KR20180117131A - 사상균 바이오매트, 이의 생산 방법 및 이의 사용 방법 - Google Patents

사상균 바이오매트, 이의 생산 방법 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

조작된 인공 배지를 사용하고 최소한의 가공으로 수확될 수 있고 항생제, 단백질, 및 지질과 같은 진균 생성물이 단리될 수 있는 고밀도 사상균 바이오매트를 생산하는 진균을 성장시키는 새로운 방법이 개시되며, 상기 방법은 에너지 사용, 산소 첨가, 물 사용 및 폐기물 흐름 생산을 위한 진균 배양 비용을 낮춘다.

Description

사상균 바이오매트, 이의 생산 방법 및 이의 사용 방법
본 출원은 자낭균문(Ascomycota), 접합균문(Zygomycota), 담자균문(Basidiomycota), 취균문(Glomermycota), 및 호상균문(Chytridiomycota) 내의 단리된 사상균 균주(filamentous fungal strain), 예컨대 푸사리움(Fusarium) 종, 아스퍼질러스(Aspergillus) 종, 트리코데르마(Tricoderma) 종, 페니실리움(Penicillium) 종, 리조푸스(Rhizopus) 종을 포함하는 털곰팡이목(Mucorales)에 속하는 종, MK7로 명명된 호산성 사상균 균주 및 이들의 자손뿐만 아니라 매우 다양한 유용한 생성물을 생산하는 이러한 진균 균주로부터 사상균 바이오매트를 생산하기 위해 표면 발효를 수행하는 방법에 관한 것이다.
대부분의 진균의 세포는 균사(hyphae)라 불리는 관 모양의 길쭉한 실과 같은 구조로서 성장하며, 균사는 다수의 핵을 함유할 수 있고 끝에서 성장하여 연장된다. 이것은 일련의 세포로 반복적인 세포 분열에 의해 성장하는 사상형 녹조류와 같이 유사하게 보이는 유기체와는 대조적이다.
진균의 생장 단계를 구성하는 균사의 집합체는 균사체(mycelium)라고 불린다. 균사체는 진균의 주요 몸체 또는 형태로 간주될 수 있으며, 종종 사상형인 것으로 기술된다. 성장은 분기 사슬(branching chain)로 성장하는 균사의 무성 생식에 의해 일어난다. 균사체는 토양 또는 목재를 탐색하여, 진균이 버섯, 말굽버섯(bracket), 송로버섯(truffle), 주발버섯(cup), 또는 곰보버섯(morel)과 같은 자실체(예컨대, 담자과)를 생산하고자 하는 경우 필요로 할 음식으로서 상기 기질을 사용할 수 있기 때문에 진균에게 중요하다.
균사체는 살아있는 조직을 죽일 수 있는 세포외 효소를 분비한 다음(사물기생), 그 죽은 물질을 흡수하거나(부생), 이미 죽은 물질을 단순히 흡수하거나(다시 부생), 또는 살아있는 조직을 먹는다(활물기생).
진균계의 모든 문(phyla)이 사상형 종을 포함하는 것으로 여겨지지만, 자낭균문 및 접합균문은 특히 많은 수의 사상형 종을 가지고 있다. 이들 문의 구성원은 단백질, 아미노산, 오일, 약물(예컨대, 페니실린), 식품(예컨대, 템페), 식품 첨가제, 식품 보존제(예컨대, 구연산), 및 산업 효소와 같은 매우 다양한 제품을 만들 뿐만 아니라 빵 굽기, 및 치즈, 맥주, 및 와인의 생산에 사용된다.
최신 고체 기질 발효(SSF)는 많은 분명한 단점이 있다. 예를 들어, 최종 생성물, 즉 생산된 바이오매스는 고체 기질과 단단하게 혼합되어 근본적으로 서로 분리하기 어렵다. 전형적으로, SSF는 저농도의 진균 바이오매스를 생산하고, 매우 낮은 전환율을 가지며, 궁극적으로 저수율을 초래한다. SSF는 효과적인 발효를 위해 특정한 수분 활성이 필요하다. 적절한 양의 수분 활성을 가하고 유지하는 것은 구현하기 어렵고 비용이 많이 든다. SSF 시스템을 통기시키는 것 역시 달성하기 어려우며, 이는 전환 효율을 더욱 악화시키고 시스템 수율을 제한한다. 부적절한 수분 활성뿐만 아니라 열악한 통기는 물질 및 열 전달에 제한을 가하여, 과열 및 산소 공급 결핍을 초래한다. 생성된 바이오매스는 무작위로 배향된 필라멘트(filament)를 갖는 것을 특징으로 하며, 이는 특정 용도, 즉 식품 및/또는 동물 사료에서의 유용성을 크게 제한한다.
푸사리움 베네나툼 사상균의 바이오매스로 주로 구성된 제품인 퀀(Quorn)TM은 상대적으로 영양가 있는 마이코프로틴(mycoprotein)을 제공한다. 퀀TM은 배치 기반의 연속 공정으로 대량 생산이 가능한 최신 액침 발효(submerged fermentation) 시스템에 의해 생산된다. 생산 방법은 상업적으로 실행가능하지만 많은 분명한 단점이 있다. 상업적 요구를 충족시키기 위해, 퀀TM은 각각 3천5백만 달러 내지 4천만 달러의 생물반응기를 사용한다. 퀀TM 시스템은 진균 시스템이 핵심 지표를 넘어 성숙하거나 다른 종에 의해 오염될 때까지 단일 반응기에서 연속적으로 가동된다. 이때, 생산을 중단하고, 반응기와 모든 관련된 배관을 비워 소독하는데, 이 과정은 완료하는데 몇 주가 걸릴 수 있고 상품 공급업체에게 많은 심각한 문제가 된다. 이러한 문제는, 예를 들어, (1) 생산 주기 예측의 어려움, (2) 청소 및 생산 중단에 드는 비용, (3) 재고 관리의 어려움 등이다. 또한, 대형 생물반응기에서의 액침 발효는 통기 및 혼합에 엄청난 양의 에너지를 필요로 한다. 바이오매스가 발효되는 액체로부터 바이오매스를 분리하는 것은 또한 자본 집약적이고 에너지를 요구하는 공정으로 알려진 원심분리를 필요로 한다. 상기 공정은 또한 물 집약적이어서 많은 양의 폐수의 처리가 필요하다. 생산된 바이오매스는 짧은 필라멘트 길이를 갖는 것을 특징으로 하는데, 이는 결합제를 도입하지 않고 식품/사료 제품으로 직접 전환하는 능력 및 효과적으로 관리하기 위한 추가 비용, 어려움 및 노력이 드는 후속 공정 단계를 제한한다.
현재의 사상형 균사체 성장 방법은 많은 단점이 있다. 예를 들어, 진균 성장 및 성장 배지로부터 진균 균사체의 후속 분리에 필요한 적절한 통기 및 장비(예컨대, 원심분리기)를 갖는 설비는, 특히 산업 규모로 진균 성장을 수행하기 위해, 상당한 자본 비용이 필요하다. 현재의 공정은 상당한 에너지와 물 투입이 필요할 뿐만 아니라 많은 폐기물 흐름(waste stream)을 생성한다.
따라서, 사상형 균사체 사상균 바이오매트 형성을 위한 능률적인 접근법이 업계에 요구되고 있다.
본 개시내용은 현재 사용되는 공정의 한계를 극복한다. 본원에서, 사상균 바이오매트(biomat)는 원하는 진균 균주를 통기가 필요없는 새로운 성장 배지에 접종한 후 표면 발효를 통해 생성된다. 이 표면 발효 방법은 다양한 산업에 걸쳐 다양한 제품을 생산할 수 있는 매우 다양한 진균 종에 적용될 수 있다. 개발된 배지는 빠른 세포 성장을 일으키고, 긴 필라멘트를 갖는 고밀도 사상균 바이오매트를 생성하며, 작은 폐기물 흐름을 생성하고, 탄소원, 탄소 대 질소 비율(C:N), 및 공정 매개변수의 함수로서 생산된 사상균 바이오매트를 조작할 수 있게 해 준다. 전반적인 효과는 물 사용, 에너지 사용, 장비 요구사항, 및 탄소 발자국에 의해 측정된 환경 영향을 최소화하면서 높은 생산 속도가 발생하는 것이다.
따라서, 본 발명은 사상균을 배양하고 사상균 바이오매트를 생산할 수 있는 적합한 인공 배지를 제공한다. 인공 배지는 적어도 대량 영양소인 질소(N), 인(P), 칼슘(Ca), 마그네슘(Mg), 탄소(C), 칼륨(K), 황(들), 산소(O), 수소(H) 및 미량 영양소인 철(Fe), 붕소(B), 구리(Cu), 망간(Mn), 몰리브덴(Mo), 및 아연(Zn)을 포함한다. 일부 경우, 미량 영양소에는 하기 추가의 미량 영양소인 크롬(Cr), 셀레늄(Se), 및 바나듐(V)이 추가된다. 인공 배지는 높은 단백질:지질 비율 또는 높은 지질:단백질 비율을 갖는 사상균 바이오매트의 생산을 돕는 다양한 C:N 비율을 갖는다.
또한, 사상균 바이오매트 생산을 위한 다양한 사상균을 배양하는 조건이 제공되며, 이들 중 일부는 호산성이며, 예컨대 푸사리움, 푸시스포리움, 슈도푸사리움, 지베렐라, 스포로트리켈라, 아스퍼질러스, 페니실리움, 트리코데르마의 종 및/또는 균주, 털곰팡이목(Mucorales) 종 내의 종(예컨대, 리조푸스 종) 및 MK7로 명명된 사상균 균주이다. 종 및/또는 균주에 따라, 배양 배지의 pH는 약 0.68 내지 약 8.5 및 일부 경우 10.5까지의 범위이다. 방법의 일 구현예는 하나 이상의 진균 종 및/또는 균주(들)를 인공 배지에 접종하는 단계 및 진균 종 및/또는 균주(들)를 성장시켜 하나 이상의 유용한 생성물을 함유하는 사상형 바이오매스를 생산하는 단계를 포함한다.
생산된 사상균 바이오매트는 표면 발효를 통해 혐기성, 미세호기성, 호기성 조건 또는 이의 조합으로부터 발생한다. 사상균 바이오매트는 분생자(conidia), 소분생자(microconidia), 대분생자(macroconidia), 분생포자각(pycnidia), 후막포자(chlamydospore), 균사, 균사의 파편, 또는 이의 모든 조합의 형태의 진균 종 및/또는 균주 및/또는 이의 자손을 포함한다.
또한, 사상균 바이오매트를 수확하는 방법, 사상균에 의해 생산된 유용한 단백질, 아미노산, 및/또는 지질을 단리 및/또는 정제하는 방법이 제공된다. 이러한 단백질, 아미노산, 및/또는 지질은 식품, 어류 사료, 동물 사료, 오일, 지방산, 약물, 기능식품(nutraceutical), 살진균제, 제초제, 살효모제(yeasticide), 살충제, 바이오윤활유에서 사용될 수 있고, 다른 부가가치 제품으로 전환하기 위한 공급원료로서 사용될 수 있다.
도 1. A, B: 옐로스톤 국립공원의 온천 환경 내의 자연에서의 균주 MK7; C, D: 고밀도, 고 인장 강도 응집성의 순수한 바이오매스를 나타내는, 뚜렷한 인공 조건하에서 생산된 균주 MK7 바이오매스; E: C, D의 균주 MK7 바이오매스의 단면.
도 2. 접종물의 생성에 사용된 예시적인 10 L 생물반응기.
도 3. A: 2세대 아카이브 배양(archive culture)으로부터 수집된 흰색 균사체 매트를 보여주는 루프; B: 균주 MK7 균사체 매트를 갖는 페트리 플레이트.
도 4. 트레이 반응기의 접종에 사용되는 10 L 생물반응기에서 균주 MK7 배양물의 성장 및 pH. 7.5:1의 C:N 비율을 갖는 7.5% 글리세롤 함량의 MK7-1 액체 배지. 접종물로서 사용하기 위한 최적 배양물은 바이오매스가 후기 지수 성장 단계일 때 72시간 내지 90시간(화살표 사이)에 생성된다.
도 5. A: 바이오매트를 생산하기 위한 트레이 반응기로서 사용된 트레이. 트레이 내의 눈금자는 31.75 cm(12.5 인치) 길이이다; B: 39개의 플라스틱 트레이를 수용하기 위해 사용된 트레이 랙 시스템으로 구성된 생물반응기. 전체 반응기는 사란(Saran)®과 같은 투명한 플라스틱 랩으로 싸여 있다.
도 6. 1.5 리터의 MK7-1 배지 및 125 g/L 글리세롤을 갖는 0.25 m2 트레이에서 표면 발효 8일 후 제한된 질소 조건(40:1의 C:N 비율)하에서 고지질 생산을 위해 배양된 수확된 균주 MK 7 바이오매트.
도 7. 바이오매스 축적 속도가 비교적 느린(0-1.5일) 유도기(lag phase), 및 지수 성장이 시작되는 바이오매트 형성 시간(화살표, 1.5일)을 보여주는, 얕은 트레이에서의 균주 MK7의 전형적인 성장 패턴. 7.5% 글리세롤 및 30:1 C:N 비율을 갖는 MK7-1 배지에서 성장한 바이오매트.
도 8. 3개의 크기 범위의 트레이 크기에서 글리세롤 상에서 성장한 균주 MK7 바이오매트의 건조 중량.
도 9. 배양 기간 및 온도의 함수로서 균주 MK7에 의한 리놀렌산 생산. 4% 글리세롤 표면 발효; pH 2.8 및 MK7-1 배지.
도 10. MK7-1 배지 + 글리세롤을 사용하여 생산된 5일된 MK7 바이오매트의 단면의 투과광 현미경 이미지. A, B: 3개의 층: 기균사 층(aerial hyphae layer), 전이 구역 층(transition zone layer), 및 밀집 하부 층(dense bottom layer)을 보여주는 50X 줌; C: 2개의 뚜렷한 층을 보여주는 50X 줌.
도 11. MK7-우레아 배지를 사용하여 생산된 5일된 MK7 바이오매트의 단면 현미경 사진. A: 기균사 및 밀집한 균사체 층으로부터 연장되는 균사체를 나타내는 균주 MK7 바이오매트의 상부 표면. 100X 배율에서 투과광 현미경을 사용하여 생성된 이미지; B: 기균사 및 밀집한 균사체 층으로부터 연장되는 균사체를 나타내는 균주 MK7 바이오매트의 상부 표면. 400X 배율에서 투과광 현미경을 사용하여 생성된 이미지; C: 균사 및 균사체를 나타내는 균주 MK7 바이오매트의 하부 표면. 400X 배율에서 투과광 현미경을 사용하여 생성된 이미지; D: 뒤얽힌 섬유상 조성을 나타내는 균주 MK7 바이오매트의 밀집한 내부. 400X 배율에서 투과광 현미경을 사용하여 생성된 이미지.
도 12. A, B: 5% 글리세롤을 갖는 pH 4.1의 MK-7 배지를 사용하여 6일 동안 0.25 m2 트레이에서 성장한 리조푸스 올리고스포루스의 바이오매트. C: 매트 내의 리조푸스 올리고스포루스 균사의 400x 광학 현미경 이미지.
도 13. A: 4일, 및 B: 6일 후 0.25 m2 트레이 반응기에서 성장한 푸사리움 베네나툼의 이미지. 바이오매트를 pH 5.0 및 12.5% 글리세롤의 MK7-1 배지를 사용하여 성장시켰다. 이미지 C는 광학 현미경을 사용하여 400x 배율로 촬영한 F. 베네나툼의 균사 형태를 보여준다. 이러한 조건하에, F. 베네나툼은 2개의 트레이에 대해 트레이당 평균 71g의 건조 바이오매스를 생산하였다.
도 14. A: <5 g 균주 MK7 건조 중량 바이오매스/L(배지: 공급원료 혼합물)으로 리그노셀룰로오스에 완전히 통합된 균주 MK7을 보여주는 고체 상태 발효(SSF)를 통해 배양된 균주 MK7 바이오매스의 수확. B: 밀짚과 무작위로 통합된 필라멘트를 보여주는 A의 수확된 균주 MK7 바이오매스의 미드로그래프(Midrograph) 이미지. C: 밀집한(180 g.L), 응집성의 본질적으로 순수한 균주 MK7 바이오매스를 보여주는 고체 기질 표면 발효(SSSF)에 의한 균주 MK7 바이오매트.
도 15. 7일 동안 12.7 X 12.7 cm 트레이에서 다양하게 처리한 균주 MK7의 배양. 오차 막대는 3개의 트레이의 표준 편차이다.
도 16. 좌측: 8일 후 pH 2.7에서 12.5% 글리세롤로 배양한 균주 MK7의 광학 현미경 이미지. 우측: 세포 면적의 40-60%에서 예상된 높은 지질 비율을 나타내는 나일 레드 염색 후 형광 이미지.
도 17. 균주 MK7에 의해 생산된 지질 프로파일. (좌측 패널) 배지 C:N 비율의 함수로서 직접 에스테르 교환(총 연료 잠재성) 및 추출가능한 지질 분획에서의 총 지방산 메틸 에스테르(FAME)의 평균(n=3). 추출가능한 지질 분획 막대 내의 막대는 트리-, 디- 및 모노-아실 글리세라이드(TAG, DAG, MAG) 및 유리 지방산(FFA) 성분을 나타낸다. 삽도는 지질 분획에 우세한 TAG 분자를 갖는 GC-FID 크로마토그램을 보여준다. (우측 패널) 모든 지방산의 FAME로의 직접 에스테르 교환에 의해 생성된 FAME 프로파일(직접), 및 추출가능한 지질 전구체로부터만 유래된 FAME(추출가능한). 삽도는 직접 및 추출가능한 분획에 대한 GC-MS 크로마토그램을 보여준다.
도 18. 4.8의 초기 pH에서 산 유청 대리 배지(Acid Whey Surrogate, AWS)에서 7일 성장 후 균주 MK7 바이오매트(A, B, C). 물질의 사상형 특성을 보여주는 바이오매트(C)의 투과광 현미경 이미지(400X).
정의
본원에 사용된 바와 같이, 동사 "포함하다," 및 그의 활용형은 상기 단어 다음의 항목이 포함되지만 구체적으로 언급되지 않은 항목은 제외되지 않는다는 것을 의미하기 위해 비제한적인 의미로 본 설명 및 청구범위에서 사용된다. 또한, 부정관사 "a" 또는 "an"에 의한 요소의 언급은, 문맥이 요소 중 하나 및 하나만이 존재하는 것을 명확하게 요구하지 않는 한, 둘 이상의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 부정관사 "a" 또는 "an"은 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유래된"은 원천의 기원을 지칭하며, 자연 발생, 재조합, 정제되지 않은, 또는 정제된 분자를 포함할 수 있다. 특정한 단리된 진균 균주 및/또는 그의 자손으로부터 유래된 진균은 특정 돌연변이를 포함할 수 있지만 그것이 유래된 단리된 진균 또는 그의 자손의 구별되는 형태학적 및 생리학적 특징 중 하나, 둘 또는 그 이상, 또는 모두를 여전히 보유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "호산성"은 최적 성장 조건이 산성 조건하에 있는 유기체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공급원료"는 연료로서 직접 사용될 수 있거나 다른 형태의 연료 또는 에너지 생성물로 전환될 수 있는 임의의 재생가능한 생물학적 물질을 지칭한다. 바이오매스 공급원료는 에탄올, 부탄올, 바이오디젤, 및 다른 탄화수소 연료와 같은 연료를 얻는데 사용되는 식물 및 조류 물질이다.
본원에 사용된 바와 같이, 문구 "리그노셀룰로오스 공급원료"는 리그노셀룰로오스를 함유하는 공급원료를 지칭한다. 리그노셀룰로오스 공급원료의 비제한적인 예는 농작물 잔류물(예컨대, 밀짚, 보리짚, 볏짚, 작은 곡물 짚, 옥수수 대, 옥수수 섬유(예컨대, 옥수수 섬유 검(CFG), 주정박(DDG), 옥수수 글루텐 박(CGM)), 목적을 가지고 재배한 풀 작물, 에너지 작물, 스위치그라스, 알팔파 건초(hay-alfalfa), 사탕수수 찌꺼기(sugarcane bagasse)), 옥수수 침지액, 사탕무 펄프 비농업 바이오매스(예컨대, 조류 매트, 도시 나무 잔류물), 옥수수 침지액, 사탕무 펄프, 임산물 및 산업 잔류물(예컨대, 침엽수 1차/2차 분쇄 잔류물, 경질 침엽수 1차/2차 분쇄 잔류물, 재생 종이 펄프 슬러지), 리그노셀룰로오스 함유 폐기물(예컨대, 신문용지, 폐지, 양조 곡물, 도시 유기 폐기물, 정원 폐기물, 임상 유기 폐기물, 바이오연료 생산 중에 발생한 폐기물(예컨대, 가공 조류 바이오매스, 글리세롤, 셀룰로오스 에탄올 생산으로부터의 잔류물, 바이오디젤 생산으로부터의 고체 잔류물), 및 이의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 달리 명시하지 않는 한, 용어 "탄수화물"은 적어도 2개의 하이드록실기와 조합된 알데히드 또는 케톤기를 함유하는 탄소, 수소, 및 산소의 화합물을 지칭한다. 본 발명의 탄수화물은 또한 하나 이상의 위치에서 임의로 치환되거나 산소가 제거될 수 있다. 따라서, 탄수화물은 치환된 및 비치환된 단당류, 이당류, 올리고당류, 및 다당류를 포함한다. 당류는 알도스 또는 케토스일 수 있고, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 탄소를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 이들은 단당류이다. 또 다른 구현예에서 피라노스 및 푸라노스 당일 수 있다. 이들은 임의의 상응하는 C-위치에서 임의로 산소가 제거될 수 있고/있거나 수소, 할로, 할로알킬, 카르복실, 아실, 아실옥시, 아미노, 아미도, 카르복실 유도체, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 티올, 이민, 설포닐, 설파닐, 설피닐, 설파모일, 에스테르, 카르복실산, 아미드, 포스포닐, 포스피닐, 포스포릴, 티오에스테르, 티오에테르, 옥심, 히드라진, 카르바메이트와 같은 하나 이상의 모이어티로 치환될 수 있다. 이러한 당류 단위는 임의의 순서로 배열될 수 있고, 2개의 당류 단위 사이의 연결은 약 10개의 상이한 방식으로 일어날 수 있다. 그 결과, 상이한 가능한 입체이성질체 올리고당 사슬의 수는 엄청나다. 일 구현예에서, 상기 탄수화물은 단당류, 이당류, 올리고당류, 다당류, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단당류"는 3-탄소 당(트리오스), 4-탄소 당(테트로스), 5-탄소 당(펜토스), 6-탄소 당(헥소스) 등, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 당 단량체를 지칭한다. 일 구현예에서, 5-탄소 당은 케토펜토스(예컨대, 리불로스, 자일룰로스), 알도펜토스(리보스, 아라비노스, 자일로스, 릭소스), 데옥시 당(데옥시리보스), 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 6-탄소 당은 알도헥소스(예컨대, 알로스, 알트로스, 글루코스, 만노스, 이도스, 갈락토스, 탈로스), 사이클릭 헤미아세탈, 케토헥소스(예컨대, 사이코스, 프럭토스, 소르보스, 타가토스)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 상기 단당류는 트리오스, 테트로스, 펜토스, 헥소스, 헵토스 등, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 단당류는 선형 형태이며; 또 다른 구현예에서, 단당류는 고리 형태이다.
