CN114126412A - 包含丝状真菌颗粒的食物材料组合物和膜生物反应器设计 - Google Patents

包含丝状真菌颗粒的食物材料组合物和膜生物反应器设计 Download PDF

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R.U.布莱克
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M.J.哈尼
E.B.埃克斯特罗姆
M.A.科祖巴尔
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Abstract

提供了作为食物产品中的独立蛋白质来源和/或蛋白质成分的食用丝状真菌生物垫配制剂的生产方法以及一次性使用或重复使用的自含式生物垫反应器，该反应器包含具有至少一个区室和置于区室内的原料、真菌接种物、透气膜和任选的液体营养物培养基的容器。

Description

包含丝状真菌颗粒的食物材料组合物和膜生物反应器设计
对相关申请的交叉引用
本申请要求2019年2月27日提交的美国临时专利申请62/811,421的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本申请涉及食用丝状真菌，并提供制备用于食物的食用真菌的方法、食用真菌的液体和固体配制剂、以及与之相关的用途和方法、含有食用丝状真菌的食物及其方法和用途。
背景技术
联合国在2017年8月将世界人口列为75亿，并预测该数字将在2023年增长到80亿并且在2056年增长到100亿。在相关报告中，联合国粮食农业组织(FAO)估计，若到2050年全球人口达到91亿，世界粮食产量将需要增加70％，并在发展中国家倍增。尽管能源成本上升，地下含水层资源减少，农田因城市蔓延而损失，以及由气候变化造成的日益恶劣的天气(例如温度升高、干旱增加、洪水泛滥等)，粮食产量仍将需要增加。对于诸如根据2009年的数据已经具有不足的蛋白质摄入的非洲和面临蛋白质摄入不足的风险的中国、印度、巴基斯坦和印度尼西亚的国家而言，这是一个特别的挑战。此外，预计2040年全球肉类需求增长60％，乳制品需求增长50％。
但并非所有蛋白质来源平等创建。动物性食品(肉、蛋、奶制品)提供“完全”蛋白质，因为它们包含所有必需氨基酸；即甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、组氨酸、色氨酸和赖氨酸。植物性食品虽然含有一些必需氨基酸，但通常缺乏完全组。例如，存在于淀粉根中的蛋白质缺少必需的氨基酸赖氨酸，其必须从饮食中的另一种食物中获取。豆类和豆荚含有高水平的赖氨酸，但它们缺少必需的氨基酸甲硫氨酸。尽管可以通过配对植物性食物来构建完整的蛋白质，但是使用完整的蛋白质来确保营养均衡的饮食要容易得多。
完全蛋白质的一种非动物来源是从食用丝状真菌中获得的，例如Fusariumvenenatum(以前分类为禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum))。但是，迄今为止，从这些来源生产蛋白质需要在能源和生产设备(例如资本密集型生物反应器和离心机)上进行大量投资。仍然需要低能量，消耗较少自然资源且成本低的生长、收获和食品生产方法。本发明解决了这些问题。
此外，减少与应对自然灾害、后勤隔离环境或军事和/或太空/地外任务相关的物流供应的一个领域是在提供任务关键产品，诸如营养和开胃食物、燃料、代谢物表达平台、建筑材料和/或微生物工厂情况下的生命支持回路，特别是废物流的闭合。通常，这些类型的环境无法接触或有限接触到无菌设施或/或需要密封的无菌系统来完全容纳废物流和/或所产生的食物、燃料和材料。例如，欧洲航天局的工作(第25-28号探险，太空中有色真菌的生长和生存(CFS-A))表明，真菌可以在空间站内生长，并能在潮湿条件下分解食物和其他有机物质；在这里，真菌系统的防范对于防止其他供应和表面的无意污染至关重要。除了需要在太空旅行的发展领域中分解食物和废物之外，在应对自然灾害、剧院内军事行动、荒野行动以及卫生和制冷不可靠的第三世界情况、密闭空间、后勤困难的场所以及某些农业/工业运营中时，也存在这些需求。需要拥有自含式(self-contained)无菌系统，该系统以最小的空间、能源和维护来高效运行。
强大且高效的便携式自含式生物膜反应器系统解决这些问题，所述系统能够将极其多种废物流转化为多种有价值的产品。本公开内容描述了一种简单的无菌生物反应器平台，该平台在发酵期间(除了温度控制之外)不需要搅拌，不需要主动通气，不需要外部能源，产生最少的废物残留至无废物残留，需要很少的水并且产生密集的，易于收获的，有织纹的生物垫。另外，自含式生物膜反应器系统可以是便携式的和/或可扩展的，以用于更大、更集中的任务和/或群体。
发明概述
本发明的一个方面提供了食物材料，其包含丝状真菌的颗粒，所述丝状真菌属于选自下组的目：毛霉菌目(Mucorales)、黑粉菌目(Ustilaginales)、红菇目(Russulales)、多孔菌目(Polyporales)、伞菌目(Agaricales)、盘菌目(Pezizales)和肉座菌目(Hypocreales)，其中所述丝状真菌包含大于约40重量％蛋白质含量和小于约8重量％RNA含量。
在实施方案中，丝状真菌可以属于选自下组的科：毛霉菌科(Mucoraceae)、黑粉菌科(Ustilaginaceae)、猴头菌科(Hericiaceae)、多孔菌科(Polyporaceae)、灰树花菌科(Grifolaceae)、离褶伞科(Lyophyllaceae)、球盖茹科(Strophariaceae)、马勃科(Lycoperdaceae)、伞菌科(Agaricaceae)、侧耳科(Pleurotaceae)、泡头菌科(Physalacriaceae)、光茸菌科(Omphalotaceae)、块菌科(Tuberaceae)、羊肚菌科(Morchellaceae)、绣球菌科(Sparassidaceae)、丛赤壳科(Nectriaceae)、生赤壳科(Bionectriaceae)和虫草菌科(Cordycipitaceae)。
在实施方案中，丝状真菌可以属于选自下组的种：少孢根霉(Rhizopusoligosporus)、茭白黑粉菌(Ustilago esculenta)、Hericululm erinaceus、宽鳞多孔菌(Polyporous squamosus)、Grifola fondrosa、真姬菇(Hypsizygus marmoreus)、榆菇(Hypsizygus ulmarius)(榆耳(elm oyster))、香杏丽蘑(Calocybe gambosa)、光帽鳞伞(Pholiota nameko)、大秃马勃(Calvatia gigantea)、双孢子蘑菇(Agaricus bisporus)、大球盖菇(Stropharia rugosoannulata)、砖红垂幕菇(Hypholoma lateritium)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)(珍珠菇)、糙皮侧耳columbinus变种(蓝蚝菇(Blue oyster)、波氏块菌(Tuber borchii)、羊肚菌(Morchella esculenta)、尖顶羊肚菌(Morchella conica)、梯棱羊肚菌(Morchella importuna)、绣球菌(Sparassiscrispa)(花椰菜)、Fusarium venenatum、菌株MK7 ATCC保藏号PTA-10698、肋状皱盘菌(Disciotis venosa)、粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)、北冬虫夏草(Cordycepsmilitaris)、彩绒革盖菌(Trametes versicolor)、灵芝(Ganoderma lucidum)、绒状火菇(Flammulina velutipes)、埃杜拉香菇(Lentinula edodes)、红平菇(Pleurotus djamor)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、和白环蘑属种(Leucoagaricus spp)。
在实施方案中，丝状真菌可以是镰孢菌属物种。
在实施方案中，丝状真菌可以是Fusarium venenatum。
在实施方案中，丝状真菌可以是菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)。
在实施方案中，丝状真菌可具有选自下组的特征：(a)包含大于约45重量％蛋白质含量；(b)包含大于约50重量％蛋白质含量；(c)包含大于约55重量％蛋白质含量；(d)包含大于约60重量％蛋白质含量；(e)包括小于约5重量％RNA含量；(f)包含小于约4重量％RNA含量；(g)包含小于约3重量％RNA含量；(h)包含小于约2重量％RNA含量；以及a-d之一和e-h之一的组合。
在实施方案中，丝状真菌可包含包含小于约10ppm的选自下组的真菌毒素：黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、烟曲霉毒素B1、烟曲霉毒素B2、烟曲霉毒素B3、赭曲毒素A、瓜萎镰菌醇(Nivalenol)、脱氧瓜萎镰菌醇(Deoxynivalenol)、乙酰基脱氧瓜萎镰菌醇、镰刀菌烯酮(Fusarenon)X、T-2毒素、HT-2毒素、新茄镰孢菌醇(Neosolaniol)、蛇形菌素(Diacetoxyscirpenol)、玉米赤霉烯酮(zearalenone)、白僵菌素(beauvericin)、镰菌素(fusarin)C、镰刀菌酸及它们的任意组合。
丝状真菌可包含小于约10ppm，或小于约9ppm，或小于约8ppm，或小于约7ppm，或小于约6ppm，或小于约5ppm，或小于约4ppm，或小于约3ppm，或小于约2ppm，或小于约1ppm，或小于约0.9ppm，或小于约0.8ppm，或小于约0.7ppm，或小于约0.6ppm所选真菌毒素，或者备选小于约百万分的任何十分之一(等于或少于10ppm)。在特定的实施方案中，所选择的真菌毒素可以是烟曲霉毒素或烟曲霉毒素、白僵菌素、镰菌素C、镰刀菌酸的组合，以及它们的组合。
