseudofusarium)、赤霉(Gibberella)、Sporotrichella、曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、木霉(Triocoderma)、毛霉目(Mucorales)(例如，根霉属(Rhizopus))物种、命名为MK7的分离的丝状嗜酸性真菌菌株、及其组合、和/或其后代。命名为MK7的菌株已以ATCC保藏号PTA-10698保藏。
嗜酸性真菌菌种和/或菌株和/或其后代可以在至多约7.0、约6.5、约6.0、约5.5、约5.0、约4.5、约4.0、约3.5、约2.0、约1.8、约1.6、约1.4、约1.2、约1.0、约0.9、约0.8、或约0.7或约0.6、或约0.5的低pH下生长。例如，真菌菌株可以在约0.68至约2.0的低pH下生长。
所使用的嗜酸性菌种和/或菌株可以在如上所述的低pH范围内生长的丝状真菌生物垫内大量产生脂质和蛋白质。例如，分离的菌株可以在如上所述的低pH下，以比之前现有技术中报道的(如之前描述的分离的镰孢(Fusarium)菌株(参见Nairn等人,1985,Bhatia等人,2006,和Naqvi等人,1997))更高的速率，将碳源转换为脂质。在pH2.5孵育10天后，所用的嗜酸性菌种和/或菌株可以以至少0.04g脂质/g碳源、0.05g脂质/g碳源、0.06g脂质/g碳源、0.07g脂质/g碳源、0.08g脂质/g碳源、0.1g脂质/g碳源、0.12g脂质/g碳源、0.14g脂质/g碳源、0.16g脂质/g碳源、0.18g脂质/g碳源、0.2g脂质/g碳源、0.25g脂质/g碳源、0.3g脂质/g碳源、0.35g脂质/g碳源、或0.4g脂质/g碳源的速率，将碳源转换为脂质。
与之前由培养的真菌或微藻产生的生物质相比，本发明的培养条件还产生具有更有利的脂质谱的丝状生物质。例如，使用的嗜酸性菌种和/或菌株产生更多饱和脂肪酸(例如棕榈酸(16：0)和硬脂酸(18：0))和单不饱和脂肪酸(例如油酸(18:1))，但更容易氧化的多不饱和脂肪酸较少。
此外，嗜酸性真菌菌种和/或菌株和/或其后代可以在高金属浓度下生长，其中金属选自Mn、Ag、Zn、Fe、Al、Be、Pb、Cu、Cr、Ni、Cd、Co、Ni、Pd、Pt、U、Th、Mo、Sn、Ti、As、Au、Se、Sb和Hg。
嗜酸性真菌菌种和/或菌株和/或其后代能够在培养条件下快速、高密度地生长细胞。在此，微生物能够达到至少约10g/L、至少约15g/L、至少约20g/L、至少约25g/L、至少约30g/L、至少约50g/L、至少约75g/L、至少约100g/L、至少约125g/L、至少约135g/L、至少约140g/L、至少约145g/L、至少约150g/L、至少约160g/L、至少约170g/L、至少约180g/L、至少约190g/L、至少约200g/L、至少约210g/L、至少约220g/L、至少约230g/L、至少约240g/L、至少约250g/L的细胞密度(以干重/L人工培养基计)。
例如，嗜酸性真菌菌种和/或菌株能够达到约10g/L至约300g/L、约15g/L至约300g/L、约20g/L至约300g/L、约25g/L至约300g/L、约30g/L至约300g/L、约50g/L至约300g/L、约75g/L至约300g/L、约100g/L至约300g/L、约125g/L至约300g/L、约150g/L至约300g/L、约170g/L至约300g/L、约130g/L至约290g/L、约135g/L至约280g/L、约140g/L至约270g/L、约145g/L至约260g/L、约150g/L至约250g/L、约170g/L至约250g/L、约100g/L至约280g/L的细胞密度。通过调节发酵条件(例如温度、pH、离子浓度、孵育时间和/或气体浓度)，可以进一步增加嗜酸性真菌菌种和/或菌株的高密度生长。
镰孢属物种(Fusarium species)
关于嗜酸性镰孢属物种(Fusarium species)的信息、鉴定、分离培养的方法描述于Nelson等人(Taxonomy,Biology,and Clinical Aspects of Fusarium Species,1994,Clinical Microbiology Reviews,7(4):479-504),Toussoun and Nelson(1976,Fusarium)、Booth(Fusarium:laboratory guide to the identification of the majorspecies,1977,Commonwealth Mycological Institute,ISBN 0851983839,9780851983837)和Leslie等人(The Fusarium laboratory manual,2006,Wiley-Blackwell,ISBN0813819199,9780813819198)中，其每一篇通过引用整体并入本文。
可以从该生物产生的丝状生物质中纯化由该丝状真菌菌种和/或菌株产生的蛋白质，包括例如某些酶。蛋白质纯化的方法是本领域技术人员已知的。详细的蛋白质纯化方法已经描述在Janson和Ryden(Protein purification:principles,high-resolutionmethods,and applications；Wiley-VCH,1998,ISBN 0471186260,9780471186267)、Detscher(Guide to protein purification,Volume 182of Methods in enzymology,Gulf Professional Publishing,1990,ISBN 0121820831,9780121820831)和Cutler(Protein purification protocols,Volume 244of Methods in molecular biology,Humana Press,2004ISBN 1588290670,9781588290670)中，其通过引用整体并入本文用于所有目的。
蛋白质可以无需从垫中纯化来应用或用作产品。也就是说，可以在没有纯化的情况下加工垫并且其是有用的；即作为蛋白质源、作为食物和/或作为动物饲料。垫可以自身形成产品；生物垫原位产生的产品的混合物是重要且有价值的。
真菌菌种和/或菌株的脂质
如上所述，当在具有高C:N比的人工培养基中培养时，与藻类和其他产生脂质的生物相比，可以产生具有高脂质含量和更有利的脂质谱的丝状真菌生物垫。可以从分离的丝状生物质中提取脂质。在一些情况下，脂质主要是具有脂肪酸酰基的三酰基甘油酯。在一些情况下，脂肪酸基本上是不饱和脂肪酸和/或饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸包括油酸(18:1)、α-亚麻酸(18:3)、二十碳烯酸(20:1)及其组合。饱和脂肪酸包括棕榈酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、花生酸(20:0)、山嵛酸(22:0)及其组合。可以产生的其他类型的脂质包括但不限于甾醇(例如麦角甾醇、D2前体中的维生素)、二酰基甘油酯、类胡萝卜素、饱和脂肪(例如丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、十九烷酸、二十烷酸、二十二烷酸、二十四烷酸)、单不饱和脂肪(例如，十四碳烯酸、十五碳烯酸、十六碳烯酸、十七碳烯酸、十八碳烯酸、二十碳烯酸、二十二碳烯酸、顺式二十四碳烯酸)和多不饱和脂肪(例如，十六碳二烯酸、亚油酸、亚麻酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、brassic acid、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸)。
丝状真菌菌种和/或菌株和/或其后代能够有效地产生脂质。在一些情况下，产生的脂质的量为至少约1g/L/天、5g/L/天、至少约10g/L/天、至少约20g/L/天、至少约30g/L/天、至少约40g/L/天、至少约50g/L/天、至少约60g/L/天、至少约70g/L/day、或更多。例如，产生的生物油的量为约1g/L/天至约5g/L/天、约5g/L/天至约70g/L/天、约10g/L/天至约70g/L/天、约20g/L/天至约70g/L/天、或约30g/L/天至约70g/L/天。这些值远远大于文献中报道的约12g/L/天的最高值(参见Dey,P.等人(2011)Comparative lipid profiling oftwo endophytic fungal isolates–Colletotrichum sp.and Alternaria sp.havingpotential utilities as biodiesel feedstock.Bioresource Technology 102:5815-5823；Gong,Z.等人(2013)Efficient conversion of biomass into lipids by usingthe simultaneous saccharification and enhanced lipid productionprocess.Biotechnology for Biofuels 6:36；Gong,Z.等人(2014)Lipid productionfrom corn stover by the oleaginous yeast Cryptococcus curvatus.Biotechnologyfor Biofuels7:158；Hui,L.等人(2010)Direct microbial conversion of wheat strawinto lipid by a cellulolytic fungus of Aspergillus oryzae A-4in solid-statefermentation.Bioresource Technology 101:7556-7562；Liang,Y.等人(2014)Microbiallipid production from pretreated and hydrolyzed corn fiber.BiotechnolProgress 30:945-951；Liu,C.-Z.等人(2012)Ionic liquids for biofuel production:Opportunities and challenges.Applied Energy92:406-414；Ruan,Z.等人(2013)Co-hydrolysis of lignocellulosic biomassfor microbial lipid accumulation.Biotechnol.Bioeng.110:1039-1049；Sung,M.等人(2014)Biodiesel production from yeastCryptococcus sp.using Jerusalem artichoke.Bioresource Technology 155:77-83；Xie,H.等人(2012)Enzymatic hydrolysates of corn stover pretreated by a N-methylpyrrolidone–ionic liquid solution for microbial lipid production.GreenChem.14:1202-1210)。
可以使用各种步骤从丝状真菌生物垫中提取脂质。脂质提取的非限制性实例描述于King等人(Supercritical Fluid Extraction:Present Status and Prospects,2002,GrasaAsceites,53,8-21),Folch等人(A simple method for the isolation andpurification of total lipids from animal tissues,1957,J Biol.Chem.,226,497-509),Bligh和Dyer(A rapid method of total lipid extraction andpurification.1959,Can.J Biochem.Physiol.,37,911-917),Cabrini等人(Extractionof lipids and lipophilic antioxidants from fish tissues-a comparison amongdifferent methods.1992,Comp.Biochem.Physiol.,101(3),383-386),Hara等人(Lipidextraction of tissues with a low toxicity solvent.1978,Anal.Biochem.90,420-426),Lin等人(Ethyl acetate/ethyl alcohol mixtures as an alternative to Folchreagent for extracting animal lipids.2004,J.Agric.Food Chem.,52,4984-4986),Whiteley等人(Lipid peroxidation in liver tissue specimens stored at subzerotemperatures.1992,Cryo-Letters,13,83-86),Kramer等人(A comparison ofprocedures to determine free fatty acids in rat heart.1978,J.Lipid Res.,19,103-106)和Somashekar等人(Efficacy of extraction methods for lipid and fattyacid composition from fungal cultures,2001,World Journal of Microbiology andBiotechnology,17(3):317-320)。
在另一个实例中，可以通过类似于
Figure GDA0002402560150000311
(Westfalia SeparatorIndustry GmbH，Germany)的方法提取脂质，该方法用于提取由微生物产生的生物油。
Figure GDA0002402560150000312
是一种水基物理油提取方法，由此含油原料可直接用于提取油，无需使用任何常规溶剂提取方法。在该方法中，水溶性有机溶剂可用作加工辅助，通过使用重力或离心力的密度分离，将油从原料肉汤分离。