본원에 사용된 바와 같이, 문구 "발효가능한 당"은 유용한 부가가치 발효 생성물로 전환될 수 있는 당 화합물을 지칭하며, 유용한 부가가치 발효 생성물의 비제한적인 예는 아미노산, 단백질, 당, 탄수화물, 지질, 핵산, 폴리케타이드, 비타민, 의약품, 동물 사료 보충제, 특수 화학제품, 화학적 공급원료, 플라스틱, 용매, 연료, 또는 다른 유기 중합체, 젖산, 및 에탄올을 포함한다. 개시된 방법에 의해 생산될 수 있는 특정 부가가치 생성물은 비제한적으로, β-글루칸, 젖산; 특수 화학제품; 유기산, 예컨대 구연산, 석신산 및 말레산; 용매; 어류 사료 및 동물 사료 보충제; 의약품; 비타민; 아미노산, 예컨대 리신, 메티오닌, 트립토판, 트레오닌, 카로티노이드, 인간 식품, 기능식품, 및 아스파트산; 산업 효소, 예컨대 프로테아제, 셀룰라아제, 아밀라아제, 글루카나아제, 락타아제, 리파아제, 리아제, 산화환원효소, 전이효소 및 자일라나아제; 및 화학적 공급원료를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "진균(fungus, fungi)"은 흡수 영양을 갖고 엽록소가 결여된 진핵 유기체의 뚜렷한 군을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "산성화 물질"은 용매(예컨대, 물)에 첨가될 때, 순수한 용매(예컨대, 물)보다 더 큰 수소 이온 활성을 갖는 용액을 제공하는 임의의 물질, 화학적 화합물, 제제, 및/또는 조성물을 지칭한다. 물질은 기체, 액체, 또는 고체 형태일 수 있다. 물질은 유기 및/또는 무기일 수 있다. 산성화 물질의 비제한적인 예는 할로겐화 수소 및 이의 용액(예컨대, 염산(HCl), 브롬화수소산(HBr), 및 요오드화수소산(HI)), 할로겐 옥소산(예컨대, 차아염소산, 염소산, 과염소산, 과요오드산 및 브롬 및 요오드에 상응하는 화합물), 황산(H2SO4), 플루오로황산, 질산(HNO3), 인산(H3PO4), 플루오로안티몬산, 플루오로붕산, 헥사플루오로인산, 크롬산(H2CrO4), 설폰산, 메탄설폰산(메실산으로도 알려짐, MeSO3H), 에탄설폰산(에실산으로도 알려짐, EtSO3H), 벤젠설폰산(베실산으로도 알려짐, C6H5SO3H), p-톨루엔설폰산(토실산으로도 알려짐, CH3C6H4SO3H), 트리플루오로메탄설폰산(트리플릭산으로도 알려짐, CF3SO3H), 카르복실산(예컨대, 아세트산, 구연산, 포름산, 글루콘산, 젖산, 옥살산, 타르타르산, 비닐족 카르복실산(예컨대, 아스코브산, 멜드럼산(meldrum's acid)), 산 염(예컨대, 탄산수소나트륨(NaHCO3), 황산수소나트륨(NaHS), 중황산나트륨(NaHSO4), 제일인산나트륨(NaH2PO4), 및 제이인산나트륨(Na2HPO4))을 포함하는 임의의 물질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "중화시키다," "중화시키는," 및 "중화"는 산 및 염기가 반응하여 물과 염을 형성하고, 용액의 pH가 초기 pH로 되돌아가는 수용액에서의 화학적 반응을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "망간 공여체"는 수용액에서 망간 이온(예컨대, 망간 (I), 망간 (II), 및 망간 (III))을 제공할 수 있는 조성물 또는 화합물을 지칭한다. 망간 공여체의 비제한적인 예는 Mn2(CO)10, K5Mn(CN)6NO, MnCl, MnF2, MnBr2, MnO, MnO2, MnCh, MnF3, MnBr3, MnCO3, Mn(CH3COO)2, C6H9MnO6, MnTiO3, [CH3COCH=C(O)CH3]2Mn, [C6H11(CH2)3CO2]2Mn, (HCO2)2Mn, Mn(C5HF6O2)2, Mn(PH2O2)2, MnI, (C3H5O3)2Mn, MnMoO4, Mn(NO3)2, Mn(ClO4)2, C32H16MnN8, MnSO4, (CH3COO)3Mn, C32H16ClMnN8, C48H28ClMnN4O8, C5H4CH3Mn(CO3), Mn(C5H4C2H5)2, 및 C16H22Mn을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "pH 완충 물질"은 액체 혼합물에 첨가될 때, 상기 액체 혼합물의 pH를 유지할 수 있는 조성물을 지칭하며, pH는 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4, 약 2.5, 약 2.6, 약 2.7, 약 2.8, 약 2.9, 약 3.0, 약 3.1, 약 3.2, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9, 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0으로 유지된다. 예를 들어, 액체 혼합물의 pH는 약 0.5 내지 약 3.0의 범위이다. 사상형 호산성 MK7 균주에 대한 바람직한 pH는 약 2.2 내지 약 3.0이다. 이러한 조성물은 산, 산 염, 염기성 및 염기성 염, 예를 들어, HCl, H2NO3, H2SO4, NaHCO3, NaHS, NaHSO4, NaH2PO4, Na2HPO4, NaHSO3, KHCO3, KHS, KHSO4, KH2PO4, K2HPO4, KHSO3. NaOH, KOH, Mg(OH)2, Na2CO3, K2CO3, KHCO3, CaCO3, MgCO3, Na2S, K2S 등과 같은 화합물을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "호기성 조건"은 충분한 산소가 공급되고, 이러한 조건하에 성장하는 미생물에서의 혐기성 호흡이 금지되며 혐기성 대사 경로가 억제되어 혐기성 호흡을 방지하는 조건을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "미세호기성"은 산소의 공급이 제한되지만, 유기체에서의 세포 호흡이 우세하게 호기성 호흡인 조건을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "지방산"은 하나의 말단에 메틸기를 갖고 다른 말단에 카르복실산을 갖는 장쇄 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단리된 진균"은 천연 공급원으로부터 수득된 진균 집단을 포함하는 임의의 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "탄소원"은 일반적으로 원핵 또는 진핵 세포 성장을 위한 탄소의 공급원으로서 사용하기에 적합한 물질을 지칭한다. 탄소원은, 비제한적으로, 바이오매스 가수분해물, 산 유청, 스위트 유청, 탄수화물(예컨대, 전분, 수크로스, 다당류, 및 단당류), 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 자일로스, 및 리그닌뿐만 아니라 이들 기질의 단량체 성분 및/또는 이의 조합을 포함한다. 탄소원은, 비제한적으로 중합체, 탄수화물, 산, 알코올, 알데히드, 케톤, 아미노산, 펩타이드 등을 포함하는, 다양한 형태의 다양한 유기 화합물을 포함할 수 있다. 이들은, 예를 들어, 다양한 단당류, 예컨대 글루코스, 덱스트로스(D-글루코스), 말토오스, 올리고당류, 다당류, 포화 또는 불포화 지방산, 석시네이트, 락테이트, 아세테이트, 에탄올 등, 또는 이의 혼합물을 포함한다. 탄소원은 또한 사탕무 펄프와 같은 공급원료 또는 리그노셀룰로오스 공급원료일 수 있다. 광합성 유기체는 광합성의 산물로서 탄소원을 추가로 생산할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생체촉매"는 반응의 활성화 에너지를 낮춤으로써 화학적 반응을 가속화하고 공정에서 소비되지 않거나 변경되지 않는 임의의 유형의 살아있는 시스템 또는 세포를 지칭한다. 생체촉매는, 비제한적으로, 효모, 진균, 세균, 및 고세균과 같은 미생물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단리된 진균 종 및/또는 균주(들)는 단백질 및 지질의 생산에서, 또는 단백질 및 지질의 생산을 위한 탄소 기질 또는 유기 분자의 분해에서 생체촉매로서 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발효" 또는 "발효 공정"은 유기체 또는 생체촉매가 탄소원 및 영양소와 같은 원료를 함유하는 배양 배지에서 배양되는 공정을 지칭하며, 여기서 유기체 또는 생체촉매는 상기 원료를 생성물로 전환시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바이오매스"는 살아있는, 또는 최근에 살아있는 유기체로부터 유래된 생물학적 물질, 예컨대, 녹색 식물의 줄기, 잎, 및 전분 함유 부분, 또는 목재, 폐기물, 산림 잔류물(죽은 나무, 가지 및 나무 그루터기), 정원을 절단한 것, 목재 칩, 또는 조류 또는 동물로부터 유래된 물질 및/또는 산업 부산물 및 폐기물 흐름, 식품 폐기물/찌꺼기, 및 다른 기타 당을 지칭한다. 일부 경우, 바이오매스는 상당 부분의 단백질 및/또는 지질을 함유한다. 다른 경우, 바이오매스는 주로 전분, 리그닌, 펙틴, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 및/또는 펙틴으로 구성된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "셀룰로오스 바이오매스"는 사람이 먹을 수 없거나 거의 먹을 수 없고 중요한 성분으로서 셀룰로오스를 갖는 식물 섬유로 주로 구성된 바이오매스를 지칭한다. 상기 섬유는 가수분해되어 미생물에 의해 발효될 수 있는 다양한 당을 생성할 수 있다. 셀룰로오스 바이오매스의 예는 풀, 목재, 및 농업 또는 임산물 산업으로부터 비롯되는 셀룰로오스가 풍부한 잔류물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "사상형 바이오매트," 및 "사상균 바이오매트"는 상호교환적으로 사용되며, 사상균에 의해 생산되고 사상균을 함유하는 바이오매트를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전분"은 소화 효소, 예컨대, 아밀라아제에 의해 쉽게 가수분해되는 글루코스의 중합체를 지칭한다. 전분은 일반적으로 감자, 옥수수 알갱이, 쌀알, 밀알, 및 사탕수수 줄기와 같은 식물의 특수 부위에 농축되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "리그닌"은 식물에서 구조적 견고성의 기초를 형성하는 p-쿠마릴 알코올, 코니페릴 알코올, 및 시나필 알코올과 같은 연결된 페놀계 단량체 화합물로 주로 구성된 중합체 물질을 지칭하며, 종종 식물의 목재 부분으로 언급된다. 리그닌은 또한 식물의 세포벽의 비탄수화물 부분인 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "셀룰로오스"는 리그닌 및 임의의 헤미셀룰로오스와 조합되어 식물 세포벽에서 일반적으로 발견되는, 베타-글루코스의 장쇄 중합체 다당류 탄수화물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "헤미셀룰로오스"는 몇 가지 헤테로중합체 중 어느 것일 수 있는 식물 세포벽 다당류의 부류를 지칭한다. 이들은 자일란, 자일로글루칸, 아라비녹실란, 아라비노갈락탄, 글루쿠로녹실란, 루코만난 및 갈락토만난을 포함한다. 헤미셀룰로오스의 단량체 성분은, 비제한적으로: D-갈락토스, L-갈락토스, D-만노스, L-람노스, L-푸코스, D-자일로스, L-아라비노스, 및 D-글루쿠론산을 포함한다. 이 부류의 다당류는 셀룰로오스와 함께 거의 모든 세포벽에서 발견된다. 헤미셀룰로오스는 셀룰로오스보다 중량이 적고 온수 또는 킬레이트화제에 의해 추출될 수 없지만, 수성 알칼리에 의해 추출될 수 있다. 헤미셀룰로오스의 중합체 사슬은 대부분의 식물 세포의 세포벽을 형성하는 가교결합 섬유의 네트워크에서 펙틴 및 셀룰로오스에 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "펙틴"은 산 및 킬레이트화제로 처리하여 추출될 수 있는 식물 세포벽 이종 다당류의 부류를 지칭한다. 전형적으로, 펙틴의 70-80%는 α-(1-4)-연결된 D-갈락투론산 단량체의 선형 사슬로서 발견된다. 펙틴의 더 작은 RG-I 분획은 교대하는 (1-4)-연결된 갈락투론산 및 (1-2)-연결된 L-람노스로 구성되며, 람노스 잔기에서 나오는 실질적인 아라비노갈락탄 분지를 갖는다. 다른 단당류, 예컨대 D-푸코스, D-자일로스, 아피오스, 아세트산, Kdo, Dha, 2-O-메틸-D-푸코스, 및 2-O-메틸-D-자일로스는 RG-II 펙틴 분획(<2%)에서 발견되거나, 또는 RG-I 분획에서 미량 성분으로서 발견된다. D-갈락투론산과 관련하여 각각의 단당류의 비율은 개별 식물 및 그의 미세환경, 종, 및 성장 주기 동안의 시간에 따라 다양하다. 동일한 이유로, 호모갈락투로난 및 RG-I 분획은 GalA 잔기 상의 메틸 에스테르의 함량, 및 GalA 및 중성 당의 C-2 및 C-3 위치 상의 아세틸 잔기 에스테르의 함량이 광범위하게 상이할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "통성 혐기성 유기체(facultative anaerobic organism)" 또는 "통성 혐기성 미생물" 또는 "통성 혐기성 생체촉매"는 본 발명에서 단리된 진균 균주와 같이, 산소의 존재 또는 부존재하에 성장할 수 있는 유기체로서 정의된다.
본원에 사용된 바와 같이, DDG로 약칭된 용어 "주정박(distillers dried grains)"은, 일반적으로 소비되지 않은 공급원료 고체, 잔류 영양소, 단백질, 섬유, 및 오일뿐만 아니라 생체촉매 세포 부스러기로 구성된, 발효 후 남은 고체를 지칭한다. 용어는 또한 발효로부터의 가용성 잔류 물질을 포함할 수 있고 이후 "주정잔액박(distillers dried grains and soluble)"(DDGS)으로 불린다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "영양소"는 유기체 또는 생체촉매가 성장하고 생존하는데 사용되는 화학적 화합물로서 정의된다. 예로서, 영양소는 탄수화물 및 아미노산과 같은 유기 화합물 또는 금속 염과 같은 무기 화합물일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "복합 영양소"는 단백질, DNA, 지질, 및 탄수화물의 생산을 위해 유기체 또는 생체촉매에 의해 사용되는 주로 단량체 유기 화합물을 함유하는 영양원으로 정의된다. 용어 "풍부한 영양소"는 용어 복합 영양소와 상호교환적으로 사용된다. 전형적으로, 복합 영양소 또는 풍부한 영양소는 도살장 폐기물(들), 낙농 폐기물(들), 또는 농업 잔류물과 같은 생물학적 물질로부터 유래된다. 복합 영양소 또는 풍부한 영양소는, 비제한적으로 효모 추출물, 트립톤, 펩톤, 콩 추출물, 옥수수 침지액, 콩 단백질, 및 카세인을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "호기성 대사"는 탄수화물로부터 전형적으로 ATP의 형태로 에너지를 만들기 위해 산소가 사용되는 생화학적 공정을 지칭한다. 전형적인 호기성 대사는 해당 및 TCA 주기를 통해 발생하며, 여기서 단일 글루코스 분자는 산소의 존재하에 이산화탄소로 완전히 대사된다.
본원에 사용된 바와 같이, 문구 "혐기성 대사"는 산소가 NADH에 함유된 전자의 최종 수용체가 아닌 생화학적 공정을 지칭한다. 혐기성 대사는 산소 이외의 화합물이 말단 전자 수용체로서의 역할을 하는 혐기성 호흡, 및 NADH로부터의 전자가 "발효 경로"를 통해 환원된 생성물을 생성하는데 이용되는 발효로 나뉠 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "미생물학적 발효"는 유기 물질이 미생물에 의해 분해되고 생성물로 재조립되는 공정을 지칭한다. 상기 물질은, 비제한적으로, 글루코스, 수크로스, 글리세롤, 전분, 말토덱스트린, 락토오스, 지방, 탄화수소, 단백질, 암모니아, 질산염, 및 인 공급원을 포함할 수 있다. 상기 생성물은, 비제한적으로, 특수 제품(비제한적으로, 마이코프로틴 재품, 콩 제품, 템페, 등 포함), 전통 제품(비제한적으로, 빵, 맥주, 와인, 주류, 치즈, 유제품, 발효육 및 야채, 버섯, 간장 및 식초 포함), 농산물(비제한적으로, 지베렐린, 살진균제, 살충제, 사일리지, 아미노산, 예컨대 L-글루타민, L-리신, L-트립토판, L-트레오닌, L-아스파틱 (+), L-아릴글리신 포함), 효소(비제한적으로, 탄수화물, 셀룰로오스,리파아제, 펙티나아제, 프로테아제 포함), 연료 및 화학적 공급원료(비제한적으로, 아세톤, 부탄올, 부탄디올, 이소프로판올, 에틸 알코올, 글리세롤, 메탄, 글리세롤, 부티르산, 메탄, 구연산, 푸말산, 젖산, 프로피온산, 석신산, 및 L-글루타르산 또는 이들 산 중 어느 것의 염 포함), 뉴클레오타이드, 유기산, 의약품 및 관련 화합물(비제한적으로, 알칼로이드, 항생제, 호르몬, 면역저해제, 인터페론, 스테로이드, 백신, 비타민 포함) 및 중합체(비제한적으로, 알긴산염, 덱스트란, 젤란, 폴리하이드록시부티레이트, 스클레로글루칸 및 잔탄 포함)를 포함할 수 있다. 발효에 사용되는 미생물은 원핵 미생물(세균, 시아노세균 포함) 및 진핵 미생물(효모, 진균 및 조류 포함) 모두를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 문구 "에너지 작물"은 바이오연료를 제조하는데 사용된 저비용 및 저유지 수확물로서 성장하거나, 또는 그의 에너지 함량을 위해 직접 개발된 식물을 지칭한다. 상업적인 에너지 작물은 전형적으로 조밀하게 심어져 고수율 작물 종을 생성하며, 에너지 작물은 연소되어 전력을 생성할 것이다. 윌로우(Willow) 또는 포플러(Poplar)와 같은 목재 작물뿐만 아니라 억새속(Miscanthus) 및 펜니세툼 푸르푸레움(Pennisetum purpureum)(코끼리 풀로도 알려짐)과 같은 열대 풀이 널리 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표면 발효"는 사용된 미생물이 어떠한 추가 지지 없이 발효 배지의 표면에서 성장하는 발효를 지칭한다. 배지는 전형적으로 자유 유동성 수성 배지이다. 이론에 구속되지 않으면서, 사상형 바이오매트는 호기성, 미세호기성 및/또는 혐기성 대사의 일부 조합으로부터 비롯되는 것으로 생각된다. 예를 들어, 바이오매트의 표면은 호기성 호흡에 의존하는 것으로 생각되는 반면 바이오매트의 하부는 미세호기성 내지 매우 혐기성일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "고체 기질 표면 발효"는 사용된 미생물이 발효 배지에 액침된 고체에 의해 공급된 탄소 및 영양소를 사용하여 발효 배지의 표면에서 성장하는 발효를 지칭한다. 일부 구현예에서, 바이오매트의 일부가 부분적으로 액침될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "액침 발효"는 사용된 미생물이 발효 배지 내에서 액침 상태로 성장하는 발효를 지칭한다. 페니실린 액침 발효 기술과 같은 많은 발효가 이 범주에 속한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "고체 상태 발효"는 목적을 위해 선택된 고체 지지체 상에서 성장한 미생물의 배양을 지칭한다. 예를 들어, 쌀 또는 밀기울과 같은 고체 배양 기질을 미생물을 시딩한 후 평판 위에 놓은 다음, 기질을 온도 조절된 방에 며칠 동안 방치한다. 고체 상태 발효는 낮은 수분 수준(감소된 수분 활성)을 갖는 배양 기질을 사용한다. 배지(예컨대 쌀 또는 밀기울)는 물로 포화되지만, 거의 자유 유동하지 않는다. 고체 배지는 발효가 일어나는 기질 및 고체 지지체 모두를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능식품(neutraceutical)"은 건강 또는 의약적 이익을 갖는 물질을 지칭한다. 일부 경우, 기능식품은 식이요법을 보충할 뿐만 아니라 질병 및/또는 장애의 예방 및/또는 치료에 도움을 준다. 용어 "기능식품"은 의학 혁신 재단(FIM)의 설립자이자 회장인 Stepen DeFelice, MD에 의해 1989년에 "영양" 및 "의약품"으로부터 만들어졌다.
본원에 사용된 바와 같이, "자손"은 어떻게 또는 무엇이 생산되든 간에 균주로부터 기인한 혈통에 의한 모든 후손을 지칭한다. 단리된/기탁된 균주 및 그의 자손의 모든 돌연변이체가 본원에 사용된 바와 같은 "자손"의 정의에 포함되며, 이러한 돌연변이체는 단리된/기탁된 균주 및 그의 자손의 생리학적 및/또는 형태학적 특징 중 적어도 하나를 갖는다.
사상균 바이오매트의 성장을 위한 인공 배지
인공 배지가 사상균 바이오매트를 생산하는데 사용된다. 인공 배지는 자연에서 발견되는 것과 비교하여 증가된 세포 주기 시간(즉, 증가된 성장 속도)에 필요한 영양소를 제공하며 세포 밀도를 증가시킨다. 인공 배지는 대량 영양소인 질소(N), 인(P), 칼슘(Ca), 마그네슘(Mg), 탄소(C), 칼륨(K), 황(들)을 적어도 포함한다. 철(Fe), 붕소(B), 크롬(Cr), 구리(Cu), 셀레늄(Se), 망간(Mn), 몰리브덴(Mo), 바나듐(V), 및 아연(Zn)과 같은 미량 영양소가 또한 탄소원을 보충하기 위해 배지에 첨가될 수 있다. 리그노셀룰로오스 공급원료, 스위트 유청, 및/또는 산 유청과 같은 탄소원은 전형적으로 충분한 미량 영양소를 제공하므로 추가의 미량 영양소가 필요하지 않다.
추가의 영양소 첨가물이 인공 배지에 첨가될 수 있다. 그 예는 탄수화물(예컨대, 단당류, 다당류), 아미노산 공여체(예컨대, 아미노산, 폴리펩타이드), 및 이의 조합이다. 또한, 리그노셀룰로오스 탄소원의 전처리를 용이하게 할 수 있는 화합물이 또한 인공 배지에 첨가될 수 있다. 이러한 화합물은, 비제한적으로, 산성화 물질, 망간 공여체, 영양소, 및 pH 완충 물질을 포함한다.
인공 배지는 액체 함침 고체, 액체, 또는 겔의 형태일 수 있다. 인공 배지는 또한 고체 탄소 기질, 예컨대 리그노셀룰로오스 공급원료 또는 다른 고체 탄소 기질을 덮는 액체의 형태일 수 있다. 여기서, 고체 기질은 액체의 표면 아래에 액침되어, 바이오매트가 액침 고체로부터 유래된 탄소를 사용하여 액체의 표면 상에서 성장하며, 이는 고체 기질 표면 발효(SSSF)로서 알려진 공정이다. 진균으로부터 분비된 세포외 효소는 고체 탄소 기질을 분해하여, 바이오매트/물 경계면에서 또는 그 부근에서 바이오매트에 의해 흡수될 수 있는 가용성 탄소를 방출한다. 생성된 바이오매트는 액침된 고체 기질 위의 액체 층에 매트를 형성한다. 일반적으로, 액침된 탄소원 위의 액체 층은 약 0.01-1.0 cm 깊이여야 한다. 너무 적은 액체는 매트를 형성하지 않고 고체 상태 발효 및/또는 액침 발효가 뒤따른다. 너무 많은 액체는 비효율적인 전환 및 하락한 바이오매트 성장 주기를 초래한다.
인공 배지를 위한 탄소원으로 사용될 수 있는 물질은 매우 다양하다. 이들은 당(예컨대, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 트레할로스, 수크로스, 아라비노스, 만노스, 자일로스, 프럭토스 등), 글리세롤, 전분, 탄수화물, 글리세롤, 유청, 리그노셀룰로오스 공급원료, 폐기물 흐름(들)(예컨대, 산 유청) 및 이의 조합을 포함한다. 적합한 리그노셀룰로오스 공급원료는, 예를 들어, 스위치그라스, 에너지 작물, 산림 활엽수 및 다른 생성물, 양조업자가 사용한 곡물, 밀짚, 풀, 잎, AFEX 작물 잔류물, 혐기성 소화액, 농작물 잔류물(예컨대, 보리짚, 볏짚, 작은 곡물 짚, 옥수수 대, 옥수수 섬유(예컨대, 옥수수 섬유 검(CFG), 주정박(DDG), 옥수수 글루텐 박(CGM)), 알팔파 건초(hay-alfalfa), 사탕수수 찌꺼기(sugarcane bagasse), 비농업 바이오매스(예컨대, 조류 매트, 도시 나무 잔류물), 산업 잔류물(예컨대, 침엽수 1차/2차 분쇄 잔류물, 경질 침엽수, 1차/2차 분쇄 잔류물, 재생 종이, 펄프 슬러지), 리그노셀룰로오스 함유 폐기물(예컨대, 신문용지, 폐지, 양조 곡물, 도시 유기 폐기물, 정원 폐기물), 임상 유기 폐기물, 바이오연료 생산 중에 발생한 폐기물(예컨대, 가공 조류 바이오매스, 셀룰로오스 에탄올 생산으로부터의 잔류물, 바이오디젤 생산으로부터의 고체 잔류물), 및 이의 조합을 포함한다. 적합한 폐기물 흐름(들은) 농업 폐기물, 도시 유기 폐기물, 바이오연료 생산으로부터의 폐기물(예컨대, 셀룰로오스 에탄올 생산 잔류물), 조류 바이오매스, 양조업자가 사용한 곡물 및/또는 폐기물 흐름(예컨대, 당밀, 옥수수 시럽 등), 산업폐기물(예컨대, 페놀과 다른 방향족과 같은 유기 분자) 및 섬유, 예컨대 베타-글루칸, 셀룰로오스, 키틴, 헤미셀룰로오스 및 폴리덱스트로스, 단당류, 이당류, 올리고당류, 다당류, 및 이의 임의의 조합을 포함한다. 단당류는 트리오스, 테트로스, 펜토스, 헥소스, 헵토스 등, 및 이의 모든 조합을 포함하고, 펜토스는 리불로스, 자일룰로스, 리보스, 아라비노스, 자일로스, 릭소스, 데옥시리보스, 및 이의 모든 조합을 포함하는 반면, 헥소스는 알로스, 알트로스, 글루코스, 만노스, 글루코스, 이도스, 갈락토스, 탈로스, 프시코스, 프럭토스, 소르보스, 타가토스, 및 이의 모든 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이당류는 수크로스, 락토스, 말토오스, 및 이의 모든 조합을 포함하는 반면, 다당류는 전분, 글리코겐, 셀룰로오스, 키틴, 및 이의 모든 조합을 포함한다.
단리된 진균 균주를 성장시키는데 사용되는 탄소원은 탄소원의 건조 중량의 약 5% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 95%, 약 20% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 85%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 75%, 또는 약 60% 내지 약 70%의 양의 셀룰로오스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 셀룰로오스 탄소원은 탄소원의 건조 중량의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%의 양의 셀룰로오스를 포함한다. 다른 경우에, 단리된 진균 균주를 성장시키는데 사용된 셀룰로오스 탄소원은 약 1 중량% 내지 약 50 중량%, 약 5 중량% 내지 약 40 중량%, 또는 약 10 중량% 내지 약 30 중량%의 리그닌, 헤미셀룰로오스, 또는 이의 조합으로부터 선택된 성분을 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 미생물을 성장시키는데 사용된 셀룰로오스 탄소원은 적어도 약 1 중량%, 적어도 약 5 중량%, 적어도 약 10 중량%, 적어도 약 20 중량%, 또는 적어도 약 30 중량%의 리그닌, 헤미셀룰로오스, 또는 이의 조합으로부터 선택된 성분을 포함한다.
적합한 질소원은 우레아, 질산암모늄(NH4NO3), 황산암모늄(NH4SO4), 질산염(예컨대, KNO3), 암모니아 염(즉, NH4SO4) 및 유기 N(예컨대, 단백질, 펩타이드), 질소가 높은 산업 폐기물 흐름, 옥수수 침지액, 및 이의 조합을 포함한다. 순수한 우레아 질소원을 이용하여 제조된 인공 배지는 우레아 및 질산암모늄의 조합으로 제조된 인공 배지보다 약 25% 더 빠른 사상균의 성장을 제공한다(즉, 각각 70 g/m2/일 대 52 g/m2/일). 우레아 및 질산암모늄의 조합이 또한 사용될 수 있다. 황산암모늄이 유일한 질소원으로서 사용될 때 우레아 단독 또는 우레아 조합으로 생산된 것보다 훨씬 느리긴 하지만 성장이 일어난다. 질산암모늄 단독이 또한 사용될 수 있지만, 이 질소원은 다시 우레아의 조합에서 관찰된 격렬한 성장을 일으키지 않는다.
인공 배지 내의 탄소 대 질소 비율(C:N)의 조작은 진균 종 및/또는 균주(들)에 의해 생산된 바이오매트의 조성에 유의한 영향을 미친다. 전형적으로, 낮은 C:N 비율, 예컨대 7.5:1 이하의 C:N 비율은 지질과 비교하여 단백질 및 아미노산의 생산을 촉진한다. 반면, 7.5:1을 초과하는 C:N 비율은 단백질과 비교하여 지질의 생산을 촉진한다. 때로는 지질 형성은 인공 배지가 적어도 10:1, 15:1, 20:1, 26:1, 30:1, 40:1, 또는 50:1의 C:N 비율을 가질 때 특히 촉진된다.
인공 배지의 pH는 원하는 생성물 및 사용된 진균 종 및/또는 균주(들)에 기초하여 결정된다. 푸시스포리움, 슈도푸사리움, 지베렐라, 스포로트리켈라, 아스퍼질러스, 페니실리움, 트리코데르마, 털곰팡이목(Mucorales) 종 내의 종(예컨대, 리조푸스 종), MK7로 명명된 단리된 사상형 호산성 진균 균주, 및 이의 조합, 고지질 생산은 pH 범위 2.0 - 7.0 및 최적으로 3.5 미만의 pH에서 발생한다. 높은 단백질 생산은, C:N 비율의 함수로서 주로 영향을 받지만, 적어도 2.7의 pH 및 바람직하게는 4.5 내지 5.5의 pH를 필요로 한다.
