ES2877474T5 - Biomateriales fúngicos filamentosos, métodos de su producción y métodos de su uso - Google Patents

Biomateriales fúngicos filamentosos, métodos de su producción y métodos de su uso Download PDF

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Description

DESCRIPCIÓN
Biomateriales fúngicos filamentosos, métodos de su producción y métodos de su uso
Campo técnico
La presente solicitud se refiere a cepas fúngicas filamentosas aisladas dentro de los filosAscomycota, Zygomycota, Basidiomycota, GlomermycotayChytridiomycota,tales como especies deFusarium,especies deAspergillus,especies deTricoderma,especies dePenicillium,especies dentro deMucorales,incluyendo especies deRhizopus,la cepa fúngica filamentosa acidófila denominada MK7 y su progenie, así como a los métodos para llevar a cabo la fermentación en superficie para producir biomateriales fúngicos filamentosos a partir de dichas cepas fúngicas que producen una gran variedad de productos útiles.
Antecedentes
Las células de la mayoría de los hongos crecen como estructuras tubulares, alargadas y filiformes llamadas hifas que pueden contener múltiples núcleos y que se extienden creciendo por sus puntas. Esto contrasta con los organismos de apariencia similar, tales como las algas verdes filamentosas, que crecen por división celular repetida con una cadena de células.
El cuerpo colectivo de hifas que constituye la etapa vegetativa de un hongo se llama micelio (micelios en plural). El micelio se puede considerar el cuerpo o forma principal del hongo y, a menudo, se describe como filamentoso. El crecimiento se lleva a cabo por la reproducción asexual de las hifas, que crecen en cadenas ramificadas. El micelio es importante para el hongo porque puede desplazarse a través del suelo o la madera y utilizar ese sustrato como alimento, que el hongo necesitará para producir cuerpos fructíferos (por ejemplo, basidiocarpos) tales como setas, estantes, trufas, copas o morillas.
Los micelios excretan exoenzimas que pueden destruir el tejido vivo (necrotrófico) y después absorber ese material muerto (saprotrófico), simplemente absorbiendo material que ya estaba muerto (nuevamente, saprotrófico), o alimentándose de tejido vivo (biotrófico).
Si bien se cree que todos los filos del reino de los hongos contienen especies filamentosas, los filosAscomycotayZygomycota,en particular, tienen un gran número de especies filamentosas. Los miembros de estos filos elaboran una gran variedad de productos tales como proteínas, aminoácidos, aceites, medicinas (por ejemplo, penicilina), comida (por ejemplo, tempeh), aditivos alimentarios, conservantes alimentarios (por ejemplo, ácido cítrico) y enzimas industriales, además de utilizarse en la repostería y la producción de queso, cerveza y vino.
Los últimos adelantos en fermentación en sustrato sólido (SSF, del inglés 'solid-substrate fermentation') experimentan una serie de desventajas distintas. Por ejemplo, el producto final, es decir, la biomasa producida, está íntimamente mezclado con el sustrato sólido que es básicamente difícil de separar uno del otro. Normalmente, la SSF produce biomasa fúngica en bajas concentraciones, tiene tasas de conversión muy bajas y, en última instancia, produce rendimientos bajos. La SSF requiere actividades hídricas específicas para una fermentación eficaz. Administrar y mantener la cantidad adecuada de actividad hídrica es difícil y costoso de implementar. La aireación de los sistemas de SSF también es difícil de lograr, exacerbando aún más las eficacias de conversión y limitando los rendimientos del sistema. La actividad hídrica inadecuada, así como la mala aireación, suponen limitaciones para la transferencia de masa y calor, que da como resultado sobrecalentamiento y deficiencias en el suministro de oxígeno. La biomasa resultante se caracteriza por tener filamentos orientados de manera aleatoria, que limitan enormemente la utilidad en determinadas aplicaciones; es decir, alimentos y/o piensos para animales.
Quorn™, un producto compuesto principalmente por la biomasa de los hongos filamentososFusarium venenatumofrecen una micoproteína relativamente nutritiva. Quorn™ se produce mediante un sistema de fermentación sumergido de última generación, capaz de producir grandes volúmenes en un proceso continuo basado en lotes. Aunque comercialmente viable, la metodología de producción experimenta distintas desventajas. Para satisfacer las demandas comerciales, Quorn™ utiliza biorreactores que cuestan entre 35 y 40 millones de<u>S<d>cada uno. El sistema Quorn™ se ejecuta continuamente en un solo reactor hasta que el sistema fúngico madura más allá de las métricas clave o es contaminado por otra especie. En este punto, la producción se detiene, el reactor y todas las instalaciones hidráulicas asociadas se vacían y esterilizan, un proceso que puede tardar semanas en completarse e introduce una serie de problemas graves para un proveedor de productos comerciales. Dichos problemas son, por ejemplo, (1) dificultades para predecir los ciclos de producción, (2) costes incurridos para limpiar y detener la producción, (3) dificultades para controlar el inventario, etc. Además, la fermentación sumergida en grandes biorreactores requiere enormes cantidades de energía para airear y mezclar. La separación de la biomasa a partir del líquido en el que fermenta requiere centrifugación, que también es conocida por ser un proceso intensivo en capital y demandante de energía. El proceso consume más agua, lo que requiere el manejo de grandes cantidades de aguas residuales. La biomasa producida se caracteriza por tener filamentos de corta longitud, lo que limita su capacidad para convertirse directamente en alimentos/piensos sin introducir agentes aglutinantes y etapas del proceso posteriores que supongan más costes, dificultades y esfuerzo para gestionarlo de forma eficaz. El proceso original se describe en el documento US 4.555.485 (Marsh, 1985).
Las presentes metodologías de crecimiento de micelios filamentosos experimentan de una serie de desventajas. Por ejemplo, las instalaciones que cuentan con la aireación adecuada y el equipo necesario para el crecimiento de hongos y la posterior separación del micelio de los hongos del medio de crecimiento (por ejemplo, centrifugadoras) requieren importantes gastos de capital, especialmente para realizar el crecimiento de hongos a escala industrial. Los procesos actuales no solo requieren importantes aportes de energía y agua, sino también dan como resultado la generación de una gran corriente de desechos.
Por consiguiente, existe una necesidad en la industria de un enfoque simplificado para la formación de biomateriales fúngicos filamentosos de micelios filamentosos.
Sumario de la invención
La divulgación actual supera la limitación de los procesos que se utilizan actualmente. En este punto, los biomateriales fúngicos filamentosos se generan a través de la fermentación en superficie después de la inoculación de la cepa fúngica deseada en un medio de crecimiento donde no se requiere aireación. El presente método de fermentación en superficie es aplicable a una gran variedad de especies de hongos que son capaces de producir una amplia variedad de productos en un espectro de diferentes industrias. Los medios desarrollados generan un rápido crecimiento celular, crea biomateriales fúngicos filamentosos de alta densidad con filamentos largos, produce pequeñas corrientes de desechos y permite la manipulación del biomaterial fúngico filamentoso producido en función de la fuente de carbono, la relación de carbono a nitrógeno (C:N) y los parámetros del proceso. El efecto general es aquel en el que se producen elevadas tasas de producción con un impacto ambiental mínimo, medido por el uso de agua, uso de energía, requisitos de equipos y huella de carbono.
Un aspecto de la presente invención proporciona un biomaterial fúngico filamentoso que comprende al menos una capa celular, en donde el biomaterial tiene una densidad celular de al menos 25 g de peso seco/l de medio y tiene un grosor de 1 mm a 30 mm, en donde el biomaterial se produce mediante un método de fermentación en superficie, que comprende el crecimiento en la superficie de un medio acuoso que comprende nutrientes en forma disuelta o sumergida, y en donde el biomaterial tiene suficiente resistencia a la tracción e integridad estructural para ser manipulado sin desgarro. Otro aspecto de la presente invención proporciona un producto alimenticio, que comprende el biomaterial.
De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un método para eliminar el carbono y el nitrógeno del agua de una laguna de alimentación que comprende
(a) ajustar el agua de la laguna a un pH de 2,6;
(b) inocular el agua de la laguna ajustada con la cepa MK7 (Depósito de Acceso ATCC N.° PTA-10698); y (c) producir un biomaterial fúngico filamentoso en la superficie de la laguna;
en donde el biomaterial contiene el carbono y el nitrógeno eliminados del agua de la laguna.
Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para producir un biomaterial mediante un método de fermentación en superficie adecuado para su uso en un producto alimenticio que comprende
(a) inocular una cantidad eficaz de al menos un hongo filamentoso en un medio de crecimiento artificial;
(b) incubar el medio de crecimiento inoculado en un estado inalterado mediante fermentación en superficie para producir un biomaterial fúngico filamentoso; y
(c) recoger el biomaterial fúngico filamentoso;
en donde el biomaterial tiene una densidad celular de al menos 25 g de peso seco/l de medio y tiene un grosor de 1 mm a 30 mm.
Por lo tanto, la divulgación actual proporciona un medio artificial adecuado para cultivar hongos filamentosos y permitir la producción de un biomaterial fúngico filamentoso. Los medios artificiales comprenden al menos los siguientes macronutrientes: nitrógeno (N), fósforo (P), calcio (Ca), magnesio (Mg), carbono (C), potasio (K), azufre (S), oxígeno (O), hidrógeno (H) y los siguientes oligonutrientes: hierro (Fe), boro (B), cobre (Cu), manganeso (Mn), molibdeno (Mo) y zinc (Zn). En algunos ejemplos, los oligonutrientes se aumentan con los siguientes oligonutrientes adicionales: cromo (Cr), selenio (Se) y vanadio (V). Los medios artificiales tienen proporciones variables de C:N que favorecen la producción de biomateriales fúngicos filamentosos que tienen una proporción elevada de proteína:lípido o una proporción elevada de lípido:proteína.
También se proporcionan las condiciones para el cultivo de varios hongos filamentosos para la producción de biomaterial fúngico filamentoso, algunos de los cuales son acidófilos, tales como especies y/o cepas deFusarium, Fusisporium, Pseudofusarium, Gibberella, Sporotrichella, Aspergillus, Penicillium, Triocoderma,especies dentro delMucoralessp. (por ejemplo,Rhizopussp.) y la cepa fúngica filamentosa denominada MK7. Dependiendo de la especie y/o cepa, el pH del medio de cultivo varía de aproximadamente 0,68 a aproximadamente 8,5 y en algunos casos hasta 10,5. Un aspecto del método incluye inocular una o más especies y/o cepa(s) fúngicas en medios artificiales y hacer crecer las especies y/o cepa(s) fúngicas para producir biomasa filamentosa que contiene uno o más productos útiles.
Los biomateriales fúngicos filamentosos producidos surgen de condiciones anaerobias, microaerobias y aerobias de una combinación de los mismos mediante fermentación en superficie. Los biomateriales fúngicos filamentosos comprenden la especie y/o cepa fúngica y/o progenie de la misma en forma de conidios, microconidios, macroconidios, picnidios, clamidosporas, hifas, fragmentos de hifas o cualquier y todas las combinaciones de los mismos.
También se proporcionan métodos para recoger los biomateriales fúngicos filamentosos, el aislamiento y/o la purificación de proteínas, aminoácidos y/o lípidos útiles producidos por los hongos filamentosos. Estas proteínas, aminoácidos y/o lípidos se pueden utilizar en alimentos, pienso para peces, pienso para animales, aceites, ácidos grasos, medicinas, productos nutracéuticos, fungicidas, herbicidas, levaduras, insecticidas, biolubricantes y como materia prima para la conversión en otros productos de valor añadido.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. A y B: cepa MK7 en la naturaleza en un ambiente de aguas termales en el Parque Nacional Yellowstone;
CyD: biomasa de la cepa MK7 producida en distintas condiciones artificiales que muestran biomasa pura cohesiva de elevada densidad y elevada resistencia a la tracción;E: sección transversal de la biomasa de la cepa MK7 deCyD.
Figura 2.Ejemplos de biorreactores de 10 l utilizados para la generación de inóculo.
Figura 3. A: Bucle que muestra un material de micelios blancos recogido del 2o cultivo de archivo de generación;
B: Placa de Petri con material de micelios de la cepa MK7.
Figura 4.Crecimiento y pH del cultivo de la cepa MK7 en un biorreactor de 10 l para ser utilizado para la inoculación de reactores de bandeja. Medio líquido MK7-1 con un contenido de glicerol del 7,5 % con una relación C:N de 7,5:1. El cultivo óptimo para utilizar como inóculo se genera entre 72 y 90 horas cuando la biomasa se encuentra en la fase tardía de crecimiento exponencial (entre flechas).
Figura 5. A: Bandejas utilizadas como reactores de bandeja para la producción de biomaterial. La regla en la bandeja mide 31,75 cm (12,5 pulgadas) de largo;B: Biorreactor compuesto por un sistema de rejillas para bandejas que permite alojar 39 bandejas de plástico. Todo el reactor está envuelto en una envoltura de plástico transparente de tipo Saran®.
Figura 6. El biomaterial de la cepa MK7 recogida cultivado para una producción elevada de lípidos en condiciones limitadas de nitrógeno (relación C:N de 40:1) después de 8 días de fermentación en superficie en una bandeja de 0,25 m2 con 1,5 litros de medio MK7-1 y glicerol 125 g/l.
Figura 7. Patrón de crecimiento normal para la cepa MK7 en bandejas poco profundas que muestran fase de latencia, donde las tasas de acumulación de biomasa son relativamente lentas (de 0 a 1,5 días), y el tiempo de formación de biomaterial (flecha, 1,5 días) cuando comienza el crecimiento exponencial. Biomaterial cultivado en medio MK7-1 con glicerol al 7,5 % y una relación C:N de 30:1.
Figura 8.Pesos secos de biomateriales de la cepa MK7 cultivados en glicerol en tamaños de bandeja que varían en tres órdenes de magnitud.
Figura 9.Producción de ácido linolénico por la cepa MK7 en función de la duración y la temperatura del cultivo. Fermentación en superficie con glicerol al 4 %; pH 2,8 y medio MK7-1.
Figura 10.Imágenes en microscopio de luz transmitida de secciones transversales de biomateriales de MK7 de 5 días de edad producidos utilizando medio MK7-1 glicerol.AyB: Zoom de 50x que muestra tres capas: capa de hifas aéreas, capa de la zona de transición y capa inferior densa;C: Zoom de 50x que muestra dos capas distintas.
Figura 11.Micrografías transversales de biomaterial de MK7 de 5 días de edad producido utilizando medio MK7-Urea.A: La superficie superior del biomaterial de la cepa MK7 revela hifas aéreas y micelios que se extienden desde la capa de micelios densa. Imagen generada mediante microscopio de luz transmitida con un aumento de 100x;B: La superficie superior del biomaterial de la cepa MK7 revela hifas aéreas y micelios que se extienden desde la capa de micelios densa. Imagen generada mediante microscopio de luz transmitida con un aumento de 400x;C: Superficie inferior del biomaterial de la cepa MK7 que revela hifas y micelios. Imagen generada mediante microscopio de luz transmitida con un aumento de 400x;D: Interior denso del biomaterial de la cepa MK7 que revela su composición fibrosa entrelazada. Imagen generada mediante microscopio de luz transmitida con un aumento de 400x.
Figura 12. AyB: Biomaterial deRhizopus oligosporuscultivado en una bandeja de 0,25 m2 durante 6 días utilizando medio MK-7 a pH 4,1 con glicerol al 5 %.C: Imagen de microscopio óptico de 400x de hifas deRhizopus oligosporusen material.
Figura 13.Imágenes deFusarium venenatumcultivado en un reactor de bandeja de 0,25 m2 después de,A: 4 días y,B: 6 días. Los biomateriales se cultivaron utilizando medio MK7-1 a pH 5,0 y glicerol al 12,5 %. La imagenCmuestra la forma hifal deF. venenatumtomada con un aumento de 400x utilizando un microscopio óptico. En estas condiciones,F. venenatumprodujo un promedio de 71 g de biomasa seca por bandeja para dos bandejas.
Figura 14.A: Cosecha de biomasa de la cepa MK7 cultivada mediante fermentación en estado sólido (SSF) que muestra la cepa MK7 completamente integrada en lignocelulosa a <5 g de biomasa en peso seco de la cepa MK7/l (medio: mezcla de materia prima). B: Imagen de micrografía de la biomasa de la cepa MK7 recogida de A que muestra filamentos integrados de manera aleatoria con paja de trigo. C: biomaterial de la cepa MK7 por fermentación en superficie con sustrato sólido (SSSF, del inglés ‘solid substrate surface fermentation') mostrando biomasa de la cepa MK7 esencialmente pura densa (180 g.l) y cohesiva.
Figura 15. Cultivo de la cepa MK7 con varios tratamientos en bandejas de 12,7 * 12,7 cm durante 7 días. Las barras de error son desviaciones estándar de tres bandejas.
Figura 16.Izquierda: imagen microscópica óptica de la cepa MK7 cultivada con glicerol al 12,5 % a pH 2,7 después de 8 días. Derecha: imagen fluorescente después de la tinción con rojo Nilo que indica un elevado porcentaje de lípidos estimado entre el 40 y el 60 % del área celular.
Figura 17.Perfiles lipídicos producidos por la cepa MK7. (Panel izquierdo) Promedio de ésteres metílicos de ácidos grasos totales (FAME, del inglés ‘fatty acid methyl esters') en transesterificación directa (posible combustible total) y fracciones lipídicas extraíbles en función de la relación C:N del medio (n = 3). Las barras dentro de la barra de fracción de lípidos extraíbles representan componentes de tri-, di- y mono-acil glicéridos (TAG, DAG, MAG, por sus siglas en inglés) y componentes de ácidos grasos libres (FFA, del inglés ‘free fatty acids'). El recuadro muestra un cromatograma<g>C-FID con moléculas TAG que dominan la fracción lipídica. (Panel derecho) Perfil FAME de lípidos generados a partir de la transesterificación directa de todos los ácidos grasos (Directa) a FAME, y FAME procedente únicamente de precursores lipídicos extraíbles (Extraíble). El recuadro muestra cromatogramas GC-MS para las fracciones directa y extraíble.
Figura 18.Biomateriales de la cepa MK7 después de 7 días de crecimiento en medios sustitutos de suero de leche ácido (AWS, del inglés ‘Acid Whey Surrogate') a un pH inicial de 4,8 (A,ByC). Imagen de microscopio de luz transmitida (400x) de biomaterial (C) que muestra la naturaleza filamentosa del material.
Descripción detallada
Definiciones
Como se utiliza en el presente documento, el verbo "comprende", y sus conjugaciones se utilizan en la presente descripción y en las reivindicaciones, en su sentido no limitante para significar que los elementos que siguen a la palabra están incluidos, pero no se excluyen los elementos que no se mencionan específicamente. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que estén presentes más de uno de los elementos, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. De esta manera, el artículo indefinido "un" o "una" normalmente significa "al menos uno o una".
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "procedente de" se refiere al origen de la fuente, y puede incluir moléculas de origen natural, recombinantes, no purificadas o purificadas. Un hongo procedente de una cepa fúngica específica y aislada y/o su progenie pueden comprender determinadas mutaciones pero aún retener una, dos o más, o todas las características morfológicas y fisiológicas distintivas de los hongos aislados de los que proceden o de su progenie.
Como se utiliza en el presente documento, el término "acidófilo" se refiere a un organismo cuyas condiciones óptimas de crecimiento se encuentran en condiciones ácidas.
Como se utiliza en el presente documento, el término "materia prima" se refiere a cualquier material biológico renovable que se puede utilizar directamente como combustible o convertirse en otra forma de combustible o producto energético. Las materias primas de biomasa son los materiales vegetales y de algas que se utilizan para obtener combustibles tales como etanol, butanol, biodiesel y otros combustibles hidrocarburos.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "materias primas lignocelulósicas" se refiere a materias primas que contienen lignocelulosa. Ejemplos no limitantes de materias primas lignocelulósicas incluyen, residuos de cultivos agrícolas (por ejemplo, paja de trigo, paja de cebada, paja de arroz, paja de grano pequeño, rastrojos de maíz, fibras de maíz (por ejemplo, goma de fibra de maíz (CFG, del inglés ‘corn fiber gum'), granos secos de destilería (DDG, del inglés 'distillers dried grains'), harina de gluten de maíz (CGM, del inglés 'corn gluten meal')), cultivos de pasto cultivados con propósito, cultivos energéticos, pasto varilla, heno-alfalfa, bagazo de caña de azúcar), solución de maíz macerado, biomasa no agrícola de pulpa de remolacha (por ejemplo, materiales de algas, residuos de árboles urbanos), solución de maíz macerado, pulpa de remolacha, productos forestales y residuos industriales (por ejemplo, residuos de primera/segunda transformación de madera blanda, residuos de primera/segunda transformación de madera blanda dura, lodos de pasta de papel reciclada), residuos que contienen lignocelulósicos (por ejemplo, papel prensa, papel residual, granos de cervecería, residuos orgánicos municipales, residuos de jardín, residuos orgánicos clínicos, residuos generados durante la producción de biocombustibles (por ejemplo, biomasa de algas procesadas, glicerol, residuos de la producción de etanol celulósico, residuos sólidos de la producción de biodiésel) y una combinación de los mismos.
Como se utiliza en el presente documento, salvo que se especifique de otro modo, el término "hidrato de carbono" se refiere a un compuesto de carbono, hidrógeno y oxígeno que contiene un grupo aldehído o cetona en combinación con al menos dos grupos hidroxilo. Los hidratos de carbono como se divulgan en el presente documento también pueden estar opcionalmente sustituidos o desoxigenados en una o más posiciones. Por lo tanto, los hidratos de carbono incluyen monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos sustituidos y no sustituidos. El sacárido puede ser una aldosa o cetosa y puede comprender 3, 4, 5, 6 o 7 carbonos. En un aspecto son monosacáridos. En otro aspecto pueden ser azúcares piranosa y furanosa. Pueden estar opcionalmente desoxigenados en cualquier posición C correspondiente y/o sustituidos con una o más fracciones tales como hidrógeno, halo, haloalquilo, carboxilo, acilo, aciloxi, amino, amido, derivados de carboxilo, alquilamino, dialquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfónico, tiol, imina, sulfonilo, sulfanilo, sufinilo, sulfamonilo, éster, ácido carboxílico, amida, fosfonilo, fosfinilo, fosforilo, tioéster, tioéter, oxima, hidrazina y carbamato. Estas unidades de sacárido pueden disponerse en cualquier orden y el enlace entre dos unidades de sacárido puede ocurrir en cualquiera de aproximadamente diez formas diferentes. Como resultado, el número de posibles cadenas de oligosacáridos estereoisoméricos diferentes es enorme. En un aspecto, dichos hidratos de carbono se seleccionan del grupo que consiste en monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y una combinación de los mismos.
Como se utiliza en el presente documento, el término "monosacárido" se refiere a monómeros de azúcar seleccionados del grupo que consiste en azúcares de tres carbonos (triosas), azúcares de cuatro carbonos (tetrosas), azúcares de cinco carbonos (pentosas), azúcares de seis carbonos (hexosas),etc.y una combinación de los mismos. En un aspecto como se divulga en el presente documento, los azúcares de cinco carbonos se seleccionan del grupo que consiste en cetopentosa (por ejemplo, ribulosa, xilulosa), aldopentosa (ribosa, arabinosa, xilosa y lixosa), desoxiazúcar (desoxirribosa) y una combinación de los mismos. En un aspecto, los azúcares de seis carbonos se seleccionan del grupo que consiste en aldohexosas (por ejemplo, alosa, altrosa, glucosa, manosa, idosa, galactosa y talosa), hemiacetales cíclicos, cetohexosas (por ejemplo, psicosa, fructosa, sorbosa y tagatosa). En un aspecto, dichos monosacáridos se seleccionan del grupo que consiste en triosas, tetrosas, pentosas, hexosas, heptosas,etc.y una combinación de los mismos.
En un aspecto, los monosacáridos están en forma lineal; en otro aspecto, los monosacáridos están en forma cíclica.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "azúcares fermentables" se refiere a compuestos de azúcar que se pueden convertir en productos de fermentación de valor añadido útiles, ejemplos no limitantes de los cuales incluyen aminoácidos, proteínas, azúcares, hidratos de carbono, lípidos, ácidos nucleicos, policétidos, vitaminas, productos farmacéuticos, complementos alimenticios para animales, productos químicos especiales, materias primas químicas, plásticos, disolventes, combustibles u otros polímeros orgánicos, ácido láctico y etanol. Productos específicos de valor añadido que pueden producirse mediante los métodos divulgados, pero sin limitación, p-glucano, ácido láctico; productos químicos especiales; ácidos orgánicos, incluyendo ácido cítrico, ácido succínico y ácido maleico; disolventes; complementos alimenticios para peces y animales; productos farmacéuticos; vitaminas; aminoácidos, tales como lisina, metionina, triptófano, treonina, carotenoides, alimento para seres humanos, producto nutracéutico y ácido aspártico; enzimas industriales, tales como proteasas, celulasas, amilasas, glucanasas, lactasas, lipasas, liasas, oxidorreductasas, transferasas y xilanasas; y materias primas químicas.
Como se utiliza en el presente documento, el término "hongo" u "hongos" se refieren a un grupo distinto de organismos eucariotas con nutrición absorbente y que carecen de clorofila.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "material de acidificación" se refiere a cualquier material, compuestos químicos, agentes y/o composiciones que cuando se añaden a un disolvente (por ejemplo, agua), da lugar a una solución con una actividad de iones de hidrógeno mayor que en disolvente puro (por ejemplo, agua). El material puede estar en forma de gas, líquido o sólido. El material puede ser orgánico y/o inorgánico. Ejemplos no limitantes de material de acidificación incluyen cualquier material que comprenda haluros de hidrógeno y sus soluciones (por ejemplo, ácido clorhídrico (HCl), ácido bromhídrico (HBr) y ácido yodhídrico (HI)), oxoácidos halógenos (por ejemplo, ácido hipocloroso, ácido clórico, ácido perclórico, ácido periódico y compuestos correspondientes para bromo y yodo), ácido sulfúrico (H<2>SO<4>), ácido fluorosulfúrico, ácido nítrico (HNO<3>), ácido fosfórico (H<3>PO<4>), ácido fluoroantimónico, ácido fluorobórico, ácido hexafluorofosfórico, ácido crómico (H<2>CrO<4>), ácidos sufónicos, ácido metanosulfónico (también conocido como ácido mesílico, MeSO<3>H), ácido etanosulfónico (también conocido como ácido esílico, EtSO<3>H), ácido bencenosulfónico (también conocido como ácido besílico, C<6>H<5>SO<3>H), ácido ptoluenosulfónico (también conocido como ácido tosílico CH<3>C<6>H<4>SO<3>H), ácido trifluorometanosulfónico (también conocido como ácido tríflico, CF<3>SO<3>H), ácidos carboxílicos (por ejemplo, ácido acético, ácido cítrico, ácido fórmico, ácido glucónico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácidos carboxílicos vinílogos (por ejemplo, ácido ascórbico, ácido de meldrum), sales ácidas (por ejemplo, bicarbonato de sodio (NaHCO<3>), hidrosulfuro de sodio (NaHS), bisulfato de sodio (NaHSO<4>), fosfato monosódico (NaH<2>PO<4>) y fosfato disódico (Na<2>HPO<4>)).