在提取脂质后，可通过本领域已知的任何合适方法将脂质从非脂质成分中回收或分离。例如，使用低成本的物理和/或机械技术，可以将含脂质的组合物从非脂质组合物分离。如果通过提取脂质的提取方法产生多个相或级分，其中一个或多个相或级分含有脂质，则回收含脂质相或级分的方法可包括物理地从非脂质相或级分中移出含脂质相或级分，或反之亦然。在某些情况下，可以使用
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型方法提取微生物产生的脂质，然后从富含蛋白质的重相物理分离富含脂质的轻相(如在密度分离后，可以撇取位于富含蛋白质重相上方的富脂质相)。
通过丝状真菌菌种和/或菌株生产脂质至少有两个阶段：(a)丝状真菌生物垫积累阶段和(b)脂质生产阶段。丝状真菌生物垫积累阶段产生真菌菌种和/或菌株的丝状生物质，由此在丝状真菌生物垫积累阶段中实现约10％至约95％、约20％至约95％、约30％至约95％、约40％至约95％、或约50％至约95％的真菌菌株总丝状真菌生物垫产生。在其他情况下，在丝状真菌生物垫积累阶段中实现约60％至约95％、约70％至约95％、或约80％至约95％的微生物总丝状真菌生物垫产生。在其他情况下，丝状真菌生物垫积累阶段产生微生物的丝状生物质，由此在丝状真菌生物垫积累阶段中实现至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或100％的微生物总丝状生物质产生。例如，在丝状真菌生物垫积累阶段中实现约50％至约95％的微生物总丝状真菌生物垫产生。
关于脂质生产阶段，脂质在所有生长阶段产生，因为其是细胞生长和增殖所需的；也就是说，脂质在丝状真菌生物垫积累阶段产生。不受理论束缚，据信一些储存脂质在生物垫生长的后期阶段产生，而其他储存脂质可以在生物垫形成较早期产生。此外，在低氮条件下，生物将以更快的速率积累储存脂质。
脂质积累阶段产生脂质，由此在脂质积累阶段中实现约10％至约95％、约20％至约95％、约30％至约95％、约40％至约95％、或约50％至约95％的微生物总脂质产生。在一些情况下，在脂质积累阶段中实现约60％至约95％、约70％至约95％、或约80％至约95％的微生物总脂质产生。在其他情况下，脂质积累阶段产生脂质，使得在脂质积累阶段中实现至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％的微生物总脂质产生。优选地，在脂质积累阶段中实现约50％至约95％的微生物总脂质产生。
一旦根据本发明产生脂质，可以使用本领域已知的各种方法将生物油转换为脂肪酸酯，用作食品或药品的成分。脂肪酸酯的产生可包括对微生物产生的生物油进行转酯。可以一步法同时进行从微生物中提取脂质和脂质的转酯。例如，可以将含有分离的真菌菌株的培养物暴露于促进脂质提取和脂质酯基转移的条件或处理(或条件或处理的组合)。这些条件或处理包括但不限于pH、温度、压力、溶剂的存在、水的存在、催化剂或酶的存在、洗涤剂的存在、和物理/机械力。可以组合两组条件或处理以得到用于脂质提取和转酯的一步方，其中一组条件或处理有利地促进脂质的提取，而另一组条件或处理有利地促进脂质的酯基转移，条件是两组条件或处理可以组合而不导致脂质提取或转酯的效率的显著降低。可以在全细胞丝状生物质上直接进行水解和转酯。
或者，将脂质提取作为与脂质的酯基转移步骤分开的步骤进行。这种转酯反应可以使用酸或碱催化剂进行。将生物脂质转酯成可以用作食品或药品成分的脂肪酸酯的方法包括，使含甘油三酯的生物油在醇和碱的存在下反应，以从甘油三酯产生脂肪酸残基的酯。
适用于转酯的醇包括任何含有1至6个碳原子的低级烷基醇(即，C1-6烷基醇，如甲基、乙基、异丙基、丁基、戊基、己基醇及其异构体)。不受理论束缚，据信使用低级烷基醇产生脂肪酸残基的低级烷基酯。例如，使用乙醇产生乙酯。如果醇是甲醇或乙醇，则产生的脂肪酸酯分别是脂肪酸残基的甲酯和乙酯。通常，醇占脂质组合物、醇和碱的混合物的约5重量％至约70重量％、约5重量％至约60重量％、约5％至约50重量％、约7重量％至约40重量％、约9重量％至约30重量％、或约10重量％至约25重量％。可将组合物和碱加入纯乙醇或纯甲醇中。通常，使用的醇的量可以随着脂质或含有甘油三酯的组合物在醇中的溶解度而变化。
可以使包含甘油三酯、醇和碱的组合物在一定温度下一起反应一段时间，以允许从脂肪酸残基和醇产生酯。产生酯的合适反应时间和温度可由本领域技术人员确定。不受理论的束缚，据信脂肪酸残基从甘油三酯的甘油骨架上切下，并在反应步骤中形成每个脂肪酸残基的酯。可以在温度约20℃至约140℃、约20℃至约120℃、约20℃至约110℃、约20℃至约100℃、或约20℃至约90℃，在醇和碱存在下进行组合物的反应步骤。或者，在温度等于或高于20℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、105℃、或120℃，在醇和碱存在下进行组合物的反应步骤。取决于所需产物，在醇和碱存在下，组合物的反应步骤可以进行约2小时至约36小时、约3小时至约36小时、约4小时至约36小时、约5小时至约36小时、或约6小时至约36小时。或者，在醇和碱存在下，组合物的反应步骤可以进行约0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、10、12、16、20、24、28、32或36小时。
可以通过回流组分进行脂质组合物、醇和碱的反应步骤，以产生脂肪酸酯，如PUFA酯。也可以在不导致反应组分回流的温度下进行脂质组合物的反应步骤。例如，在高于大气压的压力下进行脂质组合物的反应步骤可以提高反应混合物中存在的溶剂的沸点。在这样的条件下，反应可以在如下温度进行，在该温度下溶剂可以在大气压下沸腾，但该温度不导致反应组分的回流。通常，在约5至约20磅/平方英寸(psi)；约7至约15psi；或约9至约12psi的压力下进行反应。一些反应在7、8、9、10、11或12psi的压力下进行。在压力下进行的反应可以在上面列出的反应温度下进行。在压力下进行的反应可以在等于或高于约70℃、75℃、80℃、85℃或90℃的温度下进行。
可以通过蒸馏组合物从反应混合物中分离脂肪酸酯，以回收包含脂肪酸酯的级分。可以将包含感兴趣脂肪酸酯的反应混合物的目标级分从反应混合物分离并回收。蒸馏可以在真空下进行。不受理论束缚，与没有真空的情况相比，在真空下蒸馏允许蒸馏在更低的温度进行，因此可以防止酯的降解。典型的蒸馏温度为约120℃至约170℃,如在低于约180℃、低于约175℃、低于约170℃、低于约165℃、低于约160℃、低于约155℃、低于约150℃、低于约145℃、低于约140℃、低于约135℃、或低于约130℃的温度下进行蒸馏。真空蒸馏的典型压力范围为约0.1mm Hg至约10mm Hg，如真空蒸馏压力等于或大于约0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5或4mm Hg。
从本发明的丝状真菌菌种或菌株和/或其后代中提取的脂质可以用于生产生物润滑剂。如本文所用，术语“生物润滑剂”是指通过使用源自活的或近期活的生物的材料产生的润滑剂。如本文所用，术语“润滑剂”是指引入到两个移动表面之间的物质(通常在操作条件下是流体)，以减少它们之间的摩擦和磨损。用作机油的基础油通常被美国石油协会分类为矿物油(第I、II和III组)或合成油(第IV和V组)。参见美国石油协会(API)出版物编号09。润滑剂的单一最大应用之一是作为机油形式保护机动车辆和动力设备中的内燃机。通常，润滑剂含有90％的基础油(最常见的是石油级分，称为矿物油)和少于10％的添加剂。植物油或合成液体如氢化聚烯烃、酯、聚硅酮、碳氟化合物和许多其他化合物有时用作基础油。这些主要是源自植物和动物的甘油三酯。对于润滑剂基础油，优选使用源自植物的物质。常见的包括高油酸菜籽油、蓖麻油、棕榈油、葵花籽油和油菜籽油、以及动物来源的妥尔油(Tall oil)。许多植物油通常被水解以产生酸，其随后可以选择性地组合以形成专用合成酯。
因此，从本发明的丝状真菌菌种和/或菌株和/或其后代形成的丝状真菌生物垫中提取的脂质，可以通过添加合适的添加剂用于生产酯基生物润滑剂组合物。制备酯基润滑剂组合物的方法是本领域技术人员已知的。作为非限制性实例，可以提供并加工一定量的包含甘油三酯的生物来源的油，以水解至少一些甘油三酯并形成游离脂肪酸，其中脂肪酸是选自以下的类型：饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸、及其组合。脂肪酸可以按类型分开，使得至少单不饱和脂肪酸基本上从饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸分离。接下来，将至少一些单不饱和脂肪酸改性以形成酯产品(例如，包含三酯)，并且将至少一些饱和脂肪酸和/或多不饱和脂肪酸加氢处理以产生烷烃(石蜡)。也注意，在一些实施方案中，此类酯产品可包括以下一种或多种：单-、二-和三酯类，及其羟基化类似物。
来自丝状真菌菌种和/或菌株的酸性pH耐受性酶
尖镰孢番茄专化型(Fusarium oxysporum f.splycopersici)菌株4287的基因组最近已被测序，显示携带参与木质素、半纤维素和纤维素降解的多种基因。此外，参与这些物质降解的酶(如纤维素酶、木聚糖酶、木质素酶、葡萄糖醛酸酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯半乳聚糖酶、阿魏酸酯酶、脂酶、果胶酶、葡甘聚糖酶、淀粉酶、昆布多糖酶、木葡聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、果胶酸裂解酶、几丁质酶、外切-[3-D-氨基葡萄糖苷酶、纤维二糖脱氢酶和乙酰木聚糖酯酶、木糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、内切葡聚糖酶、[3-葡糖苷酶、锰过氧化物酶和漆酶]已在尖镰孢菌株F3中进行了广泛研究(Xiros等人(2009)Enhanced ethanol production from brewer's spent grain by a Fusariumoxysporum consolidated system.Biotechnol Biofuels 10:4)。因此，嗜酸性丝状真菌菌种和/或菌株如镰孢属物种(Fusarium species)和命名为MK7的嗜酸性丝状真菌菌株，预期是被完全配备可以水解复杂碳源的，如木质纤维素材料和废物流(如酸乳清)。还预期，由于与其他丝状菌株(pH>2；Starkey，1973)相比，这些嗜酸性丝状真菌菌种和/或菌株能够在低得多的pH(0.7-7.5)下生长，所以用于木质素、半纤维素和纤维素降解的酶将在低pH下具有更高的活性。在酸性条件下具有高活性的酶，对于在低pH下实施的方法，将是特别有用的。
由镰孢属物种产生的毒素
通常，基于微生物的生产需要使用昂贵且耗时的方法来防止污染。如上所述，丝状嗜酸性真菌菌种和/或菌株对其他生物的污染具有高度抗性。例如，已知镰孢属的成员产生毒素(例如伏马菌素(fumonisin))，其具有有效的抗生素、杀虫和植物毒素的特性。类似地，当用于丝状真菌生物垫的生产时，丝状嗜酸性MK7真菌菌株需要很少或不需要添加外部抗生素。一些镰孢属物种可以产生九种不同的毒素，毒素的产生取决于其与不同宿主植物的关系(Marasas等人,1984,Toxigenic Fusarium species,identity and mycotoxicology,ISBN 0271003480)。毒素的产生也随用于发酵的培养基而变化。镰孢属物种产生和分泌的毒素包括但不限于：比卡菌素(bikaverin)、恩镰孢素(enniatins)、镰孢酸(fusaricacid)、番茄萎蔫素(lycomarasmin)、串珠镰孢素(moniliformin)、oxysporone、单端孢霉烯类(trichothecene)、玉米赤霉烯酮(zearelones)、各种萘醌和蒽醌类化合物(例如，九酮萘茜醌类(nonaketide naphthazarin quinones)、比卡菌素(bikaverin)和诺比卡菌素(norbikaverin)、七酮类(heptaketides)、nectriafurone、5-0-甲基爪哇素(javanicin)和脱水镰孢红素内半缩醛(anhydrofusarubinlactol))。