단리된 진균 종 및/또는 균주를 포함하는 배양물 및 조성물
본 발명은 단리된 진균 종 및/또는 균주의 순수한 배양물, 또는 2개의 진균 종 및/또는 균주의 순수한 공동 배양물, 또는 3개 이상의 진균 종 및/또는 균주의 실질적으로 순수한 배양물로 구성된 순수한 공동 배양물을 사용한다. 많은 단리된 사상균 종 및/또는 균주, 예컨대 푸시스포리움, 슈도푸사리움, 지베렐라, 스포로트리켈라, 아스퍼질러스, 페니실리움, 트리코데르마의 종 및/또는 균주(들), 피키아 종, 털곰팡이목(Mucorales) 종 내의 종(예컨대 리조푸스 종), 및 이의 조합이 사용될 수 있다. 생물학적으로 순수한 배양물/공배양물/실질적으로 순수한 배양물은 또한 ATCC 기탁번호 PTA-10698로 기탁된 MK7로 명명된 단리된 사상형 호산성 진균 균주, 또는 이의 활성 돌연변이를 포함할 수 있다. 유전적으로 변형된 사상균의 생물학적으로 순수한 배양물이 또한 사용될 수 있다. 순수한 진균 종 및/또는 균주(들) 및/또는 그의 자손은 전형적으로 분생자(conidia), 소분생자(microconidia), 대분생자(macroconidia), 분생포자각(pycnidia), 후막포자(chlamydospore), 균사, 균사 및 균사체의 파편 또는 이의 조합의 형태이다.
사상형 호산성 MK7 진균 균주는 리그노셀룰로오스 탄소원, 탄수화물(예컨대, 산 유청) 및 조류 바이오매스와 같은 탄소원을 단백질 및 지질을 포함하는 사상균 바이오매트로 직접 전환할 수 있는 호산성 진균의 새로운 균주이다.
인공 배지 및 단리된 진균 균주 및/또는 그의 자손을 사용하여 유용한 생성물을 생산하는 방법은 하기를 포함한다:
a) 용기에서 당, 글리세롤, 리그노셀룰로오스 공급원료, 탄소를 함유하는 농업, 산업, 및 도시 폐기물, 탄수화물, 효모 추출물, 카사미노산(casamino acid), 산 유청, 스위트 유청 및/또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 탄소원을 갖는 인공 배지에 하나 이상의 진균 종 또는 균주 및/또는 그의 자손을 접종하는 단계로서, 인공 배지는 표면 발효를 통해 상기 단리된 진균 균주의 성장을 지지할 수 있고;
b) 상기 단리된 진균 균주를 상기 인공 배지에서 성장시켜 사상균 바이오매트를 생산하는 단계;
c) 사상균 바이오매트를 수확하는 단계; 및
d) 임의로 사상균 바이오매트로부터 생성물을 단리, 정제 및/또는 생산하는 단계.
성장은 호기성 조건하에서 일어난다. 또 다른 구현예에서, 성장은 미세호기성 조건하에서 일어난다. 대안적으로, 성장은 표면 발효를 통해서와 같이, 호기성 조건, 미세호기성 조건 및 혐기성 조건의 임의의 조합의 결과로서 일어난다.
유용한 생성물은 단백질이 풍부한 바이오매스, 바이오매트 및/또는 사상균 바이오매트이다. 예를 들어, 개시된 진균 및 방법을 사용하여 생산된 유용한 생성물은, 비제한적으로, 식료품, 어류 사료 제품, 동물 사료 제품, 바이오플라스틱, 및/또는 이의 전구체에서 사용하기 위한 단백질 바이오매트를 포함한다. 여기서, 성장은 호기성 조건, 미세호기성 조건, 및 혐기성 조건 또는 이의 임의의 조합에 의해 일어난다.
많은 호산성 진균 종 및/또는 균주(들), 예컨대, 푸시스포리움, 슈도푸사리움, 지베렐라, 스포로트리켈라, 아스퍼질러스. 페니실리움, 트리코데르마, 털곰팡이목 종 내의 종(예컨대, 리조푸스 종), MK7로 명명된 단리된 사상형 호산성 진균 균주 및 이의 조합, 및/또는 이들의 자손은 거의 또는 전혀 오염 없이 항생제의 존재하에 배양될 수 있다. 전형적으로, 인공 배지에서의 오염은 다른 유기체, 예컨대 세균, 다른 원하지 않는 진균(예컨대, 효모, 곰팡이), 조류, 식물, 곤충, 및 이의 혼합물에 의해 야기된다.
푸시스포리움, 슈도푸사리움, 지베렐라, 스포로트리켈라, 아스퍼질러스, 페니실리움, 트리코데르마의 단리된 진균 종 및/또는 균주, 털곰팡이목 종 내의 종(예컨대, 리조푸스 종), 필라멘트를 생산할 수 있는 효모(즉, 야로이야), MK7로 명명된 단리된 사상형 호산성 진균 균주, 및 이의 조합을 포함하는 적어도 하나의 조성물이 또한 개시된다. 조성물은 진균 종 및/또는 균주(들)의 성장을 지지하는 인공 배지, 및 임의로 산성화 물질, 망간 공여체, 영양소 첨가물, 및/또는 이의 혼합물 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
표면 발효
현재의 개시내용은 원하는 사상균 종 및/또는 균주(들)의 부유 세포의 현탁액을 인공 배지에 접종함으로써 표면 발효를 개시한다. 접종물 반응기로부터의 접종물 배양물은 원하는 시간에 성숙한 바이오매트를 생산할 비율로 인공 배지에 첨가된다. 이론적으로, 배지에 단일 세포가 접종될 수 있지만; 이러한 접종은 성숙한 바이오매트가 발달하기 위해 엄청나게 엄격한 무균 조건 및 상당히 연장된 기간을 필요로 할 것이다. 전형적으로, 성장 배지 리터당 0.5 - 1.0 g의 세포의 접종은 3 내지 6일 내에 바이오매트를 생산할 것이다. 예를 들어, 사용된 배지의 7.5%(부피 대 부피)로 약 10 g/L의 세포를 함유하는 접종물을 첨가하는 것은 3 내지 6일 내에 바이오매트를 생산할 것이다. 외부 산소는 버블링 또는 다른 수단에 의해 인공 배지에 도입되지 않으며, 충분한 산소는 주위 또는 거의 주위 조건으로부터 모아질 수 있다.
이론에 얽매이지 않으면서, 세포 성장은 산소의 존재하에서 훨씬 더 빠르기 때문에, 더 많은 산소가 존재하는 인공 배지의 표면에 존재하는 분생자는 빠르게 성장하여 균사체 바이오매트의 형성을 시작할 것으로 생각된다. 산소 농도는 인공 배지의 표면의 단지 몇 마이크로미터 아래에서 훨씬 더 낮으므로 상기 지역에 위치한 진균 세포를 스트레스 환경에 둘 것이라고 여겨진다. 스트레스는 "점착성" 표현형을 갖는 세포외 다당류의 분비를 증가시키는 것으로 알려져 있으므로, 표면에서 증식하는 세포에 부착함으로써 사상균 바이오매트의 빠른 형성을 도울 것이다. 하지만, 기질 농도 역시 중요한 영향을 미친다. 예를 들어, 탄소 기질 농도가 4% 미만이면, 사상균 바이오매트는 형성되지 않을 것이다. 매트를 형성하기 위한 초기 환경 스트레스는 반드시 스트레스 받은 매트, 즉 스트레스 받은 유기체에 의해 분비된 독소를 함유하는 매트가 형성되는 것으로 추론하지는 않는다는 점에 유의해야 한다.
전형적으로, 인공 배지를 함유하는 얕은 트레이는 사용된 진균 종 및/또는 균주(들)에 적합한 온도, 습도, 및 기류의 제어된 조건하에 표면 발효를 위해 사용된다. 최적 사상균 바이오매트 성장을 위해 무균 조건이 유지된다. 미생물 호흡에서 생산된 열과 이산화탄소를 제거하고, 인공 배지의 표면을 교반하지 않고 진균 균사 성장을 방해하지 않으면서 산소를 공급하기 위해 충분한 기류가 유지된다.
일반적으로, 접종 2일 후 인공 배지의 표면에 "피부(skin)"가 형성되기 시작한다. 이 "피부"는 기균사뿐만 아니라 인공 배지와 접촉된 균사를 흔히 포함하고 세포 밀도가 계속 성장하고 증가하는 초기 사상균 바이오매트이다. 전형적으로, 접종 3 내지 6일 후, 생성된 사상균 바이오매트는 1 내지 30 mm 두께이고 찢어지지 않으면서 취급되기에 충분한 인장 강도 및 구조적 완전성을 갖는다.
생산된 사상균 바이오매트는 자연에서 관찰되지 않는 기술된 바와 같은 구조를 갖는다. 첫째, 자연적으로 형성된 사상균 바이오매트는 순수한 배양물/공동 배양물/실질적으로 순수한 배양물로 구성되지 않는다. 전형적으로, 자연에서 형성된 바이오매트는 적어도 하나의 사상균 종 이외에 다양한 유형의 조류 및/또는 세균을 함유하며 인공 미소생태계를 형성한다. 자연에서 형성된 진균 바이오매트의 예는 균근(mycorrhizal) 진균 매트이며, 이는 토양에서 크게 분산된 형태로 존재하고 식물 뿌리, 지의류(예컨대, 레인디어 모스(Reindeer moss) 및 고착 지의(crustose lichen)), 및 버섯(예컨대, 잣뽕나무버섯(Armillaria ostoyae))과 관련이 있다.
둘째, 본원에 기재된 방법 및 기술을 사용하여 형성된 바이오매트는, 자연적으로 형성된 바이오매트에서 발견되는 다수의 종을 고려하더라도, 자연에서 발견되는 것보다 유의하게 더 큰 세포 밀도를 갖는다. 생산된 사상균 바이오매트는 전형적으로, 리터당 50-200 그램으로 매우 밀집한 경향이 있다. 사상균의 성장을 위한 천연 및 액침 공정은 일반적으로 리터당 약 15 그램의 바이오매스 밀도를 초래한다. 고체 상태 발효 공정은 적은 비율의 진균, 즉 5% 미만의 진균 조성을 갖는 기질의 혼합물을 야기한다. 백분율 백분율 관점에서, 본원에 개시된 방법은 일반적으로 5-20% 고체 범위의 사상균 바이오매트를 생산하였다. 대조적으로, 사상균의 성장을 위한 천연 및 액침 공정은 일반적으로 1.5% 미만의 백분율 고체 범위를 초래한다. 이러한 밀집한 바이오매트에서 발견된 달성된 밀도, 사상형 특성, 및 세포외 매트릭스의 하나의 결과는 건조시 응집성 매트로서 유지되는 능력이다. 이것은 다른 건조된 사상균 바이오매트에서 일반적으로 발견되는 분말성 및/또는 비응집성 형태와 현저히 대조적이다.
셋째, 본원에 기재된 방법 및 기술을 사용하여 형성된 바이오매트는 자연 발생 바이오매트에 비해 높은 인장 강도를 가지므로, 파손 없이 들어 올려지거나 이동될 수 있다.
넷째, 본 발명의 바이오매트는, 일부 경우에 일반적으로 공기:바이오매트 계면에 평행하게 정렬된 긴 필라멘트로 구성된 단일 밀집 층을 포함하는 정의된 구조를 갖는다. 일부 사상균 바이오매트에는, 적어도 2개의 층이 존재한다: (a) 밀집 하부 층 및 (b) 기균사 층. 일부 사상균 바이오매트에서, 적어도 3개의 구조적으로 상이한 층이 보일 수 있다: (a) 밀집 하부 층, (b) 기균사 층 및 (c) 전이 구역 층(도 10A 및 B 참고). 기균사를 갖는 시스템 및 3개의 층을 갖는 시스템의 경우, 기균사 층이 전형적으로 가장 가시적으로 우세하며, 그 다음 밀집 하부 층이 우세하고, 전이 구역 층은 존재하는 경우 가장 작다. 각각의 층은 일반적으로 다른 층(들)과 비교하여 그것과 관련된 특징적인 세포 밀도를 갖는다. 예를 들어, 기균사 층은 바이오매트의 하부 층보다 훨씬 밀도가 낮다(도 10A 참고). 기균사가 생산되는 경우, 이들은 대부분 바이오매트:공기 및/또는 바이오매트:배지 계면에 수직으로 배향된다. 모든 바이오매트의 경우, 밀집한 층은 바이오매트:공기 및/또는 바이오매트:배지 계면과 평행하여 배열되는 경향이 있는 긴 필라멘트로 구성된다. 또한, 생성된 바이오매트는 적어도 대부분의 진균 바이오매스로 구성되며, 바람직한 구현예에서, 본질적으로 잔류 공급원료로 구성되지 않고 본질적으로 순수한 진균 바이오매스이다.
글리세롤이 기질로서 사용될 때와 같이 기균사가 형성되는 경우, 기균사 층 및 밀집 하부 층 사이에 많은 중요한 구별되는 인자가 또한 존재한다. 길이 면에서, 기균사는 밀집 하부 층에서 발견되는 것보다 더 긴 경향이 있다. 개별적인 기균사의 밀도 및 분포는 밀집한 층 균사체와 관련된 것보다 적다. 기균사는 대기와 병치한 말단에서 수직으로 배향하는 경향이 있다. 즉, 기균사는 표면 배지에 상대적으로 수직으로 성장하는 경향이 있다. 반면, 밀집한 층의 균사는 주로 공기:바이오매트 및/또는 바이오매트:배지 계면에 평행한 배향으로 성장하는 경향이 있다. 긴 길이 및 수직 배향과 조합된 기균사의 낮은 상대적 밀도는 산소 수확(oxygen harvesting)의 최대화를 시사한다. 또한, 기균사 층에서는 추가의 세포 매트릭스가 거의 또는 전혀 발견되지 않는다. 대조적으로, 밀집 하부 층에서는 많은 세포외 매트릭스가 발견될 수 있다.
바이오매트의 공중 층(aerial layer)은, 형성되는 경우, 바이오매트의 성장을 촉진하는 것으로 보인다. 공중 층 붕괴 영역의 붕괴는 바이오매트의 성장 가속화에 부정적으로 영향을 미친다. 붕괴는 고체 물체와의 접촉, 물방울과의 접촉, 및 바이오매트가 성장하는 액체 배지의 교반으로부터 야기된 균열 또는 틈을 포함한다. 전형적으로, 파괴된 바이오매트 영역은 파괴 원인이 제거되면 더 이상 성장하지 않는다. 일반적으로, 바이오매트 성장은 호기성 조건, 미세호기성 조건, 및 혐기성 조건 또는 이의 임의의 조합에 의해 생산된다.
바이오매트는 일반적으로 사용된 종/균주(들) 및 원하는 생성물에 따라, 접종 후 3일 내지 12일 사이에 수확되지만, 더 늦은 수확 시기 역시 가능하다. 사상균 바이오매트는 많은 상이한 방법론에 의해 수확될 수 있으며, 이는 세척, 물리적 가공(크기 감소, 압력 처리, 탈수 등), 생존력 불활성화 절차, 온도 사이클링, 바이오매스 성분의 추출 및/또는 분리, 및 상이한 시스템으로의 전환 및/또는 포함을 포함한다. 일부 구현예에서, 사상균 바이오매트는 수확되고, 물로 세척된 다음, 많은 효소를 불활성화시키고 바이오매트 내의 생화학적 변형을 제한하기 위해 온도 조절 오븐에서 건조되거나, 또는 동결된다.
사상균은 재조합 단백질 생산 및 발현 플랫폼을 위한 숙주 세포로서 매우 유용한 것으로 인식되며, 이는 바이오매스, 및/또는 사상균 바이오매트에서 발현되는 유용한 생성물을 생성한다. 이러한 공정에서 현재 사용되거나 사용하기 위해 제안된 사상균의 예는 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 아크레모니움 크리소지제눔(Acremonium chrysogenum), 톨리포크라디움 제오데스(Tolypocladium geodes), 무코르 시르시넬로이데스(Mucor circinelloides), 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)를 포함한다. 또한, 개시된 바와 같은 바이오매트를 생산하기 위해 사용된 미생물 종은 전사를 포함하는 유전자 발현의 조작에 의해 시스템을 발현/억제하도록 유전적으로 변형될 수 있으므로, 그들의 천연 또는 변경되지 않은 형태에서 발견되는 화합물 또는 화학 물질을 발현하거나 발현하지 않는다. 기존 화학 물질을 과발현하거나, 자연적으로 존재하지 않는 시스템을 발현하거나 또는 일반적으로 천연 형태로 존재하는 시스템을 억제하기 위한 진균 시스템, 즉 아스퍼질러스 종, 페니실리움 종, 리조푸스 종, 트리코데르마 종, 및 피키아 종과 같은 효모의 사용 및 조작은 당업계에 알려져 있다. 개시된 바이오매트 및 방법을 사용하여 생산된 유용한 생성물은, 비제한적으로, 의약품, 기능식품, 산업 용도를 위한 빌딩 블록 화학물질, 약물, 효소 및/또는 이의 전구체를 발현하기 위해 사용된 바이오매스 및/또는 바이오매스 바이오매트를 포함한다.
호산성 진균 종 및/또는 균주(들)
본 발명에서 사용된 호산성 진균 종 및/또는 균주는 적어도 하기 식별 특징을 갖는, 리그노셀룰로오스를 분해하는 사상균 균주 및/또는 이들의 자손이다:
a) 단리된 균주는 호산성이며, 약 0.68 내지 약 8.5 범위의 pH에서 성장할 수 있고; 및
b) 호기성 조건, 미세호기성 조건, 혐기성 조건 또는 이의 임의의 조합 하에 표면 발효를 통해 인공 배지로부터 단백질 및 지질을 함유하는 사상형, 바이오매트를 생산한다. 여기서, 인공 배지의 탄소원은 탄수화물, 리그노셀룰로오스 공급원료, 탄소 함유 폐기물(예컨대 산 유청), 또는 이의 조합을 포함한다.
단리된 종 및/또는 균주(들)는 전형적으로 하기 추가적인 식별 특징 중 하나 이상을 추가로 포함한다:
c) 단백질, 지질, 아미노산, 효소, 핵산(뉴클레오타이드), 탄수화물, 섬유, 예컨대 베타 글루칸, 폴리케타이드, 알칼로이드, 색소, 및 항생제를 생산하는 능력. 예는, 비제한적으로 에스테르, 글루탐산, 아스파트산, 아밀라아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 퍼옥시다아제, 망간 퍼옥시다아제, 핵산/뉴클레오타이드: DNA/RNA, 퓨린, 피리미딘, 올레산, 팔미톨레산, 베타-글루칸, 키틴, 베타-카로틴, 글리코시드, 페놀화합물, 18페이지, 단락 [80]에 기재된 탄소원으로부터의 테르페노이드 및 조류 공급원료, 및 다양한 혐기성, 호기성 미세호기성 조건 및/또는 이의 임의의 조합 하에 바이오연료 생산 동안 생성된 폐기물(예컨대, 가공된 조류 바이오매스, 글리세롤)로부터의 테르페노이드를 포함한다;
d) 서열번호:1과 적어도 98% 동일성을 공유하는 18S rRNA 및 ITS 영역 DNA 서열을 포함한다.
적합한 사상형 호산성 진균 종 및/또는 균주(들)는 푸시스포리움, 슈도푸사리움, 지베렐라, 스포로트리켈라, 아스퍼질러스, 페니실리움, 트리코데르마, 털곰팡이목 종 내의 종(예컨대, 리조푸스 종), MK7로 명명된 단리된 사상형 호산성 진균 균주, 및 이의 조합, 및/또는 이들의 자손을 포함한다. MK7로 명명된 균주는 ATCC 기탁번호 PTA-10698로 기탁되었다.
호산성 진균 종 및/또는 균주(들) 및/또는 그의 자손은 최대 약 7.0, 약 6.5, 약 6.0, 약 5.5, 약 5.0, 약 4.5, 약 4.0, 약 3.5, 약 2.0, 약 1.8, 약 1.6, 약 1.4, 약 1.2, 약 1.0, 약 0.9, 약 0.8, 또는 약 0.7 또는 약 0.6, 또는 약 0.5의 낮은 pH에서 성장할 수 있다. 예를 들어, 진균 균주는 약 0.68 내지 약 2.0의 범위의 낮은 pH에서 성장할 수 있다.
사용된 호산성 종 및/또는 균주(들)는 상기 기재된 바와 같은 낮은 pH 범위 하에서 성장한 사상균 바이오매트 내에서 대량의 지질 및 단백질을 생산할 수 있다. 예를 들어, 단리된 균주는, 이전에 단리된 푸사리움 균주가 기재된 바와 같이, 당업계에 이전에 보고된 것보다 상기 기재된 바와 같은 낮은 pH 내에서 더 빠른 속도로 탄소원을 지질로 전환시킬 수 있다(Nairn et al., 1985, Bhatia et al., 2006, 및 Naqvi et al., 1997 참고). 사용된 호산성 종 및/또는 균주(들)는 pH 2.5에서 10일 배양 후, 적어도 0.04 g 지질/g 탄소원, 0.05 g 지질/g 탄소원, 0.06 g 지질/g 탄소원 0.07 g 지질/g 탄소원, 0.08 g 지질/g 탄소원, 0.1 g 지질/g 탄소원, 0.12 g 지질/g 탄소원, 0.14 g 지질/g 탄소원, 0.16 g 지질/g 탄소원, 0.18 g 지질/g 탄소원, 0.2 g 지질/g 탄소원, 0.25 g 지질/g 탄소원, 0.3 g 지질/g 탄소원, 0.35 g 지질/g 탄소원, 또는 0.4 g 지질/g 탄소원의 속도로 탄소원을 지질로 전환시킬 수 있다.
본 발명의 배양 조건은 또한 배양된 진균 또는 미세조류로부터 이전에 생산된 바이오매스와 비교할 때 더 유리한 지질 프로파일을 갖는 사상형 바이오매스를 생산한다. 예를 들어, 사용된 호산성 종 및/또는 균주(들)는 포화된 지방산(예컨대, 팔미트산(16:0) 및 스테아르산(18:0)) 및 모노-불포화 지방산(예컨대, 올레산(18:1))을 더 생산하지만, 산화에 더 취약한 폴리불포화 지방산은 적게 생산한다.
또한, 호산성 진균 종 및/또는 균주(들) 및/또는 그의 자손은 높은 금속 농도에서 성장할 수 있고, 금속은 Mn, Ag, Zn, Fe, Al, Be, Pb, Cu, Cr, Ni, Cd, Co, Ni, Pd, Pt, U, Th, Mo, Sn, Ti, As, Au, Se, Sb 및 Hg로 이루어진 군으로부터 선택된다.
호산성 진균 종 및/또는 균주 및/또는 이들의 자손은 배양 조건하에서 빠른, 고밀도 세포 성장을 할 수 있다. 여기서, 미생물은 적어도 약 10 g/L, 적어도 약 15 g/L, 적어도 약 20 g/L, 적어도 약 25 g/L, 적어도 약 30 g/L, 적어도 약 50 g/L, 적어도 약 75 g/L, 적어도 약 100 g/L, 적어도 약 125 g/L, 적어도 약 135 g/L, 적어도 약 140 g/L, 적어도 약 145 g/L, 적어도 약 150 g/L, 적어도 약 160 g/L, 적어도 약 170 g/L, 적어도 약 180 g/L, 적어도 약 190 g/L, 적어도 약 200 g/L, 적어도 약 210 g/L, 적어도 약 220 g/L, 적어도 약 230 g/L, 적어도 약 240 g/L, 적어도 약 250 g/L의 세포 밀도(인공 배지의 건조 중량/L로서 측정됨)를 달성할 수 있다.
예를 들어, 호산성 진균 종 및/또는 균주(들)는 약 10 g/L 내지 약 300 g/L, 약 15 g/L 내지 약 300 g/L, 약 20 g/L 내지 약 300 g/L, 약 25 g/L 내지 약 300 g/L, 약 30 g/L 내지 약 300 g/L, 약 50 g/L 내지 약 300 g/L, 약 75 g/L 내지 약 300 g/L, 약 100 g/L 내지 약 300 g/L, 약 125 g/L 내지 약 300 g/L, 약 150 g/L 내지 약 300 g/L, 약 170 g/L 내지 약 300 g/L, 약 130 g/L 내지 약 290 g/L, 약 135 g/L 내지 약 280 g/L, 약 140 g/L 내지 약 270 g/L, 약 145 g/L 내지 약 260 g/L, 약 150 g/L 내지 약 250 g/L, 약 170 g/L 내지 약 250 g/L, 약 100 g/L 내지 약 280 g/L의 세포 밀도를 달성할 수 있다. 호산성 진균 종 및/또는 균주(들)의 고밀도 성장은 발효 조건(예컨대, 온도, pH, 이온 농도, 배양 시간 및/또는 기체 농도)을 조절함으로써 더 증가될 수 있다.
푸사리움 종
호산성 푸사리움 종, 확인, 단리, 배양 방법에 관한 정보는 문헌[Nelson et al., (Taxonomy, Biology, and Clinical Aspects of Fusarium Species, 1994, Clinical Microbiology Reviews, 7(4): 479-504), Toussoun and Nelson (1976, Fusarium), Booth (Fusarium: laboratory guide to the identification of the major species, 1977, Commonwealth Mycological Institute, ISBN 0851983839, 9780851983837) and Leslie et al., (The Fusarium laboratory manual, 2006, Wiley-Blackwell, ISBN 0813819199, 9780813819198)]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.
예컨대, 사상균 종 및/또는 균주(들)에 의해 생산된 특정 효소를 포함하는 단백질은 유기체에 의해 생산된 사상형 바이오매스로부터 정제될 수 있다. 단백질 정제 방법은 당업자에게 알려져 있다. 상세한 단백질 정제 방법은 문헌[Janson and Ryden (Protein purification: principles, high-resolution methods, and applications; Wiley-VCH, 1998, ISBN 0471186260, 9780471186267), Detscher (Guide to protein purification, Volume 182 of Methods in enzymology , Gulf Professional Publishing, 1990, ISBN 0121820831, 9780121820831), 및 Cutler (Protein purification protocols, Volume 244 of Methods in molecular biology, Humana Press, 2004 ISBN 1588290670, 9781588290670)]에 기재되었고, 이들 각각은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.
단백질은 생성물로서 효용 및 유용성을 찾기 위해 매트로부터 정제될 필요가 없다. 즉, 매트는 정제하지 않고 가공될 수 있고 유용할 수 있으며; 즉 단백질원으로서, 식품 재료로서, 및/또는 동물 사료로서 유용할 수 있다. 매트는 그 위에 생성물을 형성할 수 있고; 원위치에서 바이오매트가 생산한 생성물의 혼합은 중요하고 가치가 있다.