Como se utiliza en el presente documento, el término "neutralizar", "neutralizante", y "neutralización" se refieren a una reacción química en soluciones acuosas, en donde un ácido y una base reaccionan para formar agua y sal, y en donde el pH de la solución vuelve a un pH inicial.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "donante de manganeso" se refiere a una composición o compuesto que puede proporcionar ion manganeso (por ejemplo, manganeso (I), manganeso (II) y manganeso (III)) en una solución acuosa). Ejemplos no limitantes de donantes de manganeso incluyen, Mn<2>(CO)<10>, K<s>Mn(CN)<6>NO, MnCl, MnF<2>, MnBr<2>, MnO, MnO<2>, MnCh, MnF<3>, MnBr<3>, MnCO<3>, Mn(CH<3>COO)<2>, C<6>H<g>MnO<6>, MnTiO<3>, [CH<3>COCH=C(O)CH<3>]<2>Mn, [C<6>H<n>(CH<2>)<3>CO<2>]<2>Mn,(HCO<2>)<2>Mn, Mn(C<g>HF<6>O<2>)<2>, Mn(PH<2>O<2>)<2>, MnI, (C<3>H<g>O<3>)<2>Mn, MnMoO<4>, Mn(NO<3>)<2>, Mn(ClO<4>)<2>, C<32>H<16>MnN<8>, MnSO<4>, (CH<3>COO)<3>Mn, C<32>H<16>ClMnN<8>, C<48>H28ClMnN4O<8>, C<5>H<4>CH<3>Mn(CO<3>), Mn(C<g>H<4>C<2>H<5>)<2>, y C<16>H<22>Mn.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "materiales tamponadores de pH" se refiere a las composiciones que cuando se añaden en una mezcla líquida, pueden mantener el pH de dicha mezcla líquida en donde el pH se mantiene a aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,6, aproximadamente 0,7, aproximadamente 0,8, aproximadamente 0,9, aproximadamente 1,0, aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1.3, aproximadamente 1,4, aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,6, aproximadamente 1,7, aproximadamente 1.8, aproximadamente 1,9, aproximadamente 2,0, aproximadamente 2,1, aproximadamente 2,2, aproximadamente 2.3, aproximadamente 2,4, aproximadamente 2,5, aproximadamente 2,6, aproximadamente 2,7, aproximadamente 2.8, aproximadamente 2,9, aproximadamente 3,0, aproximadamente 3,1, aproximadamente 3,2, aproximadamente 3.3, aproximadamente 3,4, aproximadamente 3,5, aproximadamente 3,6, aproximadamente 3,7, aproximadamente 3.8, aproximadamente 3,9, aproximadamente 4,0, aproximadamente 4,1, aproximadamente 4,2, aproximadamente 4.3, aproximadamente 4,4, aproximadamente 4,5, aproximadamente 4,6, aproximadamente 4,7, aproximadamente 4.8, aproximadamente 4,9, aproximadamente 5,0, aproximadamente 5,1, aproximadamente 5,2, aproximadamente 5.3, aproximadamente 5,4, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,6, aproximadamente 5,7, aproximadamente 5.8, aproximadamente 5,9, aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,1, aproximadamente 6,2, aproximadamente 6.3, aproximadamente 6,4, aproximadamente 6,5, aproximadamente 6,6, aproximadamente 6,7, aproximadamente 6.8, aproximadamente 6,9, aproximadamente 7,0. Por ejemplo, el pH de la mezcla líquida está en un intervalo entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 3,0. El pH preferido para la cepa MK7 filamentosa acidófila es de aproximadamente 2,2 a aproximadamente 3,0. Dicha composición puede comprender compuestos tales como ácido, sales ácidas, base y sales básicas, por ejemplo, HCl, H<2>NO<3>, H<2>SO<4>, NaHCO<3>, NaHS, NaHSO<4>, NaH<2>PO<4>, Na<2>HPO<4>, NaHSO<3>, KHCO<3>, KHS, KHSO<4>, KH<2>PO<4>, K<2>HPO<4>, KHSO<3>. NaOH, KOH, Mg(OH)<2>, Na<2>CO<3>, K<2>CO<3>, KHCO<3>, CaCO<3>, MgCO<3>, Na2S, K<2>S,etc.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "condiciones aerobias" se refiere a condiciones en las que se proporciona suficiente oxígeno y se prohíbe la respiración anaerobia en un microorganismo que crece en dichas condiciones y se inhiben las rutas metabólicas anaerobias evitando la respiración anaerobia.
Como se utiliza en el presente documento, los términos "microaeróbico" y "microaerófilo" se utilizan indistintamente para referirse a condiciones en donde el suministro de oxígeno es limitado, pero la respiración celular en un organismo es predominantemente respiración aerobia.
Como se utiliza en el presente documento, el término "ácidos grasos" se refiere a moléculas de cadena larga que tienen un grupo metilo en un extremo y un grupo ácido carboxílico en el otro extremo.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "hongo aislado" se refiere a cualquier composición que comprende una población fúngica que se obtiene de una fuente natural.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "fuente de carbono" generalmente se refiere a una sustancia adecuada para ser utilizada como fuente de carbono para el crecimiento de células procariotas o eucariotas. Las fuentes de carbono incluyen, pero sin limitación, hidrolizados de biomasa, suero de leche ácido, suero de leche dulce, hidratos de carbono (por ejemplo, almidón, sacarosa, polisacáridos y monosacáridos), celulosa, hemicelulosa, xilosa y lignina, así como componentes monoméricos de estos sustratos y/o combinaciones de los mismos. Las fuentes de carbono pueden comprender varios compuestos orgánicos en diversas formas, incluyendo, aunque sin limitación, polímeros, hidratos de carbono, ácidos, alcoholes, aldehídos, cetonas, aminoácidos, péptidos, etc. Estas incluyen, por ejemplo, varios monosacáridos tales como glucosa, dextrosa (D-glucosa), maltosa, oligosacáridos, polisacáridos, ácidos grasos saturados o insaturados, succinato, lactato, acetato, etanol, etc. o mezclas de los mismos. Una fuente de carbono también puede ser una materia prima o materia prima lignocelulósica, tal como la pulpa de remolacha azucarera. Los organismos fotosintéticos también pueden producir una fuente de carbono como producto de la fotosíntesis.
Como se utiliza en el presente documento, el término "biocatalizador" se refiere a un sistema vivo o célula de cualquier tipo que acelera las reacciones químicas mediante la reducción de la energía de activación de la reacción y no se consume ni se altera en el proceso. Los biocatalizadores pueden incluir, pero sin limitación, microorganismos tales como levaduras, hongos, bacterias y arqueas. Por ejemplo, las especies y/o cepa(s) fúngicas aisladas como se divulgan en el presente documento se pueden utilizar como biocatalizadores en la producción de proteínas y lípidos, o en la degradación de sustratos de carbono o moléculas orgánicas para la producción de proteínas y lípidos.
Como se utiliza en el presente documento, el término "fermentación" o "proceso de fermentación" se refiere a un proceso en el que un organismo o un biocatalizador se cultiva en un medio de cultivo que contiene materias primas, tales como una fuente de carbono y nutrientes, en donde el organismo o biocatalizador convierte esas materias primas en productos.
Como se utiliza en el presente documento, el término "biomasa" se refiere a material biológico procedente de organismos vivos o recientemente vivos, por ejemplo, tallos, hojas y porciones de plantas verdes o madera que contienen almidón, residuos, residuos forestales (árboles muertos, ramas y tocones), recortes de jardín, astillas de madera o materiales procedentes de algas o animales y/o subproductos industriales y corrientes de desechos, desperdicios/sobras de comida y otros azúcares simples. En algunos casos, la biomasa contiene una parte significativa de proteínas y/o lípidos. En otros casos, se compone principalmente de almidón, lignina, pectina, celulosa, hemicelulosa y/o pectina.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "biomasa celulósica" se refiere a la biomasa compuesta principalmente de fibras vegetales que no son comestibles o casi no comestibles para los seres humanos y que tienen celulosa como un componente destacado. Esas fibras pueden hidrolizarse para producir una variedad de azúcares que se pueden fermentar por microorganismos. Ejemplos de biomasa celulósica incluyen pasto, madera y residuos ricos en celulosa procedentes de la agricultura o la industria de productos forestales.
Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "biomaterial filamentoso", y "biomaterial fúngico filamentoso" se utilizan indistintamente y se refieren a biomateriales producidos por hongos filamentosos y que los contienen.
Como se utiliza en el presente documento, el término "almidón" se refiere a un polímero de glucosa que se hidroliza fácilmente por enzimas digestivas, por ejemplo, amilasas. El almidón generalmente se concentra en partes especializadas de plantas, tales como patatas, granos de maíz, granos de arroz, granos de trigo y tallos de caña de azúcar.
Como se utiliza en el presente documento, el término "lignina" se refiere a un material polimérico, compuesto principalmente por compuestos monoméricos fenólicos enlazados, tales como el alcohol p-coumarílico, alcohol coniferílico y alcohol sinapílico, que forma la base de la rigidez estructural de las plantas y con frecuencia se denomina parte leñosa de las plantas. También se considera que la lignina es la parte no hidrato de carbono de la pared celular de las plantas.
Como se utiliza en el presente documento, el término "celulosa" se refiere a un hidrato de carbono de polisacárido polimérico de cadena larga de p-glucosa de fórmula (C6HioO5)n, que generalmente se encuentra en las paredes celulares de las plantas en combinación con la lignina y cualquier hemicelulosa.
Como se utiliza en el presente documento, el término "hemicelulosa" se refiere a una clase de polisacáridos de la pared celular vegetal que puede ser cualquiera de varios heteropolímeros. Éstos incluyen xilano, xiloglucano, arabinoxilano, arabinogalactano, glucuronoxilano, lucomanano y galactomanano. Los componentes monoméricos de la hemicelulosa incluyen, pero sin limitación: D-galactosa, L-galactosa, D-ramnosa, L-ramnosa, L-fucosa, D-xilosa, L-arabinosa y ácido D-glucurónico. Esta clase de polisacáridos se encuentra en casi todas las paredes celulares junto con la celulosa. La hemicelulosa tiene un peso más bajo que la celulosa y no se puede extraer con agua caliente o agentes quelantes, pero se puede extraer con álcali acuoso. Las cadenas poliméricas de hemicelulosa se unen a la pectina y la celulosa en una red de fibras entrecruzadas que forman las paredes celulares de la mayoría de las células vegetales.
El término "pectina", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una clase de polisacáridos heterogéneos de la pared celular vegetal que se pueden extraer mediante tratamiento con ácidos y agentes quelantes. Normalmente, del 70 al 80 % de la pectina se encuentra como una cadena lineal de monómeros de ácido D-galacturónico enlazados por a-(1-4). La fracción RG-I más pequeña de pectina se compone de ácido galacturónico enlazado por (1-4) y L-ramnosa enlazada por (1-2) alternados, con ramificación sustancial de arabinogalactano que emana del resto de ramnosa. Otros monosacáridos, tales como D-fucosa, D-xilosa, apiosa, ácido acérico, Kdo, Dha, 2-O-metil-D-fucosa y 2-O-metil-D-xilosa, se encuentran en la fracción de pectina RG-II (<2 %), o como constituyentes minoritarios en la fracción RG-I. Las proporciones de cada uno de los monosacáridos en relación con el ácido D-galacturónico varían según la planta individual y su microambiente, la especie y el tiempo durante el ciclo de crecimiento. Por las mismas razones, las fracciones de homogalacturonano y RG-I pueden diferir ampliamente en su contenido de ésteres metílicos en restos de GalA y en el contenido de ésteres de restos acetilo en las posiciones C-2 y C-3 de GalA y azúcares neutros.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "organismo anaerobio facultativo" o "microorganismo anaerobio facultativo" o un "biocatalizador anaerobio facultativo" se define como un organismo que puede crecer en presencia o ausencia de oxígeno, tal como las cepas fúngicas aisladas como se divulgan en el presente documento.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "granos secos de destilería", abreviado como DDG, se refiere a los sólidos que quedan después de una fermentación, generalmente que consisten en materias primas sólidas no consumidas, nutrientes restantes, proteína, fibra y aceite, así como residuos de células de biocatalizador. La expresión también puede incluir material residual soluble de la fermentación y entonces se denomina "granos secos y solubles de destilería" (DDGS, del inglés 'distillers dried grains and solubles').
Como se utiliza en el presente documento, el término "nutriente" se define como un compuesto químico que se utiliza por un organismo o biocatalizador para crecer y sobrevivir. Como un ejemplo, los nutrientes pueden ser compuestos orgánicos tales como hidratos de carbono y aminoácidos o compuestos inorgánicos tales como sales metálicas.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "nutriente complejo" se define como una fuente de nutrientes que contiene principalmente compuestos orgánicos monoméricos utilizados por un organismo o biocatalizador para la producción de proteínas, ADN, lípidos e hidratos de carbono. La expresión "nutriente rico" se utiliza indistintamente con el término nutriente complejo. Normalmente, los nutrientes complejos o nutrientes ricos proceden de materiales biológicos, tales como residuos de mataderos, residuos lácteos o residuos agrícolas. Los nutrientes complejos o nutrientes ricos incluyen, pero sin limitación: extracto de levadura, triptona, peptona, extracto de soja, solución de maíz macerado, proteína de soja y caseína.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "metabolismo aeróbico" se refiere a un proceso bioquímico en el que se utiliza oxígeno para producir energía, normalmente en forma de ATP, a partir de hidratos de carbono. El metabolismo aeróbico normal se produce a través de la glucólisis y el ciclo de TCA, en donde una única molécula de glucosa se metaboliza completamente en dióxido de carbono en presencia de oxígeno.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "metabolismo anaeróbico" se refiere a un proceso bioquímico en el que el oxígeno no es el aceptor final de los electrones contenidos en NADH. El metabolismo anaerobio se puede dividir en respiración anaerobia, en la que compuestos distintos al oxígeno sirven como aceptor de electrones terminales, y fermentación, en la que los electrones de NADH se utilizan para generar un producto reducido a través de una "ruta fermentativa".
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "fermentación microbiológica" se refiere a un proceso donde las sustancias orgánicas se descomponen y se vuelven a ensamblar en productos mediante microorganismos. Las sustancias pueden incluir, pero sin limitación, fuentes de glucosa, sacarosa, glicerol, almidón, maltodextrina, lactosa, grasas, hidrocarburos, proteína, amoniaco, nitrato y fósforo. Los productos pueden incluir, pero sin limitación, productos especializados (incluyendo, pero sin limitación, productos de micoproteínas, productos de soja, tempeh,etc.),productos tradicionales (incluyendo, pero sin limitación, pan, cerveza, vino, licores, queso, productos lácteos, carnes y verduras fermentadas, champiñones, salsa de soja y vinagre), productos agrícolas (incluyendo, pero sin limitación, giberelinas, fungicidas, insecticidas, ensilaje, aminoácidos tales como L-glutamina, L-lisina, L-triptófano, L-treonina, L-aspártico (+), L-arilglicinas), enzimas (incluyendo, pero sin limitación, hidratos de carbono, celulosas, lipasas, pectinasas, proteasas), combustibles y materias primas químicas (incluyendo, pero sin limitación, acetona, butanol, butanodiol, isopropanol, alcohol etílico, glicerol, metano, glicerol, ácido butírico, metano, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido láctico, ácido propiónico, ácido succínico y ácido L-glutárico o sales de cualquiera de estos ácidos), nucleótidos, ácidos orgánicos, productos farmacéuticos y compuestos relacionados (incluyendo, pero sin limitación, alcaloides, antibióticos, hormonas, inmunosupresor, interferón, esteroides, vacunas y vitaminas) y polímeros (incluyendo, pero sin limitación, alginatos, dextrano, gelano, polihidroxibutirato, escleroglucano y xantano). Los microorganismos utilizados para la fermentación pueden incluir tanto microorganismos procariotas (incluyendo bacterias y cianobacterias) como microorganismos eucariotas (incluyendo levaduras, hongos y algas).
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "cultivos energéticos" se refiere a plantas cultivadas como una cosecha de bajo coste y bajo mantenimiento que se utilizan para producir biocombustibles o que se explotan directamente por su contenido energético. Los cultivos energéticos comerciales suelen ser especies de cultivos de alto rendimiento, densamente plantadas, donde los cultivos energéticos se queman para generar energía. Los cultivos leñosos tales como el sauce o el álamo se utilizan ampliamente, así como los pastos tropicales tales comoMiscanthusyPennisetum purpureum(pero conocido como pasto elefante).
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "fermentación en superficie" se refiere a aquellas fermentaciones en las que los microorganismos empleados crecen en la superficie del medio de fermentación sin ningún soporte adicional. Normalmente el medio es un medio acuoso sin flujo. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que los biomateriales filamentosos son el resultado de alguna combinación de metabolismo aeróbico, microaeróbico y/o anaeróbico. Por ejemplo, se cree que la superficie del biomaterial depende de la respiración aerobia, mientras que la parte inferior del biomaterial puede ser microaerobia a altamente anaerobia.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "fermentación en superficie con sustrato sólido" se refiere a aquellas fermentaciones en las que los microorganismos empleados crecen en la superficie del medio de fermentación utilizando carbono y nutrientes suministrados por sólidos que están sumergidos en el medio de fermentación. En algunos aspectos, una parte del biomaterial puede estar parcialmente sumergida.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "fermentación sumergida" se refiere a aquellas fermentaciones en donde los microorganismos empleados crecen en un estado sumergido dentro del medio de fermentación. Muchas fermentaciones están dentro de esta categoría, tales como la técnica de fermentación sumergida en penicilina.
Como se utiliza en el presente documento, "fermentación en estado sólido" se refiere al cultivo de microorganismos que crecen en un soporte sólido seleccionado para tal fin. Por ejemplo, un sustrato de cultivo sólido, tal como arroz o salvado de trigo, se deposita en lechos planos después de sembrar con microorganismos; a continuación, se deja el sustrato en un espacio con temperatura controlada durante varios días. La fermentación en estado sólido utiliza sustratos de cultivo con bajos niveles de agua (actividad hídrica reducida). El medio (por ejemplo, arroz o salvado de trigo) está saturado con agua, pero poca es la que fluye libremente. El medio sólido comprende tanto el sustrato como el soporte sólido sobre el que tiene lugar la fermentación.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "producto nutracéutico" se refiere a sustancias que tienen beneficios medicinales o para la salud. En algunos ejemplos, un producto nutracéutico no solo complementa la dieta, sino que también ayuda en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades y/o trastornos. La expresión "producto nutracéutico" fue acuñado de "nutrición" y "farmacéutico" en 1989 por Stepen DeFelice, MD, fundador y presidente de la Foundation for Innovation in Medicine (FIM).
Como se utiliza en el presente documento, "progenie" se refiere a todos y cada uno de los descendientes por linaje que se originan a partir de una cepa sin importar cómo o dónde se produzca. Se incluye dentro de la definición de "progenie", como se utiliza en el presente documento, todos y cada uno de los mutantes de la cepa aislada/depositada y su progenie, en donde dichos mutantes tienen al menos una de las características fisiológicas y/o morfológicas de la cepa aislada/depositada y su progenie.
Medios artificiales para el crecimiento de biomaterial fúngico filamentoso
Se utiliza un medio artificial para producir un biomaterial fúngico filamentoso. El medio artificial proporciona los nutrientes necesarios para aumentar los tiempos del ciclo celular en comparación con los que se encuentran en la naturaleza (es decir, una mayor tasa de crecimiento) y da como resultado una mayor densidad celular. Los medios artificiales comprenden al menos los siguientes macronutrientes: nitrógeno (N), fósforo (P), calcio (Ca), magnesio (Mg), carbono (C), potasio (K) y azufre (S). Oligonutrientes tales como hierro (Fe), boro (B), cromo (Cr), cobre (Cu), selenio (Se), manganeso (Mn), molibdeno (Mo), vanadio (V) y zinc (Zn) también se pueden añadir a los medios para complementar las fuentes de carbono. Las fuentes de carbono tales como materias primas lignocelulósicas, suero de leche dulce y/o suero de leche ácido normalmente proporcionan suficientes oligonutrientes para que no se requieran oligonutrientes adicionales.
Se pueden añadir adiciones de nutrientes adicionales a los medios artificiales. Ejemplos de estos son hidratos de carbono (por ejemplo, monosacáridos y polisacáridos), donantes de aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos y polipéptidos) y combinaciones de los mismos. Además, también se pueden añadir al medio artificial compuestos que pueden facilitar el tratamiento previo de la fuente de carbono lignocelulósico. Dichos compuestos incluyen, pero sin limitación, materiales de acidificación, donantes de manganeso, nutrientes y material tamponador de pH.
El medio artificial puede estar en forma de un sólido impregnado de líquido, un líquido o un gel. El medio artificial también puede estar en forma de líquido que cubre un sustrato de carbono sólido, tal como una materia prima de lignocelulosa u otro sustrato de carbono sólido. En este punto, el sustrato sólido se sumerge bajo la superficie de un líquido, de tal manera que el biomaterial crece en la superficie del líquido utilizando el carbono procedente del sólido sumergido, un proceso conocido como fermentación en superficie con sustrato sólido (SSSF). Las enzimas extracelulares excretadas del hongo degradan el sustrato de carbono sólido, liberando carbono soluble que puede ser absorbido por el biomaterial en, o cerca de, la interfase biomaterial/agua. El biomaterial resultante forma un material sobre una capa líquida sobre el sustrato sólido sumergido. En general, la capa líquida por encima de la fuente de carbono sumergida debe tener aproximadamente de 0,01 a 1,0 cm de profundidad. Demasiado poco líquido da como resultado que no se forme material y se produce una fermentación en estado sólido y/o fermentación sumergida. Demasiado líquido da como resultado una conversión ineficaz y un ciclo de crecimiento de biomaterial deprimido.
Existe una gran variedad de sustancias que se pueden utilizar como fuente de carbono para los medios artificiales. Estos incluyen azúcares (por ejemplo, glucosa, galactosa, manosa, trehalosa, sacarosa, arabinosa, manosa, xilosa, fructosa, etc.), glicerol, almidón, hidratos de carbono, glicerol, suero de leche, materia prima lignocelulósica, corriente(s) de desecho (por ejemplo, suero de leche ácido) y combinaciones de los mismos. Las materias primas lignocelulósicas adecuadas incluyen, por ejemplo, pasto varilla, cultivos energéticos, maderas duras forestales y otros productos, grano usado por cerveceros, paja de trigo, hierbas, hojas, residuos de cultivos AFEX, digestato anaerobio, residuos de cultivos agrícolas (por ejemplo, paja de cebada, paja de arroz, paja de grano pequeño, rastrojos de maíz, fibras de maíz (por ejemplo, goma de fibra de maíz (CFG), granos secos de destilería (DDG), harina de gluten de maíz (CGM)), heno-alfalfa, bagazo de caña de azúcar, biomasa no agrícola (por ejemplo, materiales de algas, residuos de árboles urbanos), residuos de la industria (por ejemplo, residuos de primer/segundo transformación de madera blanda, madera blanda dura, residuo de primera/segunda transformación, papel reciclado y lodos de pulpa), residuos que contienen lignocelulósicos (por ejemplo, papel prensa, papel residual, granos de cervecería, residuos orgánicos municipales, residuos de jardín), residuos orgánicos clínicos, residuos generados durante la producción de biocombustibles (por ejemplo, biomasa de algas procesadas, residuos de la producción de etanol celulósico, residuos sólidos de la producción de biodiésel) y una combinación de los mismos. Las corrientes de desechos adecuadas incluyen desechos agrícolas, desechos orgánicos municipales, desechos de la producción de biocombustibles (por ejemplo, residuos de la producción de etanol celulósico), biomasa de algas, granos usados por cerveceros y/o corrientes de desechos (por ejemplo, melaza, jarabe de maíz, etc.), desechos industriales (por ejemplo, moléculas orgánicas tales como fenol y otros aromáticos) y fibras tales como p-glucano, celulosa, quitina, hemicelulosa y polidextrosa, monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y cualquier combinación de los mismos. Los monosacáridos engloban triosas, tetrosas, pentosas, hexosas, heptosas,etc.,y todas y cada una de las combinaciones de los mismos, las pentosas abarcan ribulosa, xilulosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, desoxirribosa y todas y cada una de las combinaciones de las mismas, mientras que las hexosas se seleccionan del grupo que consiste en alosa, altrosa, glucosa, manosa, glucosa, idosa, galactosa, talosa, psicosa, fructosa, sorbosa, tagatosa y todas y cada una de las combinaciones de las mismas. Los disacáridos abarcan sacarosa, lactosa, maltosa y todas y cada una de las combinaciones de los mismos, mientras que los polisacáridos abarcan almidón, glucógeno, celulosa, quitina y todas y cada una de las combinaciones de los mismos.
La fuente de carbono que se utiliza para hacer crecer la cepa fúngica aislada puede comprender celulosa en una cantidad de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 90 %, de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 85 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 80 %, de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 75 %, o de aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 70 % en peso seco de la fuente de carbono. Como alternativa, la fuente de carbono celulósico comprende celulosa en una cantidad de al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 % o al menos aproximadamente un 70 % del peso seco de la fuente de carbono. En otros casos, la fuente de carbono celulósico utilizada para cultivar la cepa fúngica aislada comprende de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 40 % o de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 30 % en peso de un componente seleccionado de lignina, hemicelulosa o una combinación de los mismos. En algunos aspectos como se divulgan en el presente documento, la fuente de carbono celulósico utilizada para cultivar un microorganismo comprende al menos aproximadamente un 1 %, al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 % o al menos aproximadamente un 30 % en peso de un componente seleccionado de lignina, hemicelulosa o una combinación de los mismos.
Las fuentes de nitrógeno adecuadas incluyen urea, nitrato de amonio (NH<4>NO<3>), sulfato de amonio (NH<4>SO<4>), sales de nitrato (por ejemplo, KNO<3>), sales de amoniaco (es decir, NH<4>SO<4>) y N orgánico (por ejemplo, proteínas, péptidos), corrientes de desechos industriales con alto contenido de nitrógeno, solución de maceración de maíz y combinaciones de los mismos. Los medios artificiales preparados con una fuente de nitrógeno ureico puro proporcionan un crecimiento aproximadamente un 25 % más rápido de los hongos filamentosos que los medios artificiales preparados con una combinación de urea y nitrato de amonio (es decir, 70 g/m<2>/día frente a 52 g/m<2>/día, respectivamente). También se pueden utilizar combinaciones de urea y nitrato de amonio. El crecimiento, aunque mucho más lento que el producido con urea sola o una combinación de urea, también ocurre cuando se utiliza sulfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Si bien también se puede usar nitrato de amonio solo, esta fuente de nitrógeno nuevamente no produce el crecimiento vigoroso que se observa con las combinaciones de urea.
La manipulación de la relación de carbono a nitrógeno (C:N) dentro de los medios artificiales tiene una influencia significativa en la composición del biomaterial producido por las especies y/o cepa(s) fúngicas. Normalmente, una relación C:N baja, tal como una relación C:N de 7,5:1 o inferior, favorece la producción de proteínas y aminoácidos en comparación con los lípidos. Por otra parte, una relación C:N de más de 7,5:1 favorece la producción de lípidos en comparación con las proteínas. A menudo, la formación de lípidos se ve particularmente favorecida cuando el medio artificial tiene una relación C:N de al menos 10:1, 15:1, 20:1, 26:1, 30:1, 40:1 o 50:1.
El pH del medio artificial se determina basándose en los productos deseados y las especies y/o cepa(s) fúngicas empleadas.En Fusisporium, Pseudofusarium, Gibberella, Sporotrichella, Aspergillus, Penicillium, Triocoderma,especies dentro delMucoralessp. (por ejemplo,Rhizopussp.), la cepa fúngica acidófila filamentosa aislada denominada MK7 y combinaciones de las mismas, la alta producción de lípidos tiene lugar en un intervalo de pH de 2,0 a 7,0 y, de manera óptima, a un pH de menos de 3,5. La alta producción de proteínas, mientras que predominantemente influida en función de las relaciones C:N, requiere un pH de al menos 2,7 y preferentemente un pH entre 4,5 y 5,5.
Cultivos y composiciones que comprenden especies y/o cepas fúngicas aisladas
Como se divulga en el presente documento, se utiliza un cultivo puro de una especie y/o cepa fúngica aislada, o un cultivo conjunto puro de dos especies y/o cepas fúngicas o que comprende un cultivo sustancialmente puro de tres o más especies y/o cepas fúngicas. Se puede utilizar una gran cantidad de especies y/o cepas fúngicas filamentosas aisladas, tales como una especie y/o cepa(s) deFusisporium, Psedofusarium, Gibberella, Sporotrichella, Aspergillus, Penicillium, Triocoderma,Pichia spp, especies dentro deMucoralessp. (por ejemplo,Rhizopussp.), y combinaciones de las mismas. El cultivo biológicamente puro/cultivo conjunto/cultivo sustancialmente puro también puede comprender la cepa fúngica acidófila filamentosa aislada denominada MK7, que se ha depositado como Depósito de Acceso ATCC N.° PTA-10698, o mutantes activos de la misma. También se pueden utilizar cultivos biológicamente puros de hongos filamentosos modificados genéticamente. Las especies y/o cepa(s) fúngicas puras y/o su progenie se encuentran normalmente en forma de conidios, microconidios, macroconidios, picnidios, clamidosporas, hifas, fragmentos de hifas y micelios o una combinación de los mismos.