在实施方案中，丝状真菌可包含小于约10ppm的总真菌毒素含量，或小于约9ppm的总真菌毒素含量，或小于约8ppm的总真菌毒素含量，或小于约7ppm的总真菌毒素含量，或低于约6ppm的总真菌毒素含量，或低于约5ppm的总真菌毒素含量，或低于约4ppm的总真菌毒素含量，或低于约3ppm总真菌毒素含量，或低于约2ppm的总真菌毒素含量，或小于约1ppm的总真菌毒素含量，或小于约0.9ppm的总真菌毒素含量，或小于约0.8ppm的总真菌毒素含量，或小于约0.7ppm的总真菌毒素含量，或小于约0.6ppm的总真菌毒素含量，或者备选小于约百万分的任何十分之一(等于或小于10ppm)的总真菌毒素含量。
在实施方案中，丝状真菌可包含大于约15重量％支链氨基酸。
在实施方案中，丝状真菌的颗粒可以是粉状物的形式。粉状物可以但不必具有30-400微米的粒度。粉状物可以但不必具有不超过约400微米、不超过约390微米、不超过约380微米、不超过约370微米、不超过约360微米、不超过不超过约350微米、不超过约340微米、不超过约330微米、不超过约320微米、不超过约310微米、不超过约300微米、不超过约290微米、不超过约280微米、不超过约270微米、不超过约260微米、不超过约250微米、不超过约240微米、不超过约230微米、不超过约220微米、不超过约210微米，不超过约200微米，不超过约190微米，不超过约180微米，不超过约170微米，不超过约160微米，不超过约150微米，不超过约140微米微米，不超过约130微米，不超过约120微米，不超过约110微米、不超过约100微米、不超过约90微米、不超过约80微米、不超过约70微米、不超过约60微米、不超过约50微米、不超过约40微米，不超过约30微米，不超过约20微米，不超过约10微米，不超过约9微米，不超过约8微米，不超过约7微米，不超过约6微米，不超过约5微米，不超过约4微米，不超过约3微米，不超过约2微米，或不超过约1微米，或者备选不超过约1微米和约400微米之间的约任何整数微米。粒度可以是D10粒度、D25粒度、D50粒度、D75粒度、D90粒度或重均粒度中的任何一种或多种。在一些实施方案中，基本上所有的颗粒可具有至少约30微米且不超过约400微米的粒度。
在实施方案中，颗粒可具有约0.05mm至约500mm的颗粒长度，约0.03mm至约7mm的颗粒宽度和约0.03mm至约1.0mm的颗粒高度。颗粒可以但不需要具有均大于约0.02mm、大于约0.03mm、大于约0.04mm、大于约0.05mm、大于约0.06mm、大于约0.07mm、大于约0.08mm、大于约0.09mm、大于约0.10mm、大于约0.11mm、大于约0.12mm、大于约0.13mm、大于约0.14mm、大于约0.15mm、大于约0.16mm、大于约0.17mm、大于约0.18mm、大于约0.19mm或大于约0.20mm，或者备选至少约20微米的大于约任何整数微米的颗粒长度、颗粒宽度和颗粒高度。
在实施方案中，食物材料可以是丝状真菌的颗粒的液体分散体。液体分散体可以但不需要在氮气下生产。丝状真菌的颗粒的液体分散体可以但不需要稳定至少约1天。
在实施方案中，食物材料可以是严格素食的(vegan)。
在实施方案中，丝状真菌的颗粒可以是食物材料中存在的唯一蛋白质组分。
在实施方案中，丝状真菌的颗粒可包含所有必需的氨基酸。丝状真菌颗粒可以但不必包含至少一种选自由亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸组成的组的支链氨基酸。
在实施方案中，丝状真菌颗粒可以是非活的。
本发明的另一方面是提供酸奶类似物食物产品，其包含丝状真菌的颗粒，所述丝状真菌属于选自下组的目：毛霉菌目、黑粉菌目、红菇目、多孔菌目、伞菌目、盘菌目和肉座菌目，其中所述丝状真菌包含大于约40重量％蛋白质含量和小于约8重量％RNA含量。
在实施方案中，丝状真菌可以属于选自下组的科：毛霉菌科、黑粉菌科、猴头菌科、多孔菌科、灰树花菌科(Grifolaceae)、离褶伞科、球盖茹科、马勃科、伞菌科、侧耳科、块菌科、羊肚菌科、绣球菌科、泡头菌科、光茸菌科、丛赤壳科和虫草菌科。
在实施方案中，丝状真菌可以属于选自下组的种：少孢根霉、茭白黑粉菌、Hericululm erinaceus、宽鳞多孔菌、Grifola fondrosa、真姬菇、榆菇(榆耳)、香杏丽蘑、光帽鳞伞、大秃马勃、双孢子蘑菇、大球盖菇、砖红垂幕菇、刺芹侧耳、糙皮侧耳(珍珠菇)、糙皮侧耳columbinus变种(蓝蚝菇)、波氏块菌、羊肚菌、尖顶羊肚菌、梯棱羊肚菌、绣球菌(花椰菜)、Fusarium venenatum、菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)、肋状皱盘菌、粉红螺旋聚孢霉、北冬虫夏草、彩绒革盖菌、灵芝、绒状火菇、埃杜拉香菇、红平菇、糙皮侧、和白环蘑属种。
在实施方案中，丝状真菌可以是镰孢菌属物种。
在实施方案中，丝状真菌可以是Fusarium venenatum。
在实施方案中，丝状真菌可以是菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)。
在实施方案中，丝状真菌可具有选自下组的特征：(a)包含大于约45重量％蛋白质含量；(b)包含大于约50重量％蛋白质含量；(c)包含大于约55重量％蛋白质含量；(d)包含大于约60重量％蛋白质含量；(e)包括小于约5重量％RNA含量；(f)包含小于约4重量％RNA含量；(g)包含小于约3重量％RNA含量；(h)包含小于约2重量％RNA含量；以及a-d之一和e-h之一的组合。
在实施方案中，丝状真菌颗粒与水的比率范围可以为约1:10至约10:1。
在实施方案中，丝状真菌颗粒与水的比率可以选自下组：约1:3、约1:2、约1:1和约2:1。
在实施方案中，酸奶类似物食物产品可以进一步包含转化糖。
在实施方案中，酸奶类似物食物产品可以进一步包含增稠剂。
在实施方案中，丝状真菌的细胞可以是裂解的。
在实施方案中，酸奶类似物食物产品可进一步包含保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
在实施方案中，产品可以是严格素食的。
在实施方案中，丝状真菌颗粒可包含所有必需氨基酸。
在实施方案中，丝状真菌颗粒可以是唯一的蛋白质组分。
在实施方案中，丝状真菌颗粒可以是非活的。
在实施方案中，酸奶类似物食物产品可进一步包含凝乳酶(rennet)。凝乳酶可以但不需要来自选自下组的来源：动物来源、素食来源和微生物来源。凝乳酶可以但不需要选自下组：素食来源和微生物来源。
在实施方案中，产品可以不含乳固体。
在实施方案中，酸奶类似物食物产品可以进一步包含益生菌(probiotic)。
在实施方案中，酸奶类似物食物产品可以进一步包含酶促水(enzymatic water)。
本发明的另一个方面是提供泡沫材料，其包括丝状真菌生物垫的颗粒；和液相，其中所述泡沫材料的固体含量在约5％至约30％之间，并且其中所述泡沫是稳定的。液相可以但不需要是水相，即包含水。
在实施方案中，泡沫材料可以在其生产期间停止发泡过程后不立即自发塌陷。
在实施方案中，泡沫材料可以稳定至少约7天。
在实施方案中，泡沫材料可以具有至少约10％的起泡率(overrun)。
在实施方案中，丝状真菌生物垫可包含镰孢属物种。
在实施方案中，泡沫材料可以不含乳固体。
本发明的另一方面是提供包含泡沫材料的食物产品。
本发明的另一方面提供生物反应器，其包括容器；在容器内或容器表面上布置的至少一个膜，所述至少一个膜包含第一表面和第二表面；用于丝状真菌生长的原料，其接触所述至少一个膜的所述第一表面；和在所述至少一个膜的所述第一表面或所述第二表面上布置的丝状真菌接种物，其中培养所述生物反应器中的所述接种物后，在生物垫生长期后在所述至少一个膜的所述第二表面上形成所述丝状真菌的生物垫。如本文所用，除非另有说明，否则术语“膜”是指形成平面或膜并分隔两种环境并且具有穿过其中的孔，使得能够在两种环境之间交换流体的至少一部分的任何柔性或半柔性封闭或分离部件。
在实施方案中，容器可以是袋，其中所述至少一个膜的所述第一和第二表面是所述袋的至少一部分的第一表面和第二表面。
在实施方案中，原料可以经受对所述至少一个膜的所述第一表面和所述第二表面中的至少一个相对的所述原料侧赋予的正压或负压。
在实施方案中，生物反应器可进一步包含蓝细菌，其中所述蓝细菌提供氧气和碳中的至少一种以促进所述生物垫的生长。
在实施方案中，以下至少一项可以是真实的：i)所述生物垫的密度为至少约0.05克/立方厘米；和ii)干燥后的所述生物垫的密度为至少约0.01克/立方厘米。
在实施方案中，生物垫可包括至少一个层。
在实施方案中，生物垫可以具有至少约3千帕斯卡或至少约30克-力/平方厘米的拉伸强度。生物垫可以但不需要具有至少约100千帕斯卡或至少约1,020克-力/平方厘米的拉伸强度。
在实施方案中，至少一个膜可以包含选自下组的至少一种聚合物：聚丙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚酰胺、乙酸纤维素、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluorides)、混合纤维素酯、聚醚砜、聚乙烯和聚吡咯。
在实施方案中，至少一个膜可以包含选自下组的至少一种材料：聚丙烯织物、聚四氟乙烯织物和尼龙网滤器。
在实施方案中，至少一个膜可以包含玻璃纤维材料和多孔陶瓷材料中的至少一种。
在实施方案中，至少一个膜的平均孔径可以在约0.2μm至约25μm之间。至少一个膜的平均孔径可以但不需要在约5μm至约11μm之间。
在实施方案中，容器可以是封闭的并且基本上是气密的，其中所述容器封闭所述生物垫生长于其中的气体顶部空间。
在实施方案中，生物垫可以自发与所述至少一个膜分开。
在实施方案中，当从所述至少一个膜取出所述生物垫时，新的丝状真菌接种物可以保留在所述至少一个膜上。
在实施方案中，丝状真菌可以属于选自下组的目：毛霉菌目、黑粉菌目、红菇目、多孔菌目、伞菌目、盘菌目和肉座菌目。
在实施方案中，丝状真菌可以属于选自下组的科：毛霉菌科、黑粉菌科、猴头菌科、多孔菌科、灰树花菌科、离褶伞科、球盖茹科、马勃科、伞菌科、侧耳科、泡头菌科、光茸菌科、线虫草科、块菌科、羊肚菌科和虫草菌科。