此外，来自镰孢属物种的毒素可包括4-乙酰氧基藨草镰孢烯二醇(4-Acetoxyscirpenediol,4-3-乙酰氧基-3,15-二羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯,类似化合物，单去乙酰蛇形菌素(anguidin)4-或15-乙酰基藨草镰孢烯三醇(acetylscirpentriol))、3-乙酰基脱氧雪腐镰孢烯醇(nivalenol)(脱氧雪腐镰孢烯醇单乙酸酯、3"-乙酰氧基-7"，l5-二羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮)、8-乙酰基新茄镰孢菌醇(neosolaniol)(新茄镰孢菌醇单乙酸酯，4",8",15-三乙酰氧基-3"-羟基-l2,13-环氧单端孢霉-9-烯)、4-或15-乙酰基藨草镰孢烯三醇(4-乙酰氧基藨草镰孢烯二醇)、乙酰基T-2毒素(3",4",15-三乙酰氧基-8"-(3-甲基丁酰基(氧)-12,13-环氧单端孢霉-9-烯)、蛇形菌素(Anguidin)(二乙酰氧基藨草镰孢烯醇(scirpenol))、燕麦镰孢菌素(Avenacein)、白僵菌素(Beauvericin)、丁烯酸内酯(Butenolide)(4-乙酰氨基-4-羟基-2-丁烯酸-内酯)、Calonectrin(3",15-二乙酰氧基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯)、15-去乙酰基calonectrin(15-去-O-乙酰基calonectrin，3"-乙酰氧基-15-羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯)、脱氧雪腐镰孢烯醇(Deoxynivalenol)(Rd毒素，呕吐毒素，3",T',15-三羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮)、脱氧雪腐镰孢烯醇二乙酸酯(二乙酰基脱氧雪腐镰孢烯醇)、脱氧雪腐镰孢烯醇单乙酸酯(3-乙酰基脱氧雪腐镰孢烯醇)、二乙酰氧基藨草镰孢烯二醇(Diacetoxyscirpendiol，7"-羟基二乙酰氧基藨草镰孢烯醇)、二乙酰氧基藨草镰孢烯醇(Anguidin，4,15-二乙酰氧基-3'-羟基12,13-环氧单端孢霉-9-烯)、二乙酰氧基藨草镰孢烯三醇(7"，8"-二羟基二乙酰氧基藨草镰孢烯醇)、二乙酰基脱氧雪腐镰孢烯醇(脱氧雪腐镰孢烯醇二乙酸酯，3",15-二乙酰氧基-7-羟基12,13-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮)、二乙酰基雪腐镰孢烯醇(雪腐镰孢烯醇二乙酸酯，4,15-二乙酰氧基-3',7'-二羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮)、7",8"-二羟基二乙酰氧基藨草镰孢烯醇(Diacetoxyscirpentriol，4,15-二乙酰氧基-3",7",8"-三羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯)、恩镰孢素(Enniatin)、产果镰孢素(Fructigenin)、伏马菌素B1(1,2,3-丙烷三羧酸l,-1-[1-(12-氨基-4,9,11-三羟基-2-甲基十三烷基)-2-(1-甲基戊基)-1,2-乙二基]酯；macususine)、镰孢烯酮(Fusarenon)(镰孢烯酮-X、镰孢烯酮、单乙酰基雪腐镰孢烯醇、雪腐镰孢烯醇单乙酸酯、4-乙酰氧基-3",7",15-三羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮)、镰孢酸(Fusarinic acid，5-丁基吡啶甲酸)、Fusarinic acid(镰孢酸)、F-2(玉米赤霉烯酮)、HT-2毒素＝15-乙酰氧基-3",4-二羟基-8"-(3-甲基丁酰氧基)-12-环氧单端孢霉-9-烯，7"-羟基-二乙酰氧基藨草镰孢烯醇(Diacetoxyscirpendiol，4,15-二乙酰氧基-3",7"-二羟基-12,13-环氧单端孢霉-9烯)、8"-羟基二乙酰氧基藨草镰孢烯醇(新茄镰孢菌醇)、1,4-Ipomeadiol(1-(3-呋喃基)-1,4-戊二醇)、lpomeanine(1-(3-呋喃基)-1,4-pentanetione)、1-Ipomeanol(1-(3-呋喃基)-1-羟基-4-戊酮)、4-lpomeanol(1-(3-呋喃基)-4-羟基4戊酮)、Lateritin、番茄萎蔫素、串珠镰孢素(1-羟基环丁-1-烯-3,4-二酮的钾盐或钠盐)、单乙酰氧基藨草镰孢烯醇(15-乙酰氧基-3"，4"-二羟基-12,13-环氧单端孢霉-9烯)、单乙酰基雪腐镰孢烯醇(镰孢烯酮-X)、单去乙酰基蛇形菌素(4-乙酰氧基藨草镰孢烯二醇、新茄镰孢菌醇(8"-羟基二乙酰氧基藨草镰孢烯醇、4,15-二乙酰氧基-3"8"-二羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯)、新茄镰孢菌乙酸酯(8-乙酰基新茄镰孢菌醇)、新茄镰孢菌醇单乙酸酯(8-乙酰基新茄镰孢菌醇)、雪腐镰孢烯醇(3",4",7",15"-四羟基-12,13-环氧-单端孢霉-9-烯-8-酮)、雪腐镰孢烯醇二乙酸酯(二乙酰基雪腐镰孢烯醇)、雪腐镰孢烯醇单乙酸酯(镰孢烯酮-X)、NT-1毒素(T-1毒素，4",8"-二乙酰氧基-3",15-二羟基-12,13-环氧-单端孢霉-9-烯)、NT-2毒素(4"-乙酰氧基-3",8",15-三羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯)、Rd毒素(脱氧雪腐镰孢烯醇)、Sambucynin、藨草镰孢烯三醇(3",4",15"-三羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯)、Solaniol(新茄镰孢菌醇)、T-1毒素(NT-1毒素)、T-2毒素(4",15"-二乙酰氧基-3"羟基-8"-(3-甲基丁酰基氧基)-12,13-环氧单端孢霉-9-烯)、三乙酰氧基藨草镰孢烯二醇(4",8",15"-三乙酰氧基-3",7"-二羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯)、三乙酰氧基-藨草镰孢烯醇(3",4",15"-三乙酰氧基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯)、呕吐毒素(Vomitoxin，脱氧雪腐镰孢烯醇)、Yavanicin、玉米赤霉烯醇(Zearalenol，2,4-二羟基-6-(6,10-二羟基-反式-1-十一碳烯基)-苯甲酸-内酯)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，6-(10-羟基-6-氧代-反式-1-十一碳烯基)–二羟基苯甲酸内酯)。由尖镰孢(F.Oxysporum)产生的毒素更详细描述于Tatum等人(Naphthoquinones produced by Fusarium oxysporum isolated from citrus.1985,Phytochemistry 24:457-459),Tatum等人(Naphthofurans produced by Fusariumoxysporum isolated from citrus.1987,Phytochemistry,26:2499-2500),Baker等人(Novel anthraquinones from stationary cultures of Fusarium oxysporum.1998,JFerment Bioeng 85:359-361)。Thrane(Fusarium species on their specific profilesof secondary metabolites,in Fusarium.Mycotoxins,taxonomy and pathogenicity,1989,Chelkowski J编辑,Elsevier,NY,USA,pp 199-225)；Baker等人,Antimicrobialactivity of naphthoquinones from Fusaria,Mycopathologia 111:9-15,1990；Marasas等人(Toxigenic Fusarium species,identity and mycotoxicology,1984,PennsylvaniaState University Press,University Park,PA,USA)，其中每一个通过引用整体并入本文用于所有目的。
通过以下实施例进一步举例说明本发明，这些实施例不应解释为限制性的。本申请全文引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容，以及附图和序列表，通过引用，整体并入本文用于所有目的。
实施例
实施例1：天然环境中的菌株MK7
天然存在的菌株MK7通常与自然界中的藻类、古细菌和细菌相关，其特征在于平均密度小于0.5g干生物质/L泉水(图1)。此外，MK7在自然界中作为“streamers”出现。Purcell等人如下定义“streamers”:“streamers是从连接点伸入流动水中的丝状和其他细胞形态的浸没聚集物”(Purcell等人(2007)FEMS Microbiology Ecology7 60:456-466)。菌株MK7占streamers总生物质的百分比小于10％。此外，自然界中菌株MK7生物质的特征在于大于30％的生物质为大分生孢子细胞，而这在通过本公开的方法产生的表面发酵生物垫中是不存在的。
实施例2：人工培养基的制备
用于以下步骤中的MK7-1液体培养基如下制备：将表1A中列出的成分加入去离子水(18.2Mohm)中，温度在22-30℃之间，然后将pH调节至2.8，用13N HCl调节更低的pH。使用Oakton Instruments 150型pH测定仪和探针(Orangeburg，NY)测量pH。然后将培养基煮沸20分钟并在使用前冷却至室温(～23℃)。临在添加液体培养基之前，使用OaktonInstruments 150pH仪和探针再次检查pH，如果需要，调节回pH 2.8。
使用表1B中列出的成分以相同方式制备MK7-3液体培养基。
在一些实施方案中，使用的碳源可以不是甘油，而是可以选自各种其他碳源，如糖、甘油、木质纤维素材料、木质纤维素材料的水解产物、城市或农业废物、食品加工废物(例如酸乳清)、工业废物流产品、马铃薯废物(马铃薯皮、由于降解产生的马铃薯丢弃物、马铃薯切块、擦伤的马铃)、淀粉废物、甜菜废物、甜菜浆、玉米加工废物(即玉米浆)、来自生物燃料生产的废物(来自纤维素乙醇生产的残留物、厌氧消化物等)。在这些情况下，调整培养基以适应来自所用碳源的营养素的贡献。例如，如果碳源是糖蜜、酸乳清或木质纤维素，则所需的痕量元素可能部分或完全由该碳源提供，可仅需要向培养基中加入常量营养素。在其他实施方案中，碳源可以被分类为“食品级别”。在这些情况下，不能预期与碳源相关的痕量元素和常量营养素，因此必须加入所有痕量元素和常量营养素。
表1A.用于接种物生成的MK7-1培养基中的成分。
MK7-1培养基
Figure GDA0002402560150000401
Figure GDA0002402560150000411
表1B.MK7-3培养基中的成分MK7-3培养基
Figure GDA0002402560150000412
实施例3：接种过程
用于接种托盘的培养物在10L生物反应器中在深层发酵条件下在MK7-1液体培养基中生长。应该注意的是，其他生物反应器大小是合适的，10L反应器大小的选择不应被解释为限制性的。10L反应器由1.3m长、10.16cm直径横截面的透明PVC管构成，底部有PVC端盖。将塑料通气口/配有3mm孔口连接到底部端盖，并将用于供应空气的管连接到通气口。塑料取样口/阀门连接到透明PVC壁侧，距底部端盖底15cm。用无菌纱布覆盖透明PVC反应器的顶部，将反应器放置好，松松地装上具有3mm孔的PVC端盖，以允许气体从反应器中逸出。组装的生物反应器如图2所示。
用于10L生物反应器的接种物由丝状嗜酸性MK7真菌菌株(Lot#003)的存档培养物原液制备。存档原液的培养物由无菌培养皿上生长的丝状嗜酸性MK7真菌菌株菌丝体垫组成，所述无菌培养皿含有由1.5％琼脂(BD Difco颗粒状琼脂，Lot#5287994，ThermoFisher，Waltham，MA)、甘油和如表1中所述用于MK7-1平板培养基的无机营养素组成的固体培养基。通过煮沸20分钟制备琼脂培养基，使培养基冷却至50℃，然后将25mL溶液倒入无菌培养皿中。在冷却和凝固后，通过使用无菌环(在火焰中加热至红热并冷却)从存档原液中收集样品并将其划线在培养皿上，用第二代存档的冷冻原液接种平板(图3A)。
生长5天后，菌丝体垫完全生长覆盖琼脂培养基的表面(图3B)。然后将培养物冷冻在-80℃。在接种10L反应器前5天，从冰箱中取出Petri板贮存物并使其2小时平衡至室温(～23℃)。然后用无菌镊子(用火焰加热镊子至红热并用异丙醇冷却)移取在琼脂表面上生长的菌丝体垫并置于1L无菌的玻璃带挡板摇瓶中的350mL无菌MK7-1液体培养基中，摇瓶覆盖无菌纱布。在用作10L生物反应器的接种物之前，将摇瓶在VWR OS-500实验室振荡器(VWR，Radnor，PA)上以200rpm旋转培养5天。
为准备接受接种物，10L生物反应器通过如下方式灭菌：将330mL次氯酸钠浓溶液(
Figure GDA0002402560150000421
漂白剂＝8.25％次氯酸钠)加入到生物反应器中的11L饮用质量的自来水中、并让其平衡两天。两天后，将另外330mL次氯酸钠浓溶液加入到反应器中。一天后，将稀释的次氯酸钠溶液完全从反应器中排出，并通过加入2L热水并旋流漂洗生物反应器内的所有表面，用～80℃的沸水漂洗反应器。然后排出漂洗水。将3.5L无菌MK7-1液体培养基加入到生物反应器中，并通过位于反应器底部的通气口以每分钟400mL的速率用(0.2μm过滤的)无菌空气进行鼓泡。这些鼓泡条件产生的气泡直径大小范围为3至30mm，并且在生长期间导致真菌细胞在整个液体培养基中的混合和均匀分布(浮游细胞)。实验表明，较高的鼓泡速率或较小的气泡大小导致生物膜生长习性，形成粘附于生物反应器表面的生物质团块。因此，生物膜生长习性是不期望的，对于托盘反应器的接种而言期望均匀的细胞悬浮液。然后使用无菌技术(在打开生物反应器顶部之前用70％异丙醇/30％水喷洒所有附近的外表面并且不接触生物反应器的任何内表面)，将在1L摇瓶中生长的接种物加入到10L反应器中。为了在10L反应器中建立额外的培养物体积，在培养物达到6g/L干丝状生物质密度后，将无菌新鲜MK7-1液体培养基加入到反应器中。如果将新鲜的MK7-1液体培养基加入反应器中，体积应不超过反应器中液体培养物体积的9倍。在通气系统运行时通过生物反应器上的侧口收集样品、并使用真空过滤装置(Millipore，Cat#WP6111560，XX1004700，XX1004705，Darmstat，Germany)通过0.22μm过滤器(Millipore，Cat#GSWP04700，Darmstat，Germany)过滤已知体积，来测量干丝状生物质。将预先称重的过滤器加上湿的丝状生物质在BenchmarkScientific Incu-Shaker Mini(Edison，NJ)中在50℃干燥4小时，然后在Mettler Toledoscale model MS3035(Columbus，OH)上称重。
丝状嗜酸性MK7真菌菌株在10L反应器中具有约0.024h-1的比生长速率(图4)，并且在指数生长期的生长遵循以下等式：
(Eqn 1) x＝xoexpμt
其中x是最终生物质，xo是初始生物质，μ是比生长速率，t是时间。为了用作托盘反应器中的接种物，10L反应器中的培养物细胞密度应高于6g/L干重并处于指数生长后期(图4；指数生长期是细胞数连续倍增时的培养物生长期；指数生长后期是恰在指数生长停止之前在细胞生长速率开始下降时的时期)。如果使用具有较低细胞密度的培养基用于接种，将导致生物垫形成显著较慢(延迟期长于2天)，因此是不希望的。
本文将接种物定义为基本上由浮游细胞组成，浮游细胞定义为不形成团块或聚集在一起的单细胞，约4微米的宽度至5-20微米的长度。
为了接种用于表面发酵或固体基质表面发酵的表面托盘反应器，在鼓泡连续混合的同时，通过靠近反应器底部的孔口，从10L反应器中移取液体培养物。通过用70％异丙醇/30％去离子水混合物喷洒孔口内侧、然后打开阀门以允许排出约25mL培养物，以无菌方式移取用于接种物的培养物，并因此漂洗阀门。处理掉该用过的接种培养物。如实施例3所述，将接种培养物直接加入到托盘反应器培养基中。