La cepa de hongos acidófilos filamentosos MK7 es una nueva cepa de hongos acidófilos, que puede convertir directamente fuentes de carbono, tales como las fuentes de carbono lignocelulósico, hidratos de carbono, (por ejemplo, suero de leche ácido) y biomasa de algas a biomateriales fúngicos filamentosos que comprenden proteínas y lípidos.
Los métodos de elaboración de productos útiles que utilizan medios artificiales y la cepa del hongo aislado y/o su progenie, comprenden:
a. Inocular una o más de las especies o cepas fúngicas y/o su progenie en medios artificiales que tengan una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en azúcar, glicerol, materias primas lignocelulósicas, productos de desecho agrícolas, industriales y municipales que contienen carbono, hidratos de carbono, extracto de levadura, ácidos casamino, suero de leche ácido, suero de leche dulce y/o una combinación de los mismos en un recipiente, en donde el medio artificial puede soportar el crecimiento de dicha cepa fúngica aislada mediante fermentación en superficie;
b. Cultivar dicha cepa fúngica aislada en dicho medio artificial para producir biomateriales fúngicos filamentosos; c. Recolectar los biomateriales fúngicos filamentosos; y
d. Opcionalmente aislar, purificar y/o producir productos a partir de los biomateriales fúngicos filamentosos.
El crecimiento se produce en condiciones aerobias. En otro aspecto, el crecimiento se produce en condiciones microaerobias. Como alternativa, el crecimiento se produce como resultado de cualquier combinación de condiciones aerobias, condiciones microaerobias y anaerobias, tales como mediante fermentación en superficie.
biomaterial. Por ejemplo, los productos útiles producidos utilizando los hongos y los métodos divulgados incluyen, pero sin limitación, biomateriales proteicos para su uso en productos alimenticios, piensos para peces, piensos para animales, bioplásticos y/o precursores de los mismos. En este punto, el crecimiento se produce por condiciones aerobias, condiciones microaerobias y condiciones anaerobias o cualquier combinación de las mismas.
Un gran número de especies y/o cepa(s) fúngicas acidófilas, tales comoFusisporium, Pseudofusarium, Gibberella, Sporotrichella, Aspergillus, Penicillium, Triocoderma,especies dentro delMucoralessp. (por ejemplo,Rhizopussp.), la cepa fúngica acidófila filamentosa aislada denominada MK7 y combinaciones de las mismas y/o su progenie se pueden cultivar en ausencia de antibióticos con poca o ninguna contaminación. Normalmente, la contaminación en los medios artificiales está causada por otros organismos tales como bacterias, otros hongos no deseados (por ejemplo, levaduras, mohos), algas, plantas, insectos y una mezcla de los mismos.
También se divulga al menos una composición que comprende una especie y/o una cepa fúngica aislada deFusisporium, Pseudofusarium, Gibberella, Sporotrichella, Aspergillus, Penicillium, Triocoderma,especies dentro delMucoralessp. (por ejemplo,Rhizopussp.), levaduras capaces de producir filamentos (es decirYarrowia),la cepa fúngica acidófila filamentosa aislada denominada MK7 y combinaciones de las mismas. La composición puede comprender además un medio artificial que soporta el crecimiento de la especie y/o cepa(s) fúngica, y opcionalmente uno o más de un material de acidificación, un donante de manganeso, una adición de nutrientes y/o una mezcla de los mismos.
Fermentación en superficie
La divulgación actual inicia la fermentación en superficie mediante la inoculación de medios artificiales con una suspensión de células planctónicas de las especies y/o cepa(s) fúngicas filamentosas deseadas. El cultivo de inóculo de un reactor de inóculo se añade al medio artificial a una concentración que producirá un biomaterial maduro en el período de tiempo deseado. En teoría, los medios podrían inocularse con una sola célula; sin embargo, dicha inoculación requeriría condiciones de esterilidad extraordinariamente rigurosas y un período de tiempo significativamente prolongado para que se desarrollase el biomaterial maduro. Normalmente, la inoculación con 0,5 a 1,0 g de células por litro de medio de crecimiento producirá un biomaterial en 3 a 6 días. Por ejemplo, la adición de inóculo que contenga aproximadamente 10 g/l de células al 7,5 % (volumen a volumen) del medio utilizado producirá un biomaterial en 3 a 6 días. No se introduce oxígeno externo en los medios artificiales por burbujeo u otros medios, sino que se puede extraer suficiente oxígeno de las condiciones ambientales o cercanas a las ambientales.
Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que debido a que el crecimiento celular es mucho más rápido en presencia de oxígeno, los conidios presentes en la superficie del medio artificial donde hay más oxígeno crecerán rápidamente y comenzarán la formación del biomaterial de micelios. Se cree que las concentraciones de oxígeno son mucho más bajas solo unos pocos micrómetros por debajo de la superficie del medio artificial y, en consecuencia, colocarían a las células fúngicas ubicadas en esas regiones en un entorno de estrés. Se sabe que el estrés aumenta la excreción de polisacáridos extracelulares, que tienen un fenotipo "pegajoso" y, por tanto, ayudarían a la rápida formación del biomaterial fúngico filamentoso mediante la adhesión a las células que proliferan en la superficie. La concentración de sustrato, sin embargo, también tiene un efecto significativo. Por ejemplo, cuando la concentración de sustrato de carbono es inferior al 4 %, no se formarán biomateriales fúngicos filamentosos. Cabe señalar que el estrés ambiental inicial para formar materiales no necesariamente infiere que un material estresado, es decir, se forma un material que contiene las toxinas excretadas por el organismo estresado.
Normalmente, se utilizan bandejas poco profundas que contienen medios artificiales para la fermentación en superficie en condiciones controladas de temperatura, humedad y flujo de aire adecuadas para las especies y/o cepa(s) fúngicas empleadas. Se mantienen condiciones estériles para un óptimo crecimiento de biomaterial fúngico filamentoso. Se mantiene un flujo de aire suficiente para eliminar el calor y el dióxido de carbono producidos por la respiración microbiana y suministrar oxígeno sin agitar la superficie del medio artificial y sin interrumpir el crecimiento de hifas fúngicas.
En general, comienza a formarse una "piel" en la superficie del medio artificial el día 2 después de la inoculación. Esta "piel" es la biomaterial fúngico filamentoso inicial que frecuentemente incluye hifas aéreas así como hifas en contacto con los medios artificiales y que continúa creciendo y aumentando en densidad celular. Normalmente, de tres a seis días después de la inoculación, los biomateriales fúngicos filamentosos resultantes tienen de 1 a 30 mm de espesor y tienen suficiente resistencia a la tracción e integridad estructural para ser manipulados sin rotura.
Los biomateriales fúngicos filamentosos producidos tienen una estructura como la descrita que no se observa en la naturaleza. En primer lugar, los biomateriales fúngicos filamentosos formados de manera natural no están compuestos de un cultivo puro/cultivo conjunto/cultivo sustancialmente puro. Normalmente, los biomateriales formados en la naturaleza contienen varios tipos de algas y/o bacterias además de al menos una especie fúngica filamentosa y forman un microecosistema artificial. Ejemplos de biomateriales fúngicos formados en la naturaleza son las esteras de hongos micorrízicos, que existen en una forma ampliamente dispersa en el suelo y están asociados con las raíces de las plantas, líquenes (por ejemplo, musgo de reno y líquenes costrosos) y hongos (por ejemplo,Armillaria ostoyae).
En segundo lugar, los biomateriales formados utilizando los métodos y técnicas descritos en el presente documento tienen una densidad celular significativamente mayor que las de los que se encuentran en la naturaleza, incluso teniendo en cuenta las múltiples especies que se encuentran en los biomateriales formados de manera natural. Los biomateriales fúngicos filamentosos producidos tienden a ser muy densos, normalmente, de 50 a 200 gramos por litro. Los procesos naturales y sumergidos para el crecimiento de hongos filamentosos comúnmente dan como resultado densidades de biomasa de aproximadamente, 15 gramos por litro. Los procesos de fermentación en estado sólido dan como resultado una mezcla del sustrato con un pequeño porcentaje de hongos, es decir, menos del 5 % de composición fúngica. Desde la perspectiva del porcentaje de sólidos, los métodos divulgados en el presente documento produjeron biomateriales fúngicos filamentosos que normalmente varían entre el 5 y el 20 % de sólidos. En cambio, los procesos naturales y sumergidos para el crecimiento de hongos filamentosos comúnmente dan como resultado intervalos de porcentaje de sólidos inferiores al 1,5 %. Un resultado de las densidades logradas, la naturaleza filamentosa y la matriz extracelular que se encuentra en estos biomateriales densos tienen la capacidad de mantenerse como un material cohesivo al secarse. Esto está en marcado contraste con la forma pulverulenta y/o no cohesiva que se encuentra normalmente con otros biomateriales fúngicos filamentosos secos.
En tercer lugar, los biomateriales formados utilizando los métodos y técnicas descritos en el presente documento tienen una elevada resistencia a la tracción en comparación con los biomateriales de origen natural, permitiendo que se levanten y muevan sin romperse.
En cuarto lugar, los presentes biomateriales tienen una estructura definida que comprende, en algunos ejemplos, una sola capa densa compuesta por largos filamentos generalmente alineados paralelos a la interfaz aire:biomaterial. En algunos biomateriales fúngicos filamentosos existen al menos dos capas: (a) una capa inferior densa y (b) una capa de hifas aéreas. En algunos biomateriales fúngicos filamentosos son visibles al menos tres capas estructuralmente diferentes: (a) una capa inferior densa, (b) una capa de hifas aéreas y (c) una capa de zona de transición (Véanse las figuras 10A y B). Para sistemas con hifas aéreas y sistemas con tres capas, la capa de hifas aéreas es normalmente la más visiblemente dominante, seguida de la densa capa inferior, mientras que la capa de la zona de transición, si está presente, es la más pequeña. Cada una de las capas tiene normalmente asociada una densidad celular característica en comparación con las otras capas. Por ejemplo, la capa de hifas aéreas es significativamente menos densa que la capa inferior del biomaterial (Véase la figura 10A). Si se producen hifas aéreas, están predominantemente orientadas de manera perpendicular a la interfaz biomaterial:aire y/o biomaterial:medio. Para todos los biomateriales, la capa densa está compuesta por filamentos largos que están predispuestos a alinearse en paralelo con la interfaz biomaterial:aire y/o biomaterial:medio. Además, el biomaterial resultante está compuesto por al menos la mayoría de la biomasa fúngica y en aspectos preferidos, compuesto esencialmente de materia prima sin residuos y es esencialmente biomasa fúngica pura.
En aquellos casos en los que se forman hifas aéreas, tales como cuando se utiliza glicerol como sustrato, también existen varios factores clave que distinguen la capa de hifas aéreas y la capa inferior densa. En términos de longitud, las hifas aéreas tienden a ser más largas que las que se encuentran en la capa inferior densa. La densidad y distribución de las hifas aéreas individuales es inferior a las asociadas con el micelio de la capa densa. Las hifas aéreas tienden a una orientación vertical en el extremo yuxtapuesto a la atmósfera. Es decir, las hifas aéreas tienden a crecer relativamente perpendiculares al medio superficial. Por otra parte, las hifas de la capa densa tienden a crecer en una orientación predominantemente paralela al interfaz aire:biomaterial y/o biomaterial:medio. La baja densidad relativa de las hifas aéreas combinada con su mayor longitud y orientación vertical sugiere una maximización de la extracción de oxígeno. Además, poca o ninguna matriz extracelular se encuentra en la capa de hifas aéreas. En cambio, se puede encontrar una gran cantidad de matriz extracelular en la capa inferior densa.
La capa aérea del biomaterial, si se forma, parece acelerar el crecimiento del biomaterial. Las alteraciones en el área afectada de la capa aérea impactan negativamente en el crecimiento acelerado del biomaterial. Las alteraciones incluyen el contacto con un objeto sólido, el contacto con gotículas de agua y grietas o fisuras provocadas por la agitación del medio líquido sobre el que crece el biomaterial. Normalmente, el área de biomaterial alterada no experimenta ningún crecimiento adicional cuando se elimina la causa de la alteración. En general, el crecimiento de biomaterial se produce por condiciones aerobias, condiciones microaerobias y condiciones anaerobias o cualquier combinación de las mismas.
Los biomateriales se recogen normalmente entre el día 3 y el día 12 después de la inoculación, dependiendo de las especies/cepa(s) utilizadas y del producto deseado, aunque también son posibles tiempos de cosecha más tardíos. Los biomateriales fúngicos filamentosos pueden recogerse mediante varias metodologías diferentes que pueden incluir; enjuagado, procesamiento físico (reducción de tamaño, tratamientos de presión, deshidratación, etc.), inactivación de los procedimientos de viabilidad, ciclos de temperatura, extracciones y/o separación de constituyentes de la biomasa, y conversión y/o inclusión en diferentes sistemas. En algunos aspectos, se recogen los biomateriales fúngico filamentosos, se enjuagan con agua y después se secan en un horno de temperatura controlada para desactivar muchas de las enzimas y limitar las transformaciones bioquímicas dentro del biomaterial, o, se congelan.
Los hongos filamentosos se reconocen como muy útiles como células hospedadoras para la producción de proteínas recombinantes y las plataformas de expresión, dando como resultado productos útiles expresados en la biomasa y/o un biomaterial fúngico filamentoso. Ejemplos de hongos filamentosos que se utilizan actualmente o se proponen para su uso en dichos procesos incluyenNeurospora crassa, Acremonium chrysogenum, Tolypocladium geodes, Mucor circinelloides, Trichoderma reesei, Aspergillus nidulans, Aspergillus nigeryAspergillus oryzae.Además, las especies microbianas utilizadas para producir biomateriales como se divulga se pueden modificar genéticamente para expresar/inhibir sistemas mediante la manipulación de la expresión génica, incluyendo la transcripción, de manera que sobreexpresan o no expresan compuestos o productos químicos que se encuentran en su forma nativa o inalterada. El uso y manipulación de sistemas fúngicos para sobreexpresar productos químicos existentes, expresar sistemas que no están presentes de forma natural o inhibir sistemas comúnmente presentes en la forma nativa se conoce en la materia, es decirAspergillusspp.,Penicilliumspp.,Rhizopusspp.,Trichodermaspp., y levaduras como tales Pichia spp. Los productos útiles producidos utilizando el biomaterial y los métodos divulgados incluyen, pero sin limitación, biomasa y/o biomateriales de biomasa utilizados para expresar productos farmacéuticos, productos nutracéuticos, productos químicos de bloques de construcción para aplicación industrial, medicinas, enzimas y/o precursores de los mismos.
Especies y/o cepa(s) fúngicas acidófilas
Las especies y/o cepas fúngicas acidófilas utilizadas en la divulgación son degradantes de lignocelulosa, cepas fúngicas filamentosas y/o su progenie que tienen al menos las siguientes características de identificación:
a. la cepa aislada es acidófila y puede crecer a un pH que varía entre aproximadamente 0,68 y aproximadamente 8,5; y
b. producen biomateriales filamentosos que contienen proteínas y lípidos de medios artificiales a través de la fermentación en superficie en condiciones aerobias, condiciones microaerobias, condiciones anaerobias o cualquier combinación de las mismas. En este punto, la fuente de carbono del medio artificial incluye hidratos de carbono, materias primas lignocelulósicas, productos de desecho que contienen carbono (por ejemplo, suero de leche ácido) o una combinación de los mismos.
Las especies y/o cepa(s) aisladas comprenden además normalmente una o más de las siguientes características de identificación adicionales:
c) la capacidad de producir proteínas, lípidos, aminoácidos, enzimas, ácidos nucleicos (nucleótidos), hidratos de carbono, fibras tales como p-glucanos, policétidos, alcaloides, pigmentos y antibióticos. Ejemplos incluyen, pero sin limitación, ésteres, ácido glutámico, ácido aspártico, amilasas, proteasas, celulasas, xilanasas, lipasas, peroxidasas, peroxidasas de manganeso, ácidos nucleicos/nucleótidos: ADN/ARN, purinas, pirimidinas, ácido oleico, ácido palmitoleico, p-glucano, quitina, p-caroteno, glucósidos, fenólicos, terpenoides de fuentes de carbono como se describe en la página 18, párrafo [80] y materias primas de algas, y de los desechos generados durante la producción de biocombustible (por ejemplo, biomasa de algas procesada, glicerol) bajo una variedad de condiciones anaerobias, microaerobias y aerobias y/o cualquier combinación de las mismas;
d) comprenden un ARNr 18S y una secuencia de ADN de la región ITS que comparte al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.
Las especies y/o cepa(s) fúngicas acidófilas filamentosas adecuadas incluyenFusisporium, Pseudofusarium, Gibberella, Sporotrichella, Aspergillus, Penicillium, Triocoderma,especies dentro delMucoralessp. (por ejemplo,Rhizopussp.), la cepa fúngica acidófila filamentosa aislada denominada MK7 y combinaciones de las mismas y/o su progenie. La cepa denominada MK7, ha sido depositado como Depósito de Acceso ATCC N.° PTA-10698.
La especie y/o cepa(s) fúngicas acidófilas y/o su progenie pueden crecer a un pH bajo como máximo de aproximadamente 7,0, aproximadamente 6,5, aproximadamente 6,0, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,0, aproximadamente 4,5, aproximadamente 4,0, aproximadamente 3,5, aproximadamente 2,0, aproximadamente 1,8, aproximadamente 1,6, aproximadamente 1,4, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,0, aproximadamente 0,9, aproximadamente 0,8, o aproximadamente 0,7 o aproximadamente 0,6, o aproximadamente 0,5. Por ejemplo, la cepa fúngica puede crecer a un pH bajo que varía de aproximadamente 0,68 a aproximadamente 2,0.
La especie y/o cepa(s) acidófila empleadas pueden producir lípidos y proteínas en grandes cantidades dentro de los biomateriales fúngicos filamentosos que crecen en los intervalos de pH bajos como se describió anteriormente. Por ejemplo, la cepa aislada puede convertir la fuente de carbono en lípidos a una velocidad más elevada dentro de un pH bajo como se describe anteriormente de lo que se ha informado previamente en la materia, tal como se han descrito las cepas deFusariumpreviamente aisladas (véase Nairnet al.,1985, Bhatiaet al.,2006 y Naqviet al.,1997). Las especies y/o cepa(s) acidófilas empleadas pueden convertir una fuente de carbono en lípidos a una velocidad de al menos 0,04 g de lípidos/g de fuente de carbono, 0,05 g de lípidos/g de fuente de carbono, 0,06 g de lípidos/g de fuente de carbono 0,07 g de lípidos/g de fuente de carbono, 0,08 g de lípidos/g de fuente de carbono, 0,1 g de lípidos/g de fuente de carbono, 0,12 g de lípidos/g de fuente de carbono, 0,14 g de lípidos/g de fuente de carbono, 0,16 g de lípidos/g de fuente de carbono, 0,18 g de lípidos/g de fuente de carbono, 0,2 g de lípidos/g de fuente de carbono, 0,25 g de lípidos/g de fuente de carbono, 0,3 g de lípidos/g de fuente de carbono, 0,35 g de lípidos/g de fuente de carbono o 0,4 g de lípidos/g de fuente de carbono, después de 10 días de incubación a pH 2,5.
Las condiciones de cultivo divulgadas en el presente documento también producen biomasa filamentosa que tiene un perfil de lípidos más favorable en comparación con la biomasa producida previamente a partir de hongos o microalgas cultivadas. Por ejemplo, las especies y/o cepa(s) acidófilas utilizadas producen más ácidos grasos saturados (por ejemplo, ácidos palmítico (16:0) y esteárico (18:0)) y ácidos grasos monoinsaturados (por ejemplo, ácido oleico (18:1)), pero menos ácidos grasos poliinsaturados, que son más vulnerables a la oxidación.
Además, las especies y/o cepa(s) y/o su progenie fúngicas acidófilas pueden crecer a una elevada concentración de metales, donde el metal se selecciona del grupo que consiste en Mn, Ag, Zn, Fe, Al, Be, Pb, Cu, Cr, Ni, Cd, Co, Ni, Pd, Pt, U, Th, Mo, Sn, Ti, As, Au, Se, Sb y Hg.
Las especies y/o cepas fúngicas acidófilas y/o su progenie son capaces de un rápido crecimiento celular de alta densidad en las condiciones de cultivo. En este punto, los microorganismos son capaces de alcanzar una densidad celular (medida como peso seco/l de medio artificial) de al menos 25 g/l, al menos aproximadamente 30 g/l, al menos aproximadamente 50 g/l, al menos aproximadamente 75 g/l, al menos aproximadamente 100 g/l, al menos aproximadamente 125 g/l, al menos aproximadamente 135 g/l, al menos aproximadamente 140 g/l, al menos aproximadamente 145 g/l, al menos aproximadamente 150 g/l, al menos aproximadamente 160 g/l, al menos aproximadamente 170 g/l, al menos aproximadamente 180 g/l, al menos aproximadamente 190 g/l, al menos aproximadamente 200 g/l, al menos aproximadamente 210 g/l, al menos aproximadamente 220 g/l, al menos aproximadamente 230 g/l, al menos aproximadamente 240 g/l, al menos aproximadamente 250 g/l.
Por ejemplo, las especies y/o cepa(s) fúngicas acidófilas son capaces de lograr una densidad celular de aproximadamente 25 g/l a aproximadamente 300 g/l, de aproximadamente 30 g/l a aproximadamente 300 g/l, de aproximadamente 50 g/l a aproximadamente 300 g/l, de aproximadamente 75 g/l a aproximadamente 300 g/l, de aproximadamente 100 g/l a aproximadamente 300 g/l, de aproximadamente 125 g/l a aproximadamente 300 g/l, de aproximadamente 150 g/l a aproximadamente 300 g/l, de aproximadamente 170 g/l a aproximadamente 300 g/l, de aproximadamente 130 g/l a aproximadamente 290 g/l, de aproximadamente 135 g/l a aproximadamente 280 g/l, de aproximadamente 140 g/l a aproximadamente 270 g/l, de aproximadamente 145 g/l a aproximadamente 260 g/l, de aproximadamente 150 g/l a aproximadamente 250 g/l, de aproximadamente 170 g/l a aproximadamente 250 g/l, de aproximadamente 100 g/l a aproximadamente 280 g/l. El crecimiento de elevada densidad de las especies y/o cepa(s) fúngicas acidófilas puede aumentarse aún más mediante el ajuste de las condiciones de fermentación (tales como temperatura, pH, concentración de iones, tiempo de incubación y/o concentraciones de gas).
Especies de Fusarium
La información sobre especies deFusariumacidófilas, métodos de identificación y cultivo de aislamiento se describe en Nelsonet al.,(Taxonomy, Biology, and Clinical Aspects of Fusarium Species, 1994, Clinical Microbiology Reviews, 7(4): 479-504), Toussoun y Nelson (1976, Fusarium), Booth (Fusarium: laboratory guide to the identification of the major species, 1977, Commonwealth Mycological Institute, Is Bn 0851983839, 9780851983837) y Leslieet al.,(The Fusarium laboratory manual, 2006, Wiley-Blackwell, ISBN 0813819199, 9780813819198).
Las proteínas, incluyendo, por ejemplo, determinadas enzimas, producidas por las especies y/o cepa(s) fúngicas filamentosas se pueden purificar a partir de la biomasa filamentosa producida por los organismos. Los expertos en la materia conocen métodos de purificación de proteínas. Se han descrito métodos detallados de purificación de proteínas en Janson y Ryden (Protein purification: principles, high-resolution methods, and applications; Wiley-VCH, 1998, ISBN 0471186260, 9780471186267), Detscher (Guide to protein purification, Volumen 182 de Methods in enzymology, Gulf Professional Publishing, 1990, ISBN 0121820831, 9780121820831) y Cutler (Protein purification protocols, volumen 244 de Methods in molecular biology, Humana Press, 2004 ISBN 1588290670, 9781588290670).
No es necesario purificar las proteínas de los materiales para encontrar utilidad y provecho como productos. Es decir, el material se puede procesar sin purificación y ser útil; es decir, como fuente de proteínas, como alimento y/o alimento para animales. Los materiales pueden formar productos por sí mismos; la mezcla de productos de biomaterial producidosin situson importantes y valiosos.
Lípidos de las especies y/o cepa(s) fúngicas
Como se ha indicado anteriormente, cuando se cultiva en medios artificiales que tienen una elevada relación C:N, se producen biomateriales fúngicos filamentosos que tienen un elevado contenido de lípidos y un perfil de lípidos más favorable en comparación con las algas y otros organismos productores de lípidos. Los lípidos se pueden extraer de la biomasa filamentosa aislada. En algunos casos, los lípidos son principalmente triacilglicéridos con grupos acilo de ácidos grasos. En algunos ejemplos, los ácidos grasos son esencialmente ácidos grasos insaturados y/o ácidos grasos saturados. Los ácidos grasos insaturados incluyen ácido oleico (18:1), ácido a-linolénico (18:3), ácido eicosenoico (20:1) y combinaciones de los mismos. Los ácidos grasos saturados incluyen ácidos palíticos (16:0), ácidos esteáricos (18:0), ácido araquídico (20:0), ácido behénico (22:0) y combinaciones de los mismos. Otros tipos de lípidos que pueden producirse incluyen, pero sin limitación, esteroles (por ejemplo, ergosterol, una vitamina en el precursor D2), diacilglicéridos, carotenoides, grasas saturadas (por ejemplo, ácido butírico, ácido hexanoico, ácido octanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido tridecanoico, ácido tetradecanoico, ácido pentadecanoico, ácido hexadecanoico, ácido heptadecanoico, ácido octadecanoico, ácido nonadecanoico, ácido eicosanoico, ácido docosanoico y ácido tetracosanoico), grasas monoinsaturadas (por ejemplo, ácido tetradecenoico, ácido pentadecenoico, ácido hexadecenoico, ácido heptadecenoico, ácido octadecenoico, ácido eicosenoico, ácido docosenoico y ácido cistetracosenoico) y grasas poliinsaturadas (por ejemplo, ácido hexadecadienoico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido a-linolénico, ácido Y-linolénico, ácido parinárico, ácido eicosadienoico, ácido araquidónico, ácido timnodónico, ácido brásico, ácido clupanodónico y ácido docosahexaenoico).
Las especies y/o cepa(s) fúngicas filamentosas y/o su progenie son capaces de producir lípidos de forma eficaz. En algunos ejemplos, la cantidad de lípidos producidos es de al menos aproximadamente 1 g/l/día, 5 g/l/día, al menos aproximadamente 10 g/l/día, al menos aproximadamente 20 g/l/día, al menos aproximadamente 30 g/l/día, al menos aproximadamente 40 g/l/día, al menos aproximadamente 50 g/l/día, al menos aproximadamente 60 g/l/día, al menos aproximadamente 70 g/l/día, o más. Por ejemplo, la cantidad de aceite biológico producido es de aproximadamente 1 g/l/día a aproximadamente 5 g/l/día, de aproximadamente 5 g/l/día a aproximadamente 70 g/l/día, de aproximadamente 10 g/l/día a aproximadamente 70 g/l/día, de aproximadamente 20 g/l/día a aproximadamente 70 g/l/día o de aproximadamente 30 g/l/día a aproximadamente 70 g/l/día. Estos valores son mucho mayores que el valor más elevado informado en la bibliografía de aproximadamente 12 g/l/día (Véase Dey, P.et al.(2011) Comparative lipid profiling of two endophytic fungal isolates - Colletotrichum sp. and Alternaria sp. having potential utilities as biodiesel feedstock. Bioresource Technology 102:5815-5823; Gong, Z.et al.(2013) Efficient conversion of biomass into lipids by using the simultaneous saccharification and enhanced lipid production process. Biotechnology for Biofuels 6:36; Gong, Z.et al.(2014) Lipid production from corn stover by the oleaginous yeast Cryptococcus curvatus. Biotechnology for Biofuels 7:158; Hui, L.et al.(2010) Direct microbial conversion of wheat straw into lipid by a cellulolytic fungus of Aspergillus oryzae A-4 in solid-state fermentation. Bioresource Technology 101:7556-7562; Liang, Y.et al.(2014) Microbial lipid production from pretreated and hydrolyzed corn fiber. Biotechnol Progress 30:945-951; Liu, C.-Z.et al.(2012) Ionic liquids for biofuel production: Opportunities and challenges. Applied Energy 92:406-414; Ruan, Z.et al.(2013) Co-hydrolysis of lignocellulosic biomass for microbial lipid accumulation. Biotechnol. Bioeng.