在实施方案中，丝状真菌可以选自下组：菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)、Fusarium venenatum、少孢根霉、茭白黑粉菌、Hericululm erinaceus、宽鳞多孔菌、Grifola fondrosa、真姬菇、香杏丽蘑、光帽鳞伞、大秃马勃、双孢子蘑菇、大球盖菇、砖红垂幕菇、刺芹侧耳、波氏块菌、羊肚菌、尖顶羊肚菌、肋状皱盘菌、冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)和北冬虫夏草、彩绒革盖菌、灵芝、绒状火菇、埃杜拉香菇、红平菇、糙皮侧耳、Leucoagaricus holosericeus、Calvatia fragilis、龟裂秃马勃和多脂鳞伞。
在实施方案中，原料可以包含动物的粪便和动物的尿液中的至少一种。动物可以但不需要是人类。
在实施方案中，至少一个膜可以是单一复合膜，其中所述第一表面包含第一材料，并且所述第二表面包含第二材料。
在实施方案中，至少一个膜可以包含至少第一膜和第二膜，其中所述第一表面是所述第一膜的表面并且所述第二表面是所述第二膜的表面。第一膜和第二膜可以但不需要彼此物理接触
在实施方案中，生物反应器可以进一步包括选择性透气膜，其中将所述生物垫生长期间产生的第一气体选择性分离到所述选择性透气膜的第一侧上的气体顶部空间中。在生物垫生长期间产生的第二气体可以但不需要选择性分离到膜第二侧上的气体顶部空间中。在一些实施方案中，可以将液体原料中溶解或分散的，或者在其它情况下在膜的原料侧上布置的气体与原料选择性分开并且通到膜的相反侧。
本发明的另一方面是提供用于生产丝状真菌的生物垫的方法，该方法包括在生物反应器中接种丝状真菌，其中所述生物反应器包含：容器；至少一个在所述容器内或所述容器的表面上布置的膜，所述至少一个膜包含第一表面和第二表面，其中所述第一和第二表面中的任一个或两者适合于在其上接受所述丝状真菌的接种物；和用于丝状真菌生长的原料，其接触所述至少一个膜的所述第一表面。
在实施方案中，容器可以是袋，其中所述至少一个膜的所述第一表面和第二表面是所述袋的至少一部分的第一和第二表面。
在实施方案中，原料可以经受对所述至少一个膜的所述第一表面相对的所述原料侧赋予的正压或负压。正压或负压可以但不需要促进接种步骤。
在实施方案中，该方法可以进一步包括在所述生物反应器中提供蓝细菌，其中所述蓝细菌提供氧气和碳中的至少一种以促进所述生物垫的生长。
在实施方案中，以下至少一项可以是真实的：i)收获后所述生物垫的密度为至少约0.6克/立方厘米；和ii)收获和干燥后所述生物垫的密度为至少约0.1克/立方厘米。
在实施方案中，生物垫可以包括至少一个层。
在实施方案中，在收获步骤期间或之后，所述生物垫可以具有至少约3千帕斯卡或至少约30克-力/平方厘米的拉伸强度。在收获步骤期间或之后，生物垫可以但不需要具有至少约100千帕斯卡或至少约1,020克-力/平方厘米的拉伸强度。
在实施方案中，至少一个膜可以包含选自下组的至少一种聚合物：聚丙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚酰胺、乙酸纤维素、聚偏二氟乙烯、混合纤维素酯、聚醚砜、聚乙烯和聚吡咯。
在实施方案中，至少一个膜可以包含选自下组的至少一种材料：聚丙烯织物、聚四氟乙烯织物和尼龙网滤器。
在实施方案中，膜可以包含玻璃纤维材料和多孔陶瓷材料中的至少一种。
在实施方案中，至少一个膜的平均孔径可以在约0.2μm至约25μm之间。至少一个膜的平均孔径可以但不需要在约5μm至约11μm之间。
在实施方案中，容器可以是封闭的并且基本上是气密的，其中所述容器封闭所述生物垫生长于其中的气体顶部空间。
在实施方案中，生物垫可以自发与所述至少一个膜分开。
在实施方案中，方法可以进一步包括收获生物垫，其中当从所述至少一个膜取出所述生物垫时，新的丝状真菌接种物保留在所述至少一个膜上。
在实施方案中，丝状真菌可以属于选自下组的目：毛霉菌目、黑粉菌目、红菇目、多孔菌目、伞菌目、盘菌目和肉座菌目。
在实施方案中，丝状真菌可以属于选自下组的科：毛霉菌科、黑粉菌科、猴头菌科、多孔菌科、灰树花菌科、离褶伞科、球盖茹科、马勃科、伞菌科、侧耳科、泡头菌科、光茸菌科、块菌科、羊肚菌科和虫草菌科。
在实施方案中，丝状真菌可以选自下组：菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)、Fusarium venenatum、少孢根霉、茭白黑粉菌、Hericululm erinaceus、宽鳞多孔菌、Grifola fondrosa、真姬菇、香杏丽蘑、光帽鳞伞、大秃马勃、双孢子蘑菇、大球盖菇、砖红垂幕菇、刺芹侧耳、波氏块菌、羊肚菌、尖顶羊肚菌、肋状皱盘菌、冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)和北冬虫夏草。
在实施方案中，原料可包含动物的粪便和动物的尿液中的至少一种。动物可以但不需要是人类。
在实施方案中，至少一个膜可以是单一复合膜，其中所述第一表面包含第一材料，并且所述第二表面包含第二材料。
在实施方案中，至少一个膜可包括至少第一膜和第二膜，其中第一表面是第一膜的表面，并且第二表面是第二膜的表面。第一膜和第二膜可以但不需要彼此物理接触。
在实施方案中，生物反应器可以进一步包括选择性透气膜，其中将所述生物垫生长期间产生的第一气体选择性分离到所述选择性透气膜的第一侧上的气体顶部空间中。在生物垫生长期间产生的第二气体可以但不需要选择性分离到膜第二侧上的气体顶部空间中。
本发明的另一个方面是提供用于生产淡水的方法，其包括：在生物反应器中接种丝状真菌，其中所述生物反应器包含：容器；和用于丝状真菌生长的原料；培养所述丝状真菌以在所述原料的表面和所述生物反应器的膜的表面的至少一个上形成生物垫，其中所述丝状真菌在所述生物垫的形成或生长期间产生水作为代谢副产物；和收集由所述生物垫的形成或生长产生的水。
在实施方案中，原料可包含动物的粪便和动物的尿液中的至少一种。动物可以但不需要是人类。
在实施方案中，该方法可以进一步包括将收集的水再循环至生物反应器。
在实施方案中，该方法可以进一步包括制备包含所收集的水的原料。该方法可以但不需要进一步包括将包含收集的水的制备的原料再循环至生物反应器。
本发明的另一个方面是提供用于生产气体的方法，该方法包括：在生物反应器中接种丝状真菌，其中所述生物反应器包含：容器；和用于丝状真菌生长的原料；培养所述丝状真菌以在所述原料的表面和所述生物反应器的膜的表面的至少一个上形成生物垫，其中所述丝状真菌在所述生物垫的生长期间产生气体作为代谢副产物；和收集由所述生物垫的生长产生的气体。
在实施方案中，气体可以选自下组：氨、铵种类、氢气和挥发性酯。
本发明的一个方面是提供一种生产丝状真菌生物垫的方法，包括(a)将有效量的至少一种丝状真菌的细胞接种到生长培养基的第一等分试样以产生接种的生长培养基；(b)将接种的生长培养基温育第一时间以产生初始生物垫；(c)取出生长培养基的第一等分试样的至少一部分并加入生长培养基的第二等分试样以提供更新的生长培养基；并且(d)将更新的生长培养基温育第二时间以产生成品生物垫。
在实施方案中，成品生物垫的干质量密度可以是至少约75克/升。
在实施方案中，生物垫可包含大于约40wt％的蛋白质和小于约8wt％的RNA。
在实施方案中，至少一个丝状真菌可以属于选自下组的目：黑粉菌目、红菇目、多孔菌目、伞菌目、盘菌目和肉座菌目。
在实施方案中，至少一个丝状真菌可以属于选自下组的科：黑粉菌科、猴头菌科、多孔菌科、灰树花菌科、离褶伞科、球盖茹科、马勃科、伞菌科、侧耳科、泡头菌科、光茸菌科、块菌科、羊肚菌科和虫草菌科。
在实施方案中，至少一个丝状真菌可以选自下组：菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)、Fusarium venenatum、茭白黑粉菌、Hericululm erinaceus、宽鳞多孔菌、Grifolafondrosa、真姬菇、香杏丽蘑、光帽鳞伞、大秃马勃、双孢子蘑菇、大球盖菇、砖红垂幕菇、刺芹侧耳、波氏块菌、羊肚菌、尖顶羊肚菌、肋状皱盘菌、冬虫夏草和北冬虫夏草。
在实施方案中，成品生物垫可具有选自下组的特征：(a)包含大于约45重量％蛋白质含量；(b)包含大于约50重量％蛋白质含量；(c)包含大于约55重量％蛋白质含量；(d)包含大于约60重量％蛋白质含量；(e)包括小于约5重量％RNA含量；(f)包含小于约4重量％RNA含量；(g)包含小于约3重量％RNA含量；(h)包含小于约2重量％RNA含量；以及(i)a-d之一和e-h之一的组合。
在实施方案中，成品生物垫可包含小于约10ppm的选自下组的真菌毒素：黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、烟曲霉毒素B1、烟曲霉毒素B2、烟曲霉毒素B3、赭曲毒素A、瓜萎镰菌醇、脱氧瓜萎镰菌醇、乙酰基脱氧瓜萎镰菌醇、镰刀菌烯酮X、T-2毒素、HT-2毒素、新茄镰孢菌醇、蛇形菌素、玉米赤霉烯酮、白僵菌素、镰菌素C、镰刀菌酸及它们的任意组合。
在实施方案中，成品生物垫可包含小于约10ppm总真菌毒素含量。
在实施方案中，成品生物垫可包含小于约5ppm总真菌毒素含量。
在实施方案中，成品生物垫可包含大于约15wt.％支链氨基酸。
本发明的另一个方面提供了至少一种丝状真菌的生物垫，其具有至少约75克/升的干质量密度。
在实施方案中，生物垫可以包含大于约40wt％蛋白质和小于约8wt％RNA。
在实施方案中，至少一个丝状真菌可以属于选自下组的目：毛霉菌目、黑粉菌目、红菇目、多孔菌目、伞菌目、盘菌目和肉座菌目。
在实施方案中，至少一个丝状真菌可以属于选自下组的科：毛霉菌科、黑粉菌科、猴头菌科、多孔菌科、灰树花菌科、离褶伞科、球盖茹科、马勃科、伞菌科、侧耳科、泡头菌科、光茸菌科、块菌科、羊肚菌科、绣球菌科、丛赤壳科、生赤壳科和虫草菌科。