진균 종 및/또는 균주(들)의 지질
상기 언급한 바와 같이, 높은 C:N 비율을 갖는 인공 배지에서 배양될 때, 조류 및 다른 지질 생산 유기체와 비교하여 높은 지질 함량 및 더 유리한 지질 프로파일을 갖는 바이오매트가 생산된다. 지질은 단리된 사상형 바이오매스로부터 추출될 수 있다. 일부 경우, 지질은 주로 지방산 아실기를 갖는 트리아실글리세라이드이다. 일부 경우, 지방산은 본질적으로 불포화 지방산 및/또는 포화된 지방산이다. 불포화 지방산은 올레산(18:1), α-리놀렌산(18:3), 에이코세노산(20:1), 및 이의 조합을 포함한다. 포화된 지방산은 팔미트산(16:0), 스테아르산(18:0), 아라키드산(20:0), 베헨산(22:0), 및 이의 조합을 포함한다. 생산될 수 있는 다른 유형의 지질은, 비제한적으로, 스테롤(예컨대, 에르고스테롤, D2 전구체에서의 비타민), 디아시클리글리세라이드, 카로티노이드, 포화 지방(예컨대, 부티르산, 헥사노산, 옥타노산, 데카노산, 도데카노산, 트리데카노산, 테트라데카노산, 펜타데카노산, 헥사데카노산, 헵타데카노산, 옥타데카노산, 노나데카노산, 에이코사노산, 도코사노산, 테트라코사노산), 모노불포화 지방(예컨대, 테트라데세노산, 펜타데세노산, 헥사데세노산, 헵타데세노산, 옥타데세노산, 에이코세노산, 도코세노산, cis-테트라코세노산), 및 폴리불포화 지방(예컨대, 헥사데카디에노산, 리놀레산, 리놀렌산, 알파-리놀렌산, 감마-리놀렌산, 파리나르산, 에이코사디에노산, 아라키돈산, 팀노돈산, 브라스산(brassic acid), 클루파노돈산(clupanodonic acid) 및 도코사헥사에노산)을 포함한다.
사상균 종 및/또는 균주(들) 및/또는 이들의 자손은 지질을 효율적으로 생산할 수 있다. 일부 경우, 생산된 지질의 양은 적어도 약 1g/L/일, 5 g/L/일, 적어도 약 10 g/L/일, 적어도 약 20 g/L/일, 적어도 약 30 g/L/일, 적어도 약 40 g/L/일, 적어도 약 50 g/L/일, 적어도 약 60 g/L/일, 적어도 약 70 g/L/일, 또는 그 이상이다. 예를 들어, 생산된 생물학적 오일의 양은 약 1g/L/일 내지 약 5 g/L/일, 약 5 g/L/일 내지 약 70 g/L/일, 약 10 g/L/일 내지 약 70 g/L/일, 약 20 g/L/일 내지 약 70 g/L/일, 또는 약 30 g/L/일 내지 약 70 g/L/일이다. 이들 값은 문헌에서 보고된 가장 큰 값인 약 12 g/L/일보다 훨씬 더 크다(Dey, P. et al. (2011) Comparative lipid profiling of two endophytic fungal isolates - Colletotrichum sp. and Alternaria sp. having potential utilities as biodiesel feedstock. Bioresource Technology 102:5815-5823; Gong, Z. et al. (2013) Efficient conversion of biomass into lipids by using the simultaneous saccharification and enhanced lipid production process. Biotechnology for Biofuels 6:36; Gong, Z. et al. (2014) Lipid production from corn stover by the oleaginous yeast Cryptococcus curvatus. Biotechnology for Biofuels 7:158; Hui, L. et al. (2010) Direct microbial conversion of wheat straw into lipid by a cellulolytic fungus of Aspergillus oryzae A-4 in solid-state fermentation. Bioresource Technology 101:7556-7562; Liang, Y. et al. (2014) Microbial lipid production from pretreated and hydrolyzed corn fiber. Biotechnol Progress 30:945-951; Liu, C.-Z. et al. (2012) Ionic liquids for biofuel production: Opportunities and challenges. Applied Energy 92:406-414; Ruan, Z. et al. (2013) Co-hydrolysis of lignocellulosic biomass for microbial lipid accumulation. Biotechnol . Bioeng . 110:1039-1049; Sung, M. et al. (2014) Biodiesel production from yeast Cryptococcus sp. using Jerusalem artichoke. Bioresource Technology 155:77-83; Xie, H. et al. (2012) Enzymatic hydrolysates of corn stover pretreated by a N-methylpyrrolidone-ionic liquid solution for microbial lipid production. Green Chem . 14:1202-1210 참고).
지질은 다양한 절차를 사용하여 사상균 바이오매트로부터 추출될 수 있다. 지질 추출의 비제한적인 예는 문헌[King et al. (Supercritical Fluid Extraction: Present Status and Prospects, 2002, Grasa Asceites , 53,8-21), Folch et al. (A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues, 1957, J Biol . Chem ., 226, 497-509), Bligh and Dyer (A rapid method of total lipid extraction and purification. 1959, Can. J Biochem . Physiol., 37, 911-917), Cabrini et al. (Extraction of lipids and lipophilic antioxidants from fish tissues - a comparison among different methods. 1992, Comp. Biochem . Physiol ., 101(3), 383-386), Hara et al. (Lipid extraction of tissues with a low toxicity solvent. 1978, Anal. Biochem . 90, 420-426), Lin et al. (Ethyl acetate/ethyl alcohol mixtures as an alternative to Folch reagent for extracting animal lipids. 2004, J. Agric. Food Chem., 52, 4984-4986), Whiteley et al. (Lipid peroxidation in liver tissue specimens stored at subzero temperatures. 1992, Cryo-Letters, 13, 83-86), Kramer et al. (A comparison of procedures to determine free fatty acids in rat heart. 1978, J. Lipid Res., 19, 103-106) and Somashekar et al. (Efficacy of extraction methods for lipid and fatty acid composition from fungal cultures, 2001, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 17(3):317-320)]에 기재되어 있다.
또 다른 예에서, 지질은 미생물에 의해 생산된 생물학적 오일을 추출하는데 사용되는 FRIOLEX®(Westfalia Separator Industry GmbH, Germany) 공정과 유사한 방법에 의해 추출될 수 있다. FRIOLEX®은 임의의 종래의 용매 추출 방법을 사용하지 않고 오일을 함유하는 원료를 오일을 추출하는데 직접 사용할 수 있는 수성 물리적 오일 추출 공정이다. 이 공정에서, 수용성 유기 용매가 공정 조제로 사용될 수 있고, 오일은 중력 또는 원심력을 사용한 밀도 분리에 의해 원료액으로부터 분리된다.
지질이 추출된 후, 지질은 당업계에 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 비지질 성분으로부터 회수되거나 분리될 수 있다. 예를 들어, 저비용 물리적 및/또는 기계적 기술이 비지질 조성물로부터 지질 함유 조성물을 분리하는데 사용된다. 하나 이상의 상 또는 분획이 지질을 함유하는 경우, 지질을 추출하기 위해 사용된 추출 방법에 의해 다수의 상 또는 분획이 생성되면, 지질 함유 상 또는 분획을 회수하는 방법은 비지질 상 또는 분획으로부터 지질 함유 상 또는 분획을 물리적으로 제거하는 단계를 포함할 수 있거나, 또는 그 반대이다. 일부 경우, FRIOLEX® 유형 방법이 미생물에 의해 생산된 지질을 추출하는데 사용되고, 이후 지질이 풍부한 가벼운 상이 단백질이 풍부한 무거운 상으로부터 물리적으로 분리된다(예컨대, 밀도 분리 후 단백질이 풍부한 무거운 상의 위에 있는 지질이 풍부한 상을 걷어냄으로써).
사상균 종 및/또는 균주(들)에 의한 지질의 생산에는 적어도 2단계가 있다: (a) 사상균 바이오매트 축적 단계 및 (b) 지질 생산 단계. 사상균 바이오매트 축적 단계는 진균 균주의 총 사상균 바이오매트 생산의 약 10% 내지 약 95%, 약 20% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 또는 약 50% 내지 약 95%가 사상균 바이오매트 축적 단계 동안 달성되도록 진균 종 및/또는 균주(들)의 사상형 바이오매스를 생산한다. 다른 경우, 미생물의 총 사상균 바이오매트 생산의 약 60% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 95%, 또는 약 80% 내지 약 95%가 사상균 바이오매트 축적 단계 동안 달성된다. 다른 경우에, 사상균 바이오매트 축적 단계는 미생물의 총 사상형 바이오매스 생산의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 100%가 사상균 바이오매트 축적 단계 동안 달성되도록 미생물의 사상형 바이오매스를 생산한다. 예를 들어, 미생물의 총 사상균 바이오매트 생산의 약 50% 내지 약 95%가 사상균 바이오매트 축적 단계 동안 달성된다.
지질 생산 단계와 관련하여, 지질은 세포 성장 및 증식에 필요하므로 모든 성장 단계에 걸쳐 생산되며; 즉, 지질은 사상균 바이오매트 축적 단계 동안 생산된다. 이론에 얽매이지 않으면서, 일부 저장 지질은 바이오매트 성장의 후기 단계에서 생산되는 반면 다른 저장 지질은 바이오매트 형성 동안에 더 이르게 생산되는 것으로 여겨진다. 또한, 낮은 질소 조건하에서, 유기체는 더 빠른 속도로 저장 지질을 축적할 것이다.
지질 축적 단계는 미생물의 총 지질 생산의 약 10% 내지 약 95%, 약 20% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 또는 약 50% 내지 약 95%가 지질 축적 단계 동안 달성되도록 지질을 생산한다. 일부 경우, 미생물의 총 지질 생산 약 60% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 95%, 또는 약 80% 내지 약 95%가 지질 축적 단계 동안 달성된다. 다른 경우, 지질 축적 단계는 미생물의 총 지질 생산의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%가 지질 축적 단계 동안 달성되도록 지질을 생산한다. 바람직하게는, 미생물의 총 지질 생산의 약 50% 내지 약 95%가 지질 축적 단계 동안 달성된다.
지질이 본 발명에 따라 생산되면, 당업계에 알려진 다양한 방법이 생물학적 오일을 식품 또는 약제학적 제품을 위한 성분으로서 사용하기 위한 지방산의 에스테르로 변환하는데 사용될 수 있다. 지방산의 에스테르의 생산은 미생물에 의해 생산된 생물학적 오일을 에스테르 교환시키는 것을 포함할 수 있다. 미생물로부터의 지질의 추출 및 지질의 에스테르 교환은 1단계 방법으로 동시에 수행될 수 있다. 예를 들어, 단리된 진균 균주를 함유하는 배양물을 지질의 추출 및 지질의 에스테르 교환 모두를 촉진하는 조건 또는 처리(또는 조건 또는 처리의 조합)에 노출시킬 수 있다. 이러한 조건 또는 처리는, 비제한적으로, pH, 온도, 압력, 용매의 존재, 물의 존재, 촉매 또는 효소의 존재, 세제의 존재, 및 물리력/기계력을 포함한다. 조건 또는 처리의 2개의 세트가 지질의 추출 또는 에스테르 교환의 효율을 유의하게 감소시키지 않으면서 조합될 수 있는 한, 조건 또는 처리의 2개의 세트는 지질을 추출하고 에스테르 교환하는 1단계 방법을 생산하기 위해 조합될 수 있고, 여기서 조건 또는 처리의 1개의 세트는 지질의 추출을 유리하게 촉진하고 조건 또는 처리의 다른 세트는 지질의 에스테르 교환을 유리하게 촉진한다. 가수분해 및 에스테르 교환은 전체 세포 사상형 바이오매스에 직접 수행될 수 있다.
대안적으로, 지질의 추출은 지질의 에스테르 교환의 단계로부터 분리된 단계로서 수행된다. 이러한 에스테르 교환 반응은 산 또는 염기 촉매를 사용하여 수행된다. 생물학적 지질을 식품 또는 약제학적 제품을 위한 성분으로서 사용하기 위한 지방산의 에스테르로 에스테르 교환하는 방법은 알코올 및 염기의 존재하에 트리글리세라이드를 함유하는 생물학적 오일을 반응시켜 트리글리세라이드로부터 지방산 잔기의 에스테르를 생산하는 단계를 포함한다.
에스테르 교환에서 사용하는데 적합한 알코올은 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 임의의 저급 알킬 알코올(즉, C1-6 알킬 알코올, 예컨대 메틸, 에틸, 이소프로필, 부틸, 펜틸, 헥실 알코올 및 이의 이성질체)을 포함한다. 이론에 얽매이지 않으면서, 저급 알킬 알코올의 사용은 지방산 잔기의 저급 알킬 에스테르를 생산하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 에탄올의 사용은 에틸 에스테르를 생산한다. 알코올이 메탄올 또는 에탄올인 경우, 생산된 지방산 에스테르는 각각 지방산 잔기의 메틸 에스테르 및 에틸 에스테르이다. 전형적으로, 알코올은 약 5 중량% 내지 약 70 중량%, 약 5 중량% 내지 약 60 중량%, 약 5% 내지 약 50 중량%, 약 7 중량% 내지 약 40 중량%, 약 9 중량% 내지 약 30 중량%, 또는 약 10 중량% 내지 약 25 중량%의 지질 조성물, 알코올 및 염기의 혼합물을 포함한다. 조성물 및 염기는 순수한 에탄올 또는 순수한 메탄올에 첨가될 수 있다. 일반적으로, 사용된 알코올의 양은 알코올에서의 트리글리세라이드를 함유하는 지질 또는 조성물의 용해도에 따라 달라질 수 있다.
트리글리세라이드, 알코올 및 염기를 포함하는 조성물은 지방산 잔기 및 알코올로부터 에스테르를 생산할 수 있는 온도 및 시간 동안 함께 반응한다. 에스테르를 생산하기 위한 적합한 반응 시간 및 온도는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 이론에 의해 얽매이지 않으면서, 지방산 잔기는 트리글리세라이드의 글리세롤 백본으로부터 절단되는 것으로 여겨지며, 반응 단계 동안 각각의 지방산 잔기의 에스테르가 형성된다. 알코올 및 염기의 존재하에 조성물을 반응시키는 단계는 약 20℃ 내지 약 140℃, 약 20℃ 내지 약 120℃, 약 20℃ 내지 약 110℃, 약 20℃ 내지 약 100℃, 또는 약 20℃ 내지 약 90℃의 온도에서 수행된다. 대안적으로, 알코올 및 염기의 존재하에 조성물을 반응시키는 단계는 약 20℃, 75℃, 80℃, 85℃, 90℃, 95℃, 105℃, 또는 120℃ 이상의 온도에서 수행된다. 원하는 생성물에 따라, 알코올 및 염기의 존재하에 조성물을 반응시키는 단계는 약 2시간 내지 약 36시간, 약 3시간 내지 약 36시간, 약 4시간 내지 약 36시간, 약 5시간 내지 약 36시간, 또는 약 6시간 내지 약 36시간의 시간 동안 수행된다. 대신, 알코올 및 염기의 존재하에 조성물을 반응시키는 단계는 약 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 5.0, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 10, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 또는 36시간 동안 수행될 수 있다.
지질 조성물, 알코올 및 염기를 반응시키는 단계는 지방산 에스테르, 예컨대 PUFA 에스테르를 생산하기 위해 성분을 환류시킴으로써 수행될 수 있다. 지질 조성물을 반응시키는 단계는 또한 반응 성분의 환류를 야기하지 않는 온도에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 대기 압력을 초과하는 압력하에서 지질 조성물을 반응시키는 단계를 수행하면 반응 혼합물에 존재하는 용매의 끓는점을 증가시킬 수 있다. 이러한 조건하에, 용매가 대기 압력에서 끓지만 반응 성분의 환류를 야기하지 않을 온도에서 반응이 일어날 수 있다. 일반적으로, 반응은 제곱인치당 약 5 내지 약 20 파운드(psi); 약 7 내지 약 15 psi; 또는 약 9 내지 약 12 psi의 압력에서 수행된다. 일부 반응은 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 psi의 압력에서 수행된다. 압력하에 수행된 반응은 상기 열거된 반응 온도에서 수행될 수 있다. 압력하에 수행된 반응은 약 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 또는 90℃ 이상의 온도에서 수행될 수 있다.
지방산 에스테르는 조성물을 증류하여 지방산의 에스테르를 포함하는 분획을 회수함으로써 반응 혼합물로부터 분리된다. 관심있는 지방산 에스테르를 포함하는 반응 혼합물의 표적화된 분획은 반응 혼합물로부터 분리되고 회수될 수 있다. 증류는 진공하에 수행될 수 있다. 이론에 얽매이지 않으면서, 진공 하에 증류는 진공의 부재하에서보다 더 낮은 온도에서 증류를 달성하여 에스테르의 분해를 방지할 수 있다. 전형적인 증류 온도는 약 120℃ 내지 약 170℃의 범위이며, 예컨대 약 180℃ 미만, 약 175℃ 미만, 약 70℃ 미만, 약 165℃ 미만, 약 160℃ 미만, 약 155℃ 미만, 약 150℃ 미만, 약 145℃ 미만, 약 140℃ 미만, 약 135℃ 미만, 또는 약 130℃ 미만의 온도에서 증류를 수행하는 것이다. 진공 증류를 위한 전형적인 압력은 약 0.1 mm Hg 내지 약 10 mm Hg의 범위, 예컨대 약 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 또는 4 mm Hg 이상의 진공 증류 압력이다.
본 발명의 사상균 종 또는 균주 및/또는 그의 자손으로부터 추출된 지질은 바이오윤활유를 생산하는데 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바이오윤활유"는 살아있거나 최근에 살아있는 유기체로부터 유래된 물질을 사용하여 생산된 윤활유를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "윤활유"는 2개의 움직이는 표면 사이에 도입되어 이들 사이의 마찰 및 마모를 감소시키는 물질(일반적으로 작동 조건 하에서 액체)을 지칭한다. 모터 오일로 사용되는 베이스 오일은 일반적으로 미국 석유 협회에 의해 미네랄 오일(그룹 I, II, 및 III) 또는 합성 오일(그룹 IV 및 V)로서 분류된다. 미국 석유 협회(API) 간행물 번호 09를 참고한다. 모터 오일 형태의 윤활유의 가장 큰 단일 적용분야 중 하나는 자동차 및 동력 장치에서 내연 기관을 보호하는 것이다. 전형적으로, 윤활유는 90% 베이스 오일(미네랄 오일로 불리는, 대부분 석유 분획) 및 10% 미만의 첨가제를 함유한다. 식물성 오일 또는 합성 액체, 예컨대 수소화된 폴리올레핀, 에스테르, 실리콘, 불화탄소 및 기타 다수가 때때로 베이스 오일로 사용된다. 이들은 주로 식물 및 동물로부터 유래된 트리글리세라이드 에스테르이다. 윤활유 베이스 오일 사용을 위해, 식물 유래 물질이 바람직하다. 일반적인 것은 고올레산 카놀라유, 피마자유, 팜유, 해바라기씨유 및 식물로부터의 유채씨유, 및 동물 공급원으로부터의 톨유를 포함한다. 많은 식물성 오일은 종종 가수분해되어 산을 생성하며, 이는 이후에 선택적으로 결합하여 특수 합성 에스테르를 형성한다.
따라서, 본 발명의 사상균 종 및/또는 균주(들) 및/또는 이들의 자손에 의해 형성된 사상균 바이오매트로부터 추출된 지질은 적합한 첨가제를 첨가함으로써 에스테르계 바이오윤활유 조성물을 생산하는데 사용될 수 있다. 에스테르계 윤활유 조성물을 제조하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 비제한적인 예로서, 트리글리세라이드를 포함하는 다량의 생물학적으로 유래된 오일이 트리글리세라이드의 적어도 일부를 가수분해시켜 유리 지방산을 형성하도록 제공 및 가공되며, 여기서 지방산은 포화 지방산, 모노불포화 지방산, 및 폴리불포화 지방산, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 유형이다. 지방산은 적어도 모노불포화 지방산이 포화 지방산 및 폴리불포화 지방산으로부터 실질적으로 단리되도록 유형에 따라 분리된다. 다음으로, 모노불포화 지방산 중 적어도 일부가 변형되어 에스테르 생성물(예컨대, 트리에스테르를 포함함)을 형성하며, 포화 지방산 및/또는 폴리불포화 지방산 중 적어도 일부가 수소처리되어 알칸(파라핀)을 생성한다. 또한, 일부 구현예에서, 이러한 에스테르 생성물은 모노-, 디-, 및 트리에스테르 종, 및 이의 수산화 유사체 중 하나 이상을 포함할 수 있다는 것에 유의한다.
사상균 종 및/또는 균주(들)로부터의 산 pH 내성 효소
푸사리움 옥시스포룸 f. sp. 리코페르시시 균주 4287의 게놈이 최근에 시퀀싱되었고, 리그닌, 헤미셀룰로오스 및 셀룰로오스의 분해에 관여하는 다양한 유전자를 보유하는 것으로 나타났다. 또한, 이들 물질의 분해에 관여하는 효소(예컨대, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리그니나아제, 글루쿠로니다아제, 아라비노푸라노시다아제, 아라비노갈락타나아제, 페룰산 에스테라아제, 리파아제, 펙티나아제, 글루코만나아제, 아밀라아제, 라미나리나아제, 자일로글루카나아제, 갈락타나아제, 글루코아밀라아제, 펙테이트 리아제(pectate lyase), 키티나아제, 엑소-[3-D­글루코사미니다아제, 셀로바이오스 탈수소효소, 및 아세틸자일란 에스테라아제, 자일로시다아제, a-L-아라비노푸라노시다아제, 페룰로일 에스테라아제, 엔도글루카나아제, [3-글루코시다아제, Mn-퍼옥시다아제, 및 락카아제)가 F. 옥시스포룸 균주 F3에서 광범위하게 연구되었다(Xiros et al. (2009) Enhanced ethanol production from brewer's spent grain by a Fusarium oxysporum consolidated system. Biotechnol Biofuels 10:4). 결과적으로, 호산성 사상균 종 및/또는 균주(들), 예컨대 푸사리움 종 및 MK7로 명명된 호산성 사상균 균주는 리그노셀룰로오스 물질 및 폐기물 흐름(예컨대, 산 유청)과 같은 복합 탄소원을 가수분해하도록 완전하게 갖추고 있을 것으로 기대된다. 이들 호산성 사상균 종 및/또는 균주(들)는 다른 사상형 균주(pH>2; Starkey, 1973)와 비교하여 훨씬 낮은 pH(0.7-7.5)에서 성장할 수 있으므로, 리그닌, 헤미셀룰로오스 및 셀룰로오스 분해를 위한 효소는 낮은 pH에서 더 높은 활성을 가질 것으로 기대된다. 산성 조건하에 높은 활성을 갖는 효소는 낮은 pH에서 수행되는 공정에서 특히 유용할 것이다.
푸사리움 종에 의해 생산된 독소.
종종, 미생물 기반 생산은 오염을 막기 위해 많은 비용이 들고 시간 소모가 큰 방법의 사용을 필요로 한다. 상기에 논의된 바와 같이, 사상형 호산성 진균 종 및/또는 균주(들)는 다른 유기체에 의한 오염에 대해 매우 내성이다. 예를 들어, 푸사리움 속의 구성원들은 강력한 항생, 살충 및 식물독성 특성을 갖는 독소(예컨대, 푸모니신)를 생성하는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 사상형 호산성 MK7 진균 균주는 사상균 바이오매트의 생산에 사용될 때 첨가될 외부 항생제를 거의 또는 전혀 필요로 하지 않는다. 일부 푸사리움 종은 상이한 숙주 식물과의 관계에 의존적인 생산으로 9개의 상이한 독소를 생산할 수 있다(Marasas et al., 1984, Toxigenic Fusarium species, identity and mycotoxicology, ISBN 0271003480). 독소의 생산은 또한 발효에 사용된 배지에 따라 달라진다. 푸사리움 종에 의해 생산되고 분비된 독소는, 비제한적으로, 비카베린(bikaverin), 엔니아틴(enniatin), 푸사르산(fusaric acid), 리코마라스민(lycomarasmin), 모닐리포르민(moniliformin), 옥시스포론(oxysporone), 트리코테센(trichothecene), 제아렐론(zearelone), 다양한 나프토퀴논(naphthoquinone) 및 안트라퀴논(anthraquinone)(예컨대, 노나케타이드 나프타자린 퀴논, 비카베린 및 노르비카베린, 헵타케타이드, 넥트리아푸론, 5-0-메틸자바니신, 및 안하이드로푸사루빈 락톨)을 포함한다.