110:1039-1049; Sung, M.et al.(2014) Biodiesel production from yeast Cryptococcus sp. using Jerusalem artichoke. Bioresource Technology 155:77-83; Xie, H.et al.(2012) Enzymatic hydrolysates of corn stover pretreated by a N-methylpyrrolidone-ionic liquid solution for microbial lipid production. Green Chem. 14: 1202-1210).
Los lípidos se pueden extraer de los biomateriales fúngicos filamentosos utilizando varios procedimientos. Se describen ejemplos no limitantes de extracción de lípidos en Kinget al.(Supercritical Fluid Extraction: Present Status and Prospects, 2002, Grasa Asceites, 53,8-21), Folchet al.(A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues, 1957, J Biol. Chem., 226, 497-509), Bligh y Dyer (A rapid method of total lipid extraction and purification. 1959, Can. J Biochem. Physiol., 37, 911-917), Cabriniet al.(Extraction of lipids and lipophilic antioxidants from fish tissues - a comparison among different methods. 1992, Comp. Biochem. Physiol., 101(3), 383-386), Haraet al.(Lipid extraction of tissues with a low toxicity solvent. 1978, Anal. Biochem. 90, 420-426), Linet al.(Ethyl acetate/ethyl alcohol mixtures as an alternative to Folch reagent for extracting animal lipids. 2004, J. Agric. Food Chem.,
52, 4984-4986), Whiteleyet al.(Lipid peroxidation in liver tissue specimens stored at subzero temperatures. 1992, Cryo-Letters, 13, 83-86), Krameret al.(A comparison of procedures to determine free fatty acids in rat heart. 1978, J.
Lipid Res., 19, 103-106) y Somashekaret al.(Efficacy of extraction methods for lipid and fatty acid composition from fungal cultures, 2001, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 17(3):317-320).
En otro ejemplo, el lípido se puede extraer mediante métodos similares al proceso FRIOLEX® (Westfalia Separator Industry GmbH, Alemania) que se utiliza para extraer los aceites biológicos producidos por los microorganismos.
FRIOLEx ® es un proceso de extracción física de aceite a base de agua, mediante el cual la materia prima que contiene aceite se puede utilizar directamente para extraer el aceite sin utilizar ningún método convencional de extracción con disolventes. En este proceso, se puede utilizar un disolvente orgánico soluble en agua como ayuda del proceso y el aceite se separa del caldo de materia prima mediante separación por densidad utilizando gravedad o fuerzas centrífugas.
Una vez extraídos los lípidos, éstos se pueden recuperar o separar de los componentes no lipídicos mediante cualquier medio adecuado conocido en la materia. Por ejemplo, se utilizan técnicas físicas y/o mecánicas de bajo coste para separar las composiciones que contienen lípidos de las composiciones no lipídicas. Si se crean múltiples fases o fracciones mediante el método de extracción utilizado para extraer los lípidos, donde una o más fases o fracciones contienen lípidos, un método para recuperar las fases o fracciones que contienen lípidos puede implicar eliminar físicamente las fases o fracciones que contienen lípidos de las fases o fracciones no lipídicas, o viceversa. En algunos casos, se utiliza un método tipo FRIOLEX® para extraer los lípidos producidos por los microorganismos y después la fase ligera rica en lípidos se separa físicamente de la fase pesada rica en proteínas (tal como mediante la retirada de la fase rica en lípidos que se encuentra en la parte superior de la fase pesada rica en proteínas después de la separación por densidad).
Hay al menos dos etapas en la producción de lípidos por las especies y/o cepa(s) fúngicas filamentosas: (a) la etapa de acumulación de biomaterial fúngico filamentoso y (b) la etapa de producción de lípidos. La etapa de acumulación de biomaterial fúngico filamentoso produce una biomasa filamentosa, de la especie y/o cepa(s) fúngica de manera que de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un
95 %, de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 95 % o de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 95 % de la producción total de biomaterial fúngico filamentoso de la cepa fúngica se logra durante la etapa de acumulación de biomaterial fúngico filamentoso. En otros casos, de aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 95 % o de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 95 % de la producción total de biomaterial fúngico filamentoso del microorganismo se logra durante la etapa de acumulación de biomaterial fúngico filamentoso. En otras circunstancias, la etapa de acumulación de biomaterial fúngico filamentoso produce biomasa filamentosa del microorganismo tal que al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o el 100 % de la producción total de biomasa filamentosa del microorganismo se logra durante la etapa de acumulación de biomaterial fúngico filamentoso. Por ejemplo, de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 95 % de la producción total de biomaterial fúngico filamentoso del microorganismo se logra durante la etapa de acumulación de biomaterial fúngico filamentoso.
Con respecto a la etapa de producción de lípidos, éstos se producen en todas las etapas de crecimiento, ya que son necesarios para el crecimiento y la proliferación celular; es decir, los lípidos se producen durante la etapa de acumulación de biomaterial fúngico filamentoso. Aunque sin pretender quedar ligado a una teoría, se cree que algunos lípidos de almacenamiento se producen en etapas posteriores del crecimiento de biomaterial, mientras que otros lípidos de almacenamiento se producen antes durante la formación de biomaterial. Además, en condiciones de bajo contenido de nitrógeno, el organismo acumulará lípidos de almacenamiento a una velocidad más rápida.
La etapa de acumulación de lípidos produce lípidos de manera que de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 95 % o de aproximadamente un
50 % a aproximadamente un 95 % de la producción total de lípidos del microorganismo se logra durante la etapa de acumulación de lípidos. En algunos casos, de aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 95 % o de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 95 % de la producción total de lípidos del microorganismo se logra durante la etapa de acumulación de lípidos. En otras circunstancias, la etapa de acumulación de lípidos produce lípidos tales que al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90%o al menos aproximadamente un 95%de la producción total de lípidos del microorganismo se logra durante la etapa de acumulación de lípidos. Preferentemente, de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 95 % de la producción total de lípidos del microorganismo se logra durante la etapa de acumulación de lípidos.
Una vez que los lípidos se producen como se divulga en el presente documento, se pueden utilizar varios métodos conocidos en la materia para transformar los aceites biológicos en ésteres de ácidos grasos para su uso como ingredientes para productos alimenticios o farmacéuticos. La producción de ésteres de ácidos grasos puede comprender transesterificar los aceites biológicos producidos por el microorganismo. La extracción de los lípidos de los microorganismos y la transesterificación de los lípidos se pueden realizar de manera simultánea, en un método de una sola etapa. Por ejemplo, el cultivo que contiene la cepa fúngica aislada puede exponerse a condiciones o tratamientos (o una combinación de condiciones o tratamientos) que promueven tanto la extracción de los lípidos como la transesterificación de los lípidos. Dichas condiciones o tratamientos incluyen, pero sin limitación, pH, temperatura, presión, la presencia de disolventes, la presencia de agua, la presencia de catalizadores o enzimas, la presencia de detergentes y fuerzas físicas/mecánicas. Se pueden combinar dos conjuntos de condiciones o tratamientos para producir un método de una sola etapa para extraer y transesterificar los lípidos, donde un conjunto de condiciones o tratamientos promueve favorablemente la extracción de los lípidos y el otro conjunto de condiciones o tratamientos promueve favorablemente la transesterificación de los lípidos, siempre que los dos conjuntos de condiciones o tratamientos se puedan combinar sin causar una reducción significativa en la eficacia de la extracción o la transesterificación de los lípidos. La hidrólisis y transesterificación se pueden realizar directamente en biomasa filamentosa de células enteras.
Como alternativa, la extracción de los lípidos se realiza como una etapa separada de la etapa de transesterificación de los lípidos. Dichas reacciones de transesterificación se realizan utilizando catalizadores ácidos o básicos. Los métodos para transesterificar los lípidos biológicos en ésteres de ácidos grasos para su uso como ingredientes para productos alimenticios o farmacéuticos implican hacer reaccionar los aceites biológicos que contienen triglicéridos en presencia de un alcohol y una base para producir ésteres de los restos de ácidos grasos a partir de los triglicéridos.
Los alcoholes adecuados para su uso en transesterificación incluyen cualquier alcohol de alquilo inferior que contenga de 1 a 6 átomos de carbono (es decir, un alcohol alquílico C<1>-<6>, tales como alcoholes metílico, etílico, isopropílico, butílico, pentílico, hexílico e isómeros de los mismos). Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que el uso de alcoholes de alquilo inferior produce ésteres de alquilo inferior de los restos de ácidos grasos. Por ejemplo, el uso de etanol produce ésteres etílicos. Si el alcohol es metanol o etanol, los ésteres de ácidos grasos producidos son un éster metílico y un éster etílico del resto de ácido graso, respectivamente. Normalmente, el alcohol comprende de aproximadamente un 5 % en peso a aproximadamente un 70 % en peso, de aproximadamente un 5 % en peso a aproximadamente un 60 % en peso, desde aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 50 % en peso, de aproximadamente un 7 % en peso a aproximadamente un 40 % en peso, de aproximadamente un 9 % en peso a aproximadamente un 30 % en peso o de aproximadamente un 10 % en peso a aproximadamente un 25 % en peso de la mezcla de la composición de lípidos, el alcohol y la base. La composición y la base se pueden añadir al etanol puro o al metanol puro. En general, la cantidad de alcohol utilizada puede variar con la solubilidad de los lípidos o la composición que contiene triglicéridos en el alcohol.
La composición que comprende triglicéridos, el alcohol y la base se hace reaccionar juntos a una temperatura y durante un tiempo que permite la producción de un éster a partir de los restos de ácidos grasos y el alcohol. Los tiempos y temperaturas de reacción adecuados para producir un éster se pueden determinar por un experto en la materia. Sin pretender quedar ligados a teoría alguna, se cree que los restos de ácidos grasos se escinden de la cadena principal de glicerol del triglicérido y se forman ésteres de cada resto de ácidos grasos durante la etapa de reacción. La etapa de reacción de la composición en presencia de un alcohol y una base se realiza a una temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 140 °C, de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 120 °C, de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 110 °C, de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 100 °C o de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 90 °C. Alternativamente, la etapa de reacción de la composición en presencia de un alcohol y una base se realiza a una temperatura igual o superior a aproximadamente 20 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C, 95 °C, 105 °C o 120 °C. Dependiendo del producto deseado, la etapa de reacción de la composición en presencia de un alcohol y una base se realiza durante un tiempo de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 36 horas, de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 36 horas, de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 36 horas, de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 36 horas o de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 36 horas. En cambio, la etapa de reacción de la composición en presencia de un alcohol y una base se puede realizar durante aproximadamente 0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 5,0, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 10, 12, 16, 20, 24, 28, 32 o 36 horas.
La etapa de reacción de la composición de lípidos, el alcohol y la base pueden llevarse a cabo sometiendo a reflujo los componentes para producir los ésteres de ácidos grasos, tales como ésteres PUFA. La etapa de reacción de la composición de lípidos también se puede llevar a cabo a una temperatura que no dé como resultado el reflujo de los componentes de reacción. Por ejemplo, llevar a cabo la etapa de reacción de la composición de lípidos a presiones superiores a la presión atmosférica puede aumentar el punto de ebullición de los disolventes presentes en la mezcla de reacción. En dichas condiciones, la reacción puede ocurrir a una temperatura a la que los disolventes hiervan a presión atmosférica, pero no daría como resultado el reflujo de los componentes de reacción. En general, la reacción se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 5 (34,47 * 103 Pa) a aproximadamente 20 (137,89 * 103 Pa) libras por pulgada cuadrada (psi); de aproximadamente 7 (48,26 * 103 Pa) a aproximadamente 15 (103,42 * 103 Pa) psi; o de aproximadamente 9 (62,05 * 103 Pa) a aproximadamente 12 (82,73 * 103 Pa) psi. Algunas reacciones se llevan a cabo a una presión de 7, 8, 9, 10, 11 o 12 psi (48,26 * 103, 55,15 * 103, 62,05 * 103, 68,94 * 103, 75,84 * 103 u 82,73 * 103 Pa). Las reacciones realizadas bajo presión se pueden llevar a cabo a las temperaturas de reacción enumeradas anteriormente. Las reacciones realizadas bajo presión se pueden llevar a cabo a una temperatura igual o superior a aproximadamente 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C o 90 °C.
Los ésteres de ácidos grasos se separan de la mezcla de reacción mediante la destilación de la composición para recuperar una fracción que comprende el éster del ácido graso. Una fracción diana de la mezcla de reacción que incluye los ésteres de ácidos grasos de interés se puede separar de la mezcla de reacción y recuperarse. La destilación se puede realizar al vacío. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, la destilación al vacío permite que la destilación se realice a una temperatura inferior que en ausencia de vacío y, por lo tanto, puede evitar la degradación de los ésteres. Las temperaturas de destilación normales varían de aproximadamente 120 °C a aproximadamente 170 °C, tal como realizar la destilación a una temperatura inferior a aproximadamente 180 °C, inferior a aproximadamente 175 °C, inferior a aproximadamente 70 °C, inferior a aproximadamente 165 °C, inferior a aproximadamente 160 °C, inferior a aproximadamente 155 °C, inferior a aproximadamente 150 °C, inferior a aproximadamente 145 °C, inferior a aproximadamente 140 °C, inferior a aproximadamente 135 °C o inferior a aproximadamente 130 °C. Las presiones normales para la destilación al vacío varían de aproximadamente 0,1 mm Hg (13 Pa) a aproximadamente 10 mm Hg (1,3 * 103 Pa), tal como una presión de destilación al vacío igual o superior a aproximadamente 0,1 (13 Pa), 0,5 (67 Pa), 1 (133 Pa), 1,5 (200 Pa), 2 (267 Pa), 2,5 (333 Pa), 3 (400 Pa), 3,5 (467 Pa) o 4 (533 Pa) mm Hg.
Los lípidos extraídos de la especie o cepa fúngica filamentosa y/o su progenie de la presente invención se utilizan para producir biolubricantes. Como se utiliza en el presente documento, el término "biolubricantes" se refiere a lubricantes producidos mediante el uso de material procedente de organismos vivos o recientemente vivos. Como se utiliza en el presente documento, el término "lubricantes" se refiere a sustancias (normalmente un líquido en condiciones de funcionamiento) que se introducen entre dos superficies móviles para reducir la fricción y el desgaste entre ellas. Los aceites base utilizados como aceites de motor generalmente están clasificados por el American Petroleum Institute como aceites minerales (Grupo I, II y III) o aceites sintéticos (Grupo IV y V). Véase la publicación número 09 del American Petroleum Institute (API). Una de las aplicaciones más grandes para lubricantes, en forma de aceite de motor, es proteger los motores de combustión interna en vehículos de motor y equipos motorizados. Normalmente, los lubricantes contienen el 90 % de aceite base (la mayoría de las veces fracciones de petróleo, llamadas aceites minerales) y menos del 10 % de aditivos. Los aceites vegetales o líquidos sintéticos tales como poliolefinas hidrogenadas, ésteres, siliconas, fluorocarbonos y muchos otros se utilizan a veces como aceites base. Estos son principalmente ésteres de triglicéridos procedentes de plantas y animales. Para el uso de aceite base lubricante se prefieren los materiales procedentes de vegetales. Unos de los más comunes incluyen aceite de canola alto oleico, aceite de ricino, aceite de palma, aceite de semilla de girasol y aceite de colza de origen vegetal, y tall oil de origen animal. Muchos aceites vegetales se hidrolizan a menudo para producir los ácidos que posteriormente se combinan selectivamente para formar ésteres sintéticos especializados.
Por lo tanto, los lípidos extraídos de los biomateriales fúngicos filamentosos formados por las especies y/o cepa(s) fúngicas filamentosas y/o su progenie de la presente invención se pueden utilizar para producir composiciones biolubricantes basadas en ésteres mediante la adición de aditivos adecuados. Los expertos en la materia conocen métodos para preparar composiciones lubricantes basadas en ésteres. Para un ejemplo no limitativo, se proporciona y procesa una cantidad de aceite de origen biológico que comprende triglicéridos para hidrolizar al menos algunos de los triglicéridos y formar ácidos grasos libres, en donde los ácidos grasos son de un tipo seleccionado del grupo que consiste en ácidos grasos saturados, ácidos grasos monoinsaturados y ácidos grasos poliinsaturados y combinaciones de los mismos. Los ácidos grasos se separan por tipo, de manera que al menos los ácidos grasos monoinsaturados están sustancialmente aislados de los ácidos grasos saturados y los ácidos grasos poliinsaturados. A continuación, al menos algunos de los ácidos grasos monoinsaturados se modifican para formar un producto éster (por ejemplo, que comprende triésteres), y al menos algunos de los ácidos grasos saturados y/o ácidos grasos poliinsaturados se hidrotratan para producir alcanos (parafinas). Hay que tener en cuenta también que en algunos aspectos, dichos productos de éster pueden incluir uno o más de los siguientes: especies de mono-, di y tri ésteres y análogos hidroxilados de los mismos.
Enzimas tolerantes al pH ácido de especies y/o cepa(s) fúngicas filamentosas
El genoma de la cepa 4287 deFusarium oxysporum f sp. lycopersicise ha secuenciado recientemente y se ha demostrado que lleva una variedad de genes implicados en la degradación de la lignina, hemicelulosa y celulosa. Asimismo, las enzimas implicadas en la degradación de estos materiales (por ejemplo, celulasa, xilanasa, ligninasa, glucuronidasa, arabinofuranosidasa, arabinogalactanasa, esterasa de ácido ferúlico, lipasa, pectinasa, glucomanasa, amilasa, laminarinasa, xiloglucanasa, galactanasa, glucoamilasa, pectato liasa, quitinasa, exo-[3-D-glucosaminidasa, celobiosa deshidrogenasa y acetilxilano esterasa, xilosidasa, a-L-arabinofuranosidasa, feruloil esterasa, endoglucanasa, [3-glucosidasa, Mn-peroxidasa y lacasa) se han estudiado ampliamente en la cepa F3 de F.oxysporum(Xiroset al.(2009) Enhanced ethanol production from brewer's spent grain by a Fusarium oxysporum Consolidated system. Biotechnol Biofuels 10:4). Por consiguiente, especies y/o cepa(s) fúngicas filamentosas acidófilas tales como especies deFusariumy la cepa fúngica filamentosa acidófila denominada MK7, se espera que estén completamente equipadas para hidrolizar fuentes de carbono complejas, tales como materiales lignocelulósicos y corrientes de desechos (por ejemplo, suero de leche ácido). También se espera que, dado que estas especies y/o cepas(s) fúngicas filamentosas acidófilas son capaces de crecer a un pH mucho más bajo (0,7 a 7,5) en comparación con otras cepas filamentosas (pH >2; Starkey, 1973), las enzimas para la degradación de la lignina, hemicelulosa y celulosa tendrán mayores actividades a pH bajo. Las enzimas con elevada actividad en condiciones ácidas serían especialmente útiles en procesos llevados a cabo a pH bajo.
Toxinas producidas por especies de Fusarium.
A menudo, la producción basada en microbios requiere el uso de métodos costosos y que requieren mucho tiempo para prevenir la contaminación. Tal como se ha analizado anteriormente, las especies y/o cepa(s) fúngicas filamentosas acidófilas son altamente resistentes a la contaminación por otros organismos. Se sabe, por ejemplo, que los miembros del géneroFusariumgeneran toxinas (por ejemplo, fumonisinas), que tienen un potentes propiedades antibióticas, insecticidas y fitotóxicas. De manera análoga, la cepa fúngica filamentosa acidófila MK7 requiere poca o ninguna adición de antibióticos externos cuando se utiliza en la producción de biomateriales fúngicos filamentosos. Algunas especies deFusariumpueden producir nueve toxinas diferentes, cuya producción depende de su relación con diferentes plantas hospedadoras (Marasaset al.,1984, Toxigenic Fusarium species, identity and mycotoxicology, ISBN 0271003480). La producción de toxinas también varía según el medio utilizado para la fermentación. Las toxinas producidas y secretadas por las especies deFusariumincluyen, pero sin limitación, bikaverina, enniatinas, ácido fusárico, licomarasmina, moniliforme, oxisporona, tricotecenos, zearelones, varias naftoquinonas y antraquinonas (por ejemplo, quinona naftazarina nonaketida, bikaverina y norbikaverina, heptaketidas, nectriafurona, 5-0-metiljavanicina y anhidrofusarubina lactol).
Adicionalmente, las toxinas de las especies deFusariumpueden incluir, 4-acetoxiscirpenodiol (4-3-acetoxi-3,15-dihidroxi-12,13-epoxitricotec-9-eno. Un compuesto similar, monodeacetilanguidina 4- o 15-acetilcirpentriol), 3-acetildeoxinivalenol (monoacetato de desoxinivalenol, 3"-acetoxi-7", 15-dihidroxi-12,13-epoxitricotec-9-en-8-ona), 8-acetilneosolaniol (monoacetato de neosolaniol, 4", 8",15-triacetoxi-3"-hidroxi-12, 13-epoxitricotec-9-eno), 4- o 15-acetilcirpentriol (4-acetoxiscirpenodiol), toxina acetil T-2 (3",4",15-triacetoxi-8"-(3-metilbutiri(oxi)-12, 13-epoxitricotec-9-eno), anguidina (diacetoxiscirpenol), avenaceína, beauvericina, butenolida (ácido 4-acetamido-4-hidroxi-2-butenoico-lactona), calonectrin (3",15-diacetoxi-12,13-epoxitricotec-9-eno), 15-deacetilcalonectrina (15-De-O-acetilcalonectrina, 3"-acetoxi-15-hidroxi-12,13-epoxitricotec-9-eno), deoxinivalenol (toxina Rd, vomitoxina, 3",T’,15-trihidroxi-12, 13-epoxitricotec-9-en-8-ona), diacetato de desoxinivalenol (diacetildesoxinivalenol), monoacetato de desoxinivalenol (3-acetildesoxinjvalenol), diacetoxiscirpendiol (7"-hidroxidiacetoxiscirpenol), diacetoxiscirpenol (anguidina, 4, 15-diacetoxi-3'-hidroxi12, 13-epoxitricotec-9-eno), diacetoxiscerpentriol (7", 8"-dihidroxidiacetoxiscirpenol), diacetildesoxinivalenol (diacetato de desoxinivalenol, 3", 15-diacetoxi-7-hidroxi12,13-epoxitricotec-9-en-8-ona), diacetilnivalenol (diacetato de nivalenol, 4, 15-diacetoxi-3', 7'-dihidroxi-12, 13-epoxitricotec-9-en-8-ona), 7", 8"-dihidroxidiacetoxiscirpenol (diacetoxiscirpentriol, 4, 15-diacetoxi-3", 7", 8"-trihidroxi-12, 13-epoxitricotec-9-eno), enniatinas, fructigenina, fumonisina B1 (ácido 1,2,3-propanotricarboxílico 1,-1-[1-(12-amino-4,9,11-trihidroxi-2-metiltridecil)-2-(1-metilpentil)-1,2-etanodiilo] éster; macrofusina), fusarenon (Fusarenon-X, fusarenon, monoacetilnivalenol, monoacetato de nivalenol, 4-acetoxi-3", 7",15-trihidroxi-12,13-epoxitricotec-9-en-8-ona) ácido fusárico (ácido fusarínico, ácido 5-butilpicolínico), ácido fusarínico (ácido fusárico), F-2 (zearalenona), toxina HT-2 = 15-acetoxi-3",4-dihidroxi-8"-(3-metilbutiriloxi)-12-epoxitricotec-9-eno, 7"-hidroxi-diacetoxiscirpenol (diacetoxiscirpendiol, 4,15-diacetoxi-3",7"-dihidroxi-12,13-epoxitricotec-9-eno), 8"-hidroxidiacetoxiscirpenol (Neosolaniol), 1,4-ipomeadiol(1-(3-furil)-1,4-pentanodiol), ipomeanina(1-(3-furil)-1,4-pentanetiona), 1-ipomeanol(1-(3-furil)-1-hidroxi-4-pentanona), 4-ipomeanol(1-(3-furil)-4-hidroxi4pentanona), lateritina, licomarasmina, moniliformina (sal de sodio o potasio de 1-hidroxiciclobut-1-eno-3,4-diona), monoacetoxiscirpenol (15-acetoxi-3",4"-dihidroxi-12,13-epoxitricotec-9-eno), monoacetilnivalenol (Fusarenon-X), monoacetilanguidina (4-acetoxiscirpenodiol), neosolaniol (8"-hidroxidiacetoxiscirpenol,4,15-diacetoxi-3"8"-dihidroxi-12,13-epoxitricotec-9-eno), neosolaniolacetato (8-acetilneosolaniol), monoacetato de neosolaniol (8-acetilneosolaniol), nivalenol (3",4",7",15"-tetrahidroxi-12,13-epoxitricotec-9-en-8-ona), diacetato de nivalenol (diacetilnivalenol), monoacetato de nivalenol (Fusarenon-X), toxina NT-1 (toxina T-1, 4",8"-diacetoxi-3",15-dihidroxi-12,13-epoxitricotec-9-eno), toxina NT-2 (4"-acetoxi-3",8 ", 15-trihidroxi-12,13-epoxitricotec-9-eno), toxina Rd (Deoxinivalenol), sambucinina, escirpentriol (3",4",15"-trihidroxi-12,13-epoxitricotec-9-eno), solaniol (Neosolaniol), toxina T-1 (toxina NT-1), toxina T-2 (4",15"-diacetoxi-3"-hidroxi-8"-(3-metilbutiriloxi)-12,13-epoxitricotec-9-eno), triacetoxi-escirpendiol (4",8",15"-triacetoxi-3",7"-dihidroxi-12,13-epoxitricotec-9-eno), triacetoxi-escirpenol (3",4",15"-triacetoxi-12,13-epoxitricotec-9-eno), vomitoxina (Deoxinivalenol), yavanicina, zearalenol (ácido 2,4-dihidroxi-6-(6,10-dihidroxi-trans-1-undecenil)-benzoico-lactona), zearalenona (ácido 6-(10-hidroxi-6-oxo-trans-1-undecenil)-resorcílico lactona). Toxinas más detalladas producidas porF. oxysporumse describen en Tatumet al.(Naphthoquinones produced by Fusarium oxysporum isolated from citrus. 1985, Phytochemistry 24:457-459), Tatumet al.(Naphthofurans produced by Fusarium oxysporum isolated from citrus. 1987, Phytochemistry, 26:2499-2500), Bakeret al.(Novel anthraquinones from stationary cultures of Fusarium oxysporum.
1998, J Ferment Bioeng 85:359-361). Thrane (Fusarium species on their specific profiles of secondary metabolites, in Fusarium. Mycotoxins, taxonomy and pathogenicity, 1989, editado por Chelkowski J, Elsevier, NY, EE.UU., págs. 199 225); Bakeret al.,Antimicrobial activity of naphthoquinones from Fusaria, Mycopathologia 111: 9-15, 1990; Marasaset al.(Toxigenic Fusarium species, identity and mycotoxicology, 1984, Pennsylvania State University Press, University Park, PA, EE.UU.).