在实施方案中，丝状真菌可以属于选自下组的种：少孢根霉、茭白黑粉菌、Hericululm erinaceus、宽鳞多孔菌、Grifola fondrosa、真姬菇、榆菇(榆耳)、香杏丽蘑、光帽鳞伞、大秃马勃、双孢子蘑菇、大球盖菇(Stropharia rugosoannulata)、砖红垂幕菇(Hypholoma lateritium)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)(珍珠菇)、糙皮侧耳columbinus变种(蓝蚝菇(Blue oyster)、波氏块菌(Tuberborchii)、羊肚菌(Morchella esculenta)、尖顶羊肚菌(Morchella conica)、梯棱羊肚菌(Morchella importuna)、绣球菌(Sparassis crispa)(花椰菜)、Fusarium venenatum、菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)、肋状皱盘菌(Disciotis venosa)、和北冬虫夏草、彩绒革盖菌(Trametes versicolor)、灵芝(Ganoderma lucidum)、绒状火菇(Flammulinavelutipes)、埃杜拉香菇(Lentinula edodes)、红平菇(Pleurotus djamor)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、和白环蘑属种(Leucoagaricus spp)。
在实施方案中，生物垫可具有选自下组的特征：(a)包含大于约45重量％蛋白质含量；(b)包含大于约50重量％蛋白质含量；(c)包含大于约55重量％蛋白质含量；(d)包含大于约60重量％蛋白质含量；(e)包括小于约5重量％RNA含量；(f)包含小于约4重量％RNA含量；(g)包含小于约3重量％RNA含量；(h)包含小于约2重量％RNA含量；以及(i)a-d之一和e-h之一的组合。
在实施方案中，生物垫可包含小于约10ppm的选自下组的真菌毒素：黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、烟曲霉毒素B1、烟曲霉毒素B2、烟曲霉毒素B3、赭曲毒素A、瓜萎镰菌醇、脱氧瓜萎镰菌醇、乙酰基脱氧瓜萎镰菌醇、镰刀菌烯酮X、T-2毒素、HT-2毒素、新茄镰孢菌醇、蛇形菌素、玉米赤霉烯酮、白僵菌素、镰菌素C、镰刀菌酸及它们的任意组合。
在实施方案中，成品生物垫可包含小于约10ppm总真菌毒素含量。
在实施方案中，成品生物垫可包含小于约5ppm总真菌毒素含量。
在实施方案中，成品生物垫可包含大于约15wt.％支链氨基酸。
在实施方案中，生物垫可以通过本文中描述的方法产生。
本发明的另一方面是提供一种生产丝状真菌生物垫的方法，包括将丝状真菌接种在生物反应器中，其中所述生物反应器包括容器；布置在容器的表面内或表面上的至少一个网状支架，该至少一个网状支架包括第一表面和第二表面，其中第一和第二表面中的一个或两个适于在其上接收丝状真菌的接种物；和用于丝状真菌生长的原料，接触网状支架的第一表面。
在实施方案中，网状支架可包括尼龙材料。
本发明的另一个方面提供了培养的食物产品，其包含属于选自下组的目的丝状真菌的颗粒：毛霉菌目、黑粉菌目、红菇目、多孔菌目、伞菌目、盘菌目和肉座菌目，其中丝状真菌包含大于约40wt.％蛋白质含量和小于约8wt％RNA含量；和微生物食物培养物。
在实施方案中，微生物食物培养物可以包含乳酸菌。
本发明的另一个方面提供了用于制备培养的食物产品的方法，其包括给微生物食物培养物接种丝状真菌的颗粒，其中丝状真菌属于选自下组的目：毛霉菌目、黑粉菌目、红菇目、多孔菌目、伞菌目、盘菌目和肉座菌目，其中丝状真菌包含大于约40wt.％蛋白质含量和小于约8wt.％RNA含量。
在实施方案中，微生物食物培养物可以包含乳酸菌。
在实施方案中，本文描述的培养的食物产品可以通过本文所述的制备培养的食物产品的方法制备。
附图说明
图1.在营养物培养基中镰孢菌菌株MK7生物垫的生长，所述营养物培养基在最初的4天生物垫生长阶段后每天更新。
图2.液体营养物培养基中形成的3厘米厚的镰孢菌菌株MK7生物垫，所述液体营养物培养基每天更新(第4天后)。显示了生物垫下面的尼龙网筛，并且用于将生物垫提起并移动到新鲜培养基中。
图3.连续流系统，其设计用于连续供给镰孢菌菌株MK7生物垫生长并从培养基中除去营养物。从接种时间起生长7天后，通道中显示生物垫。
图4.从接种时间起生长10天(连续流下6天+静止/静态条件下4天)后生物垫生长。
图5.生物垫的半连续生产，显示(A)在第12天时最成熟的生物垫部分的取出。在托盘下端收获最成熟的生物垫的1/3之后，剩余的生物垫沿箭头方向物理向下移动，直到生物垫的边缘接触到托盘的末端(B)。移动生物垫在托盘上端创建新的开放空间，在那里形成新的生物垫。
图6.使用半连续生产方法随时间累积生产生物质。虚线是第5天到第19天的线性回归线(y＝0.57x–1.52，r2＝0.973)。误差棒是三个重复托盘的平均值的标准偏差。小于数据点符号时的误差棒不可见。
图7.生物垫的连续生产，右侧显示生物垫的最成熟部分的取出。在托盘右侧连续收获最成熟的生物垫时，在托盘的左端创建新的开放空间，使新的生物垫能够形成。托盘中的液体培养基可以根据需要或连续进行补充和/或增加。
图8.用UVB光照射4小时后镰孢菌菌株MK7生物膜的橙色色素沉着(右侧的两个切下的盘)。左侧显示了来自未照射的对照生物垫的两个切下的盘。
图9.使用具有甘油、玉米淀粉和玉米浆的MK7-1培养基(描述于PCT/US2017/020050中)产生的4日龄镰孢菌菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)生物垫的场发射扫描电子显微术。图像A、B和C显示了通过乙醇清洗除去胞外基质(ECM)的生物垫。A)具有气生菌丝的生物垫的顶表面的视图。B)致密底层的横截面，箭头描绘层。通过用剃须刀切割生物垫创建横截面视图。生物垫的底部显示在图像的左下角，而致密底层上方的较差粘附的过渡层显示在右上角。C)生物垫的底面的视图。D)具有适当位置的ECM(即未用乙醇清洗除去ECM)的生物垫的底部表面的视图。
图10.在甘油、淀粉和玉米浆上培养的生物垫的透射光显微镜图像(100x)。气生菌丝层左侧的图像揭示了细丝的占优势的近垂直方向。右图显示了致密的底层和相邻的过渡层。
图11.使用公开的方法生产的生物垫。A：灵芝(Reishi mushroom)；B：珍珠蚝菇(Pearl Oyster mushroom)；C：蓝蚝菇(Blue Oyster mushroom)；D：花椰菜蘑菇(Cauliflower mushroom)；E：榆菇(Elm oyster mushroom)；F：大秃马勃菇(GiantPuffball mushroom)。
图12.当细胞附着到可容易获得氧气的透气膜时，在包囊的反应器中开始生物膜的生长。随时间，生物垫向下生长，并最终充满反应器的空间，消耗所有液体和营养物。
图13.在静态条件下在培养皿中在五天中培养的镰孢菌菌株MK7生物垫，该培养皿覆盖有由(A)-(C)聚丙烯和(D)聚碳酸酯构建的半透膜。基本上没有游离液体留在培养皿中，并且所有营养物掺入生物垫中。反应器的空隙/液体体积基本上充满生物垫。
图14.通过透气膜与液体培养基分开的附着袋用于供应和捕获气体。集成的多功能膜允许氧气进入和CO2和其他产生气体的外出。在下部液体区室(黄色)中培养的真菌生物质将原料和营养物转化为生物垫，随着其生长，该生物垫充满区室。通过打开反应器封闭系统(例如
Figure GDA0003479952310000161
型)并从袋中取出，可以容易收获致密的固结生物垫。
图15.基础反应器(1)。显示了具有共用壁/挡板(9)、前阀(6)和后阀(8)和透气膜(2)的多个通道(4)。
图16.具有单个气体收集室(14)的基本密闭反应器(1)。
图17.具有带通道气体收集室(15,20)的基本密闭反应器(1)。
图18.基本密闭反应器(1)，其具有带通道的气体收集室(15)，该室具有气体特异性通道(30，40)，所述气体特异性通道具有气体特异性可渗透膜(2，50)。
图19.基本的密闭反应器(1)，其具有圆柱形通道(4)、壁/挡板(9)、前阀(6)和后阀(8)和透气膜(2)。
图20.用丝状真菌制成的严格素食乳的10-1000x稀释样品中的折射率、密度和粒度分析。
图21.严格素食乳的光学显微镜下的结构。
图22.严格素食乳样品的粘度对剪切速率的图。
图23.各种生物反应器配置的一般示意图。
图24.生物反应器配置“1”的密封实施方案的图。
图25.生物反应器配置“4”的密封实施方案的图。
图26.袋式反应器的生物垫生长过程。
图27.生物反应器配置“4”的密封实施方案的图。
图28.使用“生物膜”的生物反应器的图。
图29.包括光合蓝细菌的生物反应器的示例性示意图。
图30.原料比较测试中产生的生物垫的图。
图31.连续补料反压消除生物反应器的图。
图32.膜袋生物膜反应器中生物垫生长的图。
图33.尼龙网滤膜的图。
图34.在光照和黑暗条件下生长的生物垫的比较。
图35A.膜包囊生物反应器(MEBR)的图示。
图35B.图35A的插图，显示了膜包囊生物反应器的详情。
图36.具有和没有更新生长培养基的盘中的生物垫生长速率的图示。
发明详述
如本文所用，除非另有说明，否则术语“生物垫”是指包含交织的菌丝丝网络的丝状真菌组织的粘性物质。生物垫当此处使用该术语时可以但不必通过以下一种或多种表征：约50至约200克/升之间的密度、约5wt％至约20wt％之间的固体含量以及足够的拉伸强度从生长培养基的表面基本完整地提升。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“细胞外基质”是指至少部分地围绕生物垫中的丝状真菌结构并且保护、支持和/或隔离生物垫的真菌菌丝体免受周围环境影响的细胞外材料。细胞外基质当此处使用该术语时通常可以包括各种大分子，包括但不一定限于蛋白聚糖(例如硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素)、非蛋白聚糖多糖(例如透明质酸)和蛋白质(例如胶原蛋白、弹性蛋白)。
食用丝状真菌可单独或掺入食物中用作营养物来源，例如对于蛋白质。
虽然在食物中使用担子菌纲(Basidiomycota)和子囊菌纲(Ascomycota)丝状真菌的子实体，但只有少数产品主要包含担子菌纲或子囊菌纲丝状真菌的营养菌丝体。这部分是由于菌丝体通常在地下或与其生长的物质在很大程度上不可分离。
然而，在特定条件下，丝状真菌可以在厌氧、微需氧或需氧条件或其组合下通过表面发酵形成真菌生物垫。在此，丝状真菌生物垫主要以菌丝体、菌丝体片段、菌丝、菌丝片段的形式包含真菌种类和/或其菌株和/或后代，并在较小程度上包含分生孢子、微分生孢子、大分生孢子或它们的任何以及所有组合，并且在某些情况下还可以包含分生孢子器、厚壁孢子和胞外基质的部分。