实施例4：通过表面发酵在托盘反应器中生长菌株MK7
使丝状嗜酸性MK7真菌菌株在浅托盘反应器中生长。应该注意的是，不同托盘大小均适合于本发明的教导。在本实施例中，聚乙烯托盘的内部尺寸为41.27cm宽x 61.28cm长,和2.54cm高的侧壁(可用于垫生长的总表面积＝0.253m2；图5；Winco,Idaho Falls,ID)。期望托盘无碎片和化学品，以及在使用之前进行灭菌以最小化潜在的污染。因此，在使用之前，将托盘用肥皂和温热饮用质量自来水(50-70℃)彻底洗涤，用该温热的自来水彻底漂洗1分钟，并验证去除所有肥皂的残留物。然后用70％异丙醇/30％去离子水(18.2Mohm)的溶液喷洒托盘的所有表面，直到所有表面都润湿，并用浸有酒精混合物的纸巾用戴手套的手擦拭托盘。然后将托盘放置在托架系统内，使得所述托盘可接受并容纳液体培养基(如下所述)而不溢出，并使其干燥。
用于本文描述的表面发酵过程的托盘和托架系统提供了形成生物垫并使生物垫快速生长的所有必要组件。用于容纳反应器托盘的托架系统是包被铬合金的钢材质的39托盘架，购自Global Equipment Company(Chicago，IL；图5A，B)。使用16英寸宽的透明塑料
Figure GDA0002402560150000441
样包裹膜(Costco，Bozeman，MT)包裹和封闭托架系统，并将托盘与周围房间隔离。这样可以控制环境条件(湿度，气流)和最小化污染(图5A，B)。借助于鼓泡通过200mL去离子水(18.2Mohm)(水温22-30℃)(以加湿空气)并通过高压灭菌的0.2um过滤器(Millipore,Cat#SLFG85000,Darmstat,Germany)(以去除微生物)，将加湿的无菌空气以800mL/分钟的速率吹入密封的架中。理想情况下，气流速率使得其在托架系统中产生轻微的正压力(>0.1psi)，从而最小化进入封闭托盘和托架系统的空气污染物的量，直到生物垫达到期望的密度和/或稠度。
当微生物垫是活的，细胞呼吸；也就是说，产生二氧化碳和热量，以及消耗氧气。积累的二氧化碳会降低氧气的利用度，应该受到限制。因此，气流应该能够冲走在微生物呼吸期间产生和积累的二氧化碳。此外，气流应该能够移除微生物呼吸期间产生的多余热量，并为呼吸的细胞提供足够的氧气。应调整气流以满足这些需求。例如，当使用更多数量的托盘时，随着需要增加，应增加气流以满足增加的温度和空气需求。气流不应强到扰乱真菌菌丝和抑制其生长和功能的强度。理想地，在托盘系统中，气流将导致空气流经托盘。在一个实施方案中，可以通过风扇使空气通过0.2um的过滤器并流经垫，来产生气流。可通过基于置于架中的温度、二氧化碳和氧气传感器的智能传感器/致动系统，来控制风扇速度和产生的气流。
在生长期间托盘系统的温度范围为25℃±2℃。使用ThermoScientificGenesys10S Series，Biomat 3S，Evolution 60S软件和传感器系统(Thermo Fisher.Waltham,MA)测量温度。热电偶传感器放置在托盘架系统内20mm，置于托盘架系统的中间高度和顶部。
如实施例2中所述制备MK7-1培养基[添加营养素、调节pH、煮沸并冷却至室温(～23℃)]。制备培养基后，自接种物反应器获得接种物培养物(参见实施例3)，并以MK7-1培养基的7.5％(体积比体积)的比率加入罐中。例如，将113mL接种物加入到罐中的1.5L培养基中。此接种物与培养基比率可以为细胞的快速生长和垫形成提供充分的条件。在该实施方案中，接种新鲜培养基后，期望的干细胞丝状生物质为0.45至0.75g/L。然而，可以使用0.01至100g/L的密度来成功地在本托盘系统中产生生物垫。如实施例3中所述，降低接种物与培养基的比率导致生长较慢。
碳基质体积与培养基体积的比，影响所得的生物质生产速率。一般而言，当上述比率太小时，由于缺乏可用碳，生长速率减慢；也就是说，其变得碳限制性的。当上述比率太大时，所得的渗透压变得太大并且生物质生长速率降低。此外，当碳受限时，所得的生物质密度和生物质粘性小，从而降低表面发酵过程提供的加工和处理优势。例如，当上述比率在8-15％之间时，命名为MK7的丝状真菌菌株具有最佳生长条件。
用灭菌的大塑料勺(30cm长，用酒精混合物漂洗灭菌)混合培养基/细胞悬浮液，并使用灭菌的(用醇混合物漂洗)刻度量筒将1.5L所得混合物加入每个托盘中。将所有托盘装入托架系统后，用透明塑料包裹托架系统。
孵育6天后，所得到的生物垫厚3至10mm，具有足够的拉伸强度和结构完整性，使得可以处理该生物垫而不造成撕裂(图6)。通过首先移除架系统周围的透明塑料包裹膜并从架上移出托盘，来收获生物垫。用手移取托盘中的生物垫，置于12.7×23cm的Pyrex玻璃托盘中，用饮用质量的自来水轻轻漂洗2分钟。将漂洗的生物垫留在玻璃托盘上并干燥或置于3.7L塑料袋中并冷冻。为了干燥，将生物垫置于温控烘箱中并在60℃±1℃下加热45分钟以使许多酶失活并限制垫内的生化转化，然后在50℃±1℃下加热直至干重不变(约48-72小时)。对于丝状嗜酸性MK7真菌菌株，在给定上述条件下产生的生物垫的平均干重为每个托盘81g干燥丝状生物质。这相当于54g/L、324g/m2表面积和0.37g/L/小时的生产率。未干燥的生物垫的平均水分含量为0.17干丝状生物质/g或83％液体。
托盘中的细胞生长典型地根据图7中所示的生长曲线发生。细胞在浮游状态(整个培养基中均质/均匀分布的细胞)下生长，直至生长约48小时。48小时后，细胞在培养基表面聚集并开始形成生物膜，即，其中细胞交织并粘在一起的微生物垫。该垫起初是非常薄的皮，但是可以继续快速生长，直至一些限制因素，如缺乏碳基质或其他营养素，限制生长。
由于生物垫对干扰的敏感性以及随后的生长下降，重要的是在整个生长期期间托盘保持不受干扰并且保持生物垫的完整性。影响生物垫的干扰包括托盘的过度振荡、向垫施加压力、向生物垫表面施加液体、经过生物垫的快速气流、对菌丝的干扰、破坏或压缩、或垫本身的物理破坏。这些类型的干扰导致生长生物垫的优势丧失，这些优势包括快速生长速率和高丝状生物质积累/液体体积和表面积。
推定气生菌丝和菌丝体在为整个生物垫中的细胞呼吸提供氧气方面起重要作用。因此，气生菌丝/菌丝体的形成、生长和功能对于生物垫的快速生长是重要的。因此，任何影响这些菌丝/菌丝体形成或生长的干扰都会导致生物垫生长的下降。
上述表面发酵方法和培养基提供了形成生物垫并实现快速生长所需的所有必要组分。使用上述概念测试了多种托盘系统，获得了几乎相等的每单位面积的生产率。例如，使用7.5％甘油和10:1的C:N比，随着生物反应器的表面积从0.02增加到1m2，在生长阶段中生产率保持恒定在约44g/m2/d。
实施例5：托盘大小对丝状真菌生物垫生长和生产率的作用
为了测试托盘大小对生物垫生长和生产率的影响，菌株MK7丝状真菌生物垫在0.02m2
Figure GDA0002402560150000471
玻璃托盘、0.25m2聚丙烯托盘和1.77m2塑料衬里托盘中，在含有7.5％甘油的MK7-1培养基上生长。对于所有处理，液体培养基体积与表面积的比为6L/m2。生长速率仅极小地受到托盘大小的影响，并且在6天后观察到线性生长速率(图8)。对于0.02、0.25和1.77m2托盘，干生物质生产率分别为1.32、1.54和1.57/m2/h。
实施例6：菌株MK7在不同培养基上的生长
丝状嗜酸性MK7真菌菌株的生长特征(即生长速率、细胞密度、基质转化效率、垫形成)，根据生长培养基的选择以及培养物是否在SSF/深层发酵或SSSF/表面发酵条件下生长而急剧变化。丝状嗜酸性MK7真菌菌株在历史(2009年5月至2012年11月)培养基MK7A上培养，该培养基最初设计用于模拟黄石国家公园中生物自然环境的化学条件，但是具有增加的氮、磷、钙和镁浓度以匹配发现对其他丝状真菌有益的营养源(表2；MK7A)。开发MK7-1培养基以增强和改善丝状嗜酸性MK7真菌菌株生长特征，特别是在通过表面发酵形成垫的方面(表2)。具体地，增加磷酸、钙和镁和氮，并加入额外的氮源(尿素)。增加钙、镁和加入尿素尤其增加了生长速率并增强垫形成。
表2.与设计用于通过表面发酵形成高密度丝状生物质的改良MK7-1相比，历史培养基MK7A(深层发酵)的化学组分。
Figure GDA0002402560150000481
使用MK7A培养基的初始实验仅在摇瓶中在深层发酵条件下进行。在这些条件下产生的最大生长速率、转化效率(转化为丝状生物质的碳基质g)和最高丝状生物质分别为0.072g/L/h；22％和8.6g/L(表3)。
表3.在各种条件下丝状嗜酸性MK7真菌菌株的生长特征
Figure GDA0002402560150000482
为了增加细胞密度，将MK7A培养基与表面发酵条件结合使用。在碳浓度4-15％(葡萄糖或蔗糖)和4-30％(甘油)中，形成生物垫。发现尿素增加表面发酵条件下的生产速率，并且NH4NO3、NH4PO4、NH4SO4可以是NH4的替代源。与其他NH4源相比，添加尿素具有较便宜的市场价格的优势。发现12.5％的碳基质，对于增加丝状生物质密度至达到180g/L(从托盘中移出生物质后的密度)和优化生长速率，是理想的。
与深层发酵条件相比，使用表面发酵和MK7-1培养基产生的高密度生物垫(使用任一种培养基)具有许多优点，包括：(1)与深层发酵的最大值24.1g/L相比，增加丝状生物质密度至多达180g/L(生物垫从托盘取出后的密度)(表3)，(2)与浸没条件下的最大速率0.28g/L/hr相比，增加生长速率至多达0.46g/L/h，(3)使碳原料密度从7.5％增加至12.5％用于最大生长速率，(4)丝状生物质的收获条件容易得多，特别是当产生高密度丝状生物质时(例如不需要离心)，(5)与用于深层发酵的大型复杂通气生物反应器相比，不需要向丝状生物质通气，(6)与非常大的商业浸没发酵罐相比，使用表面托盘系统的可规模放大性和可扩大性都大得多，(7)更少的液体废物。
将C:N比降低至<10:1也对丝状生物质产生非常有益并且增加蛋白质相对于脂质的水平。历史上，MK7A培养基被设计用于通过丝状嗜酸性MK7真菌菌株生产脂质，特别是在C:N比高于30:1时。改变C:N比以及培养条件允许定制丝状嗜酸性MK7真菌菌株生物质中的脂质浓度，在生物质重量的5至60％之间。在MK7A和具有各种简单碳基质(例如甘油、葡萄糖、蔗糖)的MK7-1培养基之间，丝状生物质的脂肪酸谱非常相似，但发现温度增加多不饱和脂肪酸的浓度，其中ω-3亚麻酸在较低的相对温度下随时间而增加(图9)。
实施例7.菌株MK7在MK7A和MK7-1培养基上的生长
使用具有蔗糖或甘油作为碳源(原料)的MK7-1培养基和MK7A，在表面发酵条件下生产菌株MK7丝状真菌生物垫。为了评估由MK7A和MK7-1培养基产生的丝状真菌生物垫，制备了五种不同的培养基制剂：1)MK7A培养基中4％蔗糖，2)MK7-1培养基中4％蔗糖，3)MK7A培养基中4％甘油，4)MK7-1培养基中10％甘油，和5)MK7-1培养基中12.5％甘油。使用适当添加的浓HCl将所有五种培养基制剂的pH调节至2.7，然后煮沸10分钟。冷却至室温(～23℃)后，向每种培养基中加入7.5％体积/体积的指数生长期的菌株MK7接种物。将pH重新调节至2.7，并将250mL接种的培养基等分试样加入到消毒的0.023m2
Figure GDA0002402560150000501
玻璃托盘。然后将托盘置于托盘架系统中，使培养基与接种物的混合物在23℃±1℃下孵育。
基于先前实验的结果，预期将在所有培养基组合上形成生物质。还预期相对于MK7-1培养基，在MK7A培养基上将更快地形成生物质。这是由于MK7A培养基的化学条件对生长更友好(例如，较低的离子强度/渗透压、较低的铵浓度)。然而，最后，在MK7-1培养基表面上形成的丝状真菌生物垫将比在MK7A培养基上生长的生物质以更快的生长速率生长。也就是说，两种系统具有不同的生长速率曲线，其中MK7-1培养基在早期阶段表现出快速生长，随后在后期阶段表现出降低的生长速率。相反，在MK7-1培养基上生长的丝状真菌生物垫在早期生长阶段中具有初始相对缓慢的生长速率，随后在生物质生长的后期阶段中具有极快的生长速率。最终，与在MK7A培养基上生长的生物垫相比，在MK7-1培养基上生长的丝状真菌生物垫变得更厚并且具有更大的拉伸强度。预期MK7A培养基中显著较低的营养素浓度(例如N、P、K)将导致早期营养素限制，导致生长抑制，生物垫不像MK7-1培养基上产生的生物垫那样厚或强。
实施例8：菌株MK7产生的生物垫的结构
通过透射光显微镜确定生物垫的结构。在此，从生长在含有7.5％甘油的MK7-1培养基上5天的菌株MK7，产生生物垫。收获生物垫、冷冻(-20℃)、并切成1cm×1cm方块、然后在冷冻模具(cryomold)(VWR 25608-916,Radnor,PA)中包埋在10％明胶(Sigma G2500-3000 Bloom gelatin,Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO)中。通过将冷冻模具暴露于液氮浴的汽相中快速冷冻明胶/组织样品，然后在-20℃下放置过夜。
使用Leica型号39475214冷冻切片机(Leica,Wetzlar,Germany)完成冷冻切片。从冷冻模具中取出样品并用OTC组织冷冻介质(Leica 14020108926)包被，然后冷冻切片成10-50μm厚的切片。使用透射光显微镜(显微镜：Zeiss AxioObserver；Camera:ZeissAxioCamHRc,Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)使样品切片可视化并成像。
使用甘油垫，观察到至少两个不同的层：(a)致密底层和(b)气生菌丝层。在一些样品中，可见至少三个结构上不同的层：(a)致密底层，(b)气生菌丝层和(c)过渡区层(参见图10A和B)。典型地，气生菌丝层最明显占优势，其次是致密底层，而过渡区层(如果存在和/或可见时)最小。在一些情况下，例如图10A中所示的生物垫，(a)致密底层与(b)气生菌丝层与(c)过渡区层的可见比率为约3.86比约9.43比约1。在另一个样品中，如图18B中所示的生物垫，该比率为约1.7比约3.7比约1。在图18C中没有明显的可见不同的过渡区层。
MK7-3生长的生物垫的额外光学成像表明，与致密底层相比，顶部气生菌丝层中不存在脂质或色素(图11A和11B)。发现气生菌丝从垫向外延伸，每个菌丝暴露在空气中，在菌丝之间没有液体。这将它们与垫的其他层中的菌丝/菌丝体区分开来，其他层中的菌丝/菌丝体通过液体和/或胞外多糖/蛋白基质分开。气生菌丝负责氧气传递和CO2传递。氧气可及性导致顶部气生菌丝层中的氧气吸收菌丝。这些气生菌丝看起来比在较低垫层中发现的菌丝/菌丝体更长(比较图11B和图11C)。顶层的气生菌丝也倾向于具有垂直取向的优势，即它们的取向倾向垂直于丝状真菌生物垫空气界面。