Ejemplos
Ejemplo 1: Cepa MK7 en el medio natural
La cepa MK7 de origen natural siempre se asocia con algas, arqueas y bacterias en la naturaleza y se caracteriza por densidades promedio inferiores a 0,5 g de biomasa seca/l de agua mineral (Figura 1). Además, MK7 se presenta en la naturaleza como "serpentinas". Purcellet al.definen "serpentinas" de la siguiente manera: "Las serpentinas son agregaciones sumergidas de filamentos y otras morfologías celulares que se proyectan en el agua que fluye desde un punto de unión" (Purcellet al.(2007) FEMS Microbiology Ecology760:456-466). La cepa MK7 como porcentaje de la biomasa total de serpentinas es inferior al 10 %. Asimismo, la biomasa de la cepa MK7 en la naturaleza se caracteriza por más del 30 % de biomasa como células de macroconidias, que nunca se encuentran en biomateriales de fermentación en superficie producidos por los métodos descritos en la presente divulgación.
Ejemplo 2: Preparación de medios artificiales
El medio líquido MK7-1 utilizado en los siguientes procedimientos se preparó mediante la adición de los ingredientes enumerados en la tabla 1A a agua desionizada (18,2 Mohm), temperatura entre 22 y 30 °C seguido de ajuste del pH a 2,8, pH ajustado más bajo con HCl 13 N. El pH se midió utilizando un medidor de pH modelo 150 y una sonda de Oakton Instruments (Orangeburg, NY). A continuación, el medio se hirvió durante 20 minutos y se dejó enfriar a temperatura ambiente (~ 23 °C) antes de su uso. Inmediatamente antes de añadir el medio líquido, el pH se comprueba otra vez utilizando el medidor de pH 150 y la sonda de Oakton Instruments y se ajusta de nuevo a pH 2,8 si es necesario.
El medio líquido MK7-3 se preparó de la misma manera utilizando los ingredientes enumerados en la tabla 1B.
En algunos aspectos, la fuente de carbono utilizada no es glicerol, sino que se puede seleccionar de varias otras fuentes de carbono, tales como azúcares, glicerol, materiales lignocelulósicos, hidrolizados de materiales lignocelulósicos, residuos municipales o agrícolas, residuos de procesamiento de alimentos (por ejemplo, suero de leche ácido), productos de corrientes de desechos industriales, residuos de patata (cáscaras de patata, descartes de patata debido a la degradación, esquejes de patata, patata magullada), residuos de almidón, residuos de remolacha azucarera, pulpa de remolacha azucarera, residuos del procesamiento de maíz (es decir, solución de maceración de maíz), residuos de la producción de biocombustibles (residuos de la producción de etanol celulósico, digestato anaerobio, etc.). En esos casos, el medio se ajusta para adaptarse a la contribución de nutrientes de la fuente de carbono utilizada. Por ejemplo, si la fuente de carbono es melaza, suero de leche ácido o lignocelulosa, los oligoelementos necesarios probablemente serán proporcionados parcial o totalmente por la fuente de carbono y es posible que solo sea necesario añadir los macronutrientes al medio. En otros aspectos, la fuente de carbono puede clasificarse como "de calidad alimentaria". En estos ejemplos, no se esperan oligoelementos y macronutrientes asociados con la fuente de carbono, por lo que se deben añadir todos los oligoelementos y macronutrientes.
Tabla 1A.Ingredientes en el medio MK7-1 utilizados para la generación de inóculo.
Medio MK7-1
Líquido (g/l) Placa (g/l) Clase N.° de lote Proveedor UbicaciónNH4NO3 12,9 3 ACS 144801A Fisher Waltham, MA Urea 4,3 0,3 ACS A0355726 ACROS Somerville, NJ KH2PO4 10 2 Reactivo Eiser-Golden
CaCl2^2 H2O 2,6 0,4 ACS 53H0276 Sigma St. Louis, MO MgSO4^7H2O 2 0,3 Lab 5GJ15040920A Fisher Waltham, MA Extracto de levadura 2 0
Agar 0 15 Técnica 5287994 Fisher Waltham, MA Glicerol 75 60 Alimentos 4O19410427A Duda Energy Decatur, ALMicronutrientes* mg/l mg/l
FeSO4^7 H2O 9,98 4,99 ACS 3562C398 Amresco Solon, OH ZnSO4^7 H2O 4,4 2,2 USP/FCC 61641 Fisher Waltham, MA MnCl2^4 H2O 1,01 0,51 13446-34-9 Fisher Waltham, MA CoCl2^6 H2O 0,32 0,16 7791-13-1 Fisher Waltham, MA CuSO4^5 H2O 0,31 0,16 Técnica 114675 Fisher Waltham, MA (NH4)6Mo7O24^4
H2O 0,22 0,11 ACS 68H0004 Sigma St. Louis, MO H3BO3 0,23 0,11 ACS 103289 Fisher Waltham, MA (continuación)
Medio MK7-1
Líquido (g/l) Placa (g/l) Clase N.° de lote Proveedor UbicaciónEDTA, ácido libre 78,52 39,3 Electroforesis 46187 Fisher Waltham, MApH pH
HCl 2,8 4,8 ACS 5GK251022 Fisher Waltham, MA
Tabla 1B.Ingredientes en el medio MK7-3.
Medio MK7-3
Líquido (g/l) Clase N.° de lote Proveedor UbicaciónUrea 8,4 ACS A0355726 ACROS Somerville, NJ KH2PO4 10 Reactivo Eiser-Golden
CaCl2^2 H2O 2,6 ACS 53H0276 Sigma St. Louis, MO MgSO4^7H2O 2 Lab 5GJ15040920A Fisher Waltham, MA Extracto de levadura 2
Agar 0 Técnica 5287994 Fisher Waltham, MA Glicerol 75 Alimentos 4O19410427A Duda Energy Decatur, ALMicronutrientes*mg/l
FeSO4^7 H2O 9,98 ACS 3562C398 Amresco Solon, OH ZnSO4^7 H2O 4,4 USP/FCC 61641 Fisher Waltham, MA MnCl2^4 H2O 1,01 13446-34-9 Fisher Waltham, MA CoCl2^6 H2O 0,32 7791-13-1 Fisher Waltham, MA CuSO4^5 H2O 0,31 Técnica 114675 Fisher Waltham, MA (NH4)6Mo7O24^4 H2O 0,22 ACS 68H0004 Sigma St. Louis, MO H3BO3 0,23 ACS 103289 Fisher Waltham, MA EDTA, ácido libre 78,52 Electroforesis 46187 Fisher Waltham, MAPHHCl 2,8 ACS 5GK251022 Fisher Waltham, MA
Ejemplo 3: Proceso de inoculación
Los cultivos que se utilizarían para la inoculación de bandejas se cultivaron en biorreactores de 10 l en condiciones de fermentación sumergida en medio líquido MK7-1. Cabe señalar que otros tamaños de biorreactores son adecuados y que la elección del tamaño del reactor de 10 l no debe interpretarse como limitante. El reactor de 10 l se construyó con una sección de 1,3 m de largo de tubería de PVC transparente de 10,16 cm de diámetro con una tapa de PVC en la parte inferior. Se unió una vía/accesorio de aireación de plástico con un orificio de 3 mm a la tapa de la parte inferior y se unió un tubo para suministrar aire a la vía de aireación. Se unió una vía/válvula de muestreo de plástico al lado de la pared de PVC transparente a 15 cm de la parte inferior de la tapa de la parte inferior. La parte superior del reactor de PVC transparente se cubrió con una gasa estéril, que se mantuvo en su lugar mediante una tapa de PVC que encajaba holgadamente con un orificio de 3 mm para permitir que los gases escapen del reactor. El biorreactor montado es como se muestra en la figura 2.
El inóculo para el biorreactor de 10 l se preparó a partir de una reserva de cultivo almacenada de la cepa fúngica filamentosa acidófila MK7 (lote n.° 003). La reserva de cultivo almacenada consistió en el material de micelios de la cepa fúngica filamentosa acidófila MK 7 cultivada en una placa de Petri estéril que contenía medio sólido compuesto de agar al 1,5 % (agar granulado BD Difco, lote n.° 5287994, ThermoFisher, Waltham, MA), glicerol y nutrientes inorgánicos como se describe en la tabla 1 para el medio de placa MK7-1. El medio de agar se preparó hirviendo durante 20 minutos, dejando que el medio se enfríe a 50 °C y luego vertiendo 25 ml de la solución en una placa de Petri estéril. Después de enfriar y solidificar, la placa se inoculó con una reserva de congelador almacenada de segunda generación, mediante el uso de un bucle estéril (calentado al rojo vivo en una llama y enfriado) para recoger una muestra de la reserva almacenada y rallarla en la placa de Petri (Figura 3A).
Después de 5 días de crecimiento, el material de micelios creció completamente sobre la superficie del medio de agar (Figura 3B). A continuación, el cultivo se congeló a -80 °C. Cinco días antes de inocular el reactor de 10 l, se sacó del congelador una reserva de placa Petri y se dejó que se equilibrara a temperatura ambiente (~ 23 °C) durante 2 horas. El material de micelios que creció en la superficie del agar se retiró después con fórceps estériles (los fórceps se calentaron con una llama hasta que se pusieron al rojo vivo y se enfriaron con isopropanol) y se colocó en 350 ml de medio líquido MK7-1 estéril en un matraz agitador con deflectores estéril de 1 l cubierto con un paño de gasa estéril. El matraz se hizo girar a 200 rpm en un agitador de laboratorio VWR OS-500 (VWR, Radnor, PA) durante 5 días antes de su uso como inóculo para el biorreactor de 10 l.
En la preparación para recibir el inóculo, el biorreactor de 10 l se esterilizó mediante la adición de 330 ml de solución concentrada de hipoclorito de sodio (lejía Chlorox® = hipoclorito de sodio al 8,25 %) a 11 l de agua del grifo en el biorreactor y dejándolo equilibrar durante dos días. Después de dos días, se añadieron al reactor otros 330 ml de solución concentrada de hipoclorito de sodio. Después de un día, la solución diluida de hipoclorito de sodio se drenó completamente del reactor y el reactor se enjuagó con agua hervida a ~ 80 °C mediante la adición de 2 l de agua caliente y agitando para enjuagar todas las superficies dentro del biorreactor. A continuación, se drenó el agua de enjuague. Se añadieron 3,5 l de medio líquido MK7-1 estéril al biorreactor y se burbujeó aire estéril (filtrado 0,2 |jm) a una velocidad de 400 ml por minuto a través de la vía de aireación ubicada en el fondo del reactor. Estas condiciones de burbujeo generaron burbujas que variaban en tamaño de 3 a 30 mm de diámetro y dieron como resultado una mezcla y una distribución homogénea de las células fúngicas en todo el medio líquido (células planctónicas) durante el crecimiento. Los experimentos han demostrado que velocidades de burbujeo más elevadas o tamaños de burbujas más pequeños dan como resultado un hábito de crecimiento de biopelículas que forman grupos de biomasa que se adhieren a las superficies del biorreactor. Por tanto, el hábito de crecimiento de la biopelícula no es deseable ya que es deseable una suspensión homogénea de células para la inoculación de los reactores de bandeja. El inóculo que creció en el matraz agitador de 1 l se añadió después al reactor de 10 l utilizando una técnica aséptica (pulverización de todas las superficies exteriores cercanas con isopropanol al 70 %/agua al 30 % antes de abrir la parte superior del biorreactor y sin tocar ninguna de las superficies internas del biorreactor). Para generar un volumen de cultivo adicional en el reactor de 10 l, se añadió medio líquido MK7-1 nuevo estéril al reactor después de que el cultivo alcanzó una densidad de biomasa filamentosa seca de 6 g/l. Si se va a añadir medio líquido MK7-1 nuevo al reactor, el volumen no debe ser más de 9 veces el volumen de cultivo líquido en el reactor. La biomasa filamentosa seca se midió mediante la recogida de una muestra a través de una vía lateral en el biorreactor mientras el sistema de aireación está funcionando, y la filtración de un volumen conocido a través de un filtro de 0,22 pm (Millipore, n.° de cat. GSWP04700, Darmstat, Alemania) utilizando un aparato de filtración al vacío (Millipore, n.° de cat. WP6111560, XX1004700, XX1004705, Darmstat, Alemania). El filtro pesado previamente, más la biomasa filamentosa húmeda se seca a 50 °C durante 4 h en el Benchmark Scientific Incu-Shaker Mini (Edison, NJ) y después se pesa en un modelo a escala de Mettler Toledo MS3035 (Columbus, OH).
La cepa fúngica filamentosa acidófila MK7 tiene una velocidad de crecimiento específica de aproximadamente 0,024 h-1 en el reactor de 10 l (Figura 4) y el crecimiento durante la fase exponencial seguirá la ecuación:
(Ecuación 1) x = x0 expjí
Donde x es la biomasa final, x0 es la biomasa inicial,yes la velocidad de crecimiento específica ytes el tiempo. Para su uso como inóculo en los reactores con bandeja, la densidad de células de cultivo en el reactor de 10 l debe ser superior a 6 g/l de peso seco y en la última fase de crecimiento exponencial (Figura 4; el crecimiento exponencial es el período de crecimiento en un cultivo cuando el número de células se duplica continuamente; el crecimiento exponencial tardío es el período justo antes del cese del crecimiento exponencial cuando las velocidades de crecimiento celular comienzan a disminuir). Si se utiliza un medio de cultivo con densidades celulares más bajas para el inóculo, dará como resultado una formación de biomaterial significativamente más lenta (fase de latencia que dura más de 2 días) y, por lo tanto, no es deseable.
El inóculo se define en el presente documento como esencialmente compuesto de células planctónicas, que se definen como células individuales que no están agrupadas ni añadidas y tienen aproximadamente 4 micrómetros de ancho a 5 a 20 micrómetros de largo.
Para inocular reactores de bandeja de superficie para fermentación en superficie o fermentación en superficie con sustrato sólido, el cultivo líquido se eliminó del reactor de 10 l a través de una vía cerca del fondo del reactor mientras se mezclaba continuamente por burbujeo. El cultivo que se utilizará para el inóculo se eliminó de manera aséptica mediante pulverización del interior de la vía con una mezcla de isopropanol al 70 %/agua desionizada al 30 %, abriendo, a continuación, la válvula para permitir la expulsión de unos 25 ml de cultivo y así enjuagar la válvula. Este cultivo de inóculo de desecho se eliminó. El cultivo de inóculo se añade directamente al medio del reactor de bandeja como se describe en el ejemplo 3.
Ejemplo 4: Crecimiento de la cepa MK7 en reactores de bandeja mediante fermentación en superficie.
La cepa fúngica filamentosa acidófila MK 7, se cultivó en reactores de bandeja poco profunda. Cabe señalar que los diferentes tamaños de bandeja son adecuados para las enseñanzas de la presente innovación. En este ejemplo, las dimensiones interiores de las bandejas de polietileno eran 41,27 cm de ancho por 61,28 cm de largo con paredes laterales de 2,54 cm de alto (área de superficie total disponible para el crecimiento de material = 0,253 m2; Figura 5; Winco, Idaho Falls, ID). Es deseable que las bandejas estén limpias de desechos y productos químicos, así como esterilizadas antes de su uso para minimizar la posible contaminación. Por consiguiente, antes de su uso, las bandejas se lavaron minuciosamente con jabón y agua tibia del grifo de calidad potable (50 a 70 °C), se enjuagaron minuciosamente con agua caliente del grifo durante 1 minuto y se validó la eliminación de todos los residuos de jabón. A continuación, se pulverizaron todas las superficies de las bandejas hasta que todas las superficies se humedecieron con una solución de isopropanol al 70 %/agua desionizada al 30%(18,2 Mohm) y se limpiaron las bandejas con las manos enguantadas con una toalla de papel empapada en la mezcla de alcohol. A continuación, las bandejas se colocaron dentro de un sistema de rejillas de manera que dicha bandeja pueda aceptar y contener medio líquido (descrito a continuación) sin derramar y se dejó secar.
El sistema de bandeja y rejilla que se utiliza para el proceso de fermentación en superficie descrito en el presente documento proporciona todos los componentes necesarios para formar un biomaterial y permitir un rápido crecimiento del biomaterial. El sistema de rejillas utilizado para sujetar las bandejas del reactor era un bastidor para 39 bandejas de acero cromado comprado a Global Equipment Company (Chicago, IL; Figura 5A, B). Se utilizó una envoltura de plástico transparente de tipo Saran® de 16 pulgadas (41 cm) de ancho (Costco, Bozeman, MT) para envolver y encerrar el sistema de rejillas y aislar las bandejas del espacio circundante. Esto permitió el control de las condiciones ambientales (humedad, flujo de aire) y minimizó la contaminación (Figura 5A, B). Se insufló aire estéril humidificado en la rejilla adjunta a una velocidad de 800 ml/minuto mediante burbujeo a través de 200 ml de agua desionizada (18,2 Mohm), temperatura del agua 22 a 30 °C (para humidificar el aire) y paso a través de un autoclave con filtro de 0,2 |jm (Millipore, n.° de cat. SLFG85000, Darmstat, Alemania) para eliminar microorganismos. Idealmente, la velocidad de flujo de aire es tal que crea una ligera presión positiva en el sistema de rejillas (>0,1 psi (689 Pa)), lo que minimiza la cantidad de contaminantes en el aire que ingresan a la bandeja cerrada y al sistema de rejillas hasta que el biomaterial alcanza la densidad y/o consistencia deseada.
Mientras el material microbiano está activo, las células están respirando; es decir, produciendo dióxido de carbono y calor, además de consumiendo oxígeno. La acumulación de dióxido de carbono puede reducir la disponibilidad de oxígeno y debe limitarse. Por lo tanto, el flujo de aire debe ser tal que elimine el dióxido de carbono que se produce y se acumula durante la respiración microbiana. Adicionalmente, el flujo de aire debe ser tal que elimine el exceso de calor generado durante la respiración microbiana y suministre el oxígeno adecuado a las células que respiran. El flujo de aire debe ajustarse para satisfacer estas necesidades. Por ejemplo, ya que la necesidad aumenta cuando se utiliza un mayor número de bandejas, el flujo de aire debe aumentarse para satisfacer el aumento de la temperatura y las necesidades atmosféricas. El flujo de aire no debe ser lo suficientemente fuerte como para perturbar las hifas de los hongos e inhibir su crecimiento y función. Idealmente, en un sistema de bandejas, el flujo de aire provocaría un flujo de aire a través de las bandejas. En un aspecto, el flujo de aire puede ser generado por un ventilador que pasa aire a través de un filtro de 0,2 jm y a través de los materiales. La velocidad del ventilador y el flujo de aire resultante se pueden controlar mediante un sensor/sistema de actuación inteligente basado en sensores de temperatura, de dióxido de carbono y oxígeno colocados en la rejilla.
La temperatura del sistema de bandejas varió entre 25° ± 2 °C durante el crecimiento. La temperatura se midió utilizando el programa informático y el sistema de sensores ThermoScientific Genesys 10S Series, Biomat 3S, Evolution 60S (Thermo Fisher. Waltham, MA). Los sensores de termopar se colocaron 20 mm dentro del sistema de rejillas para bandejas a media altura y en la parte superior del sistema de rejillas para bandejas.
El medio MK7-1 se preparó como se describe en el ejemplo 2 [adición de nutrientes, ajuste de pH, hervir y enfriar a temperatura ambiente (~ 23 °C)]. Después de la preparación del medio, se obtuvo cultivo de inóculo del reactor de inóculo. (véase el ejemplo 3) y se añadió a una velocidad del 7,5 % (volumen a volumen) del medio MK7-1 en un recipiente. Por ejemplo, se añadieron 113 ml de inóculo a 1,5 l de medio en el recipiente. Esta proporción de inóculo a medio proporciona las condiciones adecuadas para el rápido crecimiento de las células y la formación del material. En este aspecto, la biomasa filamentosa celular seca deseada después de la inoculación del medio nuevo es de 0,45 a 0,75 g/l. Sin embargo, posiblemente podrían utilizarse densidades que varían de 0,01 a 100 g/l para generar con éxito un biomaterial en el presente sistema de bandejas. La reducción de la proporción de inóculo a medio da como resultado un crecimiento más lento como se describe en el ejemplo 3.
El volumen de sustrato de carbono al volumen de medio impacta en la velocidad de producción de biomasa resultante. En general, cuando la relación antes mencionada es demasiado pequeña, las velocidades de crecimiento se ralentizan debido a la falta de carbono disponible; es decir, se vuelven limitados en carbono. Cuando la relación antes mencionada es demasiado grande, la presión osmótica resultante se vuelve demasiado grande y las tasas de crecimiento de la biomasa disminuyen. Asimismo, cuando el carbono es limitado, la densidad de biomasa resultante y la cohesión de la biomasa son pequeñas, disminuyendo así las ventajas de procesamiento y manipulación que ofrece el proceso de fermentación en superficie. Por ejemplo, la cepa fúngica filamentosa denominada MK7 tiene condiciones de crecimiento óptimas cuando la relación antes mencionada está entre el 8 y el 15 %.
La suspensión de medio/células se mezcló con una cuchara de plástico grande esterilizada (30 cm de largo, esterilizada mediante el enjuague con la mezcla de alcohol) y se añadieron 1,5 l de la mezcla resultante a cada bandeja utilizando un cilindro graduado esterilizado (enjuagado con la mezcla de alcohol). Después de cargar todas las bandejas en el sistema de rejillas, el sistema de rejillas se envolvió con plástico transparente.
Después de 6 días de incubación, los biomateriales resultantes tenían de 3 a 10 mm de espesor con suficiente resistencia a la tracción e integridad estructural para poder manipularlos sin rasgarse (Figura 6). Los biomateriales se recogieron mediante la retirada primero de la envoltura de plástico transparente alrededor del sistema de rejillas y retirando las bandejas de la rejilla. Los biomateriales se retiraron de las bandejas a mano, se colocaron en una bandeja de vidrio Pyrex de 12,7 * 23 cm y se enjuagaron suavemente durante dos minutos con agua potable del grifo. Los biomateriales enjuagados se dejaron en la bandeja de vidrio y se secaron o se colocaron en una bolsa de plástico de 3,7 l y se congelaron. Para secarlos, los biomateriales se colocaron en un horno de temperatura controlada y se calentaron a 60 ° ± 1 °C durante 45 minutos para desactivar muchas de las enzimas y limitar las transformaciones bioquímicas dentro del material, seguido de calentamiento a 50 ° ± 1 °C hasta que el peso seco no cambió (aproximadamente 48 a 72 horas). Los pesos secos medios de los biomateriales producidos dadas las condiciones anteriores fueron 81 g de biomasa filamentosa seca por bandeja para la cepa fúngica filamentosa acidófila MK7. Esto equivale a 54 g/l, área de superficie de 324 g/m2 y una productividad de 0,37 g/l/hora. El contenido medio de humedad del biomaterial sin secar fue de 0,17 biomasa filamentosa seca/g u 83 % de líquido.
El crecimiento celular en bandejas ocurre normalmente de acuerdo con la curva de crecimiento que se muestra en la figura 7. Las células crecen en un estado planctónico (células homogéneas/distribuidas uniformemente por todo el medio) hasta aproximadamente 48 horas de crecimiento. Después de 48 horas, las células se añaden en la superficie del medio y comienzan a formar una biopelícula; en otras palabras, un material microbiano donde las células están entrelazadas y pegadas. El material es una piel muy fina al principio, pero continúa creciendo rápidamente hasta que algún factor limitante tal como la falta de sustrato de carbono u otro nutriente limita el crecimiento.
Debido a la sensibilidad del biomaterial a las perturbaciones y la consiguiente disminución del crecimiento, es importante que las bandejas permanezcan inalteradas y la integridad del biomaterial se mantenga durante todo el período de crecimiento. Las alteraciones que afectan al biomaterial incluyen una agitación excesiva de la bandeja, aplicación de presión al material, aplicación de líquido a la superficie del biomaterial, flujo de aire rápido a través del biomaterial, alteración, rotura o compresión de las hifas o rotura física del propio material. Estos tipos de alteraciones dan como resultado la pérdida de las ventajas del cultivo de un biomaterial, que incluyen velocidades de crecimiento rápido y elevada acumulación de biomasa filamentosa por volumen de líquido y área de superficie.
Se plantea la hipótesis de que las hifas aéreas y los micelios desempeñan un papel importante en el suministro de oxígeno para la respiración de las células en todo el biomaterial. Por lo tanto, la formación, el crecimiento y la función de las hifas aéreas/micelios es importante para el rápido crecimiento del biomaterial. Por consiguiente, cualquier alteración que afecte la formación o el crecimiento de estas hifas/micelios da como resultado una disminución del crecimiento del biomaterial.
El método y el medio de fermentación en superficie descritos anteriormente proporcionan todos los componentes necesarios para formar un biomaterial y permitir un crecimiento rápido. Se probó una amplia variedad de sistemas de bandejas utilizando los conceptos anteriores y se obtuvo una productividad casi equivalente por unidad de área. Por ejemplo, utilizando glicerol al 7,5 % y una relación C:N de 10:1, las productividades se mantuvieron constantes en aproximadamente 44 g/m2/d durante la fase de crecimiento ya que las áreas de superficie de los biorreactores aumentaron de 0,02 a 1 m2.
Ejemplo 5: Efectos del tamaño de la bandeja sobre el crecimiento y la productividad del biomaterial fúngico filamentoso
Para probar los efectos del tamaño de la bandeja en el crecimiento y la productividad de biomaterial, se cultivaron biomateriales fúngicos filamentosos de la cepa MK7 en medio MK7-1 con glicerol al 7,5 % en bandejas de vidrio Pyrex® de 0,02 m2, bandejas de polipropileno de 0,25 m2 y bandejas forradas de plástico de 1,77 m2. Las relaciones entre el volumen del medio líquido y el área de la superficie fueron de 6 l/m2 para todos los tratamientos. Las velocidades de crecimiento solo se vieron afectadas mínimamente por el tamaño de la bandeja y se observaron velocidades de crecimiento lineal después de 6 días (Figura 8). La productividad de la biomasa seca fue de 1,32, 1,54 y 1,57/m2/h para las bandejas de 0,02, 0,25 y 1,77 m2, respectivamente.
Ejemplo 6: Crecimiento de la cepa MK7 en diferentes medios
Las características de crecimiento de las características de crecimiento de la cepa fúngica filamentosa acidófila MK7 (es decir, tasa de crecimiento, densidad celular, eficacia de conversión del sustrato, formación de material) varían drásticamente en función de la elección del medio de crecimiento y de si los cultivos se cultivan en condiciones SSF/fermentación sumergida o SSSF/fermentación en superficie. La cepa fúngica filamentosa acidófila MK7 se cultivó en un medio MK7A histórico (de mayo de 2009 a noviembre de 2012), inicialmente diseñado para imitar la química que se encuentra en el entorno natural del organismo en el Parque Nacional de Yellowstone, pero con un aumento en las concentraciones de nitrógeno, fósforo, calcio y magnesio para que coincida con una fuente de nutrientes que se considera beneficiosa para otros hongos filamentosos (Tabla 2; MK7A). El medio MK7-1 se desarrolló para mejorar y favorecer las características de crecimiento de la cepa fúngica filamentosa acidófila MK7, especialmente en lo que respecta a la formación de material mediante fermentación en superficie (Tabla 2). Específicamente, se aumentaron el fosfato, calcio, magnesio y nitrógeno y se añadió una fuente adicional de nitrógeno (urea). El aumento de calcio, magnesio y la adición de urea aumentaron específicamente las velocidades de crecimiento y mejoraron la formación del material.
Tabla 2.Componentes químicos del medio histórico MK7A (fermentación sumergida) en comparación con MK7-1 modificado diseñado para la formación de biomasa filamentosa de alta densidad mediante fermentación en su erficie.
Los experimentos iniciales con el medio MK7A se realizaron exclusivamente en condiciones de fermentación sumergida en matraces agitadores. Las velocidades máximas de crecimiento, la eficiencia de conversión (g de sustrato de carbono convertido en biomasa filamentosa) y la biomasa filamentosa más elevada producida en estas condiciones fue de 0,072 g/l/h; 22 %; y 8,6 g/l, respectivamente (Tabla 3).
Tabla 3. Características de crecimiento de la cepa fúngica filamentosa acidófila MK7 en una variedad de condiciones.