通常，丝状真菌生物垫主要由菌丝体组成；也就是说，一个复杂的交织的营养性菌丝细丝网络。生物垫内未断裂细丝的平均长度通常至少为0.1mm，例如在0.1mm至100cm之间，或者由1mm至100cm之间的任何两个整数定义的任何范围。在一些实施方案中，平均长度可以是至少0.1mm、0.25mm、0.5mm、、1.0mm、1.4mm 1.6mm、1.7mm、1.8mm、2mm、2.5mm、5mm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm、10cm、15cm、20cm、25cm、30cm、35cm、40cm、45cm、50cm、55cm、60cm、65cm、70cm、75cm、80cm、85cm、90cm、85cm、或100cm或之间的任何数字。
本文描述了食物材料，其包含食用丝状真菌的颗粒，特别是在被加工成颗粒之前作为生物垫培养的那些。
适用于本发明的丝状真菌(作为生物垫或作为食物材料中的颗粒)可以选自以下门或部(division)：接合菌亚纲(zygomycota)、glomermycota、壶菌亚门(chytridiomycota)、担子菌纲或子囊菌纲。门(或部)担子菌纲尤其包括伞菌目(Agaricales)、红菇目(Russulales)、多孔菌目(Polyporales)、黑粉菌目(Ustilaginales)，并且门子囊菌纲尤其包括盘菌目(Pezizales)和肉座菌目(Hypocreales)；并且接合菌亚纲特别包括毛霉菌目。本发明的食用丝状真菌的颗粒属于选自黑粉菌目、红菇目、多孔菌目、伞菌目、盘菌目、肉座菌目和毛霉菌目。
在一些实施方案中，黑粉菌目的丝状真菌选自黑粉菌科(Ustilaginaceae)。在一些实施方案中，多孔菌目的丝状真菌选自猴头菌科(Hericiaceae)。在一些实施方案中，多孔菌目的丝状真菌选自多孔菌科(Polyporaceae)或灰树花菌科(Grifolaceae)。在一些实施方案中，伞菌目的丝状真菌选自离褶伞科(Lyophyllaceae)、球盖茹科(Strophariaceae)、马勃科(Lycoperdaceae)、伞菌科(Agaricaceae)、侧耳科(Pleurotaceae)、泡头菌科(Physalacriaceae)或光茸菌科(Omphalotaceae)。在一些实施方案中，盘菌目的丝状真菌选自块菌科(Tuberaceae)或羊肚菌科(Morchellaceae)。在一些实施方案中，毛霉菌目的丝状真菌选自毛霉菌科。。
在一些实施方案中，丝状真菌可以选自下组：镰刀菌属、曲霉属、木霉属和根霉属。
丝状真菌的物种的例子包括但不限于：茭白黑粉菌(Ustilago esculenta)、Hericululm erinaceus、宽鳞多孔菌(Polyporous squamosus)、Grifola fondrosa、真姬菇(Hypsizygus marmoreus)、榆菇(榆耳(elm oyster))、香杏丽蘑(Calocybe gambosa)、光帽鳞伞(Pholiota nameko)、大秃马勃(Calvatia gigantea)、双孢子蘑菇(Agaricusbisporus)、大球盖菇(Stropharia rugosoannulata)、砖红垂幕菇(Hypholomalateritium)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)(珍珠菇)、糙皮侧耳columbinus变种(蓝蚝菇)、波氏块菌(Tuber borchii)、羊肚菌(Morchellaesculenta)、尖顶羊肚菌(Morchella conica)、梯棱羊肚菌(Morchella importuna)、绣球菌(Sparassis crispa)(花椰菜)、Fusarium venenatum、菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)、肋状皱盘菌(Disciotis venosa)、北冬虫夏草(Cordyceps militaris)、灵芝(Ganodermalucidum,reishi)、绒状火菇(Flammulina velutipes)、埃杜拉香菇(Lentinula edodes)、冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)。另外的例子包括但不限于变色栓菌(Trametesversicolor)、撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)、Pholiota gigantea、Leucoagaricusholosericeus、粉红平菇(Pleurotus djamor)、Calvatia fragilis、龟裂秃马勃(Handkeautriformis)和少孢根霉(Rhizopus oligosporus)。
在一些实施方案中，丝状真菌是镰孢菌属物种。在一些实施方案中，丝状真菌是镰孢菌菌株MK7(ATCC PTA-10698，保藏在美国典型培养物保藏中心，1081UniversityBoulevard，Manassas，弗吉尼亚州，美国)。先前报道菌株MK7是尖孢镰孢菌菌株。然而，它随后被鉴定为不是尖孢株。在一些实施方案中，丝状真菌是镰孢菌菌株Fusarium venenatum。
如本文中详细描述的，本发明的丝状真菌具有高得令人惊讶的蛋白质含量。应当指出，天然或在野外或通过现有技术方法培养的丝状真菌不拥有此类高的蛋白质含量，而如本文所公开的生长或培养的丝状真菌具有高蛋白质含量，特别是比自然界中实现或者对于一些真菌通过先前的发酵方法实现的含量更高的蛋白质含量。例如，本文所述的丝状真菌的蛋白质含量是指作为根据本公开的生物垫中培养的丝状真菌的蛋白质含量。因此，本发明的食物材料基于材料的丝状真菌成分而具有高蛋白质含量，而不需要和/或不存在来自非丝状真菌源的蛋白质含量。因此，在各种实施方案中，本发明的食物材料不含或没有来自非丝状真菌源的蛋白质含量。
在一些实施方案中，丝状真菌包含至少约30重量％蛋白质含量。除非本文另有说明，否则生物垫或丝状真菌颗粒的组分例如蛋白质、RNA或脂质的百分比以干重百分比为基础给出。例如，可以将生物垫在99℃干燥2天，进一步风干几天，最后，生物垫预计含有约5重量％或更小的水分，例如小于4重量％，小于3重量％，小于2重量％，小于1重量％，小于0.5重量％，小于0.1重量％水分。干燥的生物垫样品中的总蛋白质含量可以使用总氮分析方法进行测量以估算蛋白质。
在一些实施方案中，丝状真菌包含至少约30％、至少约31重量％、至少约32重量％、至少约33重量％、至少约34重量％、至少约35重量％、至少约36重量％、至少约37重量％、至少约38重量％、至少约39重量％、至少约40重量％、至少约41重量％、至少约42重量％、至少约43重量％、至少约44重量％、至少约45重量％、至少约46重量％、至少约47重量％、至少约48重量％、至少约49重量％、至少约50重量％、至少约51重量％、至少约52重量％、至少约53重量％、至少约54重量％、至少约55重量％、至少约56重量％、至少约57重量％、至少约58重量％、至少约59重量％、至少约60重量％蛋白质含量、至少约61重量％、至少约62重量％、至少约63重量％、至少约64重量％、至少约65重量％、至少约66重量％、至少约67重量％、至少约68重量％、至少约69重量％、至少约70重量％蛋白质含量、至少约71重量％、至少约72重量％、至少约73重量％、至少约74重量％、至少约77重量％、至少约76重量％、至少约77重量％、至少约78重量％、至少约79重量％、或至少约80重量％蛋白质含量。或者，在本发明的实施方案中，丝状真菌可包含在范围为30重量％至80重量％之间或范围为30重量％-80重量％之间的任何整数百分比的蛋白质。参见实施例21-23。
本发明的丝状真菌还具有低得令人惊讶的RNA含量。食物中的大量RNA已显示对健康或生理有不利影响。例如，嘌呤高(RNA中存在)的饮食与痛风的发生有关。如本文公开的那样生长或培养的丝状真菌本质上具有低RNA含量，并且不需要额外或补充的处理来修饰或降低RNA含量。因此，在各种实施方案中，本发明的食物材料不含丝状真菌组分，其具有显著水平的RNA和/或为了修饰或降低组分或食物材料的RNA含量而进行了处理。在其他实施方案中，将认识到可以处理具有含有天然低量RNA的丝状真菌组分的本发明食物材料，例如通过加热或蒸热以灭活真菌，或通过也将减少或降解RNA的其他处理(如果存在的话)。此类材料可表征为具有在任何此类RNA减少或降解之前或没有任何此类RNA减少或降解的情况下具有如本文所述的低RNA含量的丝状真菌组分。
在一些实施方案中，丝状真菌包含小于约8重量％RNA含量。重量％RNA含量以干重为基础给出。例如，可以使用嘌呤分析方法测量干燥的生物垫样品中的总RNA含量。参见实施例24。
在一些实施方案中，丝状真菌中的RNA含量是小于约8.0重量％RNA含量、小于约7重量％RNA含量、小于约6重量％RNA含量、小于约5.0重量％RNA含量、小于约4重量％RNA含量、小于约3重量％RNA含量、小于约2重量％RNA含量、或小于约1重量％RNA含量或备选小于任何增量0.1-wt％增量、小于约8.0重量％或者，在本发明的实施方案中，丝状真菌可以包含范围为0.5重量％-8重量％或其亚范围的RNA。
在一些实施方案中，丝状真菌包含高蛋白质含量与低RNA含量的组合，如上文所述。例如，在一些实施方案中，丝状真菌可以包含大于45重量％蛋白质，大于50重量％蛋白质、大于55重量％蛋白质、或大于60重量％蛋白质且小于约8重量％RNA含量、小于约5重量％RNA含量、小于约4重量％RNA含量、小于约3重量％RNA含量或小于约2重量％RNA含量。在其它实施方案中，丝状真菌可以具有与上文描述的RNA含量结合的上文描述的任何蛋白质含量。