또한, 푸사리움 종으로부터의 독소는, 4-아세톡시시르펜디올(4-3-아세톡시-3,15-디하이드록시-12,13-에폭시트리코테크-9-엔, 유사한 화합물, 모노데아세틸안구이딘 4- 또는 15-아세틸시르펜트리올), 3-아세틸데옥시니발레놀(데옥시니발레놀 모노아세테이트, 3"-아세톡시-7", l5-디하이드록시-12,13-에폭시트리코테크-9-엔-8-온), 8-아세틸네오솔라니올(네오솔라니올 모노아세테이트, 4",8",15-트리아세톡시-3"-하이드록시-l2, 13-에폭시트리코테크-9-엔), 4- 또는 15-아세틸시르펜트리올(4-아세톡시시르펜디올), 아세틸 T-2 독소(3",4",15-트리아세톡시-8"-(3-메틸부티리(옥시)-12, 13-에폭시트리코-테크-9-엔), 안구이딘(디아세톡시시르페놀), 아베나세인, 뷰베리신, 부테놀리드(4-아세타미도-4-하이드록시-2-부테노익-산-락톤), 칼로넥트린(3",15-디아세톡시-12,13-에폭시트리코테크-9-엔), 15-데아세틸칼로넥트린(15-데-O-아세틸칼로넥트린, 3"-아세톡시-15-하이드록시-12,13-에폭시트리코테크-9-엔), 데옥시니발레놀(Rd 독소, 보미톡신, 3", T', 15-트리하이드록시-12, 13-에폭시트리코-테크-9-엔-8-온), 데옥시니발레놀 디아세테이트(디아세틸데옥시니발레놀), 데옥시니발레놀 모노아세테이트(3-아세틸데옥시니발레놀), 디아세톡시시르펜디올(7"-하이드록시디아세톡시시르페놀), 디아세톡시시르페놀(안구이딘, 4, 15-디아세톡시-3'-하이드록시12, 13-에폭시트리코테크-9-엔), 디아세톡시세르펜트리올(7", 8"-디하이드록시디아세톡시시르페놀), 디아세틸데옥시니발레놀(데옥시니발레놀 디아세테이트, 3", 15-디아세톡시-7-하이드록시12,13-에폭시트리코테크-9-엔-8-온), 디아세틸니발레놀(니발레놀 디아세테이트, 4, 15-디아세톡시-3', 7'-디하이드록시-12, 13-에폭시트리코테크-9-엔-8-온), 7", 8"-디하이드록시디아세톡시시르페놀(디아세톡시시르펜트리올, 4, 15-디아세톡시-3", 7", 8"-트리하이드록시-12, 13-에폭시트리코테크-9-엔), 엔니아틴, 프럭티게닌, 푸모니신 B1(1,2,3-프로판트리카르복실산 l,-l-[l-(12-아미노-4,9,11-트리하이드록시-2-메틸트리데실)-2-(1-메틸펜틸)-1,2-에탄디일] 에스테르; 마크로푸신), 푸사레논(푸사레논-X, 푸사레논, 모노아세틸니발레놀, 니발레놀 모노아세테이트, 4-아세톡시-3",7",15-트리하이드록시-12,13-에폭시트리코테크-9-엔-8-온) 푸사르산(푸사린산, 5-부틸피콜린산), 푸사린산(푸사르산), F-2(지랄레논), HT-2 독소 = 15-아세톡시-3",4-디하이드록시-8"-(3-메틸부티릴옥시)-12-에폭시트리코-테크-9-엔, 7"-하이드록시­디아세톡시시르페놀(디아세톡시시르펜디올, 4,15-디아세톡시-3",7"-디하이드록시-12,13-에폭시트리코테크-9엔), 8"-하이드록시디아세톡시시르페놀(네오솔라니올), 1,4-이포메아디올(1-(3-푸릴)-1,4-펜탄디올), 이포메아닌(1-(3-푸릴)-l,4-펜탄티온), 1-이포메아놀(1-(3-푸릴)-1-하이드록시-4-펜타논), 4-이포메아놀(l-(3-푸릴)-4-하이드록시4펜타논), 라테리틴, 리코마라스민, 모닐리포르민(1-하이드록시사이클로부트-1-엔-3,4-디온의 칼륨 또는 나트륨 염), 모노아세톡시시르페놀(15-아세톡시-3",4"-디하이드록시-12,13-에폭시트리코테크-9엔), 모노아세틸니발레놀(푸사레논-X), 모노데아세틸안구이딘(4-아세톡시시르펜디올), 네오솔라니올(8"-하이드록시디아세톡시시르페놀,4,15-디아세톡시-3 "8"-디하이드록시-12,13-에폭시트리코테크-9-엔), 네오솔라니올아세테이트(8-아세틸네오솔라니올), 네오솔라니올 모노아세테이트(8-아세틸네오솔라니올), 니발레놀(3",4",7",15"-테트라하이드록시-12,13-에폭시-트리코테크-9-엔-8-온), 니발레놀 디아세테이트(디아세틸니발레놀), 니발레놀 모노아세테이트(푸사레논-X), NT-1 독소(T-1 독소,4",8"-디아세톡시-3",15-디하이드록시-12,13-에폭시-트리코테크-9-엔), NT-2 독소(4"-아세톡시-3",8",15-트리하이드록시-12,13-에폭시트리코테크-9-엔), Rd 독소(데옥시니발레놀), 삼부시닌, 시르펜트리올(3",4",l5"-트리하이드록시-12,13-에폭시트리코테크-9-엔), 솔라니올 (네오솔라니올), T-1 독소 (NT-1 독소), T-2 독소 (4",15"-디아세톡시-3"­하이드록시-8"-(3-메틸부티릴옥시)-12,13-에폭시트리코테크-9-엔), 트리아세톡시-시르펜디올 (4",8",15"-트리아세톡시-3",7"-디하이드록시-12,13-에폭시트리코테크-9-엔), 트리아세톡시-시르페놀 (3",4",l5"-트리아세톡시-12,13-에폭시트리코테크-9-엔), 보미톡신(데옥시니발레놀), 야바니신, 제랄레놀(2,4-디하이드록시-6-(6,10-디하이드록시-트랜스-l-운데세닐)-벤조산-락톤), 지랄레논(6-(10-하이드록시-6-옥소-트랜스-l-운데세닐)-레소르사이클릭산 락톤)을 포함할 수 있다. F. 옥시스포룸에 의해 생산된 보다 상세한 독소는 문헌[Tatum et al. (Naphthoquinones produced by Fusarium oxysporum isolated from citrus. 1985, Phytochemistry 24:457-459), Tatum et al. (Naphthofurans produced by Fusarium oxysporum isolated from citrus. 1987, Phytochemistry , 26:2499-2500), Baker et al. (Novel anthraquinones from stationary cultures of Fusarium oxysporum . 1998, J Ferment Bioeng 85:359-361). Thrane ( Fusarium species on their specific profiles of secondary metabolites, in Fusarium. Mycotoxins, taxonomy and pathogenicity, 1989, ed by Chelkowski J, Elsevier, NY, USA, pp 199-225); Baker et al., Antimicrobial activity of naphthoquinones from Fusaria, Mycopathologia 111: 9-15, 1990; Marasas et al. (Toxigenic Fusarium species, identity and mycotoxicology, 1984, Pennsylvania State University Press, University Park, PA, USA)]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원 전반에 인용된 모든 참고문헌, 특허, 및 공개된 특허 출원뿐만 아니라 도면 및 서열 목록은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.
실시예
실시예 1: 자연 환경에서의 균주 MK7
자연 발생 균주 MK7은 자연에서 조류, 고세균 및 세균과 항상 결합되어 있으며, 용수 L당 0.5 g 미만의 건조 바이오매스의 평균 밀도를 특징으로 한다(도 1). 또한, MK7은 자연에서 "스트리머(streamer)"로 나타난다. 퍼셀(Purcell) 등은 "스트리머"를 하기와 같이 정의한다: "스트리머는 부착 지점에서 흐르는 물 속으로 돌출하는 사상형 및 다른 세포 형태의 액침된 응집체이다" (Purcell et al. (2007) FEMS Microbiology Ecology7 60:456-466). 총 스트리머 바이오매스의 백분율로서 균주 MK7은 10% 미만이다. 또한, 자연에서 균주 MK7 바이오매스는 대분생자 세포로서 30%를 초과하는 바이오매스를 특징으로 하며, 이는 본 개시내용에서 개괄된 방법에 의해 생산된 표면 발효 바이오매트에서는 전혀 발견되지 않는다.
실시예 2: 인공 배지의 제조
표 1A에 열거된 성분을 22-30℃의 탈이온수(18.2 Mohm)에 첨가한 후, pH를 2.8로 조정하고, pH를 13 N HCl로 더 낮게 조정하여 하기 절차에서 사용된 MK7-1 액체 배지를 제조하였다. pH를 오크톤 인스트루먼츠(Oakton Instruments) 모델 150 pH 미터 및 프로브(Orangeburg, NY)를 사용하여 측정하였다. 그리고 나서, 배지를 20분 동안 끓이고, 사용하기 전에 실온(~23℃)으로 냉각하였다. 액체 배지를 첨가하기 바로 전, pH를 오크톤 인스트루먼츠 150 pH 미터 및 프로브를 사용하여 다시 확인하고 필요한 경우 pH 2.8로 다시 조정하였다.
MK7-3 액체 배지를 표 1B에 열거된 성분을 사용하여 동일한 방법으로 제조하였다.
일부 구현예에서, 사용된 탄소원은 글리세롤이 아니라 다양한 다른 탄소원, 예컨대 당, 글리세롤, 리그노셀룰로오스 물질, 리그노셀룰로오스 물질의 가수분해물, 도시 또는 농업 폐기물, 식품 가공 폐기물(예컨대 산 유청), 산업 폐기물 흐름 생성물, 감자 폐기물(감자 껍질, 분해로 인한 감자 폐기, 감자 절단, 멍이 든 감자), 전분 폐기물, 사탕무 폐기물, 사탕무 펄프, 옥수수 가공으로부터의 폐기물(즉 옥수수 침지액), 바이오연료의 생산으로부터의 폐기물(셀룰로오스 에탄올 생산으로부터의 잔류물, 혐기성 소화액, 등)으로부터 선택될 수 있다. 이 경우, 배지는 사용된 탄소원으로부터의 영양소의 기여를 수용하도록 조정된다. 예를 들어, 탄소원이 당밀, 산 유청, 또는 리그노셀룰로오스인 경우, 필요한 미량 원소는 탄소원에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 제공될 가능성이 있으며 대량 영양소만이 배지에 첨가될 필요가 있을 수 있다. 다른 구현예에서, 탄소원은 "식품 등급"으로 분류될 수 있다. 이 경우, 탄소원과 관련된 미량 원소 및 대량 영양소의 기대가 없으므로 모든 미량 원소 및 대량 영양소가 첨가되어야 한다.
표 1A. 접종물 생성에 사용된 MK7-1 배지의 성분.
Figure pct00001
표 1B. MK7-3 배지의 성분.
Figure pct00002
실시예 3: 접종 공정
트레이의 접종에 사용될 배양물을 MK7-1 액체 배지에서 액침 발효 조건하에 10 L 생물반응기에서 성장시켰다. 다른 생물반응기 크기가 가능하며 10 L 반응기 크기의 선택은 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다는 점에 유의해야 한다. 10 L 반응기는 하부에 PVC 엔드캡(endcap)이 있는 10.16 cm 직경의 투명한 PVC 배관의 1.3 m의 긴 부분으로 구성되었다. 3 mm 구멍이 있는 플라스틱 통기 포트/부품을 하부 엔드캡에 부착하고, 공기를 공급하는 배관을 통기 포트에 부착하였다. 플라스틱 샘플링 포트/밸브를 하부 엔드캡의 하부에서 15 cm 떨어진 투명한 PVC의 벽에 부착하였다. 투명한 PVC 반응기의 상부를 멸균 거즈로 덮고, 기체가 반응기에서 빠져 나가도록 3 mm 구멍이 있는 PVC 엔드캡을 헐겁게 맞춰 고정시켰다. 조립된 생물반응기가 도 2에 나타나 있다.
10 L 생물반응기를 위한 접종물을 사상형 호산성 MK7 진균 균주의 보관된 배양 스톡(Lot# 003)으로부터 제조하였다. 보관된 스톡 배양물은 MK7-1 플레이트 배지에 대해 표 1에 기재된 바와 같이 1.5% 한천(BD Difco 과립화 한천, Lot # 5287994, ThermoFisher, Waltham, MA), 글리세롤 및 무기 영양소로 구성된 고체 배지를 함유하는 멸균 페트리 디쉬에서 성장한 사상형 호산성 MK 7 진균 균주 균사체 매트로 구성되었다. 한천 배지를 20분 동안 끓이고, 배지를 50℃로 냉각시킨 다음, 25 mL의 용액을 멸균 페트리 플레이트에 부어 제조하였다. 냉각 및 고형화 후, 보관된 스톡으로부터 샘플을 수집하기 위하여 멸균 루프(화염에서 적색으로 가열되고 냉각됨)를 사용하여 2세대 보관된 냉동고 스톡을 플레이트에 접종한 다음, 이를 페트리 플레이트에 스트리킹하였다(도 3A).
성장 5일 후, 균사체 매트가 한천 배지의 표면 위에서 완전히 성장하였다(도 3B). 이후, 배양물을 -80℃에서 동결시켰다. 10 L 반응기에 접종하기 5일 전에, 페트리 플레이트 스톡을 냉동고에서 꺼내어 2시간 동안 실온(~23℃)으로 평형화시켰다. 이후, 한천의 표면에 성장한 균사체 매트를 멸균 집게(집게는 화염으로 적색으로 가열되고 이소프로판올로 냉각됨)로 꺼내고, 멸균 거즈 천이 덮인 멸균 1 L 유리 배플드 진탕 플라스크 내의 350 mL의 멸균 액체 배지에 넣었다. 10 L 생물반응기를 위한 접종물로서 사용하기 전에 5일간 플라스크를 VWR OS-500 실험실 진탕기(VWR, Radnor, PA)에서 200 rpm으로 회전시켰다.
접종물을 받기 위한 준비로서, 330 mL의 농축된 차아염소산 나트륨 용액(Chlorox® 표백 = 8.25% 차아염소산 나트륨)을 생물반응기 내의 11 L의 음용 품질의 수돗물에 첨가하고 2일간 평형화시켜 10 L 생물반응기를 멸균하였다. 2일 후, 추가의 330 mL의 농축된 차아염소산 나트륨 용액을 반응기에 첨가하였다. 1일 후, 희석된 차아염소산 나트륨 용액을 반응기에서 완전히 배수시키고, 2 L의 열수를 첨가하고 소용돌이치게 하여 생물반응기 내부의 모든 표면을 세척함으로써 반응기를 ~80℃의 끓인 물로 세척하였다. 그리고 나서, 세척수를 배수시켰다. 3.5 L의 멸균 MK7-1 액체 배지를 생물반응기에 첨가하고, 반응기의 하부에 위치한 통기 포트를 통해 분당 400 mL의 속도로 멸균 공기(0.2 um 여과됨)로 버블링시켰다. 이러한 버블링 조건은 직경이 3 내지 30 mm 크기 범위인 버블을 생성하였고 성장 동안 액체 배지 전반에 진균 세포(부유 세포)의 혼합 및 균일한 분포를 야기하였다. 실험은 더 높은 버블링 속도 또는 더 작은 버블 크기가 생물반응기 내의 표면에 달라붙는 바이오매스 덩어리를 형성하는 바이오필름 성장 습성을 야기한다는 것을 보여주었다. 따라서, 세포의 균질 현탁액이 트레이 반응기의 접종에 바람직하므로, 상기 바이오필름 성장 습성은 바람직하지 않다. 이후, 1 L 진탕 플라스크에서 성장한 접종물을 무균 기술(생물반응기의 상부를 열기 전에 70% 이소프로판올/30% 물로 모든 가까운 외부 표면을 분무하고 생물반응기의 내부 표면을 접촉하지 않음)을 사용하여 10 L 반응기에 첨가하였다. 10 L 반응기에서 추가의 배양 부피를 제조하기 위해, 배양물이 6 g/L 건조 사상형 바이오매스 밀도에 도달한 후에 멸균된 신선한 MK7-1 액체 배지를 반응기에 첨가하였다. 신선한 MK7-1 액체 배지가 반응기에 첨가되는 경우, 부피는 반응기 내의 액체 배양 부피의 9배 이하이어야 한다. 통기 시스템이 작동하는 동안 생물반응기의 측면 포트를 통해 샘플을 수집하고 알려진 부피를 진공 여과 장치(Millipore, Cat# WP6111560, XX1004700, XX1004705, Darmstat, Germany)를 사용하여 0.22 um 필터(Millipore, Cat# GSWP04700, Darmstat, Germany)를 통해 여과함으로써 건조 사상형 바이오매스를 측정하였다. 미리 칭량한 필터와 습식 사상형 바이오매스를 Benchmark Scientific Incu-Shaker Mini(Edison, NJ)에서 4시간 동안 50℃에서 건조시킨 다음, 메틀러 톨레도(Mettler Toledo) 저울 모델 MS3035(Columbus, OH)에서 칭량한다.
사상형 호산성 MK7 진균 균주는 10 L 반응기에서 약 0.024 h-1의 비성장 속도(specific growth rate)를 가지며(도 4), 지수 단계 동안의 성장은 하기 식을 따를 것이다:
(식 1)
Figure pct00003
상기 식에서 x는 최종 바이오매스이고, x o 는 초기 바이오매스이며, μ는 비성장 속도이고, t는 시간이다. 트레이 반응기에서 접종물로 사용하기 위해서는, 10 L 반응기에서의 배양 세포 밀도가 6 g/L 건조 중량을 초과해야 하고 후기 지수 성장 단계에 있어야 한다(도 4; 지수 성장은 세포수가 지속적으로 2배가 될 때의 배양에서의 성장 기간이며; 후기 지수 성장은 세포 성장 속도가 감소하기 시작할 때의 지수 성장의 중지 바로 전의 기간임). 더 낮은 세포 밀도를 갖는 배양 배지가 접종물로서 사용되는 경우, 그것은 유의하게 더 느린 바이오매트 형성(2일보다 긴 유도기)을 초래할 것이므로 바람직하지 않다.
접종물은 본질적으로 부유 세포로 구성된 것으로 본원에서 정의되며, 이는 덩어리를 형성하거나 응집되지 않고 약 4 미크론 폭 내지 5-20 미크론 길이인 단일 세포로서 정의된다.
표면 발효 또는 고체 기질 표면 발효를 위한 표면 트레이 반응기에 접종하기 위해, 액체 배양물을 버블링에 의해 연속적으로 혼합하면서 반응기의 하부 근처의 포트를 통해 10 L 반응기로부터 제거하였다. 포트의 내부에 70% 이소프로판올/30% 탈이온수 혼합물을 분무한 다음 밸브를 열어 약 25 mL의 배양물을 배출시킴으로써 접종물을 위해 사용되는 배양물을 무균 방식으로 꺼내고, 밸브를 세척하였다. 이 쓸모없는 접종 배양물은 처분하였다. 접종 배양물을 실시예 3에 기재된 바와 같이 트레이 반응기 배지에 직접 첨가하였다.
실시예 4: 표면 발효를 통한 트레이 반응기에서 균주 MK7의 성장.
사상형 호산성 MK 7 진균 균주를 얕은 트레이 반응기에서 성장시켰다. 상이한 트레이 크기가 본 혁신의 교시 내용에 따라 가능하다는 것에 유의해야 한다. 본 실시예에서, 폴리에틸렌 트레이의 내부 치수는 41.27 cm 폭, 61.28 cm 길이, 2.54 cm 높이 측벽이었다(매트 성장에 이용가능한 총 표면적 = 0.253 m2; 도 5; Winco, Idaho Falls, ID). 트레이는 찌꺼기 및 화학물질이 없이 깨끗해야 할 뿐만 아니라 잠재적인 오염을 최소화하기 위해 사용하기 전에 멸균하는 것이 바람직하다. 결과적으로, 사용하기 전에, 트레이를 비누 및 따뜻한 음용 품질의 수돗물(50-70℃)로 철저히 세척하고, 1분 동안 따뜻한 수돗물로 철저히 헹구고, 모든 비누 잔류물의 제거를 확인하였다. 이후, 모든 표면이 70% 이소프로판올/30% 탈이온수(18.2 Mohm)의 용액으로 적셔질 때까지 트레이의 모든 표면을 분무하고 알코올 혼합물을 적신 종이 타월을 사용하여 장갑을 낀 손으로 트레이를 닦았다. 이후, 트레이가 엎질러지지 않고 액체 배지(하기 기재됨)를 받아들이고 수용할 수 있도록 상기 트레이를 랙 시스템 안에 넣고 건조시켰다.
본원에 기재된 표면 발효 공정에 사용하기 위한 트레이 및 랙 시스템은 바이오매트를 형성하고 바이오매트의 빠른 성장을 가능하게 하는 모든 필요한 성분을 제공한다. 반응기 트레이를 수용하는데 사용된 랙 시스템은 글로벌 장비 회사(Chicago, IL; 도 5A, B)로부터 구입한 크롬 코팅 철강, 39 트레이 랙이었다. 투명한 플라스틱 사란(Saran)®과 같은 랩 16인치 폭(Costco, Bozeman, MT)을 사용하여 랙 시스템을 감싸고 폐쇄하고, 주변 방에서 트레이를 분리하였다. 이것은 환경 조건(습도, 기류)의 조절과 오염의 최소화를 가능하게 하였다(도 5A, B). 가습된 멸균 공기를 200 mL의 탈이온수(18.2 Mohm), 수온 22-30℃(공기를 가습하기 위해)를 통한 버블링 및 오토클레이브된 0.2 um 필터(Millipore, Cat# SLFG85000, Darmstat, Germany) 통과를 통해 800 mL/분의 속도로 밀폐된 랙에 불어넣어 미생물을 제거하였다. 이상적으로, 기류의 속도는 랙 시스템에 약간의 압력(>0.1 psi)을 생성하여 바이오매트가 원하는 밀도 및/또는 농도에 도달할 때까지 밀폐된 트레이 및 랙 시스템에 유입되는 공기 오염물질의 양을 최소화하는 속도이다.
미생물 매트가 활성인 동안, 세포는 호흡하고; 즉, 이산화탄소 및 열을 생산할 뿐만 아니라 산소를 소비한다. 이산화탄소 축적은 산소의 이용가능성을 감소시킬 수 있으므로 제한되어야 한다. 따라서, 기류는 미생물 호흡 중에 생산되고 축적되는 이산화탄소를 제거해야 한다. 또한, 기류는 미생물 호흡 중에 생성된 과도한 열을 제거하고 호흡하는 세포에 충분한 산소를 공급해야 한다. 기류는 이러한 요구를 충족시키도록 조정되어야 한다. 예를 들어, 더 많은 수의 트레이가 사용될 때 요구가 증가하므로, 기류는 증가된 온도 및 대기 요구를 충족시키기 위해 증가해야 한다. 기류는 진균 균사를 교란시키고 이들의 성장 및 기능을 억제할 정도로 강하지 않아야 한다. 이상적으로, 트레이 시스템에서 기류는 트레이를 가로지르는 공기 흐름을 유발할 것이다. 일 구현예에서, 기류는 공기를 0.2 um 필터에 통과시키고 매트를 가로지르게 하는 팬에 의해 생성될 수 있다. 팬 속도 및 생성된 기류는 랙에 위치한 온도, 이산화탄소 및 산소 센서에 기초한 스마트 센서/작동 시스템에 의해 제어될 수 있다.
트레이 시스템의 온도는 성장 동안 25±2℃의 범위였다. 온도는 ThermoScientific Genesys 10S Series, Biomat 3S, Evolution 60S 소프트웨어 및 센서 시스템(Thermo Fisher. Waltham, MA)을 사용하여 측정하였다. 열전쌍 센서를 트레이 랙 시스템의 중간 높이와 상부에 트레이 랙 시스템 내부 20 mm에 두었다.
MK7-1 배지를 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다[영양소의 첨가, pH 조절, 끓이기, 실온(~23℃)으로 냉각]. 배지 제조 후, 접종물 반응기로부터 접종 배양물을 수득하고(실시예 3 참고), 7.5%(부피 대 부피)의 MK7-1 배지의 비율로 포트(pot)에 첨가하였다. 예를 들어, 113 mL의 접종물을 포트 내의 1.5 L의 배지에 첨가하였다. 접종물 대 배지의 이 비율은 세포의 빠른 성장 및 매트 형성을 위한 적절한 조건을 제공한다. 이 구현예에서, 신선한 배지의 접종 후 원하는 건조 세포 사상형 바이오매스는 0.45 내지 0.75 g/L이다. 그러나, 0.01 내지 100g/L 범위의 밀도가 잠재적으로 현재 트레이 시스템에서 바이오매트를 성공적으로 생성하는데 사용될 수 있다. 접종물 대 배지 비율을 감소시키면 실시예 3에 기재된 바와 같이 성장이 더 느려진다.
탄소 기질의 부피 대 배지의 부피는 결과적으로 바이오매스 생산의 속도에 영향을 미친다. 일반적으로, 전술한 비율이 너무 작으면, 이용가능한 탄소의 부족으로 인해 성장 속도가 느려지며; 즉, 이들은 탄소가 제한된다. 전술한 비율이 너무 크면, 생성된 삼투압이 너무 커져 바이오매스 성장 속도가 감소한다. 또한, 탄소가 제한되면, 생성된 바이오매스 밀도 및 바이오매스 응집성이 작아, 표면 발효 공정에 의해 제공된 가공 및 취급 이점이 줄어든다. 예를 들어, MK7로 명명된 사상균 균주는 전술한 비율이 8-15%일 때 최적 성장 조건을 갖는다.
배지/세포 현탁액을 멸균된 대형 플라스틱 스푼(30 cm 길이, 알코올 혼합물로 세척함으로써 멸균됨)으로 혼합하고, 생성된 혼합물 1.5 L를 멸균된(알코올 혼합물로 세척됨) 눈금 실린더를 사용하여 각 트레이에 첨가하였다. 모든 트레이를 랙 시스템에 넣은 후, 랙 시스템을 투명한 플라스틱으로 감쌌다.
배양 6일 후, 생성된 바이오매트는 충분한 인장 강도 및 구조적 완전성을 갖는 3 내지 10 mm 두께이므로 인열 없이 취급될 수 있다(도 6). 먼저 랙 시스템 주위의 투명한 플라스틱 랩을 제거하고 랙으로부터 트레이를 꺼내어 바이오매트를 수확하였다. 바이오매트를 손으로 트레이에서 꺼내어, 12.7 x 23 cm 파이렉스 유리 트레이에 놓고 음용 품질의 수돗물로 2분 동안 부드럽게 세척하였다. 세척된 바이오매트를 유리 트레이에 두어 건조시키거나 또는 3.7 L 플라스틱 백에 넣어 동결시켰다. 건조시키기 위해, 바이오매트를 온도 조절 오븐에 넣고 60±1℃에서 45분 동안 가열하여 많은 효소를 불활성화시키고 매트 내의 생화학적 변형을 제한한 다음, 건조 중량이 변하지 않을 때까지(약 48-72시간) 50±1℃에서 가열하였다. 상기 조건에서 생상된 바이오매트의 평균 건조 중량은 사상형 호산성 MK7 진균 균주에 대해 트레이당 81 g 건조 사상형 바이오매스였다. 이것은 54 g/L, 324 g/m2 표면적 및 0.37 g/L/시간의 생산성과 동등하다. 건조되지 않은 바이오매트의 평균 수분 함량은 0.17 건조 사상형 바이오매스/g 또는 83% 액체였다.
트레이에서의 세포 성장은 전형적으로 도 7에 나타낸 성장 곡선에 따라 일어난다. 세포는 약 48시간의 성장까지 부유(배지 전반에 균일한/균일하게 분포된 세포) 상태로 성장한다. 48시간 후, 세포는 배지 표면에서 응집하고 바이오필름; 즉 세포가 뒤얽혀 붙어 있는 미생물 매트를 형성하기 시작한다. 매트는 처음에는 매우 얇은 피부이지만, 탄소 기질 또는 다른 영양소 부족과 같은 일부 제한 인자가 성장을 제한할 때까지 계속 빠르게 성장한다.
바이오매트의 방해에 대한 민감성 및 이에 따른 성장 감소로 인해, 트레이가 방해받지 않은 상태를 유지하고 바이오매트의 완전성이 전체 성장 기간 동안 유지되는 것이 중요하다. 바이오매트에 영향을 미치는 방해는 트레이의 과도한 흔들림, 매트에 압력을 가하는 것, 바이오매트의 표면에 액체를 도포하는 것, 바이오매트를 가로지르는 빠른 기류, 균사의 방해, 파괴 또는 압축, 또는 매트 자체의 물리적 파괴를 포함한다. 이러한 유형의 방해는 빠른 성장 속도 및 액체 부피 및 표면적당 높은 사상형 바이오매스 축적을 포함하는 바이오매트를 성장시키는 장점을 상실시킨다.
기균사 및 균사체는 전체 바이오매트에서 세포의 호흡을 위해 산소를 공급하는 중요한 역할을 한다고 가정된다. 따라서, 기균사/균사체의 형성, 성장 및 기능은 바이오매트의 빠른 성장에 중요하다. 결과적으로, 이러한 균사/균사체의 형성 또는 성장에 영향을 미치는 임의의 방해는 바이오매트 성장의 감소를 초래한다.