垂直取向在致密底层的菌丝中不占优势(图11C)。这里，菌丝倾向于交织在一起并且具有混合的取向，其中水平取向占优势。底层的菌丝看上去也含有紫色色素，这在顶部空气层中不明显。初步实验表明，底层含有约30％的脂质，并且菌丝嵌入蛋白质和/或多糖基质中。底层菌丝也是色素、脂质、碳水化合物和蛋白质的主要储存区域。
在5天后收获在(1)MK7-1培养基和(2)MK7-3培养基上生长的、由菌株MK7产生的生物垫，并在20℃冷冻。二个生物垫的厚度都为2至4mm。从两个冷冻的生物垫上切下1cm2的方形截面，一式三份，然后在纵向上切成两半，产生顶部一半和底部一半的横切块，每个切块约1.5mm厚。
MK7-1培养基中生长的生物垫的顶部纵切块的平均密度为0.131g/cm3(标准差＝0.068)，底部纵切块的平均密度为0.311g/cm3(标准差＝0.032)。顶部密度与底部密度的比率为0.42。
对于MK7-3培养基中生长的生物垫，顶部纵切块的平均密度为0.102g/cm3(标准差＝0.048)，而底部纵切块的平均密度为0.256g/cm3(标准差＝0.010)。顶部密度与底部密度的比率为0.40。
实施例9：菌株MK7产生的生物垫的拉伸强度
评估在MK7-3培养基上生长5天的MK7生物垫的拉伸强度。这里使用25.4cm宽、46cm长、3.5mm厚的垫。垫的水含量约为85％，相当于约15％干重。总干重为70g/0.25m2托盘或280g/m2。垫的密度为0.08g/cm3。
为了测量拉伸强度，将垫的一端夹紧到固定位置，同时将另一端夹在自由移动的装置上。自由移动装置本身连接到测量施加张力的刻度器上。通过在几秒内牵拉刻度器，向垫施加稳定和缓慢的张力，直到垫断裂。经测量，断裂/撕开/撕裂垫所需的张力范围为0.28kg/2.54cm垫宽至0.58kg/2.54cm垫宽，相当于0.11kg/cm垫宽至0.23kg/cm垫宽。平均为0.5kg/2.54cm垫宽，或为0.2kg/cm垫宽。
实施例10：菌株MK7生物垫在粗甘油上的生长。
使用粗甘油作为碳和营养素源(原料)，在8天内产生致密菌株MK7生物垫。粗甘油是生物柴油生产的副产物，其获自W-2燃料(产品代码GL32000，批号4300，CAS号56-81-5，Adrian，MI)。粗甘油由75-85％甘油、2-10％水、2-5％盐、1-2％脂肪、油或酯、和<1％甲醇的组成。
向饮用质量的自来水中的7.5％浓度(重量:体积)粗甘油，补充全强度或1/2强度的MK7-1培养基盐，以产生11L全强度和1/2强度的MK7-1培养基。将这些溶液的pH调节至4.8，然后煮沸10分钟。冷却至室温(～23℃)后，将如实施例3中所述制备的5％体积:体积菌株MK7接种物加入培养基中。将pH重新调节至4.8，并将1.5L接种的粗甘油培养基等分试样加入到消毒的聚丙烯0.25m2托盘中，然后将托盘放入托架系统中。
将混合物在23±1℃孵育，在8天后得到约4mm厚的柔韧、相对致密的生物垫，此时收获它们。将生物垫在50℃干燥72小时；平均干重±标准差，对于全强度培养基处理为30.3±3.1g(n＝6)，对于1/2强度培养基处理为30.2±2.8g(n＝8)。对于两种处理，甘油向干生物垫的平均转化率为34％，并且湿垫密度基于干生物质重量为0.03g/cm2。
实施例11：在小麦酒糟可溶物上生长的菌株MK7生物垫的菌丝/菌丝体结构
使用干燥的小麦酒糟可溶物(distillers soluble,ds)作为碳和营养素源(原料)，在7天内生产固结的菌株MK7丝状真菌生物垫。小麦ds由31.5％蛋白质、8.6％油、2.8％淀粉、13.5％糖、2.7％纤维、8.5％灰分、0.19％钙、0.29％镁、1.7％钾、0.78％磷和3.5％硫酸盐组成。准备两种生长培养基处理：处理1使用水中的5％ds干重，处理2使用在1/2强度MK7-1盐培养基中的5％ds干重。将混合物的pH调节至3.4。用7.5％(体积:体积)如实施例3所述制备的菌株MK7接种物接种混合物，并将175ml该培养基加入到酒精灭菌的12.7×12.7cm塑料托盘中。在室温(～23℃)孵育7天后收获丝状真菌生物垫。在5％ds作为唯一碳和营养素源上(处理1，不含MK7-1盐)生长的生物垫的平均厚度为2.7mm(n＝3个托盘)，没有明显的分层，平均干重为0.83g，平均密度为0.019g/cm3，转化效率约为10％。没有观察到气生菌丝，并且垫被液体整个饱和；即，垫的顶部表面在液体的表面。
在补充有MK7-1盐的5％ds上(处理2)生长的生物垫，平均厚度为6.4mm，平均干重为3.11g，平均密度为0.030g/cm3，转化效率约为40％。这些垫形成大面积的蓬松白色气生菌丝系统，厚度约为4-7mm，紧邻位于约0.9mm厚的明显更致密层之上。上层的密度为0.011g/cm3，下层的密度为0.148g/cm3。
实施例12：在作为碳和营养素源的玉米浆和玉米浆/淀粉上菌株MK7丝状真菌生物垫的生长
使用玉米浆作为唯一碳和营养素源(原料)，在短短4天内产生致密菌株MK7丝状真菌生物垫。此外，还显示具有5％淀粉添加物的玉米浆能够产生致密丝状真菌生物垫。玉米浆是玉米湿磨的粘性副产物，具有氨基酸、维生素和矿物质的组成，这使其适合作为微生物发酵的补充剂。在本实施例中使用的玉米浆购自Santa Cruz Biotechnology,Inc.(Dallas,TX；Lot#B0116)。这些实验证明了使用玉米浆可以作为MK7-1营养素的替代。处理包括10％和20％玉米浆作为唯一碳和营养素源，10％和20％玉米浆(各自分别)加5％淀粉，其中淀粉为丝状真菌生物垫生长提供额外的碳。
通过将10％或20％玉米浆加入含有0或50g干淀粉的1L体积中来制备四批培养基。通过加入适量的HCl将培养基调节至pH3.6，并在合适的容器中煮沸15分钟。冷却至室温后，将混合物的pH重新调节至3.6，并用实施例3中制备的7.5％菌株MK7接种物接种混合物。将175ml培养基的等分试样加入5个方形托盘(0.016m2表面积/托盘)中，并且将托盘在托架系统中在23±1℃孵育。6天后收获丝状真菌生物垫。对于在10％、20％、10％+淀粉和20％+淀粉的玉米浆处理，平均最终pH分别为3.97、3.69、4.23和4.15。这些处理的平均生物质重量±标准差分别为1.1±0.2、0.1±0.1、2.3±0.1和2.1±0.2g。
实施例13：将牛饲养场贮留池水(cattle feedlot lagoon water)转化为丝状真菌生物垫
使用牛饲养场贮留池水作为唯一碳和营养素源进行生长实验。水的初始溶解有机碳含量为4g/L，初始总溶解氮含量为0.8g/L。
用浓盐酸将饲养场贮留池水调节至pH 2.6，并用如实施例3中制备的7％菌株MK7接种物接种。灭菌的0.25m2聚丙烯托盘中加入1.5L接种的废水，并放入托盘架系统中在24±1℃孵育。接种后2天，在液体表面开始形成丝状真菌生物垫。十天后，将丝状真菌生物垫和剩余液体收集在单个容器中并干燥，然后使用Costech总C和N分析仪(ECS 4010，CostechAnalytical Technologies，Valencia，CA)分析总C和N。每个托盘产生的平均干生物质为6.531g(n＝2)。对垫和残余液体的分析表明，垫从饲养场贮留池废水中去除约77％的碳和99-100％的氮(方法检测限为～1％)。跨10天时间进行平均时，该系统的碳和氮去除率分别为6.8和1.2mg/L/h。根据目前的理解，通过用HCl将贮留池水酸化至pH2.6并用菌株MK7接种，可以从饲养场水中除去大部分C和几乎所有的N。还可以直接处理贮留池，在现场的饲养场水上产生漂浮的丝状真菌生物垫，然后可将其收获用于后续使用。
实施例14：在酸乳清替代物培养基上菌株MK7生物垫的生长
由酸乳清替代物培养基(AWS)在7天内产生致密菌株MK7生物垫。AWS培养基的组成基于Tsakali等人(2010)描述的酸乳清的典型组成。表4中描述了本实施例中使用的Tsakali培养基和AWS培养基的组成。
使用87mL pH 4.8AWS培养基在灭菌的12.7×12.7cm(0.016m2)聚丙烯托盘中生产生物垫。通过将表4中列出的成分混合在1L Erlenmeyer烧瓶中制备培养基，将pH调节至4.8，然后煮沸10分钟。在培养基冷却至约23℃后，将7.5％体积(体积/体积)的指数生长期的接种物加入烧瓶中。该接种物如实施例3中所述产生。将87mL接种的培养基等分试样加入异丙基擦拭过的托盘中(实施例3)，并将托盘置于安装在如实施例3所述的托盘架系统中的较大(0.25m2)托盘上。使培养物在25±1℃孵育，得到相对致密的生物垫，在7天后收获该生物垫(图18)。7天后残留液体的平均pH值为6.9±0.1。因此，该生长过程将AWS的pH从4.8(酸乳清的典型pH)中和至接近中性(～7)。透射光显微镜显示在AWS培养基上产生的生物垫的丝状性质(图18)。湿生物垫的平均厚度为4±0.5mm。将生物垫在50℃干燥30h，得到的平均干重为1.88±0.2g。湿生物垫的平均密度为0.29g/cm3。干原料(乳糖和总蛋白质)向干生物垫的平均转化率为42.2％。
表4.在Tsakali等人，2010中描述的典型酸乳清的组成，以及在本实施例中用于生长MK7生物垫的酸乳清替代物培养基(AWS)的组成。
Figure GDA0002402560150000561
*AWS的总蛋白质来源是乳清蛋白浓缩物，其是来自GNC,Pittsburgh,PA的100％乳清蛋白GNC ProPerformance。
**AWS的矿物组分是表1A中描述的1/2强度MK7-1培养基，但没有甘油。
实施例15：在酸乳清上菌株MK7生物垫的生长
使用酸乳清作为主要碳和营养素源，在6天内生长菌株MK7生物垫。使用125mL经过各种处理的粗酸乳清，在灭菌的12.7×12.7cm(0.016m2)聚丙烯托盘中产生生物垫。进行处理，以评估在调节pH、加入选择的营养素和/或加热以最小化竞争性微生物的存在后的生长速率和生物质生产率。
将500mL体积的酸乳清加入预先灭菌的1L Erlenmeyer烧瓶中(加热至125℃10分钟)，液体培养基如表5所示进行选择的处理(1-12)。pH或者未经调节(酸乳清的平均pH为4.8)或者用浓HCl调节至pH 2.7。营养素添加处理包括：不添加、添加2.5g/L尿素(作为氮源)、或添加1/2强度MK7-1(作为全套营养素)在如实施例1中所述的酸乳清液中，减去甘油。在进行其他处理(pH和/或营养素添加)之后，通过将酸乳清液培养基煮沸15分钟来进行加热灭菌。在培养基冷却至约23℃后，将7.5％体积(体积/体积)指数生长期的接种物加入烧瓶中。如实施例3中所述产生该接种物。将125mL接种培养基的等分试样加入到异丙基擦拭的托盘中(参见实施例3的灭菌步骤)，并将托盘置于安装在托盘架系统中的较大(0.25m2)托盘上，如实施例3所述。使培养物在25±1℃下孵育至少6天。
表5.用于评价酸乳清作为营养素培养基用于菌株MK7生物垫生长的处理矩阵
Figure GDA0002402560150000571
实施例16：在厌氧消化物上菌株MK7丝状真菌生物垫的生长
使用厌氧消化物作为唯一的碳和营养素源(原料)在7天内产生致密菌株MK7生物垫。厌氧消化物是富含木质素的固体残留物，其是在富木质纤维素的生物质(例如玉米秸秆、麦秸、牛粪)在氧气限制条件下微生物发酵后留下的。厌氧消化物被认为对微生物的进一步分解具有抗性，因此通常用作土壤改良剂或燃烧以向蒸汽发生器供能用于产生电力。
将潮湿的厌氧消化物(500g)加入到2L饮用质量的自来水中，形成混合物。该混合物的原本pH为5.5。用7.5％(体积:体积)的菌株MK7接种物(如实施例3所述制备)接种混合物。将200ml所得混合物加入到12.7×12.7cm方形托盘中。在表面上形成固结的生物垫，在室温(～23℃)孵育7天后收获。生物垫的平均厚度为2.6mm，平均干重为0.62g(n＝3，标准差＝0.03g)，相应的密度为0.015g/cm3。平均转化效率为2.3％。
为了提高厌氧消化物转化为微生物生物质的速率，通过用大麦培养基(BarleyMedium)补充厌氧消化物，有效地使用增强的生长培养基，进行了另外的实验。大麦培养基用于刺激生长并诱导菌株MK7原位产生酶，用于进一步降解和转化厌氧消化物为真菌生物质。通过组合1L自来水、50g大麦花、1g酵母提取物、0.1mL葡糖淀粉酶(Distillate VHP,Dupont)、0.1mLα-淀粉酶(SPEZYME ALPHA,13,775AAU/g,Dupont)和0.1mLβ-葡聚糖酶(Optimash TBG，Dupont)制备增强的大麦培养基。将混合物加热至65℃并在65℃搅拌15分钟。然后，将混合物煮沸15分钟以使酶失活。然后将混合物冷却至室温。
重复上述用于厌氧消化物实验的方案，不同之处在于用增强的大麦培养基代替自来水，并且使用的每种组分的总体积减少一半。减去在没有加入厌氧消化物的对照处理中产生的生物质后，厌氧消化物向生物垫的平均转化率为6±2％。
实施例17：托盘反应器中其他丝状真菌的生长
使用实施例1、2和3中描述的用于菌株MK7的表面发酵技术，评估了少孢根霉(Rhizopus oligosporus)和镰孢Fusarium venenatum的生长。
少孢根霉(Rhizopus oligosporus)广泛用于世界各地的豆豉(人类食品)生产。少孢根霉菌株ATCC 22595于2015年10月1日从ATCC获得。如实施例2所述，将获得自ATCC的少孢根霉的纯培养物样品置于培养皿中的MK7-1琼脂培养基上。
QuornTM食品生产中使用的镰孢Fusarium venenatum从2016年1月16日购自Bozeman,MT的Albertson超市的Quorn Chik'n Nuggets包装(UPC代码：33735-00006)中采集。为了分离F.venenatum，将含有F.venenatum的QuornTMChik'n Nuggets样品(～0.25cm2)，置于250ml带挡板摇瓶中的100mL pH5无菌MK7-1培养基中。通过将培养基在烧瓶中煮沸20分钟，对培养基和烧瓶进行灭菌。在加入QuornTM样品之前，将培养基冷却至23℃。以200rpm旋转的同时、在23±1℃孵育3天后，移取1mL培养物并用于接种另一个相同的烧瓶和培养基。以相同方式再孵育3天后，移取50μL培养物的等分试样，并在无菌培养皿中接种于无菌MK7-1琼脂培养基(pH4.8)上。