本发明的丝状真菌和相关的食物材料也可以表征为具有低得令人惊讶的真菌毒素含量。已知的真菌毒素包括黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、烟曲霉毒素B1、烟曲霉毒素B2、烟曲霉毒素B3、赭曲毒素A、瓜萎镰菌醇、脱氧瓜萎镰菌醇、乙酰基脱氧瓜萎镰菌醇、镰刀菌烯酮X、T-2毒素、HT-2毒素、新茄镰孢菌醇、蛇形菌素、白僵菌素、镰孢素C、镰刀菌酸和玉米赤霉烯酮。在一些实施方案中，本发明的丝状真菌、生物垫或食物材料中的真菌毒素的总量和/或以上列出的真菌毒素的任一种或子集的总量小于约10ppm。在其他实施方案中，真菌毒素的总量和/或以上列出的真菌毒素的任一种或子集的总量小于约9ppm，小于约8ppm，小于约7ppm，小于约6ppm，小于约5ppm，小于约4ppm，小于约3ppm，小于约2ppm、小于约1ppm、小于约0.9ppm、小于约0.8ppm、小于约0.7ppm、或小于约0.6ppm。参见实施例25。
本发明的丝状真菌还具有高得令人惊讶的分支氨基酸含量。分支氨基酸指亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，分支氨基酸的总量是大于约10重量％、大于约11重量％、大于约12重量％、大于约13重量％、大于约14重量％、大于约15重量％、大于约16重量％、大于约17重量％、大于约18重量％、大于约19重量％、大于约20重量％、大于约21重量％、大于约22重量％、大于约23重量％、大于约24重量％、大于约25重量％、大于约26重量％、大于约27重量％、大于约28重量％、大于约29重量％、大于约30重量％。对于示例性菌株MK7和Fusarium venenatum生物垫的分支氨基酸的含量，参见实施例23。实施例23还显示了两种真菌的脂肪酸概况。
生长和收获丝状真菌生物垫
丝状真菌生物垫的生长可以通过表面发酵完成。这涉及用丝状真菌细胞接种含碳源和氮源的液体培养基。合适的碳源是糖(例如蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、日本稀有糖等)、糖醇(例如甘油，多元醇等)、淀粉(例如玉米淀粉等)、淀粉衍生物(例如麦芽糊精、环糊精、葡萄糖浆、水解物和改性淀粉)、淀粉水解物、氢化淀粉水解物(HSH；例如氢化葡萄糖浆、麦芽糖醇浆、山梨糖醇浆等)、木质纤维素纸浆或原料(例如甜菜纸浆、农业纸浆、木材纸浆、干酒糟、啤酒废物等)、玉米浆、酸乳清、甜乳清、乳浆、小麦浆，碳水化合物、食品废物、橄榄油加工废物、来自木质纤维素材料的水解产物和/或它们的组合。丝状真菌细胞产生位于生长培养基表面上的生物垫。
根据本发明的液体生长培养基的特征可以在于期望的或预选的碳与氮的质量比(“C:N比”)。通常，根据本发明的液体培养基的C:N比可以具有介于约1:1和约50:1之间，或介于约2.5:1和约30:1之间，或介于约5:1和约10:1，或约1:1和50:1之间的任何比率和约1:1和50:1之间的任何其他比率。作为非限制性实例，根据本发明的生长培养基可具有约2.5:1、约5:1、约7.5:1、约10:1、约12.5:1、约15:1,约17.5:1、约20:1、约22.5:1、约25:1、约27.5:1、约30:1、约32.5:1、约35:1、约37.5:1、约40:1、约42.5:1、约45:1、约47.5:1或约50:1的C:N比，或者约X:2形式的任何比率，其中X是介于约2和约100之间的整数。
可以用包含浮游性丝状真菌细胞、分生孢子，小分生孢子或大分生孢子或孢子或子实体的接种物进行接种。在许多情况下，特别是对于子囊菌纲真菌，可以用包含浮游性丝状真菌细胞、分生孢子，小分生孢子或大分生孢子的接种物接种生长培养基。理想地，接种物的细胞漂浮在生长培养基的表面上，诸如具有高脂质含量的那些细胞，并导致增加的生长速率。浸没在生长培养基中的细胞或细胞团可以对漂浮在表面上的细胞及它们形成的生物垫产生负面影响。具体地，源自含有大量成团的浸没细胞的生长培养基的生物垫通常会褪色，并且往往无法培养均匀致密的垫。
在一些实施方案中，接种物可包含孢子。例如，在一个实施方案中，使用约2cc悬浮于来自孢子注射器(例如，MycoDirect,Huntley,IL)的去离子水中的无菌孢子接种小的Pyrex托盘中的约75mL生长培养基。或者，使用标准无菌条件将1cc悬浮于来自孢子注射器的去离子水中的孢子铺在具有麦芽提取物琼脂培养基+CF(30g干麦芽提取物、20g琼脂、1000mL水+0.01％氯霉素)的容器上。用石蜡膜密封容器，并在室温下温育直至菌丝体完全覆盖琼脂表面。然后将切成楔形的宽度约2cm的来自琼脂制备物的菌丝体区段切成可能的最小的大小，然后转移到有生长培养基的管中。密封液体培养管，在室温温育，用手摇动或通过机械手段摇动(即连续摇动或连续搅拌釜反应器)约1分钟，每天至少五(5)次，以使菌丝体尽可能多分解。将液体培养物温育直至视觉混浊，通常三天或更多天。然后将液体培养物用于以总生长培养基体积的10％或15％接种托盘中的生长培养基。
在一些实施方案中，接种物可包含子实体。例如，在一些实施方案中，担子菌纲子实体用于产生接种物以起始丝状生物垫。在某些情况下，通过以下方式制备接种物：(a)对子实体进行表面灭菌，例如在5％的漂白剂溶液中灭菌；(b)用无菌培养基冲洗；(c)在无菌条件下研磨成小于5mm长的聚集体或大于5mm的聚集体，取决于最终用途，(d)对经研磨的蘑菇生物质进行表面灭菌处理，例如在5％的漂白剂溶液中灭菌，然后再次用无菌培养基冲洗。将5克经研磨的经表面灭菌的子实体生物质直接用作接种物。在其他情况下，使用源自子实体的纯培养物。在此情况下，将约3mm3的子实体部分放在含有0.01％氯霉素的琼脂培养基上，并在室温下温育。生长2-5天后，将菌丝转移到新鲜的琼脂+氯霉素培养基上，再培养3-7天。通过提取和纯化DNA(FastDNA Spin Kit，MP Biomedicals)，对18S rRNA序列和/或ITS区域进行测序，并使用Blast(NCBI数据库)对该序列进行系统发育分类，确认培养物的纯度。确认后，使用菌丝接种50mL无菌液体培养基，并以185rpm搅拌/旋转约5天，然后以约7.5％接种物与92.5％液体培养基的比率用作接种物。
虽然可以使用多种不同的培养基，但某些培养基对于丝状真菌生物垫的生长比其它培养基表现得更好，作为非限制性实例，Hansen培养基(每升＝1.0g蛋白胨、0.3gKH2PO4·7H2O、2.0g MgSO4·7H2O 5.0g的葡萄糖，C:N比率为26.9)，其不产生完整的粘合生物垫，而起极好作用的那些培养基包括MK7A、MK7-1、MK7-3(均在WO 2017/151684中进行了描述)，以及下面介绍的培养基。实施例12中也描述了这些。
麦芽培养基001(C:N比率为19.1)
成分 量 等级
Light Pilsner麦芽 40.0g 食物
蛋白胨 4.0g 研究
酵母提取物粉 1.2g 研究
芥花油 1.0mL 食物
研磨燕麦 4.0g 食物
自来水 1000mL N/A
MK-7SF培养基(C:N比率为7.5)
成分 量 等级
NH4NO3 7.553g ACS
尿素 2.548g USP
CaCl2 2.000g 试剂
MgSO4*7H2O 2.000g USP
KH2PO4 7.500g 试剂
微量* 2.000mL *
甘油 0.075Kg 食物/USP
酵母提取物 1.750g 研究
FeCL2*4H2O 0.020g 研究
DI H2O 0.940L N/A
Figure GDA0003479952310000241
Figure GDA0003479952310000251
补充有NH4NO3的麦芽培养基001(C:N比率为7.5)
成分 量 等级
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub> 5.0g ACS
Light Pilsner麦芽 40.0g 食物
蛋白胨 4.0g 研究
酵母提取物粉 1.2g 研究
芥花油 1.0mL 食物
研磨燕麦 4.0g 食物
自来水 1000mL N/A
可以通过使用能够测量高达5000mOsm/kg的渗透压仪(例如型号3250SN：17060594)测量培养基测定以重量摩尔渗透压浓度计的渗透压浓度。对几种培养基采集三次读数，并且提供以下结果：Hansen’s＝39,39,38；麦芽001＝169,168,169；MK-7SF＝1389,1386,1387；麦芽001+NH4NO3＝288,287,286。
如前所述，本发明的方法可以导致丝状真菌的蛋白质含量、氨基酸概况(例如支链氨基酸的含量)和/或营养含量的增加。不受理论的束缚，认为该结果部分归因于用于培养真菌的培养基。
例如，虽然报道了蓝蚝菇(糙皮侧耳columbinus变种)子实体的天然蛋白质含量为约16.32％(Ulziijargal and Mau(2011)Int J Medicinal Mushrooms,13(4):343-49)或24.65％(Stamets(2005)Int J Medicinal Mushrooms 7:103-110)，如实施例12所示，根据本发明在Malt 001培养基上培养的蓝蚝菇生物垫具有29.82％的更高的经水分校正蛋白质含量，蛋白质含量增加13.6％或5.71％。
报道了珍珠蚝菇(糙皮侧耳)子实体的蛋白质含量约为23.85％(Ulziijargal andMau(2011)Int J Medicinal Mushrooms,13(4):343-49)或27.25％(Stamets(2005)Int JMedicinal Mushrooms 7:103-110)；根据本发明培养的珍珠蚝菇生物垫具有39.77％的更高的经水分校正的蛋白质含量，蛋白质含量增加至少46％至最大值67％。
报道了花椰菜蘑菇(绣球菌)子实体的蛋白质含量约为13.4％(Kimura(2013)BioMed Research International)；根据本发明培养的花椰菜生物垫具有32.21％-46.24％的更高的经水分校正的蛋白质含量，蛋白质含量的增加至少140％至最大245％。
认为对于在发酵培养基的表面上生物垫生长重要的培养基的其他特征是培养基的渗透压和离子强度。在一些实施方案中，用于生物垫生长的培养基的渗透压可以大于约3atm、大于约10atm、大于约20atm、大于约30atm、大于约40atm、大于约50atm、大于约60atm、大于约70atm、大于约80atm、大于约90atm、大于约100atm、大于约110atm、大于约120atm、或大于约125atm、大于约125atm或大于任何整数大气压值，大于3个大气压到大于125个大气压。在备选的实施方案中，渗透压的范围可以在约3atm至约125atm之间，在约20atm与约100atm之间或者在3至125之间的任何两个整数atm值之间。