상기 기재된 표면 발효 방법 및 배지는 바이오매트를 형성하고 빠른 성장을 가능하게 하는 모든 필요한 성분을 제공한다. 상기 개념을 사용하여 다양한 트레이 시스템을 시험하였고, 단위 면적당 거의 동등한 생산성이 얻어졌다. 예를 들어, 7.5% 글리세롤 및 10:1 C:N 비율을 사용하여, 생물반응기의 표면적이 0.02에서 1 m2로 증가함에 따라 생산성은 성장 단계 동안 약 44 g/m2/d로 일정하게 유지되었다
실시예 5: 사상균 바이오매트 성장 및 생산성에 대한 트레이 크기의 영향
바이오매트 성장 및 생산성에 대한 트레이 크기의 영향을 시험하기 위해, 균주 MK7 사상균 바이오매트를 0.02 m2 파이렉스® 유리 트레이, 0.25 m2 폴리프로필렌 트레이 및 1.77 m2 플라스틱 라인드 트레이에서 7.5% 글리세롤을 갖는 MK7-1 배지에서 성장시켰다. 액체 배지 부피 대 표면적 비율은 모든 처리에 대해 6 L/m2이었다. 성장 속도는 트레이 크기에 의해 단지 최소한으로 영향을 받았고, 선형 성장 속도가 6일 후에 관찰되었다(도 8). 건조 바이오매스 생산성은 0.02, 0.25, 및 1.77 m2 트레이에 대해 각각 1.32, 1.54, 및 1.57 /m2/h였다.
실시예 6: 상이한 배지에서 균주 MK7의 성장
사상형 호산성 MK7 진균 균주 성장 특징의 성장 특징(즉, 성장 속도, 세포 밀도, 기질 전환 효율, 매트 형성)은 성장 배지의 선택 및 배양물이 SSF/액침 발효 또는 SSSF/표면 발효 조건에서 성장하는지 여부의 함수로서 급격히 달라진다. 초기에는 옐로스톤 국립공원에서의 유기체 자연 환경에서 발견된 화학물질을 모방하기 위해 고안되었지만 다른 사상균에 유익한 것으로 밝혀진 영양소 공급원을 맞추도록 질소, 인, 칼슘 및 마그네슘 농도가 증가된 역사적(2009년 5월부터 2012년 11월) 배지 MK7A에서 호산성 MK7 진균 균주를 배양하였다(표 2; MK7A). MK7-1 배지는, 특히 표면 발효에 의한 매트 형성과 관련하여, 사상형 호산성 MK7 진균 균주 성장 특징을 향상시키고 개선하기 위해 개발되었다(표 2). 구체적으로, 인산염, 칼슘 및 마그네슘 및 질소가 증가하였고 추가 질소원이 첨가되었다(우레아). 칼슘, 마그네슘 증가 및 우레아 첨가는 특히 성장 속도를 증가시키고 매트 형성을 향상시켰다.
표 2. 표면 발효에 의한 고밀도 사상형 바이오매스 형성을 위해 고안된 변형된 MK7-1과 비교하여 역사적 배지 MK7A(액침 발효)의 화학적 성분.
Figure pct00004
MK7A 배지의 초기 실험은 진탕 플라스크에서 액침 발효 조건하에 배타적으로 수행되었다. 최대 성장 속도, 전환 효율(사상형 바이오매스로 전환된 탄소 기질의 g) 및 이들 조건하에 생산된 가장 높은 사상형 바이오매스는 각각 0.072 g/L/h; 22%; 및 8.6 g/L이었다(표 3).
표 3. 다양한 조건 하에서의 사상형 호산성 MK7 진균 균주의 성장 특징.
Figure pct00005
세포 밀도를 증가시키기 위해, MK7A 배지를 표면 발효 조건과 함께 이용하였다. 바이오매트는 글루코스 또는 수크로스에서 4-15%의 탄소 농도 및 글리세롤에서 4-30%의 탄소 농도로 형성되었다. 우레아는 표면 발효 조건에서 생산 속도를 증가시키는 것으로 밝혀졌으며, NH4NO3, NH4PO4, NH4SO4는 NH4의 대체 공급원이다. 우레아 첨가는 다른 NH4 공급원에 비해 시장 가격이 저렴한 이점이 있다. 12.5% 탄소 기질은 사상형 바이오매스 밀도를 180 g/L(트레이에서 바이오매트 제거 후 밀도)까지 증가시키고 성장 속도를 최적화하는데 이상적인 것으로 밝혀졌다.
표면 발효 및 MK7-1 배지로 생산된 고밀도 바이오매트는 액침 발효 조건(하나의 배지를 가짐)보다 하기를 포함하는 많은 이점을 갖는다 : (1) 액침 발효의 최대 24.1 g/L과 비교하여 180 g/L(트레이에서 바이오매트 제거 후 밀도)까지의 증가된 사상형 바이오매스 밀도(표 3), (2) 액침 조건하에서 0.28 g/L/hr의 최대 속도와 비교하여 0.46 g/L/h까지의 증가된 성장 속도, (3) 최대 성장 속도에 대해 7.5에서 12.5%로의 탄소 공급원료의 증가된 밀도, (4) 특히 고밀도 사상형 바이오매스가 생산될 때 사상형 바이오매스에 대한 훨씬 더 쉬운 수확 조건(예컨대 원심분리가 필요하지 않음), (5) 액침 발효를 위한 대형 복합 통기 생물반응기와 비교하여 사상형 바이오매스를 통기할 필요가 없음 (6) 매우 큰 상업적 액침 발효기와 비교하여 표면 트레이 시스템을 사용하기 위해 훨씬 더 확장가능함, (7) 보다 적은 액체 폐기물.
C:N 비율을 <10:1로 감소시키는 것은 또한 사상형 바이오매스 생산에 매우 유익하였고 단백질 대 지질의 수준을 증가시켰다. 역사적으로, MK7A 배지는 특히 30:1을 초과하는 C:N 비율에서 사상형 호산성 MK7 진균 균주에 의해 지질을 생산하기 위해 고안되었다. 배양 조건과 함께 C:N 비율을 변화시키는 것은 사상형 호산성 MK7 진균 균주 바이오매스에서의 지질 농도를 바이오매스 중량의 5 내지 60%까지 조정할 수 있게 해 준다. 사상형 바이오매스에 대한 지방산 프로파일은 다양한 간단한 탄소 기질(예컨대 글리세롤, 글루코스, 수크로스)을 갖는 MK7A 및 MK7-1 배지 사이에서 매우 유사하였지만, 온도는 폴리불포화 지방산의 농도를 증가시키는 것으로 나타났고, 오메가-3 리놀렌산은 더 낮은 상대적 온도에서 시간이 경과함에 따라 증가하였다(도 9).
실시예 7. MK7A 및 MK7-1 배지에서 균주 MK7의 성장.
균주 MK7 사상균 바이오매트를 탄소원(공급원료)으로서 수크로스 또는 글리세롤을 갖는 MK7A 및 MK7-1 배지를 사용하여 표면 발효 조건하에서 생산하였다. MK7A 및 MK7-1 배지로부터 생산된 사상균 바이오매트를 평가하기 위해, 5개의 상이한 배지 제형을 제조하였다: 1) MK7A 배지 중에 4% 수크로스, 2) MK7-1 배지 중에 4% 수크로스, 3) MK7A 배지 중에 4% 글리세롤, 4) MK7-1 배지 중에 10% 글리세롤, 및 5) MK7-1 배지 중에 12.5% 글리세롤. 5개의 배지 제형 모두의 pH를 농축된 HCl을 적절히 첨가하여 2.7로 조정한 다음, 10분간 끓였다. 실온(~23℃)으로 냉각한 후, 지수 성장 단계에 있는 7.5% 부피/부피의 균주 MK7 접종물을 각 배지에 첨가하였다. pH를 2.7로 재조정하고, 접종된 배지의 250 mL 분취액을 살균한 0.023 m2 파이렉스® 유리 트레이에 첨가하였다. 그리고 나서, 트레이를 트레이 랙 시스템에 넣고, 접종물을 갖는 배지의 혼합물을 23±1℃에서 배양하였다.
이전 실험의 결과에 기초하여, 바이오매스는 모든 배지 조합에서 형성될 것으로 예상된다. 또한 바이오매스는 MK7-1 배지에 비해 MK7A 배지에서 더 빠르게 형성될 것으로 예상된다. 이것은 성장을 위한 MK7A 배지의 보다 적절한 화학적 조건 때문이다(예컨대, 더 낮은 이온 강도/삼투압, 더 낮은 암모늄 농도). 그러나, 시간이 지나면, MK7-1 배지의 표면에서 발생하는 사상균 바이오매트는 MK7A 배지에서 성장하는 바이오매스보다 더 빠른 성장 속도로 성장할 것이다. 즉, 두 시스템은 상이한 성장 속도 곡선을 가지며, MK7-1 배지는 초기 단계에서 빠른 성장 후 후기 단계에서 감소된 성장 속도를 나타낸다. 반대로, MK7-1 배지에서 성장한 사상균 바이오매트는 초기 성장 단계에서 초기에는 상대적으로 느린 성장 속도 후 바이오매스 성장의 후기 단계에서 매우 빠른 성장 속도를 갖는다. 결국, MK7-1 배지에서 성장한 사상균 바이오매트는 MK7A 배지에서 성장한 바이오매트보다 더 두꺼워지고 더 큰 인장 강도를 갖는다. MK7A 배지에서의 유의하게 더 낮은 농도의 영양소(예컨대 N, P, K)는 초기 영양소 제한을 초래하여, MK7-1 배지에서 생산된 바이오매트만큼 뚜껍거나 강하지 않은 바이오매트로 성장 억제를 야기할 것으로 기대된다.
실시예 8: 균주 MK7에 의해 생산된 바이오매트의 구조
바이오매트의 구조를 투과광 현미경에 의해 결정하였다. 여기서, 바이오매트는 7.5% 글리세롤을 갖는 MK7-1 배지에서 5일 동안 성장한 균주 MK7로부터 생산하였다. 바이오매트를 수확하고, 동결시키고(-20℃), 1cm x 1cm 사각형 블록으로 절개한 다음, 냉동주형(VWR 25608-916, Radnor, PA)에서 10% 젤라틴(Sigma G2500-3000 Bloom gelatin, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO)에 포매시켰다. 젤라틴/조직 샘플을 냉동주형을 액체 질소 배스의 증기 상에 노출시켜 순간 냉동시킨 다음 -20℃에 밤새 두었다.
라이카 모델 39475214 냉동절편기(Leica, Wetzlar, Germany)를 사용하여 냉동절편화를 달성하였다. 샘플을 냉동주형에서 꺼내어 OTC 조직 동결 배지(Leica 14020108926)로 코팅한 다음, 10-50 μm 두께 슬라이스로 냉동절편화하였다. 샘플 슬라이스를 투과광 현미경(현미경: Zeiss AxioObserver; Camera: Zeiss AxioCam HRc, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 시각화하고 이미지화하였다.
글리세롤 매트에 대해, 적어도 2개의 뚜렷한 층이 관찰되었다: (a) 밀집 하부 층 및 (b) 기균사 층. 일부 샘플에서는, 적어도 3개의 구조적으로 상이한 층이 보였다: (a) 밀집 하부 층, (b) 기균사 층 및 (c) 전이 구역 층(도 10A 및 B 참고). 전형적으로, 기균사 층이 가장 가시적으로 우세하고, 그 다음에 밀집 하부 층이 우세한 번면, 전이 구역 층은, 존재하고/하거나 가시적인 경우, 가장 작다. 예를 들어, 도 10A에 나타낸 바이오매트와 같은 일부 경우, (a) 밀집 하부 층 대 (b) 기균사 층 대 (c) 전이 구역 층의 가시적인 비율은 약 3.86 대 약 9.43 대 약 1이었다. 도 18B에 나타낸 바이오매트와 같은 또 다른 샘플에서, 비율은 약 1.7 대 약 3.7 대 약 1이었다. 도 18C에서 명백한 가시적으로 뚜렷한 전이 구역 층은 존재하지 않았다.
MK7-3 성장한 바이오매트의 추가의 광학 이미징은 밀집 하부 층과 비교하여 상부 기균사 층에 지질 또는 색소가 존재하지 않는다는 것을 나타내었다(도 11A 및 11B). 기균사는 매트에서부터 연장하는 것으로 나타나며, 각각은 균사 사이에 액체 없이 대기에 노출된다. 이것은 이들을 액체 및/또는 세포외 다당류/단백질 매트릭스에 의해 분리된 매트의 다른 층(들)에서의 균사/균사체와 구별시킨다. 기균사는 산소 이동 및 CO2 이동을 담당한다. 산소 접근성은 상부 기균사 층에 산소 흡수 균사를 생성한다. 이들 기균사는 하부 매트 층(들)에서 발견되는 균사/균사체보다 긴 것으로 보인다(도 11B를 도 11C와 비교). 상부 층의 기균사는 또한 수직 배향이 우세한 경향이 있으며, 즉 이들은 사상균 바이오매트 공기 계면에 수직으로 배향되는 경향이 있다.
수직 배향은 밀집 하부 층의 균사에서 우세하지 않았다(도 11C). 여기서, 균사는 뒤얽혀 있고, 혼합된 배향을 가지며, 수평 배향이 우세한 경향이 있다. 하부 층의 균사는 또한 보라색 색소를 함유하는 것으로 보였고, 이는 상부 공중 층에서는 보이지 않았다. 예비 실험은 하부 층이 약 30% 지질을 함유한다는 것과 균사가 단백질 및/또는 다당류 매트릭스에 포매되어 있음을 나타내었다. 하부 층 균사는 또한 색소, 지질, 탄수화물, 및 단백질의 주요 저장 영역이다.
(1) MK7-1 배지 및 (2) MK7-3 배지에서 성장한 균주 MK7로부터 생산된 바이오매트를 5일 후에 수확하고, 20℃에서 동결시켰다. 두 바이오매트의 두께는 2 내지 4 mm의 범위였다. 1 cm2 정사각형 절편을 3 반복으로 2개의 동결된 바이오매트로부터 절단한 다음, 위도로 반으로 절단하여, 각각 약 1.5 mm 두께의 상부 및 하부 절반 단면을 생성하였다.
MK7-1 배지에서 성장한 바이오매트의 평균 밀도는 상부 위도 절편의 경우 0.131 g/cm3(표준 편차 = 0.068) 및 하부 위도 절편의 경우 0.311 g/cm3(표준 편차 = 0.032)이었다. 상부 대 하부 밀도의 비율은 0.42였다.
MK7-3 배지에서 성장한 바이오매트의 경우, 상부 위도 절편의 평균 밀도는 0.102 g/cm3(표준 편차 = 0.048)인 반면, 하부 위도 절편의 평균 밀도는 0.256 g/cm3(표준 편차 = 0.010이었다. 상부 대 하부 밀도의 비율은 0.40이었다.
실시예 9: 균주 MK7에 의해 생산된 바이오매트의 인장 강도
MK7-3 배지에서 5일 동안 성장한 MK7 바이오매트의 인장 강도를 평가하였다. 여기서, 25.4 cm 폭, 46 cm 길이, 3.5 mm 두께의 매트를 사용하였다. 매트의 수분 함량은 약 85%였고, 이는 약 15% 건조 중량에 해당한다. 총 건조 중량은 70 g/0.25m2 트레이 또는 280 g/m2였다. 매트는 0.08 g/cm3의 밀도를 가지고 있었다.
인장 강도를 측정하기 위해, 매트의 한쪽 끝을 정지 위치로 고정한 반면, 다른 끝을 자유 이동 장치에 고정하였다. 자유 이동 장치는 적용된 장력을 측정하는 저울에 부착하였다. 매트가 파손될 때까지 몇 초 동안 저울을 잡아당겨 꾸준하고 느린 장력을 매트에 가하였다. 매트를 파손/떼어 내기/찢기 위해 필요한 측정된 장력은 0.28 kg/2.54 cm 매트 폭 내지 0.58 kg/2.54 cm 매트 폭이며, 이는 0.11 kg/cm 매트 폭 내지 0.23 kg/cm 매트 폭에 해당한다. 평균은 0.5 kg/2.54 cm 매트 폭, 또는 0.2 kg/cm 매트 폭이었다.
실시예 10: 조(crude) 글리세린에서 균주 MK7 바이오매트의 성장.
밀집한 균주 MK7 바이오매트를 탄소 및 영양소 공급원(공급원료)으로서 조 글리세린을 사용하여 8일 내에 생산하였다. 바이오디젤 생산의 부산물인 조 글리세린을 W-2 연료(제품 코드 GL32000, Batch 4300, CAS No. 56-81-5, Adrian, MI)로부터 얻었다. 조 글리세린은 75-85% 글리세린, 2-10% 물, 2-5% 염, 1-2% 지방, 오일 또는 에스테르, 및 <1% 메탄올로 구성되었다.
음용 품질의 수돗물 중의 7.5% 농도의 조 글리세린(중량:부피)에 전체 강도 또는 ½ 강도 MK7-1 배지 염을 보충하여 11 L의 전체 강도 및 ½ 강도 MK7-1 배지를 생성하였다. 이들 용액의 pH를 4.8로 조정한 다음, 10분간 끓였다. 실온(~23℃)으로 냉각시킨 후, 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 5% 부피:부피 균주 MK7 접종물을 배지에 첨가하였다. pH를 4.8로 재조정하고, 접종된 조 글리세린 배지의 1.5 L 분취액을 살균된 폴리프로필렌 0.25 m2 트레이에 첨가한 다음, 트레이를 랙 시스템에 넣었다.
혼합물을 23±1℃에서 배양하여 8일 후 약 4 mm 두께의 유연하고, 상대적으로 밀집한 바이오매트를 생성하였고, 이때 이들을 수확하였다. 바이오매트를 50℃에서 72시간 동안 건조시켰고, 평균 건조 중량±표준 편차는 전체 강도 배지 처리의 경우 30.3±3.1 g(n=6) 및 ½ 강도 배지 처리의 경우 30.2±2.8 g(n=8)이었다. 글리세린의 건조 바이오매트로의 평균 전환율은 34%였고, 건조 바이오매스 중량 기준으로 습윤 매트의 밀도는 두 처리의 경우 0.03 g/cm2였다.
실시예 11: 밀 주정잔액박 (wheat distillers soluble)에서 성장한 균주 MK7 바이오매트의 균사/ 균사체l 구조.
통합된 균주 MK7 사상균 바이오매트를 탄소 및 영양소 공급원(공급원료)으로서 건조된 밀 주정잔액박(ds)을 사용하여 7일 내에 생산하였다. 밀 주정잔액박은 31.5% 단백질, 8.6% 오일, 2.8% 전분, 13.5% 당, 2.7% 섬유, 8.5% 회분, 0.19% 칼슘, 0.29% 마그네슘, 1.7% 칼륨, 0.78% 인, 및 3.5% 황산염으로 구성되었다. 2개의 성장 배지 처리를 준비하였다: 처리 1은 물 중의 5% 주정잔액박 건조 중량을 사용하였고, 처리 2는 ½ 강도 MK7-1 염 배지 중의 5% 주정잔액박 건조 중량을 사용하였다. 혼합물의 pH를 3.4로 조정하였다. 혼합물에 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 7.5%(부피:부피)의 균주 MK7 접종물을 접종하고, 175 ml의 상기 배지를 알코올 멸균된 12.7 x 12.7 cm 플라스틱 트레이에 첨가하였다. 사상균 바이오매트를 실온(~23℃)에서 접종 7일 후 수확하였다. 유일한 탄소 및 영양소 공급원으로서 5% 주정잔액박에서 성장한 바이오매트(처리 1, MK7-1 염이 없음)는 평균 2.7 mm 두께(n=3 트레이)였고, 뚜렷한 층을 나타내지 않았으며, 0.019 g/cm3의 평균 밀도 및 약 10%의 전환 효율로 0.83 g의 평균 건조 중량을 가지고 있었다. 기균사가 관찰되지 않았고, 매트는 전체적으로 액체로 포화되었으며; 즉 매트의 상부 표면은 액체의 표면에 있었다.
MK7-1 염이 보충된 5% 주정잔액박에서 성장한 바이오매트(처리 2)는 평균 6.4 mm 두께였고 0.030 g/cm3의 평균 밀도 및 약 40%의 전환 효율로 3.11 g의 평균 건조 중량을 가지고 있었다. 이들 매트는 약 0.9 mm 두께의 뚜렷한 더 밀집한 층 바로 위에 약 4-7 mm 두께의 광범위한 솜털 모양의 흰색 기균사 시스템을 발달시켰다. 상부 층의 밀도는 0.011 g/cm3이었고, 하부 층의 밀도는 0.148 g/cm3이었다.
실시예 12: 탄소 및 영양소 공급원으로서 옥수수 침지액 및 옥수수 침지액 /전분에서 균주 MK7 사상균 바이오매트의 성장
밀집한 균주 MK7 사상균 바이오매트를 유일한 탄소 및 영양소 공급원(공급원료)으로서 옥수수 침지액을 사용하여 4일 정도의 짧은 시간 안에 생산하였다. 또한, 5% 전분이 첨가된 옥수수 침지액 역시 밀집한 사상균 바이오매트를 생산할 수 있는 것으로 나타났다. 옥수수 침지액은 옥수수 습식 분쇄의 점성 부산물이며, 미생물 발효를 위한 보충물로서 적합한 아미노산, 비타민, 및 미네랄의 조성을 갖는다. 본 실시예에서 사용된 옥수수 침지액은 산타 크루즈 바이오테크놀로지사(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX; Lot# B0116)로부터 구입하였다. 이들 실험은 MK7-1 영양소의 대체물로서 옥수수 침지액의 사용을 입증하였다. 처리는 유일한 탄소 및 영양소 공급원으로서 10% 및 20% 옥수수 침지액, 및 10% 및 20% 옥수수 침지액 및 5% 전분(각각)을 포함하였고, 전분은 사상균 바이오매트 성장을 위한 추가의 탄소원을 제공하였다.
0 또는 50 g 건조 전분을 함유하는 1L 부피에 10% 또는 20% 옥수수 침지액을 첨가하여 배지의 4개의 배치(batch)를 제조하였다. 적합한 양의 HCl을 첨가하여 배지를 pH 3.6으로 조정하고 적합한 용기에서 15분 동안 끓였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물의 pH를 3.6으로 재조정하고, 혼합물에 실시예 3에서 제조된 바와 같은 7.5% 균주 MK7 접종물을 접종하였다. 배지의 175 ml의 분취액을 5개의 정사각형 트레이(0.016 m2 표면적/트레이)에 첨가하고 트레이를 23±1℃에서 랙 시스템에서 배양하였다. 사상균 바이오매트를 6일 후 수확하였다. 10%, 20%, 10% + 전분, 및 20% + 전분에서 옥수수 침지액 처리를 위한 평균 최종 pH는 각각 3.97, 3.69, 4.23, 및 4.15였다. 이들 처리에 대한 평균 바이오매스 중량±표준 편차는 각각 1.1±0.2, 0.1±0.1, 2.3±0.1 및 2.1±0.2 g이었다.
실시예 13: 소 사육장 석호(lagoon) 물의 사상균 바이오매트로의 전환
유일한 탄소 및 영양소 공급원으로서 소 사육장 석호(lagoon) 물을 사용하여 성장 실험을 수행하였다. 물의 초기 용존 유기 탄소 함량은 4 g/L이었고, 초기 총 용존 질소 함량은 0.8 g/L였다.
사육장 석호 물을 농축된 HCl을 사용하여 pH 2.6으로 조정하고, 실시예 3에서 제조된 바와 같이 7% 균주 MK7 접종물을 접종하였다. 멸균된 0.25 m2 폴리프로필렌 트레이에 1.5 L의 접종된 폐수를 채우고, 24±1℃에서 배양을 위해 트레이 랙에 넣었다. 접종 2일 후 액체의 표면에서 사상균 바이오매트가 형성되기 시작하였다. 10일 후, 사상균 바이오매트와 나머지 액체를 단일 용기에서 수집하여 건조시킨 다음, 코스텍 총 C 및 N 분석기(ECS 4010, Costech Analytical Technologies, Valencia, CA)를 사용하여 총 C 및 N을 분석하였다. 트레이당 생산된 평균 건조 바이오매스는 6.531 g(n=2)이었다. 매트 및 잔류 액체의 분석은 탄소의 약 77% 및 질소의 99-100%가 매트에 의해 사육장 석호 폐수로부터 제거되었음을 밝혀내었다(방법 검출 한계 ~1%). 시스템에 대한 탄소 및 질소 제거 속도는 10일 기간을 평균하였을 때 6.8 및 1.2 mg/L/h였다. 현재의 이해에 따르면, 석호를 HCl을 사용하여 pH 2.6으로 산성화시키고 균주 MK7를 접종함으로써, 사육장 물에서 대부분의 C와 거의 모든 N을 제거할 수 있다. 또한, 석호를 직접 처리하여, 현장에서 사육장 물 위의 유동하는 사상균 바이오매트를 생성할 수 있고, 이는 이후에 후속 사용을 위해 수확될 수 있다.
실시예 14: 산 유청 대리 배지에서 균주 MK7 바이오매트의 성장
밀집한 균주 MK7 바이오매트를 산 유청 대리 배지(AWS)로부터 7일 내에 생산하였다. AWS 배지의 조성은 문헌[Tsakali et al. (2010)]에 기재된 바와 같은 산 유청의 전형적인 조성에 기초하였다. 본 실시예에 사용된 Tsakali 배지 및 AWS 배지의 조성이 표 4에 기재되어 있다.
바이오매트를 87 mL의 pH 4.8 AWS 배지를 사용하여 멸균된 12.7 x 12.7 cm(0.016 m2) 폴리프로필렌 트레이에서 생산하였다. 표 4에 열거된 성분을 1 L 엘렌마이어 플라스크에서 혼합하고, pH를 4.8로 조정한 다음, 10분 동안 끓여 배지를 제조하였다. 배지를 약 23℃로 냉각시킨 후, 지수 성장 단계에 있는 7.5% 부피(부피/부피)의 접종물을 플라스크에 첨가하였다. 이 접종물은 실시예 3에 기재된 바와 같이 생성하였다. 접종된 배양 배지의 87 mL의 분취액을 이소프로필로 닦은 트레이(실시예 3)에 첨가하고, 트레이를 실시예 3에 기재된 바와 같이 트레이 랙 시스템에 장착된 더 큰(0.25 m2) 트레이에 넣었다. 배양물을 25±1℃에서 배양하여 상대적으로 밀집한 바이오매트를 생성하고, 이를 7일 후 수확하였다(도 18). 7일 후 잔류 액체의 평균 pH 값은 6.9±0.1이었다. 따라서, 성장 공정은 AWS의 pH를 산 유청에서 전형적인 4.8에서 거의 중성(~ 7)으로 중화시켰다. 투과광 현미경은 AWS 배지에서 생성된 바이오매트의 사상형 특성을 밝혀내었다(도 18). 촉촉한 바이오매트의 평균 두께는 4±0.5 mm이었다. 바이오매트를 50℃에서 30시간 동안 건조시켰고, 생성된 평균 건조 중량은 1.88±0.2 g이었다. 촉촉한 바이오매트의 평균 밀도는 0.29 g/cm3이었다. 건조 공급원료(락토스 및 총 단백질)의 건조 바이오매트로의 평균 전환은 42.2%였다.