Para aumentar la densidad celular, se utilizó medio MK7A junto con las condiciones de fermentación en superficie. Los biomateriales se formaron en concentraciones de carbono entre el 4 y el 15 % con glucosa o sacarosa y el 4 y el 30 % con glicerol. Se encontró que la urea aumenta las velocidades de producción en las condiciones de fermentación en superficie y que NH<4>NO<3>, NH<4>PO<4>, NH<4>SO<4>son fuentes alternativas de NH<4>. La adición de urea tiene los beneficios de precios de mercado menos costosos en comparación con otras fuentes de NH<4>. Se descubrió que el sustrato de carbono al 12,5 % es ideal para aumentar las densidades de biomasa filamentosa hasta 180 g/l (densidad después de la eliminación de biomaterial de la bandeja) y optimizar las velocidades de crecimiento.
Los biomateriales de elevada densidad producidos con fermentación en superficie y medio MK7-1 tienen una serie de ventajas sobre las condiciones de fermentación sumergida (con cualquiera de los medios) que incluyen: (1) aumento de la densidad de la biomasa filamentosa hasta 180 g/l (densidad después de la eliminación de biomaterial de la bandeja) en comparación con un máximo de 24,1 g/l con fermentación sumergida (Tabla 3), (2) aumento de las velocidades de crecimiento hasta 0,46 g/l/h en comparación con las velocidades máximas de 0,28 g/l/h en condiciones de inmersión, (3) aumento de la densidad de la materia prima de carbono del 7,5 al 12,5 % para obtener velocidades de crecimiento máximas, (4) condiciones de recogida mucho más fáciles para la biomasa filamentosa, especialmente cuando se produce biomasa filamentosa de elevada densidad (por ejemplo, no es necesaria la centrifugación), (5) no hay necesidad de airear la biomasa filamentosa en comparación con grandes biorreactores aireados complejos para fermentación sumergida (6) mucho más escalable y expandible para usar sistemas de bandejas de superficie en comparación con fermentadores sumergidos comerciales muy grandes (7) menos desperdicio líquido.
La disminución de las relaciones C:N a <10:1 también fue muy beneficiosa para la producción de biomasa filamentosa y aumentó los niveles de proteína frente a lípidos. Históricamente, el medio MK7A fue diseñado para la producción de lípidos por la cepa fúngica filamentosa acidófila MK7, especialmente en relaciones de C:N superiores a 30:1. Las relaciones variables de C:N junto con las condiciones de cultivo permiten adaptar las concentraciones de lípidos en la biomasa de la cepa fúngica filamentosa acidófila MK7 entre el 5 y el 60 % del peso de la biomasa. Los perfiles de ácidos grasos para la biomasa filamentosa fueron muy similares entre los medios MK7A y MK7-1 con varios sustratos de carbono simples (por ejemplo, glicerol, glucosa y sacarosa), pero se encontró que la temperatura aumentaba la concentración de ácidos grasos poliinsaturados con el ácido linolénico omega-3 aumentando con el tiempo a temperaturas relativas más bajas (Figura 9).
Ejemplo 7. Crecimiento de la cepa MK7 en medios MK7A y MK7-1.
Se produjeron biomateriales fúngicos filamentosos de la cepa MK7 en condiciones de fermentación en superficie utilizando medios MK7A y MK7-1 con sacarosa o glicerol como fuente de carbono (materia prima). Para evaluar biomateriales fúngicos filamentosos producidos a partir de los medios MK7A y MK7-1, se prepararon cinco formulaciones de medios diferentes: 1) sacarosa 4 % en medio MK7A, 2) sacarosa al 4 % en medio MK7-1, 3) glicerol al 4 % en medio MK7A, 4) glicerol al 10 % en medio MK7-1 y 5) glicerol al 12,5 % en medio MK7-1. El pH de las cinco formulaciones de medios se ajustó a 2,7 utilizando adiciones adecuadas de HCl concentrado seguido de ebullición durante 10 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente (~ 23 °C), se añadió a cada medio un 7,5 % volumen/volumen de inóculo de la cepa MK7 en fase de crecimiento exponencial. Se reajustó el pH a 2,7 y se añadieron alícuotas de 250 ml del medio inoculado para esterilizar bandejas de vidrio Pyrex® de 0,023 m<2>. A continuación, las bandejas se colocaron en un sistema de rejillas para bandejas y las mezclas de medios con inóculo se dejaron incubar a 23 ° ± 1 °C.
Según los resultados de experimentos anteriores, se espera que se forme biomasa en todas las combinaciones de medios. También se espera que la biomasa se forme más rápidamente en los medios MK7A en comparación con los medios MK7-1. Esto se debe a las condiciones químicas más hospitalarias de los medios MK7A para el crecimiento (por ejemplo, menor fuerza iónica/presión osmótica, menor concentración de amonio). Sin embargo, con el tiempo, los biomateriales fúngicos filamentosos que se desarrollan en la superficie de los medios MK7-1 crecerán con una velocidad de crecimiento más rápida que la biomasa que crece en los medios MK7A. Es decir, ambos sistemas tienen diferentes curvas de velocidad de crecimiento con los medios MK7-1 que presenta un crecimiento rápido en las primeras etapas seguido de velocidades de crecimiento reducidas en las últimas etapas. Por el contrario, los biomateriales fúngicos filamentosos cultivados en los medios MK7-1 tienen inicialmente velocidades de crecimiento relativamente lentas en las primeras etapas de crecimiento, seguidas de velocidades de crecimiento extremadamente rápidas en las últimas etapas de crecimiento de la biomasa. Finalmente, los biomateriales fúngicos filamentosos cultivados en los medios MK7-1 se vuelven más gruesos y tienen mayor resistencia a la tracción que los biomateriales cultivados en los medios MK7A. Se espera que las concentraciones significativamente más bajas de nutrientes en los medios MK7A (por ejemplo, N, P, K) den como resultado una limitación temprana de nutrientes, causando inhibición del crecimiento con biomateriales que no son tan gruesos o fuertes como los biomateriales producidos en los medios MK7-1.
Ejemplo 8: Estructura de biomateriales producidos por la cepa MK7
La estructura del biomaterial se determinó mediante microscopía de luz transmitida. En este punto, se produjeron biomateriales a partir de la cepa MK7 cultivada durante 5 días en medio MK7-1 con glicerol al 7,5 %. Los biomateriales se recogieron, se congelaron (-20 °C) y se disecaron en bloques cuadrados de 1 cm * 1 cm antes de incrustarlos en gelatina al 10 % (gelatina Sigma G2500-3000 Bloom, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) en criomoldes (VWR 25608 916, Radnor, PA). La muestra de gelatina/tejido se congeló instantáneamente mediante la exposición de los criomoldes a la fase de vapor de un baño de nitrógeno líquido antes de colocarlos a -20 °C durante la noche.
La criosección se logró utilizando un crioseccionador Leica modelo 39475214 (Leica, Wetzlar, Alemania). Las muestras se retiraron de los criomoldes y se recubrieron con medio de congelación de tejidos OTC (Leica 14020108926) antes de la criosección en cortes de 10 a 50 |jm de grosor. Se visualizaron los cortes de muestra y se tomaron imágenes utilizando un microscopio de luz transmitida (Microscopio: Zeiss AxioObserver; Cámara: Zeiss AxioCam HRc, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania).
Con materiales de glicerol, se observaron al menos dos capas distintas: (a) una capa inferior densa y (b) una capa de hifas aéreas. En algunas muestras fueron visibles al menos tres capas estructuralmente diferentes: (a) una capa inferior densa, (b) una capa de hifas aéreas y (c) una capa de zona de transición (véase la figura 10A y B). Normalmente, la capa de hifas aéreas es la más visiblemente dominante, seguida de la densa capa inferior, mientras que la capa de la zona de transición, cuando está presente y/o visible, es la más pequeña. En algunos ejemplos, por ejemplo, el biomaterial que se muestra en la figura 10A, la relación visible de la capa de fondo densa (a) a la capa de hifas aéreas (b) a la capa de zona de transición (c) fue de aproximadamente 3,86 a aproximadamente 9,43 a aproximadamente 1. En otra muestra, tal como el biomaterial que se muestra en la figura 18B, la relación fue de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,7 a aproximadamente 1. No había una capa de zona de transición visiblemente distinta aparente en la figura 18C.
La formación de imágenes ópticas adicionales de un biomaterial cultivado en MK7-3 indicó que no hay lípidos o pigmentos presentes en la capa superior de hifas aéreas en comparación con la capa inferior densa (Figura 11A y 11B). Se encuentran hifas aéreas que se extienden desde el material y cada una está expuesta a la atmósfera sin líquido entre las hifas. Esto las distingue de las hifas/micelios en las otras capas del material, que están separadas por un líquido y/o una matriz extracelular de polisacárido/proteína. Las hifas aéreas son responsables de la transferencia de oxígeno y de CO<2>. La accesibilidad al oxígeno da como resultado hifas que absorben oxígeno en la capa superior de hifas aéreas. Estas hifas aéreas parecen ser más largas que las hifas/micelios que se encuentran en las capas inferiores del material (Compárese la figura 11B con la figura 11C). Las hifas aéreas de la capa superior también tienden a tener un predominio de orientación vertical, es decir, tienden a orientarse perpendicularmente a la interfaz de aire biomaterial fúngico filamentosos.
La orientación vertical no fue tan predominante en las hifas de la capa inferior densa (Figura 11C). En este punto, las hifas tienden a estar entrelazadas y tienen una mezcla de orientaciones y tienen un predominio de orientaciones horizontales. Las hifas de la capa inferior también parecían contener un pigmento púrpura, que no fue evidente en la capa aérea superior. Los experimentos preliminares indicaron que la capa inferior contiene aproximadamente un 30 % de lípidos y que las hifas están incrustadas en una matriz de proteína y/o polisacárido. Las hifas de la capa inferior también son el área de almacenamiento principal de pigmentos, lípidos, hidratos de carbono y proteína.
Los biomateriales producidos a partir de la cepa MK7 cultivada en (1) medio MK7-1 y (2) medio MK7-3, se recogieron después de 5 días y se congelaron a 20 °C. El espesor de ambos biomateriales varió entre 2 y 4 mm. Se cortaron secciones cuadradas de un cm2 de los dos biomateriales congelados por triplicado y, a continuación, se cortaron por la mitad en latitud, produciendo secciones transversales de la mitad superior e inferior, cada una de aproximadamente 1,5 mm de espesor. \
La densidad media del biomaterial cultivado en medios MK7-1 fue de 0,131 g/cm3 para la sección latitudinal superior (desviación estándar = 0,068) y 0,311 g/cm3 para la sección latitudinal inferior (desviación estándar = 0,032). La relación de densidades de arriba a abajo fue de 0,42.
Para el biomaterial cultivado en medio MK7-3, la densidad promedio para la sección latitudinal superior fue 0,102 g/cm3 (desviación estándar = 0,048) mientras que la densidad promedio para la sección latitudinal inferior fue 0,256 g/cm3 (desviación estándar = 0,010). La relación de densidades de arriba a abajo fue de 0,40.
Ejemplo 9: Resistencia a la tracción de biomaterial producido por la cepa MK7
Se evaluó la resistencia a la tracción de un biomaterial MK7 cultivado durante 5 días en medio MK7-3. En este punto, se utilizó un material de 25,4 cm de ancho, de 46 cm de longitud, de 3,5 mm de espesor. El contenido de agua del material fue de aproximadamente el 85 %, equivalente a aproximadamente el 15 % de peso seco. El peso seco total fue de 70 g/0,25 m2 de bandeja o 280 g/m2. El material tenía una densidad de 0,08 g/cm3.
Para medir la resistencia a la tracción, un extremo del material se sujetó con abrazaderas en una posición estacionaria mientras que el otro extremo se sujetó con abrazaderas a un aparato de movimiento libre. El aparato de movimiento libre se adjuntó a una escala que mide la tensión aplicada. Se aplicó una tensión constante y lenta al material tirando de la escala durante varios segundos hasta que el material se rompió. La tensión medida necesaria para romper/desgarras/rasgar el material osciló varió de 0,28 kg/2,54 cm de ancho del material a 0,58 kg/2,54 cm de ancho del material, lo que equivale a 0,11 kg/cm de ancho del material a 0,23 kg/cm de ancho del material. El promedio fue de 0,5 kg/2,54 cm de ancho del material o 0,2 kg/cm de ancho del material.
Ejemplo 10: Crecimiento de biomateriales de la cepa MK7 en glicerina bruta.
Se produjeron biomateriales densos de la cepa MK7 en 8 días utilizando glicerina bruta como fuente de carbono y nutrientes (materia prima). La glicerina bruta, un subproducto de la producción de biodiésel, se obtuvo de W-2 Fuels (código de producto GL32000, Lote 4300, n.° CAS 56-81-5, Adrian, Mi). La glicerina bruta estaba compuesta por el 75 al 85 % de glicerina, el 2 al 10 % de agua, el 2 al 5 % de sales, el 1 al 2 % de grasa, aceites o ésteres y <1 % de metanol.
Se complementó una concentración de 7,5 % de glicerina bruta en agua del grifo potable (peso:volumen) con sales de medio MK7-1 sin diluir o diluido al 50 % para crear 11 l de medio MK7-1 sin diluir o diluido al 50 %. El pH de estas soluciones se ajustó a 4,8 seguido de ebullición durante 10 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente (~ 23 °C), se añadió al medio un inóculo de la cepa MK7 al 5 % volumen:volumen preparado como se describe en el ejemplo 3. El pH se reajustó a 4,8 y se añadieron alícuotas de 1,5 l del medio de glicerina bruta inoculado a bandejas de polipropileno esterilizadas de 0,25 m2 antes de colocar las bandejas en un sistema de rejillas.
Las mezclas se incubaron a 23 ° ± 1 °C y dieron como resultado biomateriales relativamente densos y flexibles que tenían aproximadamente 4 mm de espesor después de 8 días, momento en el que se recogieron. Los biomateriales se secaron a 50 °C durante 72 h y los pesos secos promedio ± desviaciones estándar fueron 30,3 ± 3,1 g (n = 6) para el tratamiento con medio sin diluir y 30,2 ± 2,8 g (n = 8) para el tratamiento con medio diluido al 50 %. La conversión promedio de glicerina en biomaterial seco fue del 34 % y la densidad de los materiales húmedos en base al peso de la biomasa seca fue de 0,03 g/cm2 para ambos tratamientos.
Ejemplo 11: Estructura de hifas/micelios de biomateriales de la cepa MK7 cultivada en solubles de destilería de trigo.
Se produjeron biomateriales fúngicos filamentosos de la cepa MK7 consolidada en 7 días utilizando solubles de destilería (sd) de trigo secos como fuente de carbono y nutrientes (materia prima). Los sd de trigo estaban compuestos por el 31,5 % de proteína, el 8,6 % de aceite, el 2,8 % de almidón, el 13,5 % de azúcar, el 2,7 % de fibra, el 8.5 % de ceniza, el 0,19 % de calcio, el 0,29 % de magnesio, el 1,7 % de potasio, el 0,78 % de fósforo y el 3,5 % de sulfato. Se prepararon dos tratamientos con medios de crecimiento: El tratamiento 1 utilizó el 5 % de sd en peso seco en agua y el tratamiento 2 utilizó el 5 % de sd en peso seco en medio de sales de MK7-1 diluido al 50 %. El pH de las mezclas se ajustó a 3,4. Las mezclas se inocularon con el 7,5 % (volumen:volumen) de inóculo de la cepa MK7 preparado como se describe en el ejemplo 3 y se añadieron 175 ml de ese medio a bandejas de plástico de 12,7 * 12,7 cm esterilizadas con alcohol. Se recogieron biomateriales fúngicos filamentosos después de 7 días de incubación a temperatura ambiente (~ 23 °C). Los biomateriales cultivados en 5 % de sd como única fuente de carbono y nutrientes (Tratamiento 1, sin sales de MK7-1) tenían un grosor promedio de 2,7 mm (n = 3 bandejas), no mostraron capas distintas y tenían un peso seco promedio de 0,83 g con una densidad media de 0,019 g/cm3 y una eficacia de conversión de aproximadamente el 10 %. No se observaron hifas aéreas y los materiales estaban saturados de líquido por todas partes; es decir, la superficie superior de los materiales estaba en la superficie del líquido.
Los biomateriales cultivados en 5 % de sd complementados con sales de MK7-1 (Tratamiento 2) tenían un espesor promedio de 6,4 mm y un peso seco promedio de 3,11 g con una densidad promedio de 0,030 g/cm3 y una eficacia de conversión de aproximadamente el 40 %. Estos materiales desarrollaron un extenso sistema de hifas aéreas blancas y esponjosas que tenía aproximadamente 4 a 7 mm de espesor inmediatamente por encima de una capa más densa distintiva que tenía aproximadamente 0,9 mm de espesor. La densidad de la capa superior fue de 0,011 g/cm.3 y la densidad de la capa inferior fue de 0,148 g/cm3.
Ejemplo 12: Crecimiento de biomateriales fúngicos filamentosos de la cepa MK7 en solución de maceración de maíz y solución de maceración de maíz/almidón como fuente de carbono y nutrientes
Se produjeron biomateriales fúngicos filamentosos de la cepa MK7 denos en tan solo 4 días utilizando solución de maceración de maíz como única fuente de carbono y nutrientes (materia prima). Además, también se mostró que la solución de maceración de maíz con adición de almidón al 5 % es capaz de producir biomateriales fúngicos filamentosos densos. La solución de maceración de maíz es un subproducto viscoso de la molienda húmeda de maíz y tiene una composición de aminoácidos, vitaminas y minerales que la hacen adecuada como complemento de las fermentaciones microbianas. La solución de maceración de maíz utilizada en el presente ejemplo se compró a Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX; n.° de lote B0116). Estos experimentos demostraron el uso de la solución de maceración de maíz como reemplazo de los nutrientes de MK7-1. Los tratamientos incluyeron el 10 % y el 20 % de solución de maceración de maíz como única fuente de carbono y nutrientes, y el 10 % y el 20 % de solución de maceración de maíz más 5 % de almidón (cada uno) con el almidón proporcionando carbono adicional para el crecimiento de biomateriales fúngicos filamentosos.
Se prepararon cuatro lotes de medios mediante la adición del 10 % o el 20 % de solución de maceración de maíz a volúmenes de 1 l que contenían 0 o 50 g de almidón seco. El medio se ajustó a pH 3,6 mediante la adición de una cantidad adecuada de HCl y se hirvió durante 15 minutos en un recipiente adecuado. Después de enfriar a temperatura ambiente, el pH de la mezcla se reajustó a 3,6 y la mezcla se inoculó con inóculo de la cepa MK7 al 7,5 % como se preparó en el ejemplo 3. Se añadieron alícuotas de 175 ml de medio a cinco bandejas cuadradas (superficie de 0,016 m2/bandeja) y las bandejas se incubaron en un sistema de rejillas a 23 ° ± 1 °C. Los biomateriales fúngicos filamentosos se recogieron después de 6 días. El pH final promedio para los tratamientos con solución de maceración de maíz al 10 %, 20 %, 10%almidón y 20%almidón fueron 3,97, 3,69, 4,23 y 4,15, respectivamente. El peso promedio de la biomasa ± desviación estándar para estos tratamientos fue 1,1 ± 0,2, 0,1 ± 0,1,2,3 ± 0,1 y 2,1 ± 0,2 g, respectivamente.
Ejemplo 13: Conversión del agua de una laguna de alimentación de ganado en biomateriales fúngicos filamentosos
Los experimentos de crecimiento se realizaron utilizando el agua de una laguna de alimentación de ganado como única fuente de carbono y nutrientes. El contenido de carbono orgánico disuelto inicial de las aguas fue de 4 g/l y el contenido de nitrógeno disuelto total inicial fue de 0,8 g/l.
El agua de la laguna de alimentación se ajustó a pH 2,6 con HCl concentrado y se inoculó con inóculo de la cepa MK7 al 7 % como se preparó en el ejemplo 3. Se llenaron bandejas de polipropileno esterilizadas de 0,25 m2 con 1,5 l del agua residual inoculada y se colocaron en un sistema de rejillas para bandejas para su incubación a 24 °C ± 1 °C. Los biomateriales fúngicos filamentosos comenzaron a formarse en la superficie del líquido 2 días después de la inoculación. Después de diez días, los biomateriales fúngicos filamentosos y el líquido restante se recogieron en un solo recipiente y se secaron antes del análisis de C y N totales utilizando un analizador Costech de C y N total (ECS 4010, Costech Analytical Technologies, Valencia, CA). La biomasa seca promedio producida por bandeja fue de 6,531 g (n = 2). Los análisis de los materiales y el líquido residual revelaron que aproximadamente el 77 % del carbono y el 99 al 100 % del nitrógeno se eliminaron de las aguas residuales de la laguna de alimentación por los materiales (límite de detección del método ~ 1 %). Las velocidades de eliminación de carbono y nitrógeno para el sistema fueron de 6,8 y 1,2 mg/l/h cuando se promediaron durante el período de 10 días. De acuerdo con el conocimiento actual, es posible eliminar la mayor parte del C y casi todo el N de las aguas de alimentación mediante la acidificación de la laguna a pH 2,6 con HCl y la inoculación con la cepa MK7. Además, es posible tratar las lagunas directamente, dando como resultado un biomaterial fúngico filamentoso flotante en el agua de alimentación en el sitio que luego se puede recoger para su uso posterior.
Ejemplo 14: Crecimiento de biomateriales de la cepa MK7 en medio sustituto con suero de leche ácido
Se produjeron biomateriales de la cepa MK7 densos a partir de medio sustituido con suero de leche ácido (AWS, del inglés 'Acid Whey Surrogate') en 7 días. La composición del medio AWS se basó en la composición normal de suero de leche ácido como se describe en Tsakaliet al.(2010). La composición del medio de Tsakali y el medio AWS utilizados en el presente ejemplo se describe en la tabla 4.
Los biomateriales se produjeron en bandejas de polipropileno esterilizadas de 12,7 * 12,7 cm (0,016 m2) utilizando 87 ml de medio AWS a pH 4,8. El medio se preparó mediante la mezcla de los ingredientes enumerados en la tabla 4 en un matraz Erlenmeyer de 1 l, ajustando el pH a 4,8 y, a continuación, hirviéndolo durante 10 minutos. Después de que el medio se enfríe a aproximadamente 23 °C, se añadió al matraz un 7,5 % de volumen (volumen/volumen) de inóculo en fase de crecimiento exponencial. Este inóculo se generó como se describe en el ejemplo 3. Se añadieron alícuotas de 87 ml del medio de cultivo inoculado a bandejas con hisopo de isopropilo (Ejemplo 3) y las bandejas se colocaron en una bandeja más grande (0,25 m2) montada en el sistema de rejillas para bandejas como se describe en el ejemplo 3. Los cultivos se dejaron incubar a 25 ± 1 °C dando como resultado biomateriales relativamente densos que se recogieron después de 7 días (Figura 18). El valor medio del pH del líquido residual después de 7 días fue de 6,9 ± 0,1. Por lo tanto, el proceso de crecimiento neutralizó el pH de AWS de 4,8, normal del suero de leche ácido, a casi neutro (~ 7). La microscopía de luz transmitida reveló la naturaleza filamentosa de los biomateriales generados en el medio AWS (Figura 18). El espesor medio de los biomateriales húmedos fue de 4 ± 0,5 mm. Los biomateriales se secaron a 50 °C durante 30 h y los pesos secos medios resultantes fueron 1,88 ± 0,2 g. La densidad media de los biomateriales húmedos fue de 0,29 g/cm3. La conversión promedio de materia prima seca (lactosa y proteínas totales) en biomaterial seco fue del 42,2 %.
Tabla 4.Composición de un suero de leche ácido normal como se describe en Tsakaliet al.,2010, y el medio sustituido con suero de leche ácido (AWS) utilizado en el presente ejemplo para cultivar biomaterial de MK7.
Tsakali (%) AWS (%)
Agua 94,5 94,5
Materia seca 5,5 5,5
Lactosa 4 4
Ácido láctico 0,4 0
Proteína total* 1 1
Ácido cítrico 0,1 0,1 Minerales** 0,6 1,3
pH 4,8 4,8
(continuación) __________________________________________ Tsakali (%)__________________________ AWS (%)_______ *La fuente de proteína total para AWS fue concentrado de proteína de suero de leche como GNC ProPerformance 100 % proteína de suero de leche de GNC, Pittsburgh, PA.
**La composición mineral de AWS fue el medio MK7-1 diluido al 50 % descrito en la tabla 1A pero sin glicerol.
Ejemplo 15: Crecimiento de biomateriales de la cepa MK7 en suero de leche ácido
Los biomateriales de la cepa MK7 se cultivan en 6 días utilizando suero de leche ácido como fuente principal de carbono y nutrientes. Los biomateriales se producen en bandejas de polipropileno esterilizadas de 12,7 * 12,7 cm (0,016 m2) utilizando 125 ml de suero de leche ácido crudo que ha sido sometido a diversos tratamientos. Los tratamientos se realizan para evaluar las velocidades de crecimiento y la productividad de la biomasa después de ajustar el pH, añadiendo nutrientes seleccionados y/o calentando para minimizar la presencia de microorganismos competidores.
Se añaden volúmenes de suero de leche ácido de 500 ml a matraces Erlenmeyer de 1 l previamente esterilizados (calentados a 125 °C durante 10 minutos) y el medio líquido se somete a los tratamientos seleccionados (1 a 12) como se indica en la tabla 5. El pH no se ajusta (el pH medio del suero de leche ácido es 4,8) o se ajusta a pH 2,7 con HCl concentrado. Los tratamientos de adición de nutrientes incluyen: sin adición, 2,5 g/l de urea como fuente de nitrógeno o MK7-1 diluido al 50 % como un conjunto completo de nutrientes preparados en el líquido de suero de leche ácido como se describe en el ejemplo 1, menos el glicerol. La esterilización por calor se lleva a cabo hirviendo el medio líquido de suero de leche ácido durante 15 minutos después de que se hayan realizado los otros tratamientos (pH o adiciones de nutrientes). Una vez que el medio se haya enfriado a unos 23 °C, se añade al matraz un 7,5 % de volumen (volumen/volumen) de inóculo en fase de crecimiento exponencial. Este inóculo se genera como se describe en el ejemplo 3. Se añaden alícuotas de 125 ml del medio de cultivo inoculado a bandejas con hisopo de isopropilo (véase el ejemplo 3 para el procedimiento de esterilización) y las bandejas se colocan en unas bandejas más grandes (0,25 m2) montadas en el sistema de rejillas para bandejas como se describe en el ejemplo 3. Se deja incubar los cultivos a 25 ± 1 °C durante al menos 6 días.
Tabla 5.Matriz de tratamiento utilizada para evaluar el suero de leche ácido como medio nutritivo para el crecimiento de biomateriales de la ce a MK7.
Ejemplo 16: Crecimiento de biomateriales fúngicos filamentosos de la cepa MK7 en digestato anaerobio
Se produjeron biomateriales de la cepa MK7 densos en 7 días utilizando digestato anaerobio como única fuente de carbono y nutrientes (materia prima). El digestato anaerobio es el residuo sólido rico en lignina que permanece después de la fermentación microbiana de la biomasa rica en lignocelulosa (por ejemplo, rastrojo de maíz, paja de trigo, estiércol de ganado) en condiciones limitadas de oxígeno. El digestato anaerobio se considera resistente a una mayor descomposición por microorganismos y, por esta razón, se utiliza comúnmente como modificación del suelo o se quema para alimentar generadores de vapor para la producción de electricidad.
Se añadió digestato anaerobio húmedo (500 g) a 2 l de agua del grifo potable formando una mezcla. El pH natural de esta mezcla fue de 5,5. La mezcla se inoculó con 7,5 % (volumen:volumen) de inóculo de la cepa MK7, preparado como se describe en el ejemplo 3. Se añadieron 200 ml de la mezcla resultante a bandejas cuadradas de 12,7 * 12,7 cm. Se formaron biomateriales consolidados en la superficie y se recogieron después de 7 días de incubación a temperatura ambiente (~ 23 °C). Los biomateriales tenían un espesor medio de 2,6 mm y un peso seco medio de 0,62 g (n = 3, desviación estándar = 0,03 g) y una densidad correspondiente de 0,015 g/cm3. La eficacia de conversión media fue del 2,3 %.