在一些实施方案中，可用于培养生物垫的培养基的离子强度可大于约0.02M、大于约0.05M、大于约0.10M、大于约0.20M、大于约0.30M、大于约0.40M、大于约0.50M、大于约0.60M、大于约0.70M、大于约0.80M、大于约0.90M、大于约1.0M或大于任何百分之一M值，大于0.02M到大于1.00M。在备选的实施方案中，离子强度的范围可以在约0.02M至约1.0M之间，约0.10M至约0.50M之间或在0.01至1.0之间的任意两个数字摩尔浓度值之间。
生物垫的收获可以在足够厚的生物垫形成的任何时间进行。收获通常在生长2-3天后进行，尽管在某些情况下期望更长的生长时间，例如，当期望/需要更厚或更密的生物垫时。例如，收获可以在2天-60天之间或2天-60天之间的天数或部分天(例如小时)的任何范围的生长后发生。例如，此类生长期可以是3.5-4天、3-5天、4-6天、5-7天、6-9天、7-10天或19-21天或者备选约任何整数天，直至且包括约21天。如本文所用，术语“收获”是指停止生物垫生长(例如，与营养物源分离或温度条件变化)和/或修改生物垫的物理特性(例如，将生物垫转化为颗粒或条状)的任何过程或步骤。
由于在PCT/US2017/020050和本文所述的表面发酵条件下培养的丝状生物垫的粘合结构，因此丝状生物垫具有足够的拉伸强度以在生长期结束时从培养基表面基本完整提起。在各种实施方案中，本发明的生物垫可具有至少为约30g/cm2、至少约40g/cm2、至少约50g/cm2、至少约60g/cm2、至少约70g/cm2、至少约80g/cm2、至少约90g/cm2、至少约100g/cm2、至少约150g/cm2、至少约200g/cm2、至少约250g/cm2、至少约300g/cm2、至少约350g/cm2、至少约400g/cm2、至少约450g/cm2、至少约500g/cm2、至少约550g/cm2或至少约600g/cm2或至少约650g/cm2cm2、或至少约700g/cm2、或至少约750g/cm2、或至少约800g/cm2、或至少约850g/cm2、或至少约900g/cm2、或至少约950g/cm2、或至少约1000g/cm2、或至少约1500g/cm2、或至少约2000g/cm2、或至少约2500g/cm2、或至少约3000g/cm2、或至少约3500g/cm2、或至少约4000g/cm2的拉伸强度。在其他实施方案中，本发明的生物垫可具有比大于30g/cm2的任何整数大的拉伸强度。或者，本发明的生物垫的拉伸强度可以在30g/cm2至约4000g/cm2的范围中，或约30g/cm2至约4000g/cm2之间的任何整数范围中。实施例41中解释了测量拉伸强度的合适方法。
表1A呈现了对各种丝状真菌测量的拉伸强度和其他物理特性的一些实例。
表1A–一些丝状真菌生物垫的平均拉伸强度
Figure GDA0003479952310000271
Figure GDA0003479952310000281
表1B显示了对使用其它培养基获得的各种丝状真菌测量的拉伸强度和各种物理特征的其它实例。
Figure GDA0003479952310000282
在各种实施方案中，本发明的生物垫可以具有范围为约0.05cm至至少约2cm的厚度。
在各种实施方案中，本发明的生物垫可以具有范围为约0.6cm至约3米的宽度。通常，根据本发明产生的生物垫可以具有大致等于培养生物垫的容器宽度的宽度。
表面发酵可以在各种条件下进行，包括静态培养基条件(如PCT/US2017/020050中所述，其通过引用完整并入本文)、半静态培养基条件和连续培养基流动条件。实施例1-4中描述了一些实施方案。
在半静态培养基条件下培养意味着在收获丝状真菌生物垫之前，至少更换一部分培养基。这些条件允许在延长的时间段内线性生产干生物质，这表明该系统作为连续生产系统运行的合适性。例如，在一个实验中，线性干生物质生产从第4天到第18天实现(r2＝0.995)，此后生物质重量稳定于约2.5Kg干/m2。
生物垫也可以在连续培养基流动条件下生产，其中生物垫的生长限制于生长培养基的表面，在那里连续更新或半连续更新垫下面的培养基。
但是，在某些情况下，期望半连续收获生长的生物垫。在这里，发生生物垫的某个部分的取出，然后将剩余部分物理移动到培养基的开放区域，其通过取出部分生物垫创建。这可以通过物理抓取生物垫并拉动它直至它接触到表面发酵容器的末端来实现，或者通过其他机械手段实现。由于培养基已经含有活的真菌细胞，所得的开放区域可用于形的生物垫生长，而没有分开或额外的接种步骤。此过程可以定期重复，这在更新培养基或重新引入已经变得有限的营养物时特别有用。
生物垫收获也可以连续完成。可以通过多种机制促进连续取出。一个此类例子是附着于生物垫的成熟端的滚轮(见图7)。滚轮缓慢转动并收获成熟的生物垫，同时在表面发酵容器的另一端创造开放的培养基，用于新生物垫的生长。在各种实施方案中，可以以至少约0.1cm/天、0.2cm/天、0.3cm/天、0.4cm/天、0.5cm/天、0.6cm/天、0.7cm/天、0.8cm/天、0.9cm/天、1.0cm/天、1.1cm/天、1.2cm/天、1.3cm/天、1.4cm/天、1.5cm/天、1.6cm/天、1.7cm/天、1.8cm/天、1.9cm/天、2.0cm/天、2.1cm/天、2.2cm/天、2.3cm/天、2.4cm/天或2.5cm/天的速率进行收获。典型的收获速率为1.56cm/天，尽管这可以根据特定需要或用户的期望进行更改。
在某些情况下，UVB光(290-320nm)可以触发丝状真菌的色素产生，诸如对于尖孢镰孢菌菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)，产生色素沉着的生物垫。除了可以用于创建各种食物效果的颜色变化之外，用UVB处理还将真菌细胞膜中存在的麦角固醇转化为维生素D2，并增加类胡萝卜素(如beta胡萝卜素和虾青素)的产生。因此，用UVB照射丝状真菌，例如尖孢镰孢菌菌株MK7可用于增加所得生物垫中的维生素D2和类胡萝卜素。
在某些情况下，形成的丝状真菌生物垫由外观均匀的细胞层构成，丝状生物垫的一个表面与空气接触，而一个表面与合成培养基接触。在其他情况下，存在至少两个不同的层：在顶表面的气生菌丝层和与合成培养基接触的致密的多细胞底层。通常出现三个不同的层：(a)顶表面的气生菌丝层，(b)致密的底层和(c)顶层和底层之间的过渡层。过渡层可以仅松散地附着到致密的底层，在那些情况下，能够使底层容易地与生物垫的剩余部分分开。过渡层的细丝密度范围从比两层相遇的区域中的底层密度稍低到与生物垫顶部附近的气生菌丝相当的密度。
在一些实施方案中，生物垫可以包含菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698),Fusariumvenenatum、少孢根霉、羊肚菌(Morel)、尖顶羊肚菌(Morel)、梯棱羊肚菌(Morel)、大秃马勃(giant puffball),糙皮侧耳(珍珠菇)、糙皮侧耳columbinus变种(蓝蚝菇)、绣球菌(花椰菜)、灵芝(Reishi)、榆菇(榆耳)。
丝状真菌生物垫的灭活
灭活过程开始于培养后至少2天收获的生物垫。尽管可以冲洗生物垫以除去过量的生长培养基，但是不需要进行生物垫冲洗，尽管在某些情况下，优选除去生长培养基或过量的生长培养基。类似地，可以挤压生物垫以除去过多的生长培养基，这同样不是需要的，但是对于某些应用可以是优选的。
在某些情况下，例如用于将生物垫用作独立的蛋白质来源或食品中的蛋白质成分时，期望消除细胞存活力和进一步的生物垫生长的潜力。这可以通过加热、照射、乙醇和/或蒸煮来实现。
对于加热过程，可以根据例如WO 95/23843或英国专利号1,440,642来处理丝状真菌生物垫，或在破坏生物RNA的绝大部分而没有不利地影响生物体的蛋白质组成的温度下温育。
在照射中，将丝状真菌生物垫暴露于电离能，例如由60Co(或不经常由137C)放射性同位素产生的电离能，在低于5MeV的标称能量下运行的机器产生的X射线以及由低于标称能量10MeV运行的机器产生的加速电子。
蒸煮也可以用于使某些丝状真菌生物垫，例如由镰孢菌菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)和F.venentatum产生的那些生物垫灭活，因为蒸煮也可以从生物垫构建体中除去某些特定的代谢产物，若产生那些代谢物的话。这里，将生物垫置于使生物垫排出的液体和冷凝的蒸汽可以容易从生物垫滴落下来。合适的生物垫保持系统包括多孔塑料网和多孔托盘。其他生物垫保持系统包括但不限于将生物垫固定于垂直位置的系统，例如具有夹持机构的系统，该夹持机构夹持生物垫的至少一个末端，而生物垫的剩余末端悬挂自夹持生物垫的至少两侧的所述夹和网孔系统，等等。
将生物垫置于蒸锅内，以使加热的蒸汽，例如温度高于85℃或95℃的蒸汽与生物垫接触。在将多个托盘置于单个蒸锅中的那些情况下，例如一个托盘在另一个托盘上，优选保护较低位置的生物垫免受较高位置的生物垫的滴落。保护的形式应允许蒸汽与生物垫接触，从而使生物垫存活力失活，并也使生物垫排出的液体和蒸锅中较高水平产生的冷凝蒸汽偏离而不与位于蒸锅中较低水平的生物垫接触。在一个实施方案中，圆锥体位于上托盘和下托盘之间以实现此结果。在其他实施方案中，上托盘和下托盘之间的分开还包括至少一种其他几何形状，例如圆柱体、立方体和/或长方体、角锥、球形、圆环面(tori)和/或其他柏拉图式立体(platonic solids)。在又一个实施方案中，使用至少一个圆柱体、立方体和/或长方体、角锥、球形、圆环面、其他柏拉图式立体、网孔、孔带或它们的组合来分离托盘。
将生物垫至少蒸煮至降低生物垫存活力的点，使得生物垫内进一步的生物垫生长和/或细胞繁殖可忽略不计。生物垫存活力是原始底物、生物垫形成、蒸汽/传热特性、蒸锅中的生物垫位置以及生物垫相对于放出的蒸汽的方向的函数。例如，在甘油或酸乳清底物上培养的镰孢菌菌株MK7生物垫在蒸煮5分钟后和在一些情况下小于5分钟是非活的。可以清洗和/或挤压蒸过的垫，以除去垫排出物和冷凝的蒸汽。
灭活的食用丝状真菌生物垫可直接用作蛋白质来源，例如用于制备很大程度上与豆腐、咸肉(bacon)和肉干等等相当的食物中。
丝状真菌生物垫的颗粒