표 4. 문헌[Tsakali et al., 2010]에 기재된 바와 같은 전형적인 산 유청, 및 MK7 바이오매트를 성장시키기 위해 본 실시예에서 사용된 산 유청 대리 배지(AWS)의 조성.
Figure pct00006
실시예 15: 산 유청에서 균주 MK7 바이오매트의 성장
균주 MK7 바이오매트는 주요 탄소 및 영양소 공급원으로서 산 유청을 사용하여 6일 내에 성장한다. 바이오매트를 다양한 처리를 거친 125 mL의 미가공(raw) 산 유청을 사용하여 멸균된 12.7 x 12.7 cm(0.016 m2) 폴리프로필렌 트레이에서 생산한다. 처리는 pH를 조절하고, 선택된 영양소를 첨가하고/하거나 경쟁하는 미생물의 존재를 최소화하기 위해 가열한 후 성장 속도 및 바이오매스 생산성을 평가하기 위해 수행된다.
500 mL의 산 유청 부피를 사전에 멸균된 1 L 엘렌마이어 플라스크(125℃에서 10분간 가열됨)에 첨가하고, 액체 배지를 표 5에 개괄된 대로 선택된 처리(1-12)에 적용한다. pH는 조정하지 않거나(산 유청의 평균 pH는 4.8임) 또는 농축된 HCl로 pH 2.7로 조정한다. 영양소 첨가 처리는 무첨가, 질소원으로서 2.5 g/L의 우레아, 또는 글리세롤을 제외한 실시예 1에 기재된 바와 같은 산 유청 액체에서 제조된 영양소의 전체 세트로서 ½ 강도 MK7-1을 포함한다. 가열 멸균은 다른 처리(pH 및 또는 영양소 첨가)를 수행한 후 15분 동안 산 유청 액체 배지를 끓임으로써 수행한다. 배지를 약 23℃로 냉각시킨 후, 지수 성장 단계에 있는 7.5% 부피(부피/부피)의 접종물을 플라스크에 첨가한다. 이 접종물을 실시예 3에 기재된 바와 같이 생성한다. 접종된 배양 배지의 125 mL의 분취액을 이소프로필로 닦은 트레이에 첨가하고(멸균 절차를 위해 실시예 3 참고), 트레이를 실시예 3에 기재된 바와 같이 트레이 랙 시스템에 장착된 더 큰(0.25 m2) 트레이에 넣는다. 배양물을 25±1℃에서 적어도 6일 동안 배양한다.
표 5. 균주 MK7 바이오매트의 성장을 위한 영양소 배지로서 산 유청을 평가하는데 사용된 처리 매트릭스.
Figure pct00007
실시예 16: 혐기성 소화액에서 균주 MK7 사상균 바이오매트의 성장
밀집한 균주 MK7 바이오매트를 유일한 탄소 및 영양소 공급원(공급원료)으로서 혐기성 소화액를 사용하여 7일 내에 생산하였다. 혐기성 소화액은 산소 제한 조건 하에서 리그노셀룰로오스가 풍부한 바이오매스(예컨대 옥수수 대, 밀짚, 소 퇴비)의 미생물 발효 후 잔존하는 리그닌이 풍부한 고체 잔류물이다. 혐기성 소화액은 미생물에 의한 추가 분해에 내성인 것으로 간주되며, 이 이유 때문에 일반적으로 토양 개량제로서 사용되거나 또는 연소되어 전기 생산을 위한 증기 발생기에 동력을 공급한다.
촉촉한 혐기성 소화액(500 g)을 2 L의 음용 품질의 수돗물에 첨가하여 혼합물을 형성하였다. 이 혼합물의 고유 pH는 5.5였다. 혼합물에 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 7.5%(부피:부피)의 균주 MK7 접종물을 접종하였다. 200 ml의 생성된 혼합물을 정사각형 12.7 x 12.7 cm 트레이에 첨가하였다. 통합된 바이오매트가 표면에 형성되었고, 이를 실온(~23℃)에서 7일 배양 후 수확하였다. 바이오매트는 2.6 mm의 평균 두께를 가지고 있었고 0.62 g(n=3, 표준 편차 = 0.03 g)의 평균 건조 중량 및 0.015 g/cm3.의 상응하는 밀도를 가지고 있었다. 평균 전환 효율은 2.3%였다.
미생물 바이오매스로의 혐기성 소화액 전환율을 향상시키기 위해, 보강된 성장 배지를 효과적으로 사용하여, 혐기성 소화액에 보리 배지를 보충함으로써 추가 실험을 수행하였다. 보리 배지를 사용하여 성장을 자극하고 혐기성 소화액의 진균 바이오매스로의 추가 분해 및 전환을 위해 균주 MK7에 의한 원위치 효소 생산을 유도하였다. 1 L의 수돗물, 50 g의 보리 꽃, 1 g 효모 추출물, 0.1 mL 글루코아밀라아제(Distillate VHP, Dupont), 0.1 mL 알파-아밀라아제(SPEZYME ALPHA, 13,775 AAU/g, Dupont) 및 0.1 mL 베타-글루코나아제(Optimash TBG, Dupont)를 조합하여 보강된 보리 배지를 제조하였다. 혼합물을 65℃로 가열하고, 65℃에서 15분 동안 교반하였다. 이후, 혼합물을 15분 동안 끓여 효소를 불활성화시켰다. 그리고 나서, 혼합물을 실온으로 냉각시켰다.
수돗물을 보강된 보리 배지로 대체하고 사용된 각 성분의 총 부피를 절반으로 감소시킨 것을 제외하고, 혐기성 소화액 실험을 위한 상기 기재된 프로토콜을 반복하였다. 혐기성 소화액의 바이오매트로의 평균 전환율은 혐기성 소화액이 첨가되지 않은 대조군 처리에서 생성된 바이오매스를 뺀 후 6±2%였다.
실시예 17: 트레이 반응기에서 다른 사상균의 성장.
리조푸스 올리고스포루스 및 푸사리움 베네나툼의 성장을 균주 MK7에 대해 실시예 1, 2, 및 3에 기재된 표면 발효 기술을 사용하여 평가하였다.
리조푸스 올리고스포루스는 전 세계적으로 템페(인간 식품) 생산에 광범위하게 사용된다. 리조푸스 올리고스포루스 균주 ATCC 22595를 2015년 10월 1일에 ATCC로부터 수득하였다. ATCC로부터 얻은 R. 올리고스포루스의 순수한 배양 샘플을 실시예 2에 기재된 바와 같이 페트리 플레이트 내의 MK7-1 한천 배지에 두었다.
퀀(Quorn)TM 식품 생산에 사용된 푸사리움 베네나툼을 보즈만(Bozeman, MT)의 알버트슨 슈퍼마켓에서 2016년 1월 16일에 구입한 퀀 치킨 너겟 패키지(UPC code: 33735-00006)로부터 모았다. F. 베네나툼을 단리하기 위해, F. 베네나툼을 함유하는 퀀TM 치킨 너겟의 샘플(~0.25 cm2)을 250 ml 배플드 진탕 플라스크 내의 100 mL의 멸균 pH 5, MK7-1 배지에 넣었다. 플라스크 내의 배지를 20분 동안 끓여 배지 및 플라스크를 멸균하였다. 배지를 23℃로 냉각시킨 후, 퀀TM 샘플을 첨가하였다. 200 rpm에서 교반하면서 23±1℃에서 3일 배양 후, 1 mL의 배양물을 꺼내어 또 다른 동일한 플라스크 및 배지에 접종하는데 사용하였다. 동일한 방식으로 3일간 더 배양한 후, 배양물의 50 μL 분취액을 꺼내어 멸균 페트리 플레이트 내의 멸균 MK7-1 한천 배지(pH 4.8)에 도말하였다.
R. 올리고스포루스 및 F. 베네나툼 플레이트 상에서 발달한 균사체 매트를 사용하여 실시예 3에 기재된 바와 같은 멸균 1 L 배플드 진탕 플라스크에서 350 mL의 MK7-1 배지를 접종하였다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 진탕 플라스크에서 5일간 성장시킨 후, 배양물을 트레이 반응기를 위한 접종물로서 사용하였다. 트레이 반응기를 위한 바람직한 접종물은 후기 지수 단계에 있는 6 g/L을 초과하는 세포 밀도를 갖는 미생물학적으로 순수한 배양물로 구성된다(실시예 3 참고). 실시예 3에 기재된 바와 같이, 1.5 L의 접종된 MK7-1 배지를 함유하는 2개의 트레이를 2개의 유기체 각각에 대해 제조하였다. 배지의 pH를 리조푸스의 경우 4.1 및 푸사리움의 경우 5.0으로 조정하였다. 생성된 배양물 및 매트의 이미지가 도 12 및 13에 나타나 있다.
실시예 18: 고체 기질 표면 발효( SSSF )에 의해 생산된 바이오매스와 비교하여 고체 상태 발효( SSF )에 의해 생산된 사상균 바이오매트의 비교
SSF 절차
본원에 언급된 고체 상태 발효(SSF)는 낮은 수분 함량, 전형적으로 50% 미만의 고체에서 일어나는 미생물 발효 공정을 의미한다.
2 L 유리 용기에 1 L 만델스 및 리스(Mandels and Reese) 배지에 20 g 글루코스를 첨가하여 MK7 SSF 접종물을 제조하고 pH 4.5에서 121℃에서 45분 동안 오토클레이브하였다. 100 ml의 생성된 배지를 250 ml 엘렌마이어 플라스크에 첨가하고 -80℃ 글리세롤 스톡으로부터의 0.25 g의 균주 MK7을 접종하였다. 배양물을 30℃, 180 rpm에서 14일 동안 배양한 다음, SSF를 위한 접종물로서 사용하였다.
SSF 공정의 예는 WO 제2016/004380호 및 US 제2016/0002680호에서 바이오매트의 생산에 사용된 공정이다. 구체적으로, 100 g의 밀짚을 상업적인 분쇄기에서 크기를 줄이고 2 리터 유리병에 넣었다. 300 ml의 만델스 및 리스 배지 및 3 ml의 농축된 H2SO4를 첨가하였다. 생성된 슬러리를 121℃에서 45분간 오토클레이브하였다. 오토클레이브된 슬러리의 pH를 NaOH로 3.0으로 조정하고, 실온으로 냉각시킨 다음, 4개의 250 ml 엘렌마이어 플라스크 사이에 균등하게 옮겼다. 10 ml의 균주 MK7 접종물을 첨가하고, 플라스크를 30℃, 180 rpm에서 4일 동안 진탕한 다음, 모든 플라스크의 내용물을 단일 9x9 인치 파이렉스® 디쉬로 옮겼다. 생성된 배양물을 사란® 랩으로 덮고 30℃에서 7일 동안 배양한 다음, 수확하였다.
SSSF 절차
SSSF 접종물은 실시예 3에 기재되어 있으며, 절차는 하기 실시예에 기재되어 있다(즉, 액체 층의 상부에 부유하는 사탕무 펄프 및 다른 리그노셀룰로오스 물질의 전환). 구체적으로, 본원에 언급된 바와 같이 SSSF는 고체 기질이 액체의 표면 아래에 액침될 때 일어나는 발효를 의미하며, 이로써 사상균 바이오매트가 액침된 고체로부터 유래된 탄소 및 영양소를 사용하여 액체의 표면에서 성장한다. 생산된 사상균 바이오매트는 응집성이고, 밀도가 높으며, 공급원료가 없다(도 14C).
바이오매스 생산 및 생성된 바이오매트는 SSSF 및 SSF 절차 간에 상당히 상이하다. 배지 성분, 이온 강도, 삼투압, 공급원료 농도, 접종물 품질, 배양 시간(표 6 및 7)은 SSSF 및 SSF 방법론 사이에 중요한 매개변수 차이이다. 이들 공정 차이는 매우 상이한 바이오매스 특성(예컨대, 밀도, 통합된 매트의 형성, 미생물 순도, 필라멘트 길이, 필라멘트 구성 등)을 초래한다.
SSSF에 의해 생산된 바이오매스는 액체 층의 상부에서 부유하고 고체 공급원료 층과 물리적으로 분리된 사상균 바이오매트를 생산한다. 생성된 사상균 바이오매트는 응집성이고 밀도가 높은 매트로 구성된 본질적으로 순수한 진균 바이오매스이다. 매트는 높은 인장 강도를 가지며 밀리미터 내지 수 센티미터에 이르는 평균 길이를 갖는 긴 필라멘트로 구성된다(도 1C, 11 및 12에 나타낸 바와 같음). 필라멘트는 주로 바이오매트의 표면에 평행하게 구성되며 매우 밀집한 진균의 덩어리에 의해 연결된다. 바이오매트의 표면은 바이오매트의 표면에 수직으로 배향된 기균사를 나타내거나 나타내지 않을 수 있다. 사상균 바이오매트는 액체 또는 고체 기질과 물리적으로 분리되어 있기 때문에 성장 환경에서 쉽게 제거되며, 이는 상대적으로 순수한 사상균 바이오매트를 빠르고 쉽게 수확할 수 있게 해준다.
대조적으로, SSF에 의해 성장한 바이오매스는 무작위 배열로 고체 기질과 이질적으로 통합된 바이오매스를 생산한다. 생산된 바이오매스 필라멘트는 일반적으로 100 μm 미만의 길이이다(도 14B). 또한, SSF에 의해 생산된 바이오매스는 응집성이 없으며, 낮은 인장 강도를 가져 단일 단위로 단일 단위로 들어올릴 수 없다(도 14A 참고). 생성된 바이오매스/고체 기질 혼합물은 특히SSSF에 의해 생산된 사상균 바이오매트와 비교하여 밀도가 낮은 경향이 있다.
표 6. 하기는 SSF 및 SSSF 방법론에서의 핵심적인 차이를 기술한다:
Figure pct00008
실시예 19: 균주 MK7에 의한 사탕무 펄프의 SSF 및 SSSF
균주 MK7 바이오매스를 주요 탄소원으로서 사탕무 펄프로 SSF 및 SSSF 방법을 사용하여 생산하였다. 사탕무 펄프는 가공 공장에서 사탕무 펄프로부터 당을 제거한 후 남아있는 사탕무의 식물성 부분이다. 사탕무 펄프를 빌링스(Billings, Montana)의 웨스턴 당 협동 생산 공장으로부터 얻었고, 약 24% 건조물, 9.1% 조 단백질, 0.6% 조 지방, 23.1% 조 섬유, 4% 회분, 및 0.56% 칼슘으로 구성되었다.
SSF 실험을 위해, 50 g의 건조 사탕무 펄프를 250 ml 물과 혼합하였다. 혼합물을 20분 동안 오토클레이브하여 멸균을 보장하였다. 실온(~23℃)으로 냉각시킨 후, 혼합물에 옥수수 대/물 혼합물의 표면에서 바이오매트로서 성장한 250 mg의 축축한 균주 MK7 바이오매트를 접종하였다. 균주 MK7 바이오매트를 멸균 주걱으로 사탕무 펄프 혼합물에 혼합하고, 생성된 접종된 혼합물을 실온에서 4, 5, 및 7일 동안 배양하였다.
SSSF 실험을 위해, 사탕무 펄프를 7%의 농도로 ½ 강도 MK7-1 배지(펄프 중량:액체 부피)에 첨가하여 300 ml의 배지를 생성하였다. 적합한 양의 HCl을 첨가하여 배지의 pH를 4.8로 조정한 다음, 20분 동안 끓였다. 실온으로 냉각시킨 후, 실시예 C에 기재된 바와 같이 옥수수 대/물 혼합물의 표면 상에 사상균 바이오매트로서 성장한 약 100 mg의 MK7 바이오매트를 멸균 주걱으로 배지에 혼합하였다. 적합한 양의 HCl을 첨가하여 pH를 4.8로 재조정한 다음, 접종된 펄프 배지의 100 ml 분취액을 멸균된 0.023 m2 파이렉스® 유리 트레이에 첨가한 후 트레이를 트레이 랙 시스템에 넣었다. 접종된 혼합물을 23±1℃에서 배양하여, 각각 4, 5, 및 7일 후 약 2.9, 3.4, 및 4.1 mm 두께의 유연하고, 밀집한 바이오매트를 생성하였다. 바이오매트를 수확하여 50℃에서 48시간 동안 건조시켰고, 건조 중량은 1.85 g(4일), 2,25 g(5일), 및 2.85 g(7일)이었다. 사탕무 펄프의 건조 바이오매트로의 전환은 각각 4, 5, 및 7일에 대해 26.4%, 32.1%, 및 40.7%였다. 대부분의 바이오매트 부피의 건조 중량에 기초한 바이오매트 밀도는 각각 4, 5, 및 7일에 대해 0.028, 0.029, 및 0.030 g/cm3 였다.
유의하게 상이한 바이오매스 형태가 SSF 대 SSSF를 사용한 성장으로부터 생성되었다. SSF는 바이오매스 및 기질 모두의 친밀한 혼합물인 바이오매스 구조를 생산하였다. 이들 혼합물은 사탕무 펄프 기질의 파편 주위와 그 내부에 뒤얽힌 저밀도 진균 바이오매스로 구성되었다. 이러한 친밀한 혼합물은 주로 소량의 진균 바이오매스가 산재해 있는 기질로 구성되었다. 기질로부터 바이오매스를 분리하는 것은 상당한 추가 공정을 필요로 하고 기술적으로 달성하기 어려울 것이기 때문에 수행하지 않았다.
대조적으로, SSSF는 사탕무 펄프 기질과 물리적으로 분리되고 구별되는 사상균 바이오매트를 생성하여, 바이오매트를 직접 그리고 간단하게 수확할 수 있게 해주었다. 또한, 생성된 사상균 바이오매트는 밀도가 높고, 본질적으로 순수하며, 길게 정렬된 필라멘트로 구성되었다.
실시예 20: 당근 및 브로콜리 폐기물에서 균주 MK7 사상균 바이오매트의 성장
밀집한 균주 MK7 바이오매트를 공급원료로서 균질화된 브로콜리 또는 균질화된 당근을 사용하여 6일 내에 생산하였다. 브로콜리 및 당근은 보즈만(Bozeman, Montana)의 코스트코 도매점에서 구입하였다. 100 g의 각 공급원료를 고속으로 5분 동안 금속 날을 사용하는 상업적인 식품 가공기에서 개별적으로 균질화하고 9000 ml 의 수돗물을 가진 2 리터 비이커에 넣었다. 배지 염을 하기와 같이 첨가하여 혼합물을 형성하였다:
Figure pct00009
혼합물의 pH를 1.3 ml 농축된 HCl을 첨가하여 3.5로 조정하였다. 배지를 알루미늄 호일로 덮은 다음 30분 동안 끓였다. 실온(~23℃)으로 냉각시킨 후, 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 50 ml(7.5% 부피:부피)의 접종물을 각 공급원료에 대해 배지에 첨가하고 균질한 혼합물이 형성될 때까지 교반하였다. 250 ml의 혼합물을 4개의 분리된 5X7 인치(0.02 m2) 트레이에 붓고 사란® 랩으로 덮었다. 트레이를 23±1℃에서 7일 동안 배양한 다음, 수확하였다. 생성된 바이오매스는 남아있는 브로콜리 또는 당근 공급원료가 없는 유연한, 밀집한 사상균 바이오매트였다. 즉, 공급원료 잔류물을 함유하지 않고 본질적으로 순수한 MK7 바이오매스로 구성된 사상균 바이오매트가 생산되었다. 수확 후 잔류 액체의 평균 pH 값은 6.2였다. 촉촉한 바이오매트의 평균 두께는 3±1 mm였다. 사상균 바이오매트를 50℃에서 72시간 동안 건조시켰고, 평균 건조 중량±표준 편차는 브로콜리의 경우 1.7±0.2 g이었고, 당근의 경우 1.7±0.2 g이었다. 브로콜리의 건조 중량으로의 평균 전환은 52±5 g 균주 MK7 건조 중량/100 g 건조 중량 브로콜리였다. 당근의 건조 중량으로의 평균 전환은 55±7 g 균주 MK7 건조 중량/100 g 건조 중량 당근이었다.
실시예 21: 도시 유기 폐기물 대리(전처리의 함수로서 풀 절단물 및 잎)에서의 균주 MK7 배양
산 및 염기 전처리가 도시 유기 폐기물에 미치는 영향을 공급원료의 사상균 바이오매트로의 백분율 전환의 함수로서 평가하였다. 켄터키 블루그래스(Kentucky bluegrass) 절단물 및 물푸레나무(ash tree) 잎을 수분 함량이 8% 미만일 때까지 개별적으로 60℃에서 건조시켰다. 각 공급원료를 상업적인 분쇄기에서 미세 분말로 분쇄하였다.
HCl 산 전처리
● pH 2.5의 100 ml 수돗물(33% HCl로 조정됨) 중의 10 g의 풀/잎(건조 중량으로 50:50)의 3개의 복제물을 10분 동안 끓여 전처리하였다.
● 10 mM MnSO4 를 갖는 pH 2.5의 100 ml 수돗물(33% HCl로 조정됨) 중의 10 g의 grass/잎(건조 중량으로 50:50)의 3개의 복제물을 10분 동안 끓여 전처리하였다.
● pH 2.5의 100 ml MK7-1 배지(33% HCl로 조정됨) 중의 10 g의 풀/잎(건조 중량으로 50:50)의 3개의 복제물을 10분 동안 끓여 전처리하였다.
● 10 mM MnSO4를 갖는 pH 2.5의 100 ml MK7-1 배지(33% HCl로 조정됨) 중의 10 g의 풀/잎(건조 중량으로 50:50)의 3개의 복제물을 10분 동안 끓여 전처리하였다.
NaOH 염기 전처리
● pH 10.75의 100 ml 수돗물(1% NaOH로 조정됨) 중의 10 g의 풀/잎(건조 중량으로 50:50)의 3개의 복제물을 10분 동안 끓여 전처리하였다. 최종 pH 2.5는 HCl로 조정하였다.
● 10 mM MnSO4를 갖는 pH 10.75의 100 ml 수돗물(1% NaOH로 조정됨) 중의 10 g의 풀/잎(건조 중량으로 50:50)의 3개의 복제물을 10분 동안 끓여 전처리하였다. 최종 pH 2.5는 HCl로 조정하였다.
● pH 10.75의 100 ml MK7-1 배지(1% NaOH로 조정됨) 중의 10 g의 풀/잎(건조 중량으로 50:50)의 3개의 복제물을 10분 동안 끓여 전처리하였다. 최종 pH 2.5는 HCl로 조정하였다.
● 10 mM MnSO4를 갖는 pH 10.75의 100 ml MK7-1 배지(1% NaOH로 조정됨) 중의 10 g의 풀/잎(건조 중량으로 50:50)의 3개의 복제물을 10분 동안 끓여 전처리하였다. 최종 pH 2.5는 HCl로 조절하였다.
대조군 전처리
● 100 ml 수돗물 중의 10 g의 풀/잎(건조 중량으로 50:50)의 3개의 복제물. 최종 pH 5.5.
● 100 ml 수돗물, 10 mM MnSO4 중의 10 g의 풀/잎(건조 중량으로 50:50)의 3개의 복제물. 최종 pH 5.5.
● 100 ml MK7-1 배지 중의 10 g의 풀/잎(건조 중량으로 50:50)의 3개의 복제물. 최종 pH 5.5.
● 100 ml MK7-1 배지, 10 mM MnSO4 중의 10 g의 풀/잎(건조 중량으로 50:50)의 3개의 복제물. 최종 pH 5.5.
샘플을 12.7 x 12.7 cm 트레이에 넣고, 덮은 다음, 7일 동안 배양하였다. 결과가 도 15에 나타나 있다. 각각의 경우, 전처리의 적용은 생성된 전환 백분율을 증가시켰다. 즉, 산 또는 염기 전처리의 적용에 의해 그리고 망간의 첨가에 의해 공급원료의 생성된 사상균 바이오매트로의 더 큰 양의 전환이 달성되었다.
실시예 22: 전분에서 균주 MK7 바이오매트의 성장
밀집한 균주 MK& 사상균 바이오매트를 탄소 및 영양소 공급원(공급원료)으로서 전분을 사용하여 4일만에 생산하였다. 이러한 특정 실험에 사용된 전분은 아르고 식품 회사(Memphis, TN)에 의해 제조되고 보즈만(Bozeman, MH)의 알버트슨 슈퍼마켓에서 구입한 100% 아르고 옥수수 전분이었다.
강철 10 L 포트 내의 6 L 부피의 음용 품질의 수돗물에 6%, 8%, 및 10% 건조 전분 분말을 첨가하여 전분 배지의 3개의 배치를 제조하였다. 이 혼합물에 MK7-1 염을 보충하고 10분 동안 끓인 다음, 실온(~23℃)으로 냉각시켰다. 혼합물을 가열하여 전분의 응집된 덩어리를 생성하였고, 이를 이후에 작은 덩어리로 물리적으로 분쇄하였다. 혼합물의 pH를 2.7로 조정하고 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 7.5%(부피:부피)의 MK7 접종물을 접종하였다.
1.5 L 접종된 배지의 분취액을 4개의 살균된 폴리프로필렌 0.25 m2 트레이에 첨가하고, 트레이 랙 시스템에 넣고, 23±1℃에서 배양하였다. 밀집한 사상균 바이오매트가 단지 성장 2일 후에 관찰되었고, 바이오매트를 6일 후 수확하였다. 수확 후 트레이에 남아있는 잔류 액체의 평균 pH 값은 6%, 8%, 및 10% 처리에 대해 각각 6.05, 6.11, 및 5.88이었다. 바이오매트의 평균 두께는 3개의 처리에 대해 각각 2.9, 3.1, 및 3.3 mm이었다. 사상균 바이오매트를 50℃에서 72시간 동안 건조시키고, 평균 건조 중량±표준 편차는 6%, 8%, 및 10% 전분을 함유하는 4개의 복제 트레이에 대해 각각 29.0±1.3, 34.4±1.5, 및 38.2±1.9 g이었다. 이것은 32, 29, 및 25% 전분의 사상균 바이오매트 건조 중량으로의 전환 백분율과 동일하다. 촉촉한 사상균 바이오매트에 대한 건조 중량 기준의 평균 밀도는 3가지 처리에 대해 각각 0.04, 0.04, 및 0.05 g/cm2였다.