Para mejorar las velocidades de conversión de digestato anaerobio a biomasa microbiana, se realizó un experimento adicional complementando el digestato anaerobio con medio Barley, utilizando de manera eficaz un medio de crecimiento aumentado. El medio Barley se utilizó para estimular el crecimiento e inducir la producción de enzimasin situpor la cepa MK7 para una mayor degradación y conversión del digestato anaerobio a biomasa fúngica. El medio Barley aumentado se preparó mediante la combinación de 1 l de agua del grifo, 50 g de flor de cebada, 1 g de extracto de levadura, 0,1 ml de glucoamilasa (destilado VHP, Dupont), 0,1 ml de a-amilasa (SPEZYME ALPHA, 13.775 UAA/g, Dupont) y 0,1 ml de p-gluconasa (Optimash TBG, Dupont). La mezcla se calentó a 65 °C y se agitó durante 15 minutos mientras estaba a 65 °C. Después, la mezcla se hirvió durante 15 minutos para desactivar las enzimas. A continuación, se enfrió la mezcla hasta la temperatura ambiente.
El protocolo descrito anteriormente para el experimento de digestato anaerobio se repitió con la excepción de que el agua del grifo se sustituyó por medio de Barley aumentado y los volúmenes totales de cada componente utilizado se redujeron a la mitad. La conversión promedio de digestato anaerobio a biomateriales fue del 6 ± 2 % después de la sustracción de la biomasa generada en el tratamiento de control donde no se añadió digestato anaerobio.
Ejemplo 17: Crecimiento de otros hongos filamentosos en reactores de bandeja.
El crecimiento deRhizopus oligosporusyFusarium venenatumse evaluó utilizando las técnicas de fermentación en superficie descritas en los ejemplos 1, 2 y 3 para la cepa MK7.
Rhizopus oligosporusse utiliza ampliamente para la producción de Tempeh (alimento humano) en todo el mundo. La cepa ATCC 22595 deRhizopus oligosporusse obtuvo de ATCC el 1 de octubre de 2015. La muestra de cultivo puro deR. oligosporusobtenido de ATCC se colocó en medio de agar MK7-1 en placas de Petri como se describe en el ejemplo 2.
Fusarium venenatumutilizado en la producción de alimentos Quorn™ se seleccionó de un paquete de Quorn Chik'n Nuggets (código UPC: 33735-00006) comprado el 16 de enero de 2016 en el supermercado Albertson en Bozeman, MT. Para aislar F.venenatum,se colocó una muestra (~ 0,25 cm2) de Quorn™ Chik'n Nuggets que conteníaF. venenatumen 100 ml de medio MK7-1 estéril, pH 5, en un matraz agitador con deflectores de 250 ml. El medio y el matraz se esterilizaron hirviendo el medio en el matraz durante 20 minutos. Se dejó enfriar el medio a 23 °C antes de la adición de la muestra de Quorn™. Después de 3 días de incubación a 23 ± 1 °C mientras gira a 200 rpm, se retiró 1 ml de cultivo y se utilizó para inocular otro matraz y medio idénticos. Después de 3 días más de incubación de la misma manera, se retiró una alícuota de 50 pl del cultivo y se colocó en medio de agar MK7-1 estéril (pH 4,8) en una placa de Petri estéril.
Los materiales con micelios que se desarrollaron en las placas deR. oligosporusy F.venenatumse utilizaron para inocular 350 ml de medio MK7-1 en matraces agitadores con deflectores estériles de 1 l como se describe en el ejemplo 3. Después de 5 días de crecimiento en los matraces agitadores como se describe en el ejemplo 3, los cultivos se utilizaron como inóculo para reactores de bandeja. El inóculo deseable para los reactores de bandeja consiste en cultivos microbiológicamente puros con densidad celular superior a 6 g/l que se encuentran en la fase exponencial tardía. (Véase el ejemplo 3). Como se describe en el ejemplo 3, se prepararon dos bandejas que contenían 1,5 l de medio MK7-1 inoculado para cada uno de los dos organismos. El pH del medio se ajustó a 4,1 paraRhizopusy 5,0 paraFusarium.Las imágenes de los cultivos y los materiales resultantes se muestran en las figuras 12 y 13.
Ejemplo 18: Comparación del biomaterial fúngico filamentoso producido mediante fermentación en estado sólido (SSF) en comparación con la biomasa producida por fermentación en superficie de sustrato sólido (SSSF)
Procedimiento de SSF
La fermentación en estado sólido (SSF), como se denomina en el presente documento, significa el proceso de fermentación microbiana que se produce en sólidos con bajo contenido de agua, normalmente por debajo del 50 %.
El inóculo MK7 de SSF se preparó mediante la adición de 20 g de glucosa a 1 l de medio de Mandels y Reese en un recipiente de vidrio de 2 l y se esterilizó en autoclave durante 45 minutos a 121 °C a pH 4,5. Se añadieron 100 ml del medio resultante a un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se inoculó con 0,25 g de la cepa MK7 de una solución de reserva de glicerol a -80 °C. El cultivo se incubó a 30 °C, 180 rpm durante 14 días antes de su uso como inóculo para SSF.
Un ejemplo del proceso de SSF es el que se utilizó para la producción de biomateriales en los documentos WO 2016/004380 y Us 2016/0002680. Específicamente, se redujo el tamaño de 100 gramos de paja de trigo en una licuadora comercial y se colocaron en una botella de vidrio de 2 litros. Se añadieron 300 ml de medio de Mandels y Reese y 3 ml de H<2>SO<4>concentrado. La suspensión resultante se esterilizó en autoclave durante 45 minutos a 121 °C. El pH de la suspensión esterilizada en autoclave se ajustó con NaOH a 3,0, se dejó enfriar a temperatura ambiente y después se transfirió igualmente a cuatro matraces Erlenmeyer de 250 ml. Se añadieron 10 ml de inóculo de la cepa MK7 y se agitaron los matraces a 30 °C, 180 rpm durante 4 días, seguido de la transferencia del contenido de todos los matraces a un solo plato Pyrex® de 9 * 9 pulgadas (23 * 23 cm). El cultivo resultante se cubrió con una envoltura de Saran® y se incubó a 30 °C durante 7 días antes de la recogida.
Procedimiento de SSSF
El inóculo de SSSF se describe en el ejemplo 3 y los procedimientos se describen en los ejemplos siguientes (es decir, conversión de pulpa de remolacha azucarera y otros materiales lignocelulósicos que flotan sobre una capa líquida). Específicamente, como se hace referencia en el presente documento, SSSF significa fermentación que se produce cuando un sustrato sólido se sumerge bajo la superficie de un líquido, de manera que un biomaterial fúngico filamentoso crece en la superficie del líquido utilizando carbono y nutrientes procedentes del sólido sumergido. Los biomateriales fúngicos filamentosos producidos son cohesivos, densos y sin materia prima (Figura 14C).
La producción de biomasa y los biomateriales resultantes producidos difieren considerablemente entre los procedimientos SSSF y SSF. Los componentes del medio, la fuerza iónica, la presión osmótica, la concentración de materia prima, la calidad del inóculo, el tiempo de cultivo (Tablas 6 y 7) son diferencias de parámetros importantes entre las metodologías SSSF y SSF. Estas diferencias de proceso dan como resultado propiedades de biomasa muy diferentes (por ejemplo, densidad, formación de un material consolidado, pureza microbiana, longitud del filamento, organización de filamentos, etc.).
La biomasa producida por SSSF da como resultado la producción de biomateriales fúngicos filamentosos que flotan sobre una capa líquida y que están físicamente separados de una capa de materia prima sólida. El biomaterial fúngico filamentoso resultante es una biomasa fúngica esencialmente pura organizada en un material cohesivo y denso. El material tiene una alta resistencia a la tracción y está compuesto por largos filamentos con longitudes promedio que van desde milímetros hasta varios centímetros (como se muestra en las figuras 1C, 11 y 12). Los filamentos se organizan predominantemente en paralelo a la superficie del biomaterial y están conectados por grupos de hongos muy densos. La superficie del biomaterial puede presentar o no hifas aéreas que están orientadas perpendicularmente a la superficie del biomaterial. El biomaterial fúngico filamentoso se elimina fácilmente del entorno de crecimiento, ya que está físicamente separado del sustrato líquido o sólido, lo que permite una recogida rápida y fácil de biomateriales fúngicos filamentosos relativamente puros.
En cambio, la biomasa cultivada por SSF produce biomasa heterogéneamente integrada con el sustrato sólido en una configuración aleatoria. Los filamentos de biomasa producidos tienen generalmente menos de 100 pm de longitud (Figura 14B). Además, la biomasa producida por SSF no es cohesiva y experimenta una baja resistencia a la tracción, por lo que no puede recogerse en una sola unidad (véase la figura 14A). La mezcla resultante de biomasa/sustrato sólido tiende a ser de baja densidad, particularmente cuando se compara con los biomateriales fúngicos filamentosos producidos por SSSF.
Tabla 6.A continuación se describen las diferencias clave en las metodolo ías SSF SSSF:
Ejemplo 19: SSF y SSSF de pulpa de remolacha azucarera de la cepa MK7
La biomasa de la cepa MK7 se produjo utilizando métodos SSF y SSSF con pulpa de remolacha azucarera como fuente primaria de carbono. La pulpa de remolacha es la parte vegetal de la remolacha azucarera que queda después de que se ha eliminado el azúcar de la pulpa de remolacha en la planta de procesamiento. La pulpa de remolacha azucarera se obtuvo de la planta de producción de Western Sugar Cooperative en Billings, Montana, y estaba compuesta de aproximadamente un 24 % de materia seca, un 9,1 % de proteína bruta, un 0,6 % de grasa bruta, un 23,1 % de fibra bruta, un 4 % de ceniza y un 0,56 % de calcio.
Para el experimento de SSF, se mezclaron 50 g de pulpa de remolacha seca con 250 ml de agua. La mezcla se esterilizó en autoclave durante 20 minutos para asegurar la esterilidad. Después de enfriar a temperatura ambiente (~ 23 °C), la mezcla se inoculó con 250 mg del biomaterial de la cepa MK7 húmedo que se cultivó como biomaterial en la superficie de una mezcla de rastrojo de maíz/agua. El biomaterial de la cepa m K7 se mezcló con la mezcla de pulpa de remolacha con una espátula esterilizada y la mezcla inoculada resultante se dejó incubar a temperatura ambiente durante 4, 5 y 7 días.
Para los experimentos de SSSF, se añadió pulpa de remolacha a una concentración del 7 % al medio MK7-1 diluido al 50 % (peso de pulpa:volumen de líquido) para crear 300 ml de medio. El pH del medio se ajustó a 4,8 mediante la adición de una cantidad adecuada de HCl, seguida de ebullición durante 20 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente, aproximadamente 100 mg de biomaterial de MK7 que se cultivó como un biomaterial fúngico filamentoso en la superficie de una mezcla de rastrojo de maíz/agua como se describe en el ejemplo C se mezclaron en el medio con una espátula esterilizada. El pH se reajustó a 4,8 mediante la adición de una cantidad adecuada de HCl y después se añadieron alícuotas de 100 ml del medio de pulpa inoculado a bandejas de vidrio Pyrex® de 0,023 m2 esterilizadas antes de colocar las bandejas en un sistema de rejillas para bandejas. La mezcla inoculada se incubó a 23 ° ± 1 °C, dando como resultado biomateriales densos y flexibles que tenían aproximadamente 2,9, 3,4 y 4,1 mm de espesor después de 4, 5 y 7 días, respectivamente. Los biomateriales se recogieron y se secaron a 50 °C durante 48 h y los pesos secos fueron de 1,85 g (4 días), 2,25 g (5 días) y 2,85 g (7 días). La conversión de pulpa de remolacha a biomaterial seco fue del 26,4 %, 32,1 % y 40,7 % para los materiales de 4, 5 y 7 días, respectivamente. Las densidades de biomaterial basadas en el peso seco de la mayor parte del volumen de biomaterial fueron 0,028, 0,029 y 0,030 g/cm3 para los materiales de 4, 5 y 7 días, respectivamente.
Formas de biomasa significativamente diferentes resultaron del crecimiento utilizando SSF frente a SSSF. SSF produjo estructuras de biomasa que eran mezclas íntimas de biomasa y sustrato. Estas mezclas estaban compuestas de biomasa fúngica de baja densidad entrelazada alrededor y dentro de fragmentos del sustrato de pulpa de remolacha. Estas mezclas íntimas estaban compuestas principalmente por el sustrato intercalado con una pequeña cantidad de biomasa fúngica. La separación de la biomasa del sustrato no se realizó ya que requeriría un proceso adicional significativo y sería técnicamente difícil de lograr.
En cambio, SSSF dio como resultado biomateriales fúngicos filamentosos que estaban físicamente separados y distintos del sustrato de pulpa de remolacha, permitiendo la recogida directa y sencilla del biomaterial. Además, los biomateriales fúngicos filamentosos resultantes eran densos, esencialmente puros y compuestos por largos filamentos alineados.
Ejemplo 20: Crecimiento de biomateriales fúngicos filamentosos de la cepa MK7 en residuos de zanahoria y brócoli
Se produjeron biomateriales de la cepa densa MK7 en 6 días utilizando brócoli homogeneizado o zanahorias homogeneizadas como materias primas. El brócoli y las zanahorias se compraron a Costco Wholesale en Bozeman, Montana. Se homogeneizaron individualmente 100 gramos de cada materia prima en un procesador de alimentos comercial utilizando una cuchilla de metal a alta velocidad durante 5 minutos y se colocaron en vasos de precipitados de 2 litros con 9000 ml de agua del grifo. Se añadieron sales de medios de la siguiente manera para formar una mezcla:
g/l
NH<4>NO<3>5,25
Urea 1,75
KH2PO4 5,0
CaCl<2>1 ,0
MgSO4^7 H<2>O1 ,0
Micronutrientes mg/l
FeSO4^7 H<2>O 2,50
ZnSO4^7 H<2>O 1,10
MnCb^4 H<2>O 0,25
C oC ^6 H<2>O 0,08
CuSO4^5 H<2>O 0,08
(NH4)6MO/O24^4 H<2>O 0,06
H3BO3 0,06
EDTA, ácido libre 19,63
El pH de la mezcla se ajustó a 3,5 mediante la adición de 1,3 ml de HCl concentrado. El medio se cubrió con papel de aluminio y después se hirvió durante 30 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente (~ 23 °C), se añadieron 50 ml (7,5 % volumen:volumen) de inóculo preparado como se describe en el ejemplo 3 al medio para cada materia prima y se agitó hasta que se formó una mezcla homogénea. Se vertieron 250 ml de mezcla en cuatro bandejas separadas de 5 * 7 pulgadas (0,02 m2) y cubiertas con envoltura Saran®. Las bandejas se cultivaron durante 7 días a 23 ° ± 1 °C antes de la recogida. La biomasa resultante era un biomaterial fúngico filamentoso denso y flexible sin la materia prima restante de brócoli o zanahoria. Es decir, se produjo un biomaterial fúngico filamentoso que no contenía residuos de materia prima y estaba compuesto de biomasa de MK7 esencialmente pura. El valor medio del pH del líquido residual después de la recogida fue de 6,2. El espesor medio de los biomateriales húmedos fue de 3 ± 1 mm. Los biomateriales fúngicos filamentosos se secaron a 50 °C durante 72 h y los pesos secos promedio ± desviaciones estándar fueron 1,7 ± 0,2 g para brócoli y 1,7 ± 0,2 g para zanahorias. La conversión promedio de brócoli a peso seco fue de 52 ± 5 g de peso seco de la cepa MK7/100 g de peso seco de brócoli. La conversión promedio de zanahorias en peso seco es de 55 ± 7 g de peso seco de la cepa MK7/100 g de peso seco de zanahorias.
Ejemplo 21: Cultivo de la cepa MK7 en sustituto de residuos orgánicos municipales (recortes de césped y hojas en función del tratamiento previo)
El impacto de los tratamientos previos ácidos y básicos en los residuos orgánicos municipales se evaluó en función del porcentaje de conversión de la materia prima en biomaterial fúngico filamentoso. Los recortes de pasto azul de Kentucky y las hojas de fresno se secaron por separado a 60 °C hasta que el contenido de agua fue inferior al 8 %. Cada materia prima se molió en un mezclador comercial hasta obtener un polvo fino.
Tratamientos previos con ácido HCl
•Se trataron previamente 3 repeticiones de 10 g de hierba/hojas (50:50 en peso seco) en 100 ml de agua del grifo a pH 2,5 (ajustado con HCl al 33 %) hirviendo durante 10 minutos.
•Se trataron previamente 3 repeticiones de 10 g de hierba/hojas (50:50 en peso seco) en 100 ml de agua del grifo a pH 2,5 (ajustado con HCl al 33 %) con MnSO410 mM hirviendo durante 10 minutos.
•Se trataron previamente 3 repeticiones de 10 g de hierba/hojas (50:50 en peso seco) en 100 ml de medio MK7-1 a pH 2,5 (ajustado con HCl al 33 %) hirviendo durante 10 minutos.
•Se trataron previamente 3 repeticiones de 10 g de hierba/hojas (50:50 en peso seco) en 100 ml de medio MK7-1 a pH 2,5 (ajustado con HCl al 33 %) con MnSO410 mM hirviendo durante 10 minutos.
Tratamientos previos con base NaOH
•Se trataron previamente 3 repeticiones de 10 g de hierba/hojas (50:50 en peso seco) en 100 ml de agua del grifo a pH 10,75 (ajustado con NaOH al 1%) hirviendo durante 10 minutos. El pH final de 2,5 se ajustó con HCl.
•Se trataron previamente 3 repeticiones de 10 g de hierba/hojas (50:50 en peso seco) en 100 ml de agua del grifo a pH 10,75 (ajustado con NaOH al 1 %) con MnSO4 10 mM hirviendo durante 10 minutos. El pH final de 2,5 se ajustó con HCl.
•Se trataron previamente 3 repeticiones de 10 g de hierba/hojas (50:50 en peso seco) en 100 ml de medio MK7-1 a pH 10,75 (ajustado con NaOH al 1 %) hirviendo durante 10 minutos. El pH final de 2,5 se ajustó con HCl.
•Se trataron previamente 3 repeticiones de 10 g de hierba/hojas (50:50 en peso seco) en 100 ml de medio MK7-1 a pH 10,75 (ajustado con NaOH al 1 %) con MnSO4 10 mM hirviendo durante 10 minutos. El pH final de 2,5 se ajustó con HCl.
T ratamientos previos de control
•3 réplicas de 10 g de hierba/hojas (50:50 en peso seco) en 100 ml de agua del grifo. pH final 5,5.
•3 réplicas de 10 g de hierba/hojas (50:50 en peso seco) en 100 ml de agua del grifo, MnSO410 mM. pH final 5,5.
•3 réplicas de 10 g de hierba/hojas (50:50 en peso seco) en 100 ml de medio MK7-1. pH final 5,5.
•3 réplicas de 10 g de hierba/hojas (50:50 en peso seco) en 100 ml de medio MK7-1, MnSO410 mM. pH final 5,5. Las muestras se colocaron en bandejas de 12,7 * 12,7 cm, se cubrieron y después se incubaron durante 7 días. En la figura 15 se muestran los resultados. En cada caso, la aplicación de un tratamiento previo incrementó el porcentaje de conversión resultante. Es decir, se logró una mayor cantidad de conversión de la materia prima en biomaterial fúngico filamentoso resultante mediante la aplicación de un tratamiento previo con ácido o base y mediante la adición de manganeso.
Ejemplo 22: Crecimiento de biomateriales de la cepa MK7 en almidón
Los biomateriales fúngicos filamentosos de la cepa MK& densos se produjeron en tan solo 4 días utilizando almidón como fuente de carbono y nutrientes (materia prima). El almidón utilizado en estos experimentos específicos fue 100 % almidón de maíz Argo fabricado por Argo Food Companies, Inc (Memphis, TN) y comprado en el supermercado de Albertson en Bozeman, MH
Se prepararon tres lotes de medio de almidón mediante la adición de polvo de almidón seco al 6 %, 8 % y 10 % en volúmenes de 6 l de agua del grifo potable en recipientes de acero de 10 l. Esta mezcla se complementó con sales de MK7-1 y se hirvió durante 10 minutos seguido de enfriamiento a temperatura ambiente (~ 23 °C). El calentamiento de la mezcla dio como resultado grumos de almidón fusionados que después se rompieron físicamente en grumos más pequeños. El pH de la mezcla se ajustó a 2,7 y se inoculó con 7,5 % (volumen:volumen) de inóculo MK7 preparado como se describe en el ejemplo 3.
Se añadieron alícuotas de 1,5 l de medio inoculado a cuatro bandejas de polipropileno esterilizado de 0,25 m2, colocadas en un sistema de rejillas para bandejas e incubadas a 23 ° ± 1 °C. Se observaron biomateriales fúngicos filamentosos densos después de solo 2 días de crecimiento y las biomateriales se recogieron después de 6 días. El valor de pH medio del líquido residual que queda en las bandejas después de la recogida fue de 6,05, 6,11 y 5,88 para los tratamientos al 6 %, al 8 % y al 10 %, respectivamente. El espesor medio de los biomateriales fue de 2,9, 3,1 y 3,3 mm para los tres tratamientos, respectivamente. Los biomateriales fúngicos filamentosos se secaron a 50 °C durante 72 h y los pesos secos medios ± desviaciones estándar fueron 29,0 ± 1,3, 34,4 ± 1,5 y 38,2 ± 1,9 g para las cuatro bandejas replicadas que contenían almidón al 6 %, al 8 % y al 10 %, respectivamente. Esto equivale a un porcentaje de conversión del 32, 29 y 25 % de almidón a biomateriales fúngicos filamentosos en peso seco. Las densidades promedio sobre la base del peso seco para los biomateriales fúngicos filamentosos húmedos fueron 0,04, 0,04 y 0,05 g/cm2 para los tres tratamientos, respectivamente.
Ejemplo 23: Crecimiento de biomateriales fúngicos filamentosos de la cepa MK7 en corrientes de desechos de procesamiento de patata
Se produjeron biomateriales fúngicos filamentosos de la cepa MK7 densos en 7 días utilizando residuos de procesamiento de patata como fuente de carbono y nutrientes (materia prima). Los desechos del procesamiento de la patata se producen comúnmente durante el procesamiento de las patatas e incluyen corrientes de desechos del lavado, operaciones de pelado y corte (es decir, patatas fritas, patatas en cubos, copos y similares). Las corrientes de desechos del procesamiento de la patata también incluyen pilas de descarga compuestas por múltiples corrientes de desechos del procesamiento de la patata, apilados en un montón y expuestos al ambiente natural sin cubiertas. En este ejemplo, la corriente de desechos de procesamiento de la patata compuesta por desechos de procesamiento de múltiples variedades de patatas se obtuvo de Bauch Farms en Whitehall, Montana el 21 de septiembre de 2016, y se utilizó dentro de las 48 horas siguientes como fuente de carbono y nutrientes para cultivar biomateriales de la cepa MK7.
Los trozos de patata son los trozos de patata que quedan después de que se cortan las patatas fritas de una patata entera. Los trozos de patata varían en tamaño y dimensiones que abarcan, como ejemplo no limitante, desde astillas delgadas hasta piezas de 6 pulgadas (15 cm) de largo por 0,5 pulgadas (1 cm) de grosor o más. Los descartes frescos, en la mayoría de los casos, describen aquellos trozos de patata que se retiran de una patata debido a daños, magulladuras o similares. En algunos casos, las patatas enteras se incluyen como muestras de descarte. Las mondaduras son predominantemente pieles extraídas de las patatas.
Los trozos de patata, los descartes y las pieles se procesaron en un procesador de alimentos hasta obtener una consistencia homogénea (procesador de alimentos Farbarware Modelo 103742 en posición alta) en lotes de volumen de aproximadamente 500 ml durante 1 minuto. Las muestras procesadas con alimentos se denominan mezclados a los efectos de la descripción en el presente ejemplo.
Se añadieron trozos de patata mezclados y descartes frescos a dos ollas de cocción de acero recubiertas con epoxi de 15 l en una proporción de 10 % de peso húmedo de mezclado a un volumen de medio MK7-1 en una relación de 500 g de mezclado a 4,5 l de medio líquido MK7-1, produciendo una mezcla. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 2,45 con HCl concentrado. El de inóculo de la cepa MK7, preparado como se describe en el ejemplo 3, se añadió en una relación del 7,5 % volumen:volumen (es decir, 375 ml de inóculo por 4625 ml de mezcla). Se añadieron alícuotas de 1,5 l de suspensión inoculada a bandejas de polipropileno esterilizadas individuales de 0,25 m2 por triplicado y se colocaron en un sistema de rejillas para bandejas. Los cultivos se incubaron a 23 ° ± 1 °C, dando como resultado biomateriales densos y flexibles recogidos después de 7 días. El valor de pH medio del líquido residual que queda en las bandejas después de la recogida fue de 7,1 para los tratamientos con trozos y 6,9 con descartes frescos. Los biomateriales recogidos se enjuagaron en 7 l de agua del grifo con agitación suave durante 10 minutos y se secaron a 50 °C durante 72 h.
El espesor promedio de los biomateriales húmedos fue de 3,8 ± 0,9 mm para los trozos y 3,9 ± 1,0 mm para los descartes. Los pesos secos promedio ± desviaciones estándar de la biomasa en cada bandeja fueron 33,6 ± 0,6 g para los trozos y 40,2 ± 2,7 g para los descartes frescos. La densidad promedio de los biomateriales basada en peso seco fue de 0,035 g/cm3 para los trozos y 0,041 g/cm3 para los descartes. La conversión promedio de los sólidos totales en los subproductos originales de la patata a biomaterial seco fue del 36 % para los trozos y del 43 % para los descartes frescos. Cerca del 50 % de conversión se consideraría una eficacia de conversión del 100 % del carbono dado el hecho de que aproximadamente el 50 % del carbono utilizado por la cepa MK7 se libera a la atmósfera como dióxido de carbono.
Las mondaduras de patata mezcladas se trataron previamente antes de los experimentos de crecimiento para aumentar el acceso de los nutrientes de la mondadura de patata a la cepa MK7. Se añadieron mondaduras de patata mezcladas (175 g) a cada una de nueve bandejas de vidrio Pyrex® de 12,7 * 17,8 cm (0,023 cm2) para crear una matriz experimental de tres tratamientos con tres repeticiones cada uno. El tratamiento 1 recibió 50 ml de agua del grifo potable. El tratamiento 2 recibió una alícuota de 45 ml de hidrolizado de la cepa MK7 que contenía un conjunto de enzimas hidrolíticas de la cepa MK7 excretadas por la cepa MK7 cuando se cultivó en rastrojo de maíz. El tratamiento 3 recibió 50 ml de agua del grifo y un conjunto de enzimas comerciales compuesto por 0,05 g de celulasa YC (MP Biomedicals, n.° de cat. 320951, n.° de lote M4156), 2,5 ml de glucoamilasa (destilado VHP, Dupont), 2,5 ml de a-amilasa (APEZYME ALPHA, 13.775 UAA/g, Dupont) y 2,5 ml de p-gluconasa (Optimash TBG, Dupont). Se incubaron 3 bandejas de tratamiento a 50 °C durante 30 minutos para estimular la hidrólisis enzimática seguido de ebullición durante 5 minutos para inactivar las enzimas. El pH de los tratamientos se ajustó a 3,0 utilizando HCl concentrado y todas las bandejas se inocularon con 10 ml de la cepa MK7 preparada como se describe en el ejemplo 2. Después de 7 días, los biomateriales se eliminaron de la superficie del líquido, se enjuagaron con agua del grifo durante 10 segundos y se secaron a 60 °C durante 48 h. La conversión del peso seco de la mondadura de patata a biomateriales secos fue: Control (solo H<2>O) medio = 5,9 % (5,5 %, 6,5 % y 5,8 %); Enzimas de la cepa MK7 = 9,0 % (7,2 %, 10,1 % y 9,8 %); y enzimas comerciales = 9,9 % (10,2 %, 8,4 %, y 11 %).