如实施例3中所述，将在少孢根霉和镰孢F.venenatum板上形成的菌丝体垫用于接种无菌1L带挡板摇瓶中的350mL MK7-1培养基。如实施例3所述，在摇瓶中生长5天后，培养物用作托盘反应器的接种物。用于托盘反应器的期望接种物由微生物学上纯的培养物组成，细胞密度大于6g/L，处于指数生长后期(参见实施例3)。如实施例3所述，对于两种生物的每一种，准备含有1.5L接种的MK7-1培养基的两个托盘。对于根霉菌，将培养基的pH调节至4.1，对于镰孢，将培养基的pH调节至5.0。所得培养物和垫的图像显示在图12和13中。
实施例18：通过固态发酵(SSF)产生的丝状真菌生物垫与通过固体基质表面发酵(SSSF)产生的生物质的比较
SSF工艺
本文提及的固态发酵(SSF)是指在低水含量(典型地低于50％)的固体上发生的微生物发酵过程。
通过向2L玻璃容器中的1L Mandels和Reese培养基加入20g葡萄糖，来制备MK7SSF接种物，在121℃、pH 4.5下高压灭菌45分钟。将100ml所得培养基加入到250mlErlenmeyer烧瓶中，并用来自-80℃甘油原种(stock)的0.25g菌株MK7接种。将培养物在30℃，180rpm孵育14天，然后用作SSF的接种物。
SSF方法的一个实例是在WO 2016/004380和US 2016/0002680中用于生产生物垫的方法。具体地说，在商业捣碎器中将100克麦秸进行大小减小，并放置在2升玻璃瓶中。加入300ml Mandels和Reese培养基和3ml浓H2SO4。将所得浆液在121℃高压灭菌45分钟。用NaOH将高压灭菌浆液的pH调节至3.0，使其冷却至室温，然后均等地转移到四个250mlErlenmeyer烧瓶中。加入10ml菌株MK7接种物，并将烧瓶在30℃，180rpm振荡4天，然后将所有烧瓶的内容物转移到单个9×9英寸的
Figure GDA0002402560150000591
培养皿中。用
Figure GDA0002402560150000601
包裹膜覆盖所得培养物，并在收获前于30℃孵育7天。
SSSF工艺
实施例3中描述了SSSF接种物，并且在下面的实施例中描述了步骤(即，甜菜浆和漂浮在液体层顶部的其他木质纤维素材料的转化)。具体地，如本文所述，SSSF指，当固体基质浸没在液体表面以下时发生的发酵，由此丝状真菌生物垫使用来自浸没的固体的碳和营养素在液体表面上生长。产生的丝状真菌生物垫是粘着、致密的，不含原料(图14)。
在SSSF和SSF工艺之间，生物质生产和所产生的生物垫显著不同。培养基成分、离子强度、渗透压、原料浓度、接种物质量、培养时间(表6和7)都是SSSF和SSF方法之间的重要参数差异。这些工艺差异导致极度不同的生物质性质(例如密度、固结垫的形成、微生物纯度、细丝长度、细丝组织等)。
由SSSF产生的生物质导致产生丝状真菌生物垫，所述丝状真菌生物垫漂浮在液体层的顶部并且与固体原料层物理分离。得到的丝状真菌生物垫是基本上纯的真菌生物质，其组织成粘着且致密的垫。该垫具有高的拉伸强度并且由长丝组成，长丝的平均长度从数毫米到数厘米(如图1C、11和12所示)。细丝主要组织成与生物垫的表面平行，并通过高密度的真菌团块连接。生物垫的表面可以显示或可以不显示与生物垫表面垂直的气生菌丝。丝状真菌生物垫易于从生长环境中移出，因为它与液体或固体基质是物理分隔开的，这使得能够快速且容易地收获相对纯的丝状真菌生物垫。
相反，通过SSF生长的生物质产生以随机构型与固体基质异质整合的生物质。产生的生物质细丝的长度通常小于100μm(图14)。此外，由SSF产生的生物质不是粘着的、且具有低拉伸强度，使得其不能以单个单元挑取出来(参见图14)。所得生物质/固体基质混合物倾向于具有低密度，特别是与由SSSF产生的丝状真菌生物垫相比时。
表6.以下描述了SSF和SSSF方法的关键差异：
Figure GDA0002402560150000602
Figure GDA0002402560150000611
实施例19：菌株MK7的甜菜浆的SSF和SSSF
使用SSF和SSSF方法以甜菜浆作为主要碳源生产菌株MK7生物质。甜菜浆是在加工厂从甜菜浆中除去糖后剩余的甜菜的植物性部分。甜菜浆从Billings,Montana的WesternSugar Cooperative生产厂获得，由约24％干物质、9.1％粗蛋白、0.6％粗脂肪、23.1％粗纤维、4％灰分和0.56％钙组成。
对于SSF实验，将50g干甜菜浆与250ml水混合。将混合物高压灭菌20分钟以确保无菌。冷却至室温(～23℃)后，混合物接种250mg湿菌株MK7生物垫(该生物垫在玉米秸秆/水混合物的表面上生长为生物垫)。将菌株MK7生物垫用无菌刮刀混合到甜菜浆混合物中，并使得到的接种混合物在室温下孵育4、5和7天。
对于SSSF实验，将甜菜浆以7％浓度加入到1/2强度的MK7-1培养基(浆重量:液体体积)中，以产生300ml培养基。通过加入适量的HCl，将培养基的pH调节至4.8，然后煮沸20分钟。冷却至室温后，将如实施例C所述在玉米秸秆/水混合物表面上生长为丝状真菌生物垫的约100mg MK7生物垫，用无菌刮刀混合到培养基中。通过加入适量的HCl将pH重新调节至4.8，然后将100ml接种的浆培养基等分试样加入到灭菌的0.023m2
Figure GDA0002402560150000621
玻璃托盘中，然后将托盘放入托盘架系统中。将接种的混合物在23±1℃孵育，在4、5和7天后得到厚度分别约2.9、3.4和4.1mm的柔韧、致密的生物垫。收获生物垫并在50℃干燥48小时，干重为1.85g(4天)、2.25g(5天)和2.85g(7天)。对于4、5和7天的垫，甜菜浆转化为干生物垫的转化率分别为26.4％、32.1％和40.7％。对于4、5和7天的垫，基于最大生物垫体积的干重，生物垫密度分别为0.028、0.029和0.030g/cm3。
使用SSF与SSSF的生长导致显著不同的生物质形式。SSF产生的生物质结构是生物质和基质的紧密混合物。这些混合物由在甜菜浆基质碎片的周围和内部交织的低密度真菌生物质组成。这些紧密混合物主要由散布有少量真菌生物质的基质组成。没有进行生物质与基质的分离，因为这需要显著的额外步骤并且在技术上难以实现。
相反，SSSF产生与甜菜浆基质物理分开并且不同的丝状真菌生物垫，这允许直接和简单地收获生物垫。此外，所得的丝状真菌生物垫是致密的，基本上是纯的并且由长排列的细丝组成。
实施例20：在胡萝卜和花椰菜废物上菌株MK7丝状真菌生物垫的生长
使用均质化的花椰菜或均质化的胡萝卜作为原料在6天内产生致密菌株MK7生物垫。花椰菜和胡萝卜购自蒙大拿州博兹曼的Costco Wholesale。在商业食品加工机中使用金属刀片高速将100克每种原料分别均质化5分钟，并置于具有9000ml自来水的2升烧杯中。如下加入培养基盐以形成混合物：
Figure GDA0002402560150000631
Figure GDA0002402560150000632
通过加入1.3ml浓HCl将混合物的pH调节至3.5。用铝箔覆盖培养基，然后煮沸30分钟。冷却至室温(～23℃)后，将50ml(7.5％体积:体积)如实施例3中所述制备的接种物加入到每种原料的培养基中并搅拌直至形成均匀混合物。将250ml混合物倒入四个单独的5×7英寸(0.02m2)托盘中并用
Figure GDA0002402560150000633
包裹膜覆盖。在收获前将托盘在23±1℃培养7天。得到的生物质是一种柔韧、致密的丝状真菌生物垫，不含剩余的花椰菜或胡萝卜原料。也就是说，产生了不含原料残留物的丝状真菌生物垫，其由基本上纯的MK7生物质组成。收获后残留液体的平均pH值为6.2。湿生物垫的平均厚度为3±1mm。将丝状真菌生物垫在50℃下干燥72小时，平均干重±标准差对于花椰菜为1.7±0.2g，对于胡萝卜为1.7±0.2g。基于干重的花椰菜平均转化率为52±5g菌株MK7干重/100g干重花椰菜。基于干重的胡萝卜平均转化率为55±7g菌株MK7干重/100g干重胡萝卜。
实施例21：在城市有机废物替代物上的菌株MK7培养(草屑和叶子作为预处理的函数)
酸和碱预处理对城市有机废物的影响，评估为原料向丝状真菌生物垫的转化百分比的函数。将肯塔基州蓝草屑和白蜡树叶在60℃分别干燥直至水含量低于8％。将每种原料在商业混合器中研磨成细粉。
HCl酸预处理
·通过煮沸10分钟，预处理三份重复的在100ml自来水pH2.5(用33％HCl调节)中的10g草/叶(50:50干重)。
·通过煮沸10分钟，预处理3份重复的在含有10mM MnSO4的100ml自来水pH 2.5(用33％HCl调节)中的10g草/叶(50:50干重)。
·通过煮沸10分钟，预处理3份重复的在100ml MK-7培养基pH 2.5(用33％HCl调节)中的10g草/叶(50:50干重)。
·通过煮沸10分钟，预处理3份重复的在含有10mM MnSO4的100ml MK-7培养基pH2.5(用33％HCl调节)中的10g草/叶(50:50干重)。
NaOH碱预处理
·通过煮沸10分钟，预处理3份重复的在100ml自来水pH10.75(用1％NaOH调节)中的10g草/叶(50:50干重)。用HCl调节最终pH 2.5。
·通过煮沸10分钟，预处理3份重复的在含有10mM MnSO4的100ml自来水pH 10.75(用1％NaOH调节)中的10g草/叶(50:50干重)。用HCl调节最终pH 2.5。
·通过煮沸10分钟，预处理3份重复的在100ml MK-7培养基pH 10.75(用1％NaOH调节)中的10g草/叶(50:50干重)。用HCl调节最终pH 2.5。
·通过煮沸10分钟，预处理3份重复的在含有10mM MnSO4的100ml MK-7培养基pH10.75(用1％NaOH调节)中的10g草/叶(50:50干重)。用HCl调节最终pH 2.5。
对照预处理
·3份重复的在100ml自来水中的10g草/叶(50:50干重)。最终pH 5.5。
·3份重复的在100ml自来水，10mM MnSO4中的10g草/叶(50:50干重)。最终pH5.5。
·3份重复的在100ml MK7-1培养基中的10g草/叶(50:50干重)。最终pH 5.5。
·3份重复的在100ml MK7-1培养基，10mM MnSO4中的10g草/叶(50:50干重)。最终pH 5.5。
将样品置于12.7×12.7cm托盘中，盖上托盘，然后孵育7天。结果显示在图15中。在每种情况下，预处理的应用增加了所得的转化百分比。也就是说，通过应用酸或碱预处理和通过添加锰，实现了更大的原料向所得丝状真菌生物垫的转化量。
实施例22：在淀粉上菌株MK7生物垫的生长
使用淀粉作为碳和营养素源(原料)，在短短4天内产生致密菌株MK丝状真菌生物垫。在这些特定实验中使用的淀粉是由Argo Food Companies,Inc(Memphis,TN)制造的100％Argo玉米淀粉，并购自位于Bozeman,MH的Albertson超市。
通过将6％、8％和10％干淀粉粉末添加到10L钢罐中的6L体积的饮用品质自来水中，来制备三批淀粉培养基。将该混合物补充MK7-1盐并煮沸10分钟，然后冷却至室温(～23℃)。加热混合物产生聚结的淀粉团块，然后将其物理破碎成较小的团块。将混合物的pH调节至2.7并用7.5％(体积:体积)如实施例3所述制备的MK7接种物接种。
将1.5L接种的培养基的等分试样加入到四个消毒的聚丙烯0.25m2托盘中，置于托盘架系统中，并在23±1℃孵育。在生长仅2天后观察到致密丝状真菌生物垫，并在6天后收获生物垫。对于6％、8％和10％处理，收获后托盘中剩余的残留液体的平均pH值分别为6.05、6.11和5.88。三种处理的生物垫的平均厚度分别为2.9、3.1和3.3mm。将丝状真菌生物垫在50℃干燥72小时，对于含有6％、8％和10％淀粉的四份重复托盘，平均干重±标准差分别为29.0±1.3、34.4±1.5和38.2±1.9g、。这相当于32％、29％和25％的淀粉至丝状真菌生物垫干重的转化百分比。对于三种处理，湿丝状真菌生物垫基于干重的平均密度分别为0.04、0.04和0.05g/cm2。
实施例23：在马铃薯加工废物流上菌株MK7丝状真菌生物垫的生长
使用马铃薯加工废物作为碳和营养素源(原料)在7天内产生致密菌株MK7丝状真菌生物垫。马铃薯加工废物通常在马铃薯加工过程中产生，并且包括来自洗涤、去皮和切割操作(即，薯条、薯块、薯片等)的废物流。马铃薯加工废物流还包括排放堆(dischargepile)，其由堆垛成堆且无覆盖地暴露于自然环境的多种马铃薯加工废物组成。在本实施例中，在2016年9月21日由蒙大拿州Whitehall的Bauch农场获得由多种马铃薯加工废物组成的马铃薯加工废物流，并在48小时内用作生长菌株MK7生物垫的碳和营养素源。
马铃薯下脚料(Potato shorts)是在从整个马铃薯上切下薯条后留下的那些马铃薯块。作为非限制性实例，马铃薯下脚料的大小和三维形状各不相同，从细条到6英寸长×0.5英寸厚或更厚的块不等。在大多数情况下，新鲜丢弃物描述由于损坏、挫伤等从马铃薯上除去的马铃薯块。在某些情况下，包括整个马铃薯作为丢弃样品。马铃薯皮主要是从马铃薯上去除的皮。
马铃薯下脚料、丢弃物和皮由食品加工机以1分钟约500ml体积批次加工成均匀稠度(Farbarware Model 103742食品加工机，高设置)。出于本实施例中的描述的目的，食品加工样品被称为混合料(blendate)。
将混合的马铃薯下脚料和新鲜丢弃物，以10％湿重混合料：MK7-1培养基体积的比率为500g混合料:4.5L液体MK7-1培养基，加入到两个15L环氧基涂层钢蒸煮锅中，产生混合物。用浓HCl将混合物的pH调节至2.45。以7.5％体积：体积(即375ml接种物：4625ml混合物)的比率，加入如实施例3所述制备的菌株MK7接种物。将1.5L接种的悬浮液的等分试样加入各0.25m2灭菌的聚丙烯托盘中，一式三份，放置在托盘架系统中。将培养物在23±1℃孵育，7天后收获柔韧、致密的生物垫。收获后托盘中剩余的残留液体的平均pH值对于下脚料为7.1，对于新鲜丢弃物处理为6.9。在7L自来水中轻轻搅动10分钟，漂洗收获的生物垫，并在50℃下干燥72小时。
湿生物垫的平均厚度对于下脚料为3.8±0.9mm，对于丢弃物为3.9±1.0mm。每个托盘中生物质的平均干重±标准差对于下脚料为33.6±0.6g，对于新鲜丢弃物为40.2±2.7g。基于干重的生物垫平均密度对于下脚料为0.035g/cm3，对于丢弃物为0.041g/cm3。原马铃薯副产物中总固体向干生物垫的平均转化率对于下脚料为36％，对于新鲜丢弃物为43％。考虑到菌株MK7使用的碳约50％以二氧化碳的形式释放到大气中，接近50％的转化率可以认为是碳的100％转化效率。
在生长实验之前对混合的马铃薯皮进行预处理，以增加菌株MK7对马铃薯皮营养素的利用。将混合的马铃薯皮(175g)加入到9个12.7×17.8cm(0.023cm2)
Figure GDA0002402560150000671