실시예 23: 감자 가공 폐기물 흐름에서 균주 MK7 사상균 바이오매트의 성장
밀집한 균주 MK7 사상균 바이오매트를 탄소 및 영양소 공급원(공급원료)으로서 감자 가공 폐기물을 사용하여 7일 내에 생산하였다. 감자 가공 폐기물은 일반적으로 감자의 가공 동안 생산되며 세척, 껍질 벗기기, 및 절단 작업(즉, 프렌치 프라이, 감자 큐브, 플레이크 등)으로부터의 폐기물 흐름을 포함한다. 감자 가공 폐기물 흐름은 또한 수북히 쌓여 덮개 없이 자연 환경에 노출된 다수의 감자 가공 폐기물 흐름으로 구성된 배출 더미를 포함한다. 본 실시예에서, 다수의 품종의 감자의 가공 폐기물로 구성된 감자 가공 폐기물 흐름을 2016년 9월 21일에 화이트홀(Whitehall, Montana)의 바우치 농장(Bauch Farm)으로부터 얻었고, 균주 MK7 바이오매트를 성장시키기 위한 탄소 및 영양소 공급원으로서 48시간 이내에 사용하였다.
감자 쇼트(short)는 완전한 감자로부터 프렌치 프라이를 절단한 후 남은 감자의 조각이다. 감자 쇼트는 비제한적인 예로서, 얇은 조각부터 6 인치 길이, 0.5 인치 두께 이상의 조각까지 크기 및 치수가 다양하다. 대다수의 경우, 신선한 폐기물은 손상, 멍 등으로 인해 감자에서 제거되는 감자의 조각을 기술한다. 일부 경우, 전체 감자가 폐기 샘플로서 포함된다. 껍질은 주로 감자로부터 제거된 피부이다.
감자 쇼트, 폐기물 및 피부를 식품 가공기에 의해 1분 동안 약 500 ml 부피 배치의 균질한 농도(Farbarware Model 103742 food processor set on high)로 가공하였다. 식품 가공 샘플은 본 실시예에서의 설명을 위해 혼합물(blendate)로 불린다.
혼합된 감자 쇼트 및 신선한 폐기물을 4.5 L 액체 MK7-1 배지에 대한 500 g 혼합물의 비율로 MK7-1 배지의 부피에 대한 10% 습윤 중량 혼합물의 비율로 2개의 15 L 에폭시 코팅된 강철 쿠킹 냄비에 첨가하여, 혼합물을 생성하였다. 혼합물의 pH를 농축된 HCl로 2.45로 조정하였다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 균주 MK7 접종물을 7.5% 부피:부피(즉 375 ml 접종물 to 4625 ml 혼합물)의 비율로 첨가하였다. 1.5 L 접종된 현탁액의 분취액을 3반복으로 개별적인 0.25 m2 멸균된 폴리프로필렌 트레이에 첨가하고, 트레이 랙 시스템에 넣었다. 배양물을 23±1℃에서 배양하여, 7일 후 수확된 유연한, 밀집한 바이오매트를 생성하였다. 수확 후 트레이에 남아있는 잔류 액체의 평균 pH 값은 쇼트의 경우 7.1이었고, 신선한 폐기물 처리의 경우 6.9였다. 수확된 바이오매트를 10분 동안 부드럽게 교반하면서 7 L 수돗물에서 세척하고 50℃에서 72시간 동안 건조시켰다.
촉촉한 바이오매트의 평균 두께는 쇼트의 경우 3.8±0.9 mm 및 폐기물의 경우 3.9±1.0 mm였다. 각 트레이에서 바이오매스의 평균 건조 중량±표준 편차는 쇼트의 경우 33.6±0.6 g 및 신선한 폐기물의 경우 40.2±2.7 g이었다. 건조 중량 기준으로 바이오매트의 평균 밀도는 쇼트의 경우 0.035 g/cm3 및 폐기물의 경우 0.041 g/cm3였다. 원래의 감자 부산물 내의 총 고체의 건조 바이오매트로의 평균 전환은 쇼트의 경우 36% 및 신선한 폐기물의 경우 43%였다. 균주 MK7에 의해 사용된 탄소의 약 50%가 이산화탄소로서 대기 중으로 방출된다는 사실을 고려할 때 거의 50% 전환은 탄소의 100% 전환 효율로 간주될 것이다.
혼합된 감자 껍질을 성장 실험 전에 전처리하여 감자 껍질 영양소의 균주 MK7에의 접근을 증가시켰다. 혼합된 감자 껍질(175 g)을 9개의 12.7 x 17.8 cm(0.023 cm2) 파이렉스® 유리 트레이 각각에 첨가하여 각각 3개의 복제물을 갖는 3개의 처리의 실험 매트릭스를 생성하였다. 처리 1은 50 ml 음용 품질의 수돗물을 받았다. 처리 2는 옥수수 대에서 성장할 때 균주 MK7에 의해 분비된 균주 MK7 가수분해 효소의 세트를 함유하는 균주 MK7 가수분해물의 45 ml 분취액을 받았다. 처리 3은 50 ml 수돗물 및 0.05g 셀룰라아제 Y-C(MP Biomedicals, Cat# 320951, Lot# M4156), 2.5 ml 글루코아밀라아제(Distillate VHP, Dupont), 2.5 ml 알파-아밀라아제(APEZYME ALPHA, 13,775 AAU/g, Dupont) 및 2.5 ml 베타-글루코나아제(Optimash TBG, Dupont)로 구성된 상업적 효소의 세트를 받았다. 처리 3 트레이를 50℃에서 30분 동안 배양하여 효소적 가수분해를 자극한 다음, 5분 동안 끓여 효소를 불활성화시켰다. 처리의 pH를 농축된 HCl을 사용하여 3.0으로 조정하였고, 모든 트레이에 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조된 10 ml의 균주 MK7을 접종하였다. 7일 후, 액체의 표면으로부터 바이오매트를 제거하고, 수돗물에서 10초간 세척하고, 60℃에서 48시간 동안 건조시켰다. 감자 껍질 건조 중량의 건조 바이오매트로의 전환은 대조군(H2O 단독) 평균 = 5.9%(5.5%, 6.5%, 및 5.8%); 균주 MK7 효소 = 9.0%(7.2%, 10.1%, 및 9.8%); 및 상업적 효소 = 9.9%(10.2%, 8.4%, 및 11%)였다.
실시예 24: SSF에 의해 생산된 바이오매스 대 SSSF에 의해 생산된 바이오매스의 영양 분석
영양 분석을 유로핀스(Eurofins)에 의해 수행하여 SSF 대 SSSF 방법론으로부터 얻은 바이오매트를 비교하였다. SSF 샘플을 미시간 생명공학 연구소에 의해 암모니아 섬유 팽창(AFEX)으로 전처리된 옥수수 대에서 배양된 균주 MK7로부터 얻었다. 150 g의 AFEX를 500 ml의 수돗물에 첨가하고, 농축 HCl로 pH를 3.5로 조정한 후 121℃에서 오토클레이브하였다. 생성된 혼합물에 실시예 18에 따른 25 ml의 균주 MK7 접종물을 접종하였다. 슬러리를 23 X23 cm 파이렉스® 유리 트레이로 옮기고 실온에서 11일 동안 배양하였다. 통합된 균주 MK7 바이오매스 및 옥수수 대를 수확하고 60℃에서 48시간 동안 건조시켰다. 샘플을 유로핀스 USA(Des Moines, IA)에 의해 총 단백질, 총 섬유, 총 탄수화물, 회분, 및 총 지방에 대해 분석하였다.
SSSF 샘플을 5% AFEX 옥수수 대에서 생산된 매트로부터 얻었다. 50 g의 AFEX 옥수수 대를 1L의 수돗물에 첨가하고 농축된 HCl로 pH를 3.5로 조정한 후 121℃에서 오토클레이브하였다. 생성된 혼합물에 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 50 ml의 균주 MK7 접종물을 접종하였다. 슬러리를 2개의 23 X 23 cm 파이렉스® 유리 트레이로 옮기고 실온에서 11일 동안 배양하였다. 매트를 수확하고 수돗물에서 30초 동안 세척한 다음, 60℃에서 24시간 동안 건조시켰다. 샘플을 유로핀스 USA(Des Moines, IA)에 의해 총 단백질, 총 섬유, 총 탄수화물, 회분, 및 총 지방에 대해 분석하였다.
표 7.
Figure pct00010
실시예 25: 사상형 호산성 MK7 진균 균주의 아미노산 프로파일
사상형 호산성 MK7 진균 균주 바이오매트를 MK7-1 배지에서 실시예 2 및 3에 기재된 방법을 사용하여 트레이 반응기에서 생산하였다. 6개의 트레이로부터의 사상형 바이오매스를 합친 다음, 60℃에서 45분 및 50℃에서 72시간 동안 건조시켰다. 400 g의 이 사상형 바이오매스를 영양 분석을 위해 디모인(IA)의 유로핀스 사이엔티픽사 영양 분석 센터에 보냈다. 아미노산을 하기와 같이 공인 농업 화학자 협회(Association of Official Agricultural Chemists, AOAC) 공식 분석 방법에서 발표된 국제적으로 인정된 방법을 사용하여 분석하였다: 트립토판의 경우 AOAC 988.15, 시스틴 및 메티오닌의 경우 AOAC 994.12 mod., 알라닌, 아르기닌, 아스파트산, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 총 리신, 티로신 및 발린의 경우 AOAC 982.30 mod.. 유로핀스에 의해 보고된 사상형 호산성 MK7 진균 균주 샘플의 아미노산 조성을 표 8의 어류 식품에 사용된 푸사리움 베네나툼(Alriksson, B. et al. (2014) Fish feed from wood. Cellulose Chemistry and Technology 48:9-10 (2014)), 퀀(Nutritional Profile of Quorn Mycoprotein, 2009), 달걀 알부민(Food and Agriculture Organization of the United Nations. The Amino Acid Content of Foods and Biological Data on Proteins, Nutritional Study #24. Rome (1970). UNIPUB, Inc., 4611-F Assembly Drive, Lanham, MD 20706) 및 리조푸스 올리고스포루스(Graham, D. C., Steinkraus, K. H. & Hackler, L. R. (1976) Factors affecting production of mold mycelium and protein in synthetic media. Appl Environ Microbiol 32:381-387)의 아미노산 조성과 비교한다. 총 단백질 함량은 4.5% 수분 함량 바이오매스의 41.5%로 측정되었다. 주목할 만하게, 사상형 호산성 MK7 진균 균주는 4가지 다른 단백질 공급원 모두에 비해 더 높은 농도의 필수 아미노산을 갖는 것으로 나타났으며, 이는 사상형 호산성 MK7 진균 균주를 식품 및 사료용 단백질의 매우 바람직한 공급원으로 만들었다.
표 8. 사상형 호산성 MK7 진균 균주 및 4개의 고 단백질 식품/사료 공급원에 대해 총 아미노산의 백분율로서 아미노산 농도가 제공되어 있다. 필수 아미노산은 별표로 표시되어 있다.
Figure pct00011
실시예 26: 식품 등급 글리세롤로부터 사상형 호산성 MK7 진균 균주에 의한 C18-풍부 지질의 생산
배지 제조: 4.5 리터의 MK7-1 배지를 40:1의 C:N 비율(C 공급원에서 mol 탄소: 질소 화합물에서 mol N)로 변경된 NH4NO3 및 우레아 질소 농도를 갖는 125 g/L 글리세롤(The Chemistry Store - Kosher Food Grade Glycerol >99.7%, ASIN: B00KN1LRWQ, 인터넷에서 이용가능함)(562.5 g)로 제조하였다.
표 9. 40:1의 C:N 비율 및 12.5% 글리세롤 농도를 제공하도록 변형된 MK7-1 배지의 조성. 표 1에 기재된 2 mL/L의 500x 스톡 용액을 첨가하여 대량 영양소를 공급하였다(실시예 1).
Figure pct00012
혼합물 pH를 2.7로 조정하고 알루미늄 호일이 덮인 플라스크 상부를 갖는 2 리터 엘렌마이어 플라스크에서 30분 동안 끓여 가열 멸균시켰다. 혼합물을 2시간 동안 25℃로 냉각시켰다.
접종: 지수 성장 단계에 있는 접종물(건조 중량으로서 15 g/L 부유 세포)(실시예 3 참고)을 1 g/L의 최종 건조 중량으로 냉각된 플라스크에 첨가하였다. 접종물의 균일한 분포를 위해 플라스크를 철처히 혼합하였다. 부유 상태 세포는 매트 형성에 중요하며, 세포 집락화(즉, 1 mm를 초과하는 바이오필름)를 최소화하는 것이 바람직하다. 이상적으로, 2.5 mm를 초과하는 세포 집락은 분배하기 전에 접종물에서 여과되어야 한다.
배양 및 수확: 접종물을 갖는 혼합물을 1.5 리터/트레이 또는 6 리터/m2의 부피로 3개의 0.25 m2 트레이에 균일하게 분포시키고, 25℃, 90-100% 습도에서 8일 동안 배양하였다. 통합된 바이오매트 바이오매스는 30 g/L를 초과하는 세포 밀도로 생산되며, 바이오매스는 하나의 응집 매트로서 수확될 수 있다. 일 구현예에서, 매트는 간단히 트레이에서 굴러 떨어진다(도 6). 매트를 흐르는 물을 사용하여 30초 동안 세척하고, 5-10분 동안 널어 건조시켰다. 단백질과 다른 진균 영양소가 과도한 수분 제거로 손실되기 때문에 매트의 압착은 피하였다. 널어 건조시킨 후 사상형 바이오매스는 410 g(또는 1,620 g/m2)의 습윤 중량을 가지고 있었다. 수분 함량은 73.8 g/트레이 또는 295 g/m2의 건조 중량에 해당하는 82%(즉, 18%의 건조 중량)으로 측정되었다. 18%의 건조 중량 사상형 바이오매스는 1.5%의 전형적인 건조 중량을 가진 액침 배양에서 성장한 다른 진균 바이오매스의 처리에 비해 유리하다. 대조적으로, 최신 공정은 원하는 진균 바이오매스 밀도를 달성하기 위해 원심분리(에너지 및 자본 집약적 공정)를 이용한다. 본원에 기재된 공정은 이러한 더 비싼 방법에 비해 훨씬 적은 가공, 장비 및 에너지 투입을 필요로 한다.
지질 분석: 총 지질을 나일 레드 염색(Cooksey et al., 1987; 도 16)으로 UV-Vis 현미경에 의해 추정하였고, 이는 총 지질을 40-50%로 추정하였다. 총 세포내 지질의 정량을 문헌[Lohman et al. (2013)]에 기재된 바와 같이 GC-MS 분석과 결합된 직접 에스테르 교환을 사용하여 결정하였고, 39%인 것으로 나타났다. 이것은 8일에 115 g 지질/m2(14 g/m2/일)의 지질 생산 또는 0.39 g/리터/시간 평균 생산 속도에 해당한다. 이러한 속도는 8% 글리세롤을 이용한 사상형 호산성 MK7 진균 균주의 액침 배양물에서 발견된 속도((0.245 g/L/시간)보다 훨씬 빠르며, 효모 및 조류를 비롯한 문헌에서 발견되는 다른 유기체보다 매우 경쟁적이다. 또한, 사상형 호산성 MK7 진균 균주는 대부분의 유기체가 용인할 수 없는 매우 높은 글리세롤 농도에서 이러한 경쟁적인 속도로 지질을 생산하며, 산성 pH 범위에서 이를 수행할 수 있는 유일한 유기체로서(우리가 아는 한), 오염을 제한하는데 상당한 장점이 있다. 또한, 지질 계수(g 지질/g 기질)는 0.21 g 지질/g 글리세롤에서 다른 균주보다 매우 경쟁적이다(첨부된 표 참고). 지질 생산 속도 증가 및 180 g/L의 세포 밀도는 현재 개발 중이거나 상업적으로 사용되는 다양한 미생물에 의한 미생물 오일의 생산을 변형시키는데 직접적인 영향을 미친다.
사상형 호산성 MK7 진균 균주 지질 프로파일은 상이한 유형의 처리(즉, pH, 온도, 성장 기질, 배양 시간, 수분 함량) 사이에서 현저하게 일정하며, C16:0 및 C18:0, C18:1 및 C18:2 트리아실글리세라이드(총 지질의 >95%; 하기 표 10; 도 17)이 우세하다. 지방산 프로파일은 또한 오메가-7 박센산(메틸 11-옥타데세노에이트), 오메가-7 팔미톨레산(메틸 헥사데크-9-에노에이트; 상표명 ProvinalTM) 및 테트라코사노산, 메틸 에스테르를 포함하는 가치가 높은 생성물을 나타낸다. 이들은 식물성 오일에서 전형적으로 발견되지 않는 희귀한 지방산이며 바이오디젤 단독보다 공급원료 톤당 유의하게 더 높은 수익을 생성할 수 있다.
표 10. 8일 동안 30℃에서 12.5% 글리세롤; 및 40:1의 C:N 비율로 배양된 균주 MK7 바이오매스에서 발견된 지방산의 신원, 농도
Figure pct00013
실시예 27: 균주 MK7의 독성 분석
상이한 조건에서 성장한 균주 MK7의 5개의 샘플을 진균독소(mycotoxin)의 존재에 대해 분석하였다. 샘플 1 바이오매스를 C:N 비율이 30:1인 것을 제외하고 실시예 1에 기재된 접종물을 생성하기 위해 사용된 동일한 조건하에 10 L 생물반응기에서 생산하였다. 바이오매스 샘플을 실시예 1에 기재된 바와 같은 진공 여과 장치를 사용하여 0.2 um 필터를 통해 여과하여 수집하였다.
샘플 2 바이오매트를 배지에 12% 글리세롤 및 0.2% 펩톤(중량/부피; 과립화된 펩톤, Fisher Scientific, Lot# 143241, Somerville, NJ)을 보충한 것을 제외하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 50 mL의 pH 2.8 MK7-1 배지를 사용하여 멸균된 12.7 x 17.8 cm(0.02 m2) 파이렉스® 유리 트레이에서 생산하였다. 샘플 2는 실시예 3과 관련된 0.25 m2 트레이에 대해 사용된 바와 같이 동일한 멸균 절차를 사용하였다.
샘플 3을 pH를 4.5로 조정하고 배지에 펩톤을 보충하지 않은 것을 제외하고 샘플 2와 동일한 조건에서 성장시켰다.
샘플 4를 배지에 4% 글리세롤을 보충한 것을 제외하고 샘플 2와 동일한 조건에서 성장시켰다.
샘플 5를 pH를 pH 2.2로 조정하고 배지에 펩톤을 보충하지 않은 것을 제외하고 샘플 2와 동일한 조건에서 성장시켰다. 샘플 2 내지 5 배지에 샘플 1에 사용된 7.5%(vol/vol)의 액체 배양을 접종하였다. 습윤 바이오매스 샘플을 성장 8일 후에 수집하고 진균독소의 추출 전에 -20℃에서 보관하였다.
진균독소를 Myco6in1+ 분석 키트 매뉴얼에 기재된 표준 프로토콜에 따라 비캄(Vicam)에 의해 공급된 Myco6in1+ 진균독소 분석 키트(Lot # 100000176: Nixa, MO)를 사용하여 습윤 바이오매스로부터 추출하였다. 12개의 상이한 진균독소를 Myco6in1+ LC/MS/MS 사용 매뉴얼에 기재된 프로토콜을 사용하여 LC-Q-TOF에 의해 분석하였다. 몬태나 주립대학교의 질량 분석기 핵심 시설에 보관된 애질런트(Agilent) 1290 HPLC에 결합된 애질런트 6538 Q-TOF를 독소의 확인 및 정량에 사용하였다. 푸모니신 B1 및 푸모니신 B2를 진정한 표준물질로 사용하였다.
시험된 모든 독소에 대한 측정값은 미국 식품 의약국이 정한 인간 섭취에 대한 규제 수준보다 낮았다(표 11). 20 ng/g의 규제 수준과 비교하여 8.76 ng/g이었던 샘플 4에서 발견된 총 아플라톡신을 제외하면, 측정된 수준은 규제 수준보다 적어도 한 자리수가 낮았다. 그러나, 아플라톡신 생산을 위한 유전자가 균주 MK7에는 존재하지 않기 때문에, 이 독소의 원천은 펩톤 및 배지에 사용되고 MK7의 생성물이 아니라 배지에 사용된 펩톤과 다른 성분으로부터의 오염일 것으로 예상된다.
표 11. 균주 MK7의 바이오매스에서 진균독소의 정량.
Figure pct00014
MK7 배양 배지 및 바이오매스의 비독성 특성을 독성 분석에 일반적으로 사용되는 고민감성 대형 무척추 동물인 큰물벼룩(Daphnia magna)을 이용한 생물분석(EPA Publication, 1987; Guilhermino et al., 2000)에 의해 추가로 확인하였다. 살아있는 큰물벼룩를 캐롤라이나 바이올로지컬 서플라이(Carolina Biological Supply, Burlington, NC)에서 구입하여 공급업체가 제공한 매뉴얼에 기재된 조건하에 성장시켰다. 성장 및 관찰 24시간 후, 큰물벼룩을 독성 실험에 사용하였다. 3개의 페트리 디쉬에 실시예 3에 기재된 바와 같이 접종물 반응기에서 6일 동안 성장한 30%의 MK7 배지(MK7 및 MK7-1 배지), 및 큰물벼룩이 운송된 70% 물의 30 mL을 채웠다. 실험 대조군의 경우, 3개의 추가의 페트리 디쉬에 30 mL의 운송용 물을 채웠다. 활발해 보이는 7개의 큰물벼룩을 6개의 페트리 디쉬에 각각 첨가하고 3일 동안 매일 관찰하였다. 큰물벼룩의 사망을 1분 후 가시적인 움직임이 없는 것으로 정의하였다. 3일 동안 MK7 배양 배지 및 바이오매스, 및 실험 대조군으로 처리된 큰물벼룩 사이에 생존율의 유의한 차이가 관찰되지 않았다(각각의 처리에 대해 3일 후 페트리 디쉬당 평균 1.2 사망).
균주 MK7 바이오매스의 독성을 또한 금붕어(Carassius auratus)에서 시험하였다. 2개의 동일한 5.7 L 어류 탱크, 펌프 및 필터를 보즈만(Bozeman, MT)의 펫코(Petco)(Aqueon model# E414W, Franklin, WI)에서 구입하였다. 탱크에 알버트슨 슈퍼마켓(Bozeman Montana)에서 구입한 5.7 L의 폴란드 용수를 채웠다. 6마리의 금붕어(~ 3cm 길이)를 펫코(Bozeman, MT)에서 구입하고, 3마리를 각 탱크에 넣었다. 하나의 탱크에는 약 0.05 g의 건조 테트라핀 금붕어 플레이크 플러스(TetraFin Goldfish Flakes Plus, Blacksberg, VA) 어류 사료(Petco, Bozeman, MT로부터 구입)를 매일 넣었다. 다른 탱크에는 약 0.05 g의 건조된 균주 MK7 바이오매스를 매일 넣었다. 실시예 3에 기재된 프로토콜에 따라 생산된 하나의 트레이 반응기로부터 습윤 MK7 바이오매스를 얻었다. 트레이로부터 40g의 MK7을 꺼내고(실시예 3 참고) 바이오매스를 250 mL 비이커에 넣어 MK7 바이오매스를 제조하였다. 그리고 나서, 습윤 바이오매스를 GE 마이크로웨이브(모델 WES1452SS1SS)를 사용하여 30초 동안 마이크로웨이브하였다. 건조된 바이오매스는 0.5% 미만의 수분 함량을 가지고 있었다. 그리고 나서, 바이오매스를 스테인레스 스틸 주걱으로 분쇄하여 테트라핀 금붕어 플레이크와 크기가 유사한 작은 플레이크를 형성하였다. 60일의 먹이 섭취 후 모든 어류는 생존하였고 건강한(힘차게 수영함) 것으로 보였으며, MK7 생산된 바이오매스 매트를 먹는 것에 대한 열의가 뚜렷하였다. 실험을 60일 후 종료하였다.
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참고문헌
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Figure pct00022
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Claims (20)

  1. 사상균 바이오매트를 생산하는 방법으로서,
    (a) 적어도 하나의 사상균의 부유 세포의 유효량을 인공 성장 배지에 접종하는 단계;
    (b) 접종된 성장 배지를 일정 기간 동안 방해받지 않는 상태로 배양하는 단계;
    (c) 사상균 바이오매트를 생산하는 단계; 및
    (d) 경우에 따라, 사상균 바이오매트를 수확하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 사상균 바이오매트를 생산하는 방법으로서,
    (a) 적어도 하나의 사상균의 부유 세포의 7.5%(부피:부피)를 인공 성장 배지에 접종하는 단계;
    (b) 접종된 성장 배지를 일정 기간 동안 방해받지 않는 상태로 배양하는 단계;
    (c) 사상균 바이오매트를 생산하는 단계; 및
    (d) 경우에 따라, 사상균 바이오매트를 수확하는 단계
    를 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 사상균이 MK7(ATCC 기탁번호 PTA-10698)로 명명된 균주, 푸사리움(Fusarium) 종, 및 리조푸스(Rhizopus) 종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 사상균이 MK7(ATCC 기탁번호 PTA-10698)로 명명된 균주, 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum) 또는 리조푸스 올리고스포루스(Rhizopus oligosporus)인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 사상균이 MK7(ATCC 기탁번호 PTA-10698)로 명명된 균주인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 배지가 약 18.6 atm의 삼투압을 갖는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 배지가 약 0.368의 이온 강도를 갖는 것인 방법.
  8. 적어도 25 g/L(건조 중량/L 배지)의 바이오매트 세포 밀도를 갖는 적어도 하나의 세포 층을 포함하는 사상균 바이오매트.
  9. 제8항에 있어서, 사상균이 MK7(ATCC 기탁번호 PTA-10698)로 명명된 균주, 푸사리움 종, 및 리조푸스 종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 사상형 바이오매트.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 사상균이 MK7(ATCC 기탁번호 PTA-10698)로 명명된 균주, 푸사리움 베네나툼 또는 리조푸스 올리고스포루스인 사상형 바이오매트.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 사상균이 MK7(ATCC 기탁번호 PTA-10698)로 명명된 균주인 사상형 바이오매트.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 필라멘트가 주로 공기:바이오매트 및/또는 바이오매트:배지 계면에 평행하게 구성된 것인 사상형 바이오매트.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오매트가 인공 배지와 접촉한 하나의 세포 층 및 적어도 하나의 다른 세포 층인 적어도 2개의 구조적으로 상이한 세포 층을 포함하는 것인 사상형 바이오매트.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 층 사이의 구조적 차이가 층 내의 세포의 밀도인 사상형 바이오매트.
  15. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 세포 층이 공기 및 적어도 하나의 다른 세포 층과 접촉하는 것인 사상형 바이오매트.
  16. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오매트가 3개의 구조적으로 상이한 세포 층을 포함하는 것인 사상형 바이오매트.
  17. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오매트의 인장 강도가 매트 폭의 cm당 적어도 0.2 kg인 사상형 바이오매트.
  18. 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 밀도가 적어도 50 g/l 또는 적어도 75 g/l인 사상형 바이오매트.
  19. 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오매트가 적어도 40%의 단백질 함량을 갖는 것인 사상형 바이오매트.
  20. 제8항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오매트가 적어도 39%의 지질 함량을 갖는 것인 사상형 바이오매트.
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