Ejemplo 24: Biomasa de análisis nutricional producida por SSF frente a biomateriales producidos por SSSF
Eurofins realizó el análisis nutricional comparando los biomateriales resultantes de las metodologías SSF frente a SSSF. Se obtuvieron muestras de SSF de la cepa MK7 cultivada en rastrojo de maíz tratado previamente con expansión de fibra de amoníaco (AFEX) por el Michigan Biotechnology Institute. Se añadieron 150 g de AFEX a 500 ml de agua del grifo y se esterilizaron en autoclave a 121 °C después de ajustar el pH a 3,5 con HCl concentrado. La mezcla resultante se inoculó con 25 ml de inóculo de la cepa MK7 de acuerdo con el ejemplo 18. La suspensión se transfirió a una bandeja de vidrio Pyrex® de 23 * 23 cm y se incubó a temperatura ambiente durante 11 días. La biomasa integrada de la cepa MK7 y el rastrojo de maíz se recogieron y se secaron a 60 °C durante 48 horas. Las muestras se analizaron para determinar la proteína total, la fibra total, los hidratos de carbono totales, la ceniza y las grasas totales mediante Eurofins USA (Des Moines, IA).
Se obtuvieron muestras de SSSF de materiales producidos en rastrojo de maíz AFEX al 5 %. Se añadieron 50 g de rastrojo de maíz AFEX a 1 l de agua del grifo y se esterilizó en autoclave a 121 °C después de ajustar el pH a 3,5 con HCl concentrado. La mezcla resultante se inoculó con 50 ml de inóculo de la cepa MK7 preparado como se describe en el ejemplo 3. La suspensión se transfirió a dos bandejas de vidrio Pyrex® de 23 * 23 cm y se incubó a temperatura ambiente durante 11 días. Se recogieron los materiales y se enjuagaron con agua del grifo durante 30 segundos, seguido de secado a 60 °C durante 24 horas. Las muestras se analizaron para determinar la proteína total, la fibra total, los hidratos de carbono totales, la ceniza y las grasas totales mediante Eurofins USA (Des Moines, IA).
Tabla 7.
Ejemplo 25: Perfil de aminoácidos de la cepa fúngica filamentosa acidófila MK7
El biomaterial de la cepa fúngica filamentosa acidófila MK7 se produjo en reactores de bandeja utilizando el método descrito en los ejemplos 2 y 3 en el medio MK7-1. La biomasa filamentosa de 6 bandejas se combinó antes de secar a 60 °C durante 45 minutos y 50 °C durante 72 horas. 400 g de esta biomasa filamentosa se enviaron al Eurofins Scientific Inc. Nutritional Analysis Center en Des Moines, I A, para análisis nutricional. Se analizaron los aminoácidos utilizando los métodos reconocidos internacionalmente publicados en los Association of Official Agricultural Chemists (AOAC) Official Methods of Analysis de la siguiente manera: AOAC 988.15 para triptófano, AOAC 994.12 mod. para cistina y metionina, AOAC 982.30 mod. para alanina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, lisina total, tirosina y valina. La composición de aminoácidos de la muestra de la cepa fúngica filamentosa acidófila MK7 informada por Eurofins se compara con la composición de aminoácidos deFusarium venenatumutilizada como alimento para peces (Alriksson, B.et al.(2014) Fish feed from wood. Cellulose Chemistry and Technology 48:9-10 (2014), Quorn (Nutritional Profile of Quorn Mycoprotein, 2009), albúmina de huevo (Food and Agriculture Organization of the United Nations. The Amino Acid Content of Foods and Biological Data on Proteins, Estudio nutricional n.° 24. Roma (1970). UNIPUB, Inc., 4611-F Assembly Drive, Lanham, MD 20706) yRhizopus oligosporus(Graham, D. C., Steinkraus, K. H. y Hackler, L. R. (1976) Factors affecting production of mold mycelium and protein in synthetic media. Appl Environ Microbiol 32:381-387) en la tabla 8. El contenido de proteína total se midió como el 41,5 % de una biomasa con un contenido de humedad del 4,5 %. Notablemente, se demostró que la cepa fúngica filamentosa acidófila MK7 tiene una mayor concentración de aminoácidos esenciales en comparación con las otras cuatro fuentes de proteínas, haciendo de la cepa fúngica filamentosa acidófila MK7 una fuente muy deseable de proteínas para alimentos y piensos.
Tabla 8.La concentración de aminoácidos como porcentaje de aminoácidos totales se proporciona para la cepa fúngica filamentosa acidófila MK7 y cuatro fuentes de alimentos/piensos con alto contenido en proteínas. Los aminoácidos esenciales se indican con un asterisco.
Ejemplo 26: Producción de lípidos ricos en C18 por la cepa fúngica filamentosa acidófila MK7 a partir de glicerol de calidad alimentaria
Preparación del medio:Se prepararon 4,5 litros de medio MK7-1 con 125 g/l de glicerol (The Chemistry Store - Glicerol de calidad alimentaria kosher >99,7 %, ASIN: BOOKN1LRWQ, disponible en Internet) (562,5 gramos) con NH<4>NO<3>y concentraciones de nitrógeno ureico alteradas a una relación C:N de 40:1 (moles de carbono en fuente de C:moles de N en compuestos nitrogenados).
Tabla 9.Composición del medio MK7-1 modificado para proporcionar una relación C:N de 40:1 y una concentración de glicerol del 12,5 %. Los micronutrientes se suministraron mediante la adición de 2 ml/l de una solución de reserva 500x descrita en la tabla 1 (Ejemplo 1).
Volumen total 4,5
NH<4>NO<3>(g) 10,8
Urea (g) 3,7
CaCl<2>(g) 9,0
MgSO4-7H2O (g) 9,0
KH<2>PO<4>(g) 45,0
Micronutrientes (ml) 9,0
Glicerol (g) 563
Glicerol (l) 0,446
(continuación)
Relación C:N 40:1
pH 2,7
H<2>O desionizada (l) 4,05
HCl (ml) 5,85
El pH de la mezcla se ajustó a 2,7 y se esterilizó con calor hirviéndolo durante 30 minutos en un matraz Erlenmeyer de 2 litros con la parte superior del matraz cubierta con papel de aluminio. La mezcla se enfrió durante 2 horas a 25 °C.
Inoculación:Se añadió el inóculo (15 g/l de células planctónicas como peso seco en fase de crecimiento exponencial (véase el ejemplo 3) al matraz enfriado a una concentración final de peso seco de 1 g/l. El matraz se mezcló completamente para lograr una distribución uniforme del inóculo. Las células en estado planctónico son fundamentales para la formación del material y se desea minimizar el agrupamiento de células (es decir, biopelículas mayores de 1 mm). Idealmente, los grupos de células mayores de 2,5 mm deben filtrarse del inoculante antes de la distribución.
Incubación y recogida:La mezcla con inóculo se distribuyó uniformemente en tres bandejas de 0,25 m2 a un volumen de 1,5 litros/bandeja o 6 litros por metro cuadrado y se incubó a 25 °C, humedad del 90 al 100 % durante 8 días. Se produce una biomasa de biomaterial consolidada a densidades celulares superiores a 30 g/l y la biomasa se puede recoger como un material cohesivo. En un aspecto, el material simplemente se quita de la bandeja (Figura 6). El material se enjuaga durante 30 segundos con agua corriente y se deja secar por goteo durante 5 a 10 minutos. Se evitó apretar el material ya que las proteínas y otros nutrientes fúngicos se pierden debido a la eliminación excesiva de agua. La biomasa filamentosa después del secado por goteo tenía un peso húmedo de 410 gramos (o 1.620 gramos/m2). El contenido de humedad se midió al 82 % (es decir, peso seco del 18 %) correspondiente a un peso seco de 73,8 g/bandeja o 295 g/m2. La biomasa filamentosa en peso seco del 18 % se compara favorablemente con el procesamiento de otra biomasa fúngica cultivada en cultivos sumergidos con un peso seco normal del 1,5 %. En cambio, los procesos de vanguardia utilizan centrifugadoras (un proceso intensivo en energía y capital) para lograr la densidad de biomasa fúngica deseada. El proceso descrito en el presente documento requiere mucho menos procesamiento, equipos y aportes de energía en comparación con estos métodos más costosos.
Análisis de lípidos:Las estimaciones de los lípidos totales se realizaron mediante microscopía UV-Vis con tinción con rojo Nilo (Cookseyet al.,1987; Figura 16), que estimó los lípidos totales en el 40 al 50 %. La cuantificación de los lípidos intracelulares totales se determinó mediante transesterificación directa junto con análisis GC-MS como se describe en Lohman.et al.(2013) y se encontró que era del 39 %. Esto corresponde a una producción de lípidos de 115 g de lípidos/m2 en 8 días (velocidad media de producción de 14 g/m2/día) o 0,39 g/litro/hora. Estas velocidades son mucho más rápidas que las encontradas en cultivos sumergidos con la cepa fúngica filamentosa acidófila MK7 con glicerol al 8 % (0,245 g/l/h) y muy competitivas con otros organismos encontrados en la bibliografía, incluyendo las levaduras y las algas. Asimismo, la cepa fúngica filamentosa acidófila MK7 produce lípidos a estas velocidades competitivas a concentraciones muy elevadas de glicerol no tolerables por la mayoría de los organismos y es el único organismo (que se sepa) que puede hacer esto en intervalos de pH ácidos, lo que tiene ventajas significativas para limitar la contaminación. Asimismo, el coeficiente de lípidos (g de lípidos/g de sustrato) es altamente competitivo con otras cepas a 0,21 g de lípidos/g de glicerol (véase la tabla adjunta). El aumento de las velocidades de producción de lípidos y las densidades celulares de 180 g/l tienen implicaciones directas para transformar la producción de aceites microbianos por una amplia variedad de microorganismos actualmente en desarrollo o en uso comercial.
Los perfiles lipídicos de la cepa fúngica filamentosa acidófila MK7 son notablemente coherentes entre los diferentes tipos de tratamientos (es decir, pH, temperatura, sustrato de crecimiento, duración del cultivo, contenido de humedad) y están dominados por triacilglicéridos C16:0 y C18:0, y C18:1 y C18:2 (>95 % de los lípidos totales; tabla 10 a continuación; figura 17). Los perfiles de ácidos grasos también muestran una serie de productos de elevado valor, incluyendo el ácido vaccénico omega-7 (11-octadecenoato de metilo), ácido palmitoleico omega-7 (hexadec-9-enoato de metilo; nombre comercial Provinal™) y ácido tetracosanoico, éster de metilo. Estos son ácidos grasos raros que no se encuentran normalmente en los aceites vegetales y pueden producir significativamente más ingresos por tonelada de materia prima que el biodiésel solo.
Tabla 10.Identidades y concentraciones de ácidos grasos encontrados en la biomasa de la cepa MK7 cultivada con ____________ glicerol al 12,5 % durante 8 días a 30 °C; y relación C:N de 40:1______________________
EuroFin SB (n = 3)
% de perfil FAME % de perfil FAME DE (Ácido cáprico) 0,3 % 0,1 % 0,01 % (Ácido undecanoico) 0,3 % 0,0 % 0,01 % (Ácido láurico) 0,3 % 0,0 % 0,00 % (Ácido mirístico) 0,5 % 0,4 % 0,00 % (Ácido miristoleico) 0,3 % 0,0 % 0,00 % (Ácido pentadecanoico) 0,3 % 0,3 % 0,03 %
(Ácido palmítico) 15,8 % 21,2 % 0,45 % continuación
Ejemplo 27: Análisis de toxicidad de la cepa MK7
Se probaron cinco muestras de la cepa MK7 cultivadas en diferentes condiciones para determinar la presencia de micotoxinas. La biomasa de la muestra 1 se produjo en un biorreactor de 10 l en las mismas condiciones utilizadas para generar el inóculo como se describe en el ejemplo 1, con la excepción de que la relación C:N fue de 30:1. La muestra de biomasa se recogió mediante filtración a través de un filtro de 0,2 pm utilizando un aparato de filtración al vacío como se describe en el ejemplo 1.
El biomaterial de la muestra 2 se produjo en una bandeja de vidrio Pyrex® esterilizada de 12,7 * 17,8 cm (0,02 m2) utilizando 50 ml de medio MK7-1 pH 2,8 preparado como se describe en el ejemplo 1, con la excepción de que el medio se complementó con un glicerol al 12 % y peptona al 0,2 % (peso/volumen; peptona granulada, Fisher Scientific, n.° de lote 143241, Somerville, NJ). La muestra 2 utilizó el mismo procedimiento de esterilización que se utilizó para bandejas de 0,25 m2 referidas en el ejemplo 3.
La muestra 3 se cultivó en condiciones idénticas a las de la muestra 2, con la excepción de que el pH se ajustó a 4,5 y el medio no se complementó con peptona.
La muestra 4 se cultivó en condiciones idénticas a las de la muestra 2, con la excepción de que el medio se complementó con glicerol al 4 %.
La muestra 5 se cultivó en condiciones idénticas a las de la muestra 2, con la excepción de que el pH se ajustó a pH 2,2 y el medio no se complementó con peptona. Se inocularon los medios de las muestras 2 a 5 con 7,5 % (vol./vol.) del cultivo líquido utilizado para la muestra 1. Se recogieron las muestras de biomasa húmeda después de 8 días de crecimiento y se almacenaron a -20 °C antes de la extracción de las micotoxinas.
Las micotoxinas se extrajeron de la biomasa húmeda utilizando un kit de ensayo de micotoxinas Myco6in1 suministrado por Vicam (n.° de lote 100000176: Nixa, MO) siguiendo el protocolo estándar descrito en el manual del kit de ensayo Myco6in1+. Se analizaron doce micotoxinas diferentes mediante LC-Q-TOF utilizando el protocolo descrito en el Manual de instrucciones de Myco6in1+ LC/MS/MS. Se utilizó un Agilent 6538 Q-TOF acoplado a un Agilent 1290 HPLC alojado en las Mass Spectrometer Core Facility at Montana State University para la identificación y cuantificación de las toxinas. Se utilizaron fumonisina B1 y fumonisina B2 como patrones auténticos.
Los valores medidos para todas las toxinas analizadas estuvieron por debajo de los niveles reglamentarios para el consumo humano establecidos por la U.S. Food and Drug Administration (Tabla 11). Los niveles medidos fueron al menos un orden de magnitud más bajos que los niveles reglamentarios, con excepción de las aflatoxinas totales que se encuentran en la muestra 4, que fueron de 8,76 ng/g en comparación con el nivel reglamentario de 20 ng/g. Sin embargo, los genes para la producción de aflatoxinas no están presentes en la cepa MK7, por lo tanto, se espera que la fuente de esta toxina sea una contaminación de la peptona y otros ingredientes utilizados en el medio y no un producto de MK7.
Tabla 11.Cuantificación de micotoxinas en biomasa de la ce a MK7.
continuación
El carácter no tóxico del medio de cultivo MK7 y la biomasa se verificó adicionalmente mediante bioensayos conDaphnia magna,un macroinvertebrado altamente sensible comúnmente utilizado para ensayos de toxicidad (Publicación de la EPA, 1987; Guilherminoet al.,2000).D. magnavivo se compró a Carolina Biological Supply (Burlington, NC) y se cultivó en las condiciones descritas en el manual proporcionado por el proveedor. Después de 24 horas de crecimiento y observación, se utilizaronDaphniapara el experimento de toxicidad. Se llenaron tres placas de Petri con 30 ml de un 30 % de cultivo MK7 (medio MK7 y MK7-1) cultivado en el reactor de inóculo durante 6 días como se describe en el ejemplo 3, y 70 % de agua en la que se transporta elD. magna.Para un control experimental, se llenaron tres placas de Petri adicionales con 30 ml de agua de transporte. Se añadieron sieteD. magnaque parecían animados a cada una de las seis placas de Petri y se observaron diariamente durante tres días. La muerte deD. magnase definió como ningún movimiento visible después de 1 minuto. No se observaron diferencias significativas en las velocidades de supervivencia entreD. magnatratados con medio de cultivo MK7 y biomasa, y los controles experimentales durante 3 días (promedio de 1,2 muertes por placa de Petri después de 3 días para cada tratamiento).
La toxicidad de la biomasa de la cepa MK7 también se probó en Goldfish(Carassius auratus).Dos peceras idénticas de 5,7 l, la bomba y los filtros se compraron a Petco en Bozeman, MT (modelo de Aqueon n.° E414w , Franklin, WI). Los tanques se llenaron con 5,7 l de agua mineral de Polonia comprada en el supermercado de Albertson, Bozeman, Montana. Se compraron seis peces de colores (~ 3 cm de longitud) de Petco (Bozeman, MT) y se colocaron tres en cada uno de los tanques. Uno de los tanques recibió alrededor de 0,05 g de alimento para peces seco TetraFin Goldfish Flakes Plus (Blacksberg, VA) diariamente (comprado a Petco, Bozeman, MT). El otro tanque recibió diariamente aproximadamente 0,05 g de biomasa seca de la cepa MK7. La biomasa húmeda de MK7 se obtuvo de uno de los reactores de bandeja producidos de acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 3. La biomasa de MK7 se preparó retirando 40 g de MK7 de una bandeja (véase el ejemplo 3) y colocando la biomasa en un vaso de precipitados de 250 ml. La biomasa húmeda se calentó a continuación en el microondas que utiliza una microonda GE (Modelo WES1452SS1SS) durante 30 segundos. La biomasa seca tenía un contenido de humedad inferior al 0,5 %. A continuación, la biomasa se trituró con una espátula de acero inoxidable para obtener pequeñas escamas que eran de tamaño similar a las escamas TetraFin Goldfish Flakes. Todos los peces sobrevivieron y parecían estar sanos (nadando vigorosamente) después de 60 días de alimentación y mostraron un marcado entusiasmo por comer el material de biomasa producido por MK7. El experimento se terminó después de 60 días.
SEQ ID NO: 1 Secuencia de ADN de la región ITS y ARNr 18S de la especie fúngica filamentosa acidófila denominada cepa MK7
CCG CG G G G AATACTACCTG ATCCG AG G TCACATTCAG AG TTG G G G G TTTA CGGCTTGGCCGCGCCGCGTACCAGTTGCGAGGGTTTTACTACTACGCAATGGAAG CTGCAGCGAGACCGCCACTAGATTTCGGGGCCGGCTTGCCGCAAGGGCTCGCCG ATCCCCAACACCAAACCCG G G G G CTTG AG G G TTG AAATG ACG CTCG AACAG G CA TG CCCG CCAG AATACTG G CG G G CG CAATG TG CG TTCAAAG ATTCG ATG ATTCACT G AATTC TG C AATTC ACATTACTTATCG C ATTTTG C TG CG TTCTTC ATCG ATG C CAG A A C C A A G A G A TC C G TTG TTG A A A G TTTTG A TTTA TTTA TG G TTTTA C TC A G A A G TT ACATATAG AAACAG AG TTTAG G G G TCCTCTG G CG G G CCG TCCCG TTTTACCG G G A GCGGGCTG ATCCG CCG AG G CAACAATTG G TATG TTCACAG G G G TTTG G G AG TTG TAAACTCG G TAATG ATCC CTC CG C AG TTC TCACC TACG G ATAG G ATCATTAC CG A G TTTACAACTCCCAAACCCCTG TG AACATACCCATTG TTG CCTCG G CCG G ATCAG CCCGCTCCCG G TTAAAACG G G ACG G CCCG CCAG AG TACCCCTAAACTCTG TTTCT A T A T G T A A C T T C T G A G TA A A A C C A TA A A TA A A TC A A A A C TTTC A A C A C G C A TC TC TTG CTTC TG TC ATC G ATG AAG AAC G C AG C AAAATG C G ATAG TC ATG TG ATTG C AC
ATTCAG TG AATCATCG ATCTTG ACG CACATTG CG CCTG CAG TATTCTG G CG G TCA
TGCCTGTTCGAGCGTCATTCAGCCCTCAGCCCTCGGTTGTGTTCGGGATCGGCGA
GTCCTGCGCCAGCGACCGGATCAGTGGCGTCTGCCTGCGCCTCCATTGCGGTTAG
A G U A AGCCCTCG CCCACTTG TTTTACG CTAACSEQ ID NO: 2 Factor de elongación de la traducción 1 a (Tef1)
ATG ATCACTG G TACTTCCCAG G CCG ATTG CG CCATTCTCATCATTG CCG CC GGTACTG G TG AG TTCG AG G CTG G TATCTCCAAG G ATG G CCAG ACCCG TG AG CAC G C TC TTCTTG CCTACACCCTTG G TG TCAAG AACCTCATCG TCG CCATCAACAAG A TG G AC ACC ACCAAG TG G TCTG AG G CCCG TTACCAG G AG ATCATCAAG G AG ACCT CCTCCTTCATCAAG AAG G TCG G CTACAACCCCAAG G CTG TCG CTTTCG TCCCCAT CTCCG G TTTCAACG G TG ACAACATG CTTACCCCCTCCACCAACTG CCCCTG G TAC AAG G G TTG G G AG CG TG AG ATCAAG TCCG GCAAG CTCACCG G CAAG ACCCTCCTC G AGGCCATTGACTCCATCGAGCCTCCCAAGCGTCCCGTTGACAAGCCCCTCCGTC TTCCCCTCCAG G ATG TCTACAAG ATCG G TG G TATTG G AACG G TTCCCGTCG G CCG TATTG AG ACTG G TG TCATCAAG CCCG G TATG G TCG TTACCTTCG CTCCCTCCAAC G TCACCACTG AAG TCAAGTCCG TCG AG ATG CACCACG AG CAGCTCAG TG AG G G C C AG CC CG G TG ACAACG TTG G TTTCAACG TG AAG AACG TCTCCG TCAAG G ACATC CGACGTGGTAACGTCGCTGGTGACTCCAAGAACGACCCCCCCCAGGGTGCCGCT TCTTTCACCGCCCAGGTCATCGTCCTCAACCACCCCGGCCAGGTCGGTGCTGGTT ACG CTCCCG TCCTCG ATTG CCACACTG CCCACATTG CCTGCAAG TTCG CCG AG AT CCAG G AG AAG ATCG ACCG CCG AACCG G TAAG G CTACTGAG G CCG CTCCCAAG TT CATCAAG TCTG G TGACTCCG CCATCG TCAAG ATG G TTCCCTCCAAG CCCATG TG T GTCGAGGCTTTCACTGACTACCCTCCTCTGGGTCGTTTCGCCGTCCGTGACATGC G ACAGACTGTCGCCGTCGGTGTCATCAAGGCCGTCGAGAAGTCCACCGGTGCTG CT GGC A A G G T C ACC AAGTCCGCTGCC AAGGCCGCC A A G A A A T A ASEQ ID NO: 3 Cadena p de tubulina (Tub1): secuencia parcial
GTGGATCTTGAGCCCGGTCCTCAGGATGCCATCCGCGCCGGGCCCCTAGG CCAGCTTTTCCGCCCCGACAACTTCGTCGCCGGAAATGCCAGCGCCGGTAACAAC T GGGC C A AGGGT C A T T AC AC CGA AGGT GC T GAGC TC GTT GAGGAGGC C ATC G AT G TTG TG CG ACACG AG G TTG AG AACTG TG ACCATCTTCAG G G TTTCCAG CTCACCC ACTCTCTCGGCGGTGGTACCGGTTCTGGTATGGGAACGCTTCTTCTGTCGAAAAT CCG TG AG GAGTTTCCCGATCGCATGATGGCTACTTTTTCCGTTATGCCTTCGCCTA
AG G TTTCTG ATACCG TTG TCG AACCTTACAACG CCACTTTG TCATTG AACCAG CT
TG TCG AG AACTCCG ATG AG ACCTTCTG T ATC G AT AAC G AG G C TTTG TAC G ACATT
TACG AG AAG ACCCTG AAG ATTG CTG ATCCTTCTTACG CCG ATCTC
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Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un biomaterial fúngico filamentoso que comprende al menos una capa celular, en donde el biomaterial tiene una densidad celular de al menos 25 g de peso seco/l de medio y tiene un grosor de 1 mm a 30 mm,
en donde el biomaterial se produce mediante un método de fermentación en superficie, que comprende el crecimiento en la superficie de un medio acuoso que comprende nutrientes en forma disuelta o sumergida, y
en donde el biomaterial tiene suficiente resistencia a la tracción e integridad estructural para ser manipulado sin desgarro.
2. El biomaterial de la reivindicación 1, en donde el biomaterial tiene una densidad celular de al menos 50 g de peso seco/l de medio o al menos 75 g de peso seco/l de medio.
3. El biomaterial de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el biomaterial comprende al menos dos capas celulares estructuralmente diferentes en contacto entre sí, incluyendo una capa de hifas aéreas y una capa inferior en contacto con un medio artificial, en donde la capa de hifas aéreas es menos densa que la capa inferior.
4. El biomaterial de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el biomaterial tiene un contenido de proteína de al menos un 40 %.
5. El biomaterial de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el biomaterial tiene un contenido de lípidos de al menos un 39 %.
6. El biomaterial de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los hongos filamentosos se seleccionan del grupo que consiste en una especie de un género seleccionado del grupo que consiste en Fusisporium, Pseudofusarium, Gibberella, Sporotrichella, Aspergillus, Penicillium y Trichoderma; una especie del orden Mucorales; la cepa fúngica filamentosa denominada MK7; levaduras capaces de producir filamentos; y combinaciones de los mismos.
7. El biomaterial de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los hongos filamentosos se seleccionan del grupo que consiste en una especie de Fusarium y una especie de Rhizopus.
8. El biomaterial filamentoso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los hongos filamentosos se seleccionan del grupo que consiste en la cepa denominada MK7 (Depósito de acceso ATCC n.° PTA-10698), Fusarium venenatum y Rhizopus oligosporus.
9. El biomaterial de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el biomaterial tiene entre el 5 % y el 20 % de sólidos.
10. Un producto alimenticio, que comprende el biomaterial de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
11. Un método para eliminar carbono y nitrógeno del agua de la laguna de alimentación que comprende
(a) ajustar el agua de la laguna a un pH de 2,6;
(b) inocular el agua de la laguna ajustada con la cepa MK7 (Depósito de Acceso ATCC N.° PTA-10698); y (c) producir un biomaterial fúngico filamentoso en la superficie de la laguna;
en donde el biomaterial contiene el carbono y el nitrógeno eliminados del agua de la laguna.
12. Un método para producir un biomaterial mediante un método de fermentación en superficie adecuado para su uso en un producto alimenticio que comprende
(a) inocular una cantidad eficaz de al menos un hongo filamentoso en un medio de crecimiento artificial;
(b) incubar el medio de crecimiento inoculado en un estado inalterado mediante fermentación en superficie para producir un biomaterial fúngico filamentoso; y
(c) recoger el biomaterial fúngico filamentoso;
en donde el biomaterial tiene una densidad celular de al menos 25 g de peso seco/l de medio y tiene un grosor de 1 mm a 30 mm.
13. El método de la reivindicación 12, en donde el medio de crecimiento artificial comprende una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en azúcares, almidón, hidratos de carbono, glicerol, suero de leche, materia prima lignocelulósica, suero de leche ácido y combinaciones de los mismos.
14. El método de la reivindicación 13, en donde el azúcar es glucosa, galactosa, manosa, trehalosa, sacarosa, arabinosa, maltosa, xilosa y/o fructosa.
15. El método de la reivindicación 13, en donde la materia prima lignocelulósica se selecciona del grupo que consiste en paja de trigo, paja de cebada, paja de arroz, paja de grano pequeño, rastrojos de maíz, fibras de maíz, solución de maíz macerado, pulpa de remolacha y una combinación de las mismas.
16. El método de la reivindicación 13, en donde el hidrato de carbono se selecciona del grupo que consiste en monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y una combinación de los mismos.
17. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en donde el medio de crecimiento artificial comprende una fuente de nitrógeno seleccionada del grupo que consiste en urea, nitrato de amonio, sulfato de amonio, sales de nitrato, sales de amoniaco, proteínas, péptidos, solución de maceración de maíz y combinaciones de los mismos.
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