玻璃托盘的每一个中，以产生三个处理的实验基质，每个处理重复三次。处理1接受50ml饮用质量的自来水。处理2接受45ml菌株MK7水解产物的等分试样，其含有菌株MK7在玉米秸秆上生长时分泌的一系列菌株MK7水解酶。处理3接受50ml自来水和一系列商业酶，包括0.05g纤维素酶Y-C(MP Biomedicals,Cat#320951,Lot#M4156)、2.5ml葡糖淀粉酶(Distillate VHP，Dupont)、2.5mlα-淀粉酶(APEZYME ALPHA,13,775AAU/g,Dupont)和2.5mlβ-葡聚糖酶(Optimash TBG，Dupont)。处理3托盘在50℃孵育30分钟以刺激酶水解，然后煮沸5分钟以使酶失活。使用浓HCl将处理的pH调节至3.0，并用10ml如实施例2所述制备的菌株MK7接种所有托盘。7天后，从液体表面取出生物垫，在自来水中漂洗10秒钟，在60℃下干燥48小时。马铃薯皮干重向干生物垫的转化为：对照(仅H2O)平均值＝5.9％(5.5％、6.5％和5.8％)；菌株MK7酶＝9.0％(7.2％、10.1％和9.8％)；和商业酶＝9.9％(10.2％、8.4％和11％)。
实施例24：由SSF产生的生物质与由SSSF产生的生物垫的营养分析
通过Eurofins进行营养分析，比较SSF与SSSF方法获得的生物垫。SSF样品获自在密歇根生物技术研究所(Michigan Biotechnology Institute)用氨纤维膨胀(AFEX)预处理的玉米秸秆上培养的菌株MK7。将150g AFEX加入到500ml自来水中，用浓HCL调节pH至3.5后在121℃高压灭菌。根据实施例18，用25ml菌株MK7接种物接种所得混合物。将浆液转移到23×23cm
Figure GDA0002402560150000681
玻璃托盘中，并在室温下孵育11天。收获整合的菌株MK7生物质和玉米秸秆，并在60℃干燥48小时。通过Eurofins USA(Des Moines，IA)分析样品的总蛋白质、总纤维、总碳水化合物、灰分和总脂肪。
从在5％AFEX玉米秸秆上产生的垫获得SSSF样品。将50g AFEX玉米秸秆加入1L自来水中，用浓HCl调节pH至3.5后在121℃高压灭菌。用50ml如实施例3所述制备的菌株MK7接种物接种所得混合物。将浆液转移到两个23×23cm
Figure GDA0002402560150000682
玻璃托盘中，并在室温下孵育11天。收获垫并在自来水中漂洗30秒，然后在60℃干燥24小时。通过Eurofins USA(DesMoines IA)分析样品的总蛋白质、总纤维、总碳水化合物、灰分和总脂肪。
表7
Eurofins分析 SSF(％) SSSF(％)
总蛋白质 2.56 51.10
总脂肪 0.60 12.00
总纤维 80.30 23.30
总糖 2.10 <0.35
总灰分 15 12.40
实施例25：丝状嗜酸性MK7真菌菌株的氨基酸谱
使用实施例2和3中描述的方法在MK7-1培养基中在托盘反应器中生产丝状嗜酸性MK7真菌菌株生物垫。将来自6个托盘的丝状生物质合并，然后在60℃干燥45分钟，在50℃干燥72小时。将400g这种丝状生物质送到位于Des Moines,IA的Eurofins ScientificInc.Nutritional Analysis Center进行营养分析。使用在Association of OfficialAgricultural Chemists(AOAC)官方分析方法中公布的国际公认的方法，分析氨基酸：AOAC988.15用于色氨酸，AOAC 994.12mod.用于胱氨酸和蛋氨酸，AOAC 982.30mod.用于丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、总赖氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在表8中将Eurofins报道的丝状嗜酸性MK7真菌菌株样品的氨基酸组成与用于鱼食的镰孢Fusarium venenatum(Alriksson,B.et al.(2014)Fishfeed from wood.Cellulose Chemistry and Technology48:9–10(2014)、Quorn(Nutritional Profile of Quorn Mycoprotein,2009)、卵清蛋白(Food and AgricultureOrganization of the United Nations.The Amino Acid Content of Foods andBiological Data on Proteins,Nutritional Study#24.Rome(1970).UNIPUB,Inc.,4611-F Assembly Drive,Lanham,MD 20706)和少孢根霉(Rhizopus oligosporus)(Graham,D.C.,Steinkraus,K.H.&Hackler,L.R.(1976)Factors affecting production of moldmycelium and protein in synthetic media.Appl Environ Microbiol 32:381–387)的氨基酸组成，进行比较。总蛋白含量测量为4.5％水分含量生物质的41.5％。值得注意的是，与所有其他四种蛋白质来源相比，丝状嗜酸性MK7真菌菌株显示具有更高浓度的必需氨基酸，使得丝状嗜酸性MK7真菌菌株成为食品和饲料中非常理想的蛋白质来源。
表8.针对丝状嗜酸性MK7真菌菌株和四种高蛋白食物/饲料来源，以总氨基酸百分比提供氨基酸浓度。必需氨基酸用星号表示。
Figure GDA0002402560150000691
Figure GDA0002402560150000701
实施例26：由丝状嗜酸性MK7真菌菌株从食品级甘油产生的富含C18的脂质
培养基制备：用125g/L甘油(The Chemistry Store–Kosher食品级甘油>99.7％,ASIN:B00KN1LRWQ,可在因特网上获得)(562.5克)以及NH4NO3和尿素，制备4.5升MK7-1培养基，其中氮浓度改变为C:N比为40:1(C源中碳摩尔数：氮化合物中N摩尔数)。
表9.经修饰以提供40:1的C:N比和12.5％甘油浓度的MK7-1培养基的组成。通过添加2mL/L表1中描述的500x储备溶液(实施例1)来提供微量营养素。
Figure GDA0002402560150000702
将混合物pH调节至2.7，通过在烧瓶顶部覆盖铝箔的2升Erlenmeyer烧瓶中煮沸30分钟进行加热灭菌。将混合物冷却2小时至25℃。
接种：将接种物(干重15g/L浮游细胞，在指数生长期(参见实施例3))加入到冷却的烧瓶中，最终干重浓度为1g/L。将烧瓶充分混合使接种物均匀分布。浮游状态细胞对于垫形成是至关重要的，并且希望最小化细胞聚集(即大于1mm的生物膜)。理想地，在分配之前应该从接种物中过滤掉大于2.5mm的细胞聚集物。
孵育和收获：将具有接种物的混合物均等地分配到三个0.25m2的托盘中，体积为1.5升/托盘或6升/平方米，并在25℃、90-100％湿度下孵育8天。在细胞密度高于30g/L时产生固结的生物垫生物质，并且生物质能够作为一个粘性垫收获。在一个实施方案中，简单地从托盘上卷出(rolled off)垫(图6)。使用流水将垫漂洗30秒并使其滴干5-10分钟。由于过量除水会损失蛋白质和其他真菌营养素，因此避免垫的挤压。滴干后丝状生物质的湿重为410克(或1,620克/m2)。测量的水分含量为82％(即18％的干重)，相当于73.8g/托盘或295g/m2的干重。18％的干重丝状生物质优于在浸没培养物中生长的其他真菌生物质(其典型干重为1.5％)。相对地，现有技术工艺利用离心机(能量和资本密集型方法)来获得所需的真菌生物质密度。与这些更昂贵的方法相比，本文描述的方法需要少得多的处理、设备和能量投入。
脂质分析：通过紫外-可见显微镜和尼罗红染色(Cooksey等人，1987；图16)进行总脂质的估计，其估计总脂质为40-50％。如Lohman等人(2013)所述，使用直接酯基转移结合GC-MS分析，确定了总细胞内脂质的定量，发现该定量为39％。这相当于在8天内的脂质产量为115g脂质/m2(14g/m2/天)或0.39g/升/小时的平均生产率。这些速率比使用8％甘油的丝状嗜酸性MK7真菌菌株浸没培养物中发现的速率(0.245g/L/hr)快得多，并且与文献中的其他生物(包括酵母和藻类)相比是非常有竞争性的。此外，丝状嗜酸性MK7真菌菌株是在大多数生物不能耐受的非常高甘油浓度下以这样具有竞争性的速率产生脂质，并且是在酸性pH范围内可以做到这一点的唯一生物(据我们所知)，这对于限制污染具有显著优势。此外，脂质系数(g脂质/g基质)与0.21g脂质/g甘油的其他菌株相比具有高度竞争性(参见附表)。增加的脂质生产速率和180g/L的细胞密度，对于通过目前正在开发或商业应用的各种微生物转化微生物油的生产，具有直接意义。
丝状嗜酸性MK7真菌菌株脂质谱在不同类型的处理(即pH、温度、生长基质、培养持续时间、水分含量)之间非常一致，并且由C16:0和C18:0,C18:1和C18:2三酰基甘油酯占主导(>总脂质的95％；下表10；图17)。脂肪酸谱也显示出许多高价值产品，包括ω-7异油酸(11-十八碳烯酸甲酯)、ω-7棕榈油酸(十六碳-9-烯酸甲酯；商品名ProvinalTM)和二十四烷酸甲酯。这些是植物油中不常见的稀有脂肪酸，并且与单独的生物柴油相比，每吨原料可产生显著更多的收益。
表10.在30℃用12.5％甘油和40:1的C:N比率培养8天的菌株MK7生物质中发现的脂肪酸及其浓度
Figure GDA0002402560150000721
Figure GDA0002402560150000731
实施例27：菌株MK7的毒性分析
测定在不同条件下生长的5个菌株MK7样品中霉菌毒素(mycotoxin)的存在。如实施例1中所述，在用于产生接种物的相同条件下，在10L生物反应器中产生样品1生物质，不同之处在于C:N比为30：1。如实施例1所述，使用真空过滤装置通过0.2μm过滤器过滤收集生物质样品。
使用如实施例1中所述制备的50mL pH 2.8MK7-1培养基，在灭菌的12.7×17.8cm(0.02m2)
Figure GDA0002402560150000732
玻璃托盘中产生样品2生物垫，不同之处在于培养基补充有12％甘油和0.2％蛋白胨(重量/体积；蛋白胨颗粒，Fisher Scientific,Lot#143241,Somerville,NJ)。样品2使用与实施例3中相关的用于0.25m 2托盘相同的步骤灭菌。
在与样品2相同的条件下生长样品3，不同之处在于将pH调节至4.5并且培养基不补充蛋白胨。
在与样品2相同的条件下生长样品4，不同之处在于培养基补充有4％甘油。
在与样品2相同的条件下生长样品5，不同之处在于将pH调节至pH2.2并且培养基不补充蛋白胨。用7.5％(体积/体积)的用于样品1的液体培养物，接种样品2至5培养基。生长8天后收集湿生物质样品，并在提取霉菌毒素之前储存在-20℃。
使用Vicam提供的Myco6in1+霉菌毒素测定试剂盒(Lot#100000176:Nixa,MO)、按照Myco6in1+测定试剂盒手册中描述的标准方案，从湿生物质中提取霉菌毒素。使用Myco6in1+LC/MS/MS操作手册中描述的方案，通过LC-Q-TOF分析12种不同的霉菌毒素。使用蒙大拿州立大学质谱仪核心设施的Agilent 6538Q-TOF偶联Agilent 1290HPLC，鉴定和定量毒素。伏马菌素(Fumonisin)B1和伏马菌素B2用作真实标准。
测试的所有毒素的测量值低于美国食品和药物管理局设定的人消耗管理水平(表11)。测量水平至少比管理水平低一个数量级，样品4中发现的总黄曲霉毒素(Aflatoxin)除外，与20ng/g的管理水平相比，其为8.76ng/g。然而，菌株MK7中不存在黄曲霉毒素产生的基因，因此预期该毒素的来源是蛋白胨和培养基中使用的其他成分的污染而不是MK7的产物。
表11.菌株MK7的生物质中霉菌毒素的定量
Figure GDA0002402560150000741
*总黄曲霉毒素
Figure GDA0002402560150000742
总伏马菌素
通过用大型蚤(Daphnia magna)的生物测定法，进一步证实了MK7培养基和生物质的无毒特性，大型蚤是一种常用于毒性测定的高度敏感的大型无脊椎动物(EPAPublication，1987；Guilhermino等人，2000)。活的大型蚤(D.Magna)购自CarolinaBiological Supply(Burlington,NC)，并在供应商提供的手册中描述的条件下生长。在生长和观察24小时后，将水蚤用于毒性实验。在三个培养皿中装入30mL 30％MK7培养物(MK7和MK7-1培养基)(如实施例3所述的在接种反应器中生长6天的培养物)和70％水(其中运载大型蚤)。对于实验对照，另外三个培养皿中装入30mL的运载水。将七个看上去活的大型蚤添加到六个培养皿的每一个中，并且每天观察，持续三天。大型蚤死亡被定义为1分钟后没有可见的运动。在用MK7培养基和生物质处理的大型蚤和实验对照之间，经过3天没有观察到存活率的显著差异(对于每个处理，3天后，每个培养皿平均1.2个死亡)。
还在金鱼(Carassius auratus)上测试了菌株MK7生物质的毒性。两个相同的5.7L鱼缸、泵和过滤器购自位于Bozeman,MT的Petco(Aqueon model#E414W,Franklin,WI)。缸中装入购自Bozeman Montana的Albertson超市的5.7升波兰泉水(Poland Spring)。从Petco(Bozeman，MT)购买六条金鱼(长约3cm)，并每个缸中放入三条金鱼。其中一个缸每天接收约0.05g干TetraFin Goldfish Flakes Plus(Blacksberg，VA)鱼饲料(购自Petco，Bozeman，MT)。另一个缸每天接收约0.05g干燥的菌株MK7生物质。从根据实施例3中描述的方案产生的托盘反应器之一获得湿MK7生物质。通过从托盘中移取40g MK7(参见实施例3)并将生物质置于250mL烧杯中来制备MK7生物质。然后使用GE微波(型号WES1452SS1SS)将湿生物质微波加热30秒。经干燥的生物质的水分含量小于0.5％。然后用不锈钢刮刀将生物质粉碎成与TetraFin Goldfish Flakes大小相似的小片。在喂食60天后，所有的鱼都存活并且看起来是健康的(活跃地游泳)，并且对于吞食MK7产生的生物质垫，显示出显著的热情。60天后终止实验。
SEQ ID NO：1：命名为菌株MK7的嗜酸性丝状真菌菌种的18S rRNA和ITS区DNA序列
Figure GDA0002402560150000761
SEQ ID NO:2翻译延延伸因子1α(Tef1)
Figure GDA0002402560150000771
SEQ ID NO:3微管蛋白β链(Tub1):部分序列
Figure GDA0002402560150000772
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atgatcactg gtacttccca ggccgattgc gccattctca tcattgccgc cggtactggt 60
gagttcgagg ctggtatctc caaggatggc cagacccgtg agcacgctct tcttgcctac 120
acccttggtg tcaagaacct catcgtcgcc atcaacaaga tggacaccac caagtggtct 180
gaggcccgtt accaggagat catcaaggag acctcctcct tcatcaagaa ggtcggctac 240
aaccccaagg ctgtcgcttt cgtccccatc tccggtttca acggtgacaa catgcttacc 300
ccctccacca actgcccctg gtacaagggt tgggagcgtg agatcaagtc cggcaagctc 360
accggcaaga ccctcctcga ggccattgac tccatcgagc ctcccaagcg tcccgttgac 420
aagcccctcc gtcttcccct ccaggatgtc tacaagatcg gtggtattgg aacggttccc 480
gtcggccgta ttgagactgg tgtcatcaag cccggtatgg tcgttacctt cgctccctcc 540
aacgtcacca ctgaagtcaa gtccgtcgag atgcaccacg agcagctcag tgagggccag 600
cccggtgaca acgttggttt caacgtgaag aacgtctccg tcaaggacat ccgacgtggt 660
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gtcatcgtcc tcaaccaccc cggccaggtc ggtgctggtt acgctcccgt cctcgattgc 780
cacactgccc acattgcctg caagttcgcc gagatccagg agaagatcga ccgccgaacc 840
ggtaaggcta ctgaggccgc tcccaagttc atcaagtctg gtgactccgc catcgtcaag 900
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ggtatgggaa cgcttcttct gtcgaaaatc cgtgaggagt ttcccgatcg catgatggct 300
actttttccg ttatgccttc gcctaaggtt tctgataccg ttgtcgaacc ttacaacgcc 360
actttgtcat tgaaccagct tgtcgagaac tccgatgaga ccttctgtat cgataacgag 420
gctttgtacg acatttacga gaagaccctg aagattgctg atccttctta cgccgatctc 480
<210> 3
<211> 962
<212> DNA
<213> 菌株MK&
<400> 3
ccgcggggaa tactacctga tccgaggtca cattcagagt tgggggttta cggcttggcc 60
gcgccgcgta ccagttgcga gggttttact actacgcaat ggaagctgca gcgagaccgc 120
cactagattt cggggccggc ttgccgcaag ggctcgccga tccccaacac caaacccggg 180
ggcttgaggg ttgaaatgac gctcgaacag gcatgcccgc cagaatactg gcgggcgcaa 240
tgtgcgttca aagattcgat gattcactga attctgcaat tcacattact tatcgcattt 300
tgctgcgttc ttcatcgatg ccagaaccaa gagatccgtt gttgaaagtt ttgatttatt 360
tatggtttta ctcagaagtt acatatagaa acagagttta ggggtcctct ggcgggccgt 420
cccgttttac cgggagcggg ctgatccgcc gaggcaacaa ttggtatgtt cacaggggtt 480
tgggagttgt aaactcggta atgatccctc cgcagttctc acctacggat aggatcatta 540
ccgagtttac aactcccaaa cccctgtgaa catacccatt gttgcctcgg ccggatcagc 600
ccgctcccgg ttaaaacggg acggcccgcc agagtacccc taaactctgt ttctatatgt 660
aacttctgag taaaaccata aataaatcaa aactttcaac acgcatctct tgcttctgtc 720
atcgatgaag aacgcagcaa aatgcgatag tcatgtgatt gcacattcag tgaatcatcg 780
atcttgacgc acattgcgcc tgcagtattc tggcggtcat gcctgttcga gcgtcattca 840
gccctcagcc ctcggttgtg ttcgggatcg gcgagtcctg cgccagcgac cggatcagtg 900
gcgtctgcct gcgcctccat tgcggttaga gttaagccct cgcccacttg ttttacgcta 960
ac 962

Claims (53)

1.包含丝状真菌菌株MK7：ATCC保藏号PTA-10698的生物垫，
其中所述生物垫厚1mm-30mm，和具有细胞密度为至少25g干重/L培养基，
其中所述生物垫通过表面发酵方法生产，所述表面发酵方法包括用包含MK7的丝状真菌的生物学纯的培养物接种人工液体培养基，并且孵育接种的丝状真菌以在所述液体培养基的表面上生产所述生物垫，
其中所述生物垫包含彼此接触的至少两个结构上不同的细胞层，包括在所述表面发酵期间与大气接触的上部气生菌丝层和在所述表面发酵期间与所述液体培养基接触的下部层，其中所述下部层比所述气生菌丝层具有更高的真菌密度。
2.根据权利要求1的生物垫，其中所述生物垫通过培养所述丝状真菌以生产至少25g干重丝状真菌/升培养基生产。
3.根据权利要求1的生物垫，其中所述生物垫通过培养所述丝状真菌以生产至少50g干重丝状真菌/升培养基生产。
4.权利要求1的生物垫，其中所述生物垫通过培养所述丝状真菌以生产至少125g干重丝状真菌/升培养基生产。
5.权利要求1的生物垫，其中所述生物垫通过培养所述丝状真菌以生产至少180g干重丝状真菌/升培养基生产。
6.根据权利要求1的生物垫，其中所述生物垫进一步包含所述气生菌丝层和所述下部层之间的过渡区层。
7.根据权利要求1的生物垫，其中所述生物垫具有足够的拉伸强度和结构完整性以在不撕裂的情况下用手提升和移动。
8.权利要求1的生物垫，其中所述生物垫具有至少40％的蛋白含量。
9.权利要求1的生物垫，其中所述生物垫具有至少39％的脂质含量。
10.权利要求1的生物垫，其中所述生物垫是5％-20％固体。
11.权利要求1的生物垫，其中所述底部层的厚度与所述气生菌丝层的厚度的比率是至少0.41。
12.权利要求1的生物垫，其中所述生物垫具有0.05cm-2cm的平均细丝长度。
13.权利要求1的生物垫，其中所述生物垫包含由所述丝状真菌产生的氨基酸，其选自色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
14.权利要求1的生物垫，其中所述生物垫的拉伸强度是至少0.31kg/cm2。
15.食品，其包含丝状真菌菌株MK7：ATCC保藏号PTA-10698的生物垫，
其中所述生物垫具有细胞密度为至少25g干重/L培养基和至少40％的蛋白含量，
其中所述生物垫通过表面发酵方法生产，所述表面发酵方法包括用包含MK7的丝状真菌的生物学纯的培养物接种人工液体培养基，并且孵育接种的丝状真菌以在所述液体培养基的表面上生产所述生物垫，
其中所述生物垫包含彼此接触的至少两个结构上不同的细胞层，包括在所述表面发酵期间与大气接触的上部气生菌丝层和在所述表面发酵期间与所述液体培养基接触的下部层，其中所述下部层比所述气生菌丝层具有更高的真菌密度。
16.权利要求15的食品，其中所述生物垫包含由所述丝状真菌产生的氨基酸，其选自下组：色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、酪氨酸、缬氨酸及其组合。
17.权利要求15的食品，其中所述生物垫具有至少39％的脂质含量。
18.权利要求15的食品，其中所述食品选自下组：人食品、鱼饲料和动物饲料。
19.根据权利要求15的食品，其中所述生物垫通过培养所述丝状真菌以生产至少25g干重丝状真菌/升培养基生产。
20.根据权利要求15的食品，其中所述生物垫通过培养所述丝状真菌以生产至少50g干重丝状真菌/升培养基生产。
21.根据权利要求15的食品，其中所述生物垫通过培养所述丝状真菌以生产至少125g干重丝状真菌/升培养基生产。
22.根据权利要求15的食品，其中所述生物垫通过培养所述丝状真菌以生产至少180g干重丝状真菌/升培养基生产。
23.根据权利要求15的食品，其中所述生物垫进一步包含所述气生菌丝层和所述下部层之间的过渡区层。
24.根据权利要求15的食品，其中所述生物垫是5％-20％固体。
25.根据权利要求15的食品，其中所述生物垫具有0.05cm-2cm的平均细丝长度。
26.根据权利要求15的食品，其中所述生物垫包含所有必需氨基酸。
27.通过表面发酵方法生产生物垫的方法，所述方法包括
(a)用有效量的丝状真菌菌株MK7：ATCC保藏号PTA-10698的生物学纯的培养物接种人工液体生长培养基；
(b)孵育接种的丝状真菌以在所述液体培养基的表面上生产丝状真菌生物垫；并且
(c)收获所述丝状真菌生物垫，
其中所述生物垫具有细胞密度为至少25g干重/L培养基和包含彼此接触的至少两个结构上不同的细胞层，包括在所述表面发酵期间与大气接触的上部气生菌丝层和在所述表面发酵期间与所述液体培养基接触的下部层，其中所述下部层比所述气生菌丝层具有更高的真菌密度。
28.权利要求27的方法，其中所述人工液体生长培养基包含选自下组的碳源：淀粉、酸乳清、玉米浆、马铃薯废物、甜菜废物、甘油、右旋糖、葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖、玉米糖浆和蔬菜废料。
29.根据权利要求28的方法，其中所述碳源是酸乳清。
30.根据权利要求28的方法，其中所述碳源是甘油。
31.根据权利要求27的方法，其中所述人工液体生长培养基包含碳源，其包含选自下组的废物：农业废物、临床有机废物、城市有机废物、食品加工废物、生物燃料生产废物、工业废物、含有木质纤维素的废物、乳制品废物、屠宰场废物及其组合。
32.根据权利要求27的方法，其中所述人工液体生长培养基包含碳源，其选自下组：单糖、二糖及其组合。
33.根据权利要求27的方法，其中所述人工液体生长培养基包含碳源，其选自下组：甘油、糖、玉米浆、酸乳清、马铃薯废物、甜菜废物、玉米糖浆及其组合。
34.根据权利要求27的方法，其中所述人工液体生长培养基包含碳源，所述碳源是干燥的小麦酒糟可溶物、牛饲养场贮留池水、胡萝卜废物或花椰菜废物。
35.根据权利要求27的方法，其中所述人工生长培养基具有约18.6atm的渗透压。
36.根据权利要求27的方法，其中所述人工生长培养基具有约0.368的离子强度。
37.根据权利要求27的方法，其中所述人工生长培养基包含硝酸铵、尿素、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁和酵母提取物。
38.根据权利要求37的方法，其中所述人工生长培养基还包含硫酸铁、硫酸锌、氯化锰、氯化钴、硫酸铜和硼酸。
39.根据权利要求27的方法，其中步骤(a)包括接种有效量的所述丝状真菌MK7的浮游细胞。
40.根据权利要求39的方法，其中将体积百分比7.5％的浮游细胞接种到所述人工生长培养基中。
41.根据权利要求27的方法，其中所述生物垫包含三个结构上不同的细胞层。
42.根据权利要求27的方法，其中步骤(b)中生产的所述生物垫包含至少25g干重丝状真菌/升培养基。
43.根据权利要求27的方法，其中步骤(b)中生产的所述生物垫包含至少50g干重丝状真菌/升培养基。
44.根据权利要求27的方法，其中步骤(b)中生产的所述生物垫包含至少125g干重丝状真菌/升培养基。
45.根据权利要求27的方法，其中其中步骤(b)中生产的所述生物垫包含至少180g干重丝状真菌/升培养基。
46.根据权利要求27的方法，其中所述人工生长培养基包含氮源。
47.根据权利要求46的方法，其中所述氮源选自下组：硝酸盐、铵盐、蛋白质、肽、尿素、包含氮的废物流及其组合。
48.根据权利要求27的方法，其中所述人工液体生长培养基包含碳和氮，并且C:N比率是约7.5:1或更小。
49.根据权利要求27的方法，其中所述人工液体生长培养基包含碳和氮，并且C:N比率大于约7.5:1。
50.根据权利要求27的方法，其中所述生物垫具有至少40％的蛋白含量。
51.根据权利要求27的方法，其中所述生物垫具有至少39％的脂质含量。
52.根据权利要求27的方法，其中所述生物垫包含选自下组的氨基酸：色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
53.根据权利要求27的方法，其中所述生物垫包含所有必需氨基酸。
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