灭活的食用丝状真菌生物垫也可以大小减小的，以用作食品中的蛋白质来源。大小减小可以通过机械手段，例如切割、剁碎、切块、切碎、研磨、混合等发生，或者通过超声处理发生，并且在与其他成分或液体混合之前进行。大小减小的颗粒可以是大小均匀的或可变的。
通常，大小减小的颗粒的长度在0.05-500mm之间，宽度在0.03-7mm之间，并且高度在0.03-1.0mm之间。例如，粉状物型颗粒的范围通常在0.03mm至0.4mm之间，肉干型颗粒范围在100mm至500mm之间，等等。可以生产更大大小的颗粒。例如，已经在可充气池(直径66”)中培养生物垫，产生直径66”且完全圆形的单一生物垫。较大的容器可用于培养出甚至更大的垫。
每个生物垫产生的大小减小的颗粒的数目取决于初始生物垫大小和使用生物垫大小减小的颗粒的目的。
大颗粒
在一些实施方案中，将灭活的食用丝状真菌生物垫缩小成颗粒，其中至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％的颗粒具有约0.05mm至约500mm的颗粒长度，约0.03mm至约7mm的颗粒宽度和约0.03mm至约1.0mm的颗粒高度，或备选，在这些范围内的任何子范围内。例如，至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％的颗粒可具有约0.08mm至约100mm或10mm至约70mm，或130mm至约200mm的颗粒长度；约0.05mm至约2mm、或约1mm至约3mm、或约4mm至约6mm的颗粒宽度；以及约0.03mm至约0.06mm，或约0.04mm至约0.07mm，或约0.08mm至约1.0mm的颗粒高度。
在一些实施方案中，将灭活的食用丝状真菌生物垫缩小成颗粒，其中至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％颗粒质量具有约50mm至约500mm的颗粒长度，约0.03mm至约7mm的颗粒宽度和约0.03mm至约1.0mm的颗粒高度，或备选在这些范围内的任何子范围内。例如，至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％或至少90％的颗粒质量可具有约0.08mm至约100mm，或10mm至约70mm，或130mm至约200mm的颗粒长度；约0.05mm至约2mm，或约1mm至约3mm，或约4mm至约6mm的颗粒宽度；和约0.03mm至约0.06mm，或约0.04mm至约0.07mm，或约0.08mm至约1.0mm的颗粒高度。
例如，至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％的颗粒可具有约0.08mm至约100mm，或10mm至约70mm，或130mm至约200mm的颗粒长度；约0.05mm至约2mm，或约1mm至约3mm，或约4mm至约6mm的颗粒宽度；和约0.03mm至约0.06mm，或约0.04mm至约0.07mm，或约0.08mm至约1.0mm的颗粒高度。
此类颗粒模仿肉类产品，例如鸡块或汉堡的质地和咀嚼性，并且可用于制备此类产品，例如肉类产品的填充物(filler)或填充剂(extender)，或者它们的素食形式。在使用本发明的颗粒作为肉类产品的填充剂或增量剂的情况下，丝状真菌颗粒与肉的比率范围可以为10:90至90:10或之间的任何比率。
例如，在一些实施方案中，丝状真菌颗粒包含以下颗粒，该颗粒具有至少90％的具有小于约1.5mm的长度且大部分长度为1mm或更小，小于约1mm的宽度，和小于约0.75mm的高度的颗粒。包含此类颗粒的食物材料的特征在于在口腔中具有较高的感知密度，更易于咀嚼，提供乳脂状的口感和更精致的食物体验，并且此类颗粒可用于制备类似于高级餐厅中发现的汉堡包的食物材料。
在一些实施方案中，丝状真菌颗粒包含如下的颗粒，所述颗粒具有至少约90％的具有约4mm至约10mm之间的长度、约1.0mm至约3mm之间的宽度，和小于0.75mm的高度的颗粒。发现包含此类颗粒的食物材料可以带来更丰盛的食物体验，类似于在堡餐厅或BBQ店中常见的堡类型。
细颗粒(粉状物)
在一些实施方案中，将灭活的食用丝状真菌生物垫缩小成细颗粒。在一些实施方案中，丝状真菌的颗粒为粉状物的形式。在此类实施方案中，粒度和粒度分布可以与用于粉状物样材料如小麦或其他粉状物的常规粒度相同或相似。在一些实施方案中，至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％的颗粒落在0.03mm至约0.4mm的范围内，或备选，在此范围内的任何子范围内，例如约0.03mm至0.07mm、约0.07mm至约0.12mm、约0.12mm至约0.15mm、约0.15mm至约2.0、约0.04mm至约0.2mm、或0.06mm至约0.120mm或0.2mm至约0.4mm。在一些实施方案中，至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％的颗粒落在0.075mm至约0.12mm的范围内。
在一些实施方案中，至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％或至少90％的颗粒质量落入0.03mm至约0.4mm的范围内，或在此范围内的任何子范围内，例如约0.03mm至0.07mm，约0.07mm至约0.12mm，约0.12mm至约0.15mm，约0.15mm至约2.0，约0.04mm至约0.2mm，或0.06mm至约0.120mm或0.2mm至约0.4mm。在一些实施方案中，至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％的颗粒质量落在0.075mm至约0.12mm的范围内。
可以使用磨粉机、研磨机或其他用于减小大小的常规设备来减小尺寸。
在一些实施方案中，本发明的细颗粒材料的水分含量小于约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％，约9％，约8％，约7％，约6％，约5％，约4％，约3％，约2％或约1％。低水分含量有助于防止颗粒结块。
此类颗粒可用于制备食物材料，例如烘焙产品，包括但不限面包、面包卷(rolls)、松饼、蛋糕、饼干、馅饼等，或者可以撒在其他食物产品上。
液体分散体(乳)
将蛋白质引入食物中的一个方面是使用从丝状真菌生物垫制成的液体分散体作为乳或乳类似物的替代成分。液体分散体(在本文中也称为“乳”)包括分散在水性培养基中的丝状真菌生物垫的颗粒。
适用于液体分散体的丝状真菌生物垫颗粒的大小通常小于约10微米。在一些实施方案中，液体分散体中的至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％的颗粒落在约1微米至约10微米的范围内，或备选在此范围内的任何子范围内。在一些实施方案中，至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％的颗粒小于10微米、小于9微米、小于8微米、小于7微米、小于6微米、小于5微米、小于4微米、小于3微米、小于2微米或小于1微米。在一些实施方案中，至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％或至少约90％颗粒可以具有小于约1微米的粒度。
可以通过将丝状真菌生物垫与水相(例如)水组合并混合来制备液体分散体或乳。可以将混合的混合物逐渐加热至例如沸腾温度。然后，使加热的混合物冷却。在一些实施方案中，可以在氮气下产生液体分散体。此过程导致液体分散体的更为乳脂状的稠度和更少的真菌气味。氮气下的生产可以通过在密闭容器中用氮气鼓泡完成，以使氮气在掺混期间(例如使用Vitamix)或者在高能大小减小或研磨过程中或在加热循环中替换几乎所有可用的氧气。实施例27中描述了示例性方法。
可以调节丝状真菌生物垫与水的比率，以产生具有适当稠度和密度的液体分散体。生物垫与水的比率的范围可以为约1:10至约10:1，或之间的任何比率范围。在一些实施方案中，生物垫与水的比率可以为约1:10、约1:9、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1和约10:1。
在各种实施方案中，本发明的液体分散体是稳定的，使得丝状真菌的颗粒不容易与分散它们的液体培养基分离。例如，在形成分散体时，所形成的液体看起来在外观上是均匀的，并且没有明显地分离成不同的相。例如，在容纳分散液的容器的底部没有视觉可识别的或显著的沉积物形成。在一些实施方案中，液体分散体保持稳定至少约1、2、3、4、5、6、9、12、15、18、21或24小时，或者备选，它可以保持稳定至少约1、2、3、4、5、6或7天，或1、2、3或4周，或1、2、3、4、5或6个月。在这些实施方案中，分散体可以在室温或在冷藏温度，例如在约35°F(1.6℃)。
实施例26例示了本发明的液体分散体(即乳)的稳定性。乳在冷冻器中静置放置15天和30天，并且在任一种样品中未观察到可见的分离。乳也没有表现出风味或气味的降低。
在一些实施方案中，分散体包含至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％固体。在其他实施方案中，本发明的液体分散体将具有约4％至约30％之间或4％至30％之间的任何子范围的固体含量。
液体分散液可用作饮用物或饮料，包括任何乳制品，杏仁奶、米奶、豆浆等的替代品。它可以用于多种食谱，包括汤、冰淇淋、酸奶、思慕雪、软糖(fudge)和糖果，例如焦糖(caramel)和圆形巧克力软糖(truffles)。在某些情况下，从不同原料/碳源生产的丝状真菌生物垫导致具有不同风味的液体分散体。例如，当原料/碳源为甘油时，从镰孢菌株MK7产生的所得液体分散体更甜，而由在酸性乳清原料/碳源上培养的镰孢菌株MK7所得的液体分散体趋于变酸。丝状真菌(例如镰孢菌株MK7)的天然甜味或酸味转移到最终食物产品。例如，酸乳清液体分散体自身导致酸奶，而甘油液体分散体往往自身导致慕斯、焦糖或软糖。
在一些实施方案中，液体分散体可用于形成稳定的泡沫，因为它形成的泡沫在停止发泡过程后不立即自发塌陷。发泡过程可包括用搅打器具搅打，并入压缩气体或其他常规的发泡过程。泡沫在外观上是光滑且乳脂状的，并显示出大小分布的气泡的存在。较大的气泡在静置或被倒入后往往弹出，但较小的气泡长时间保持在悬浮液中，以形成稳定的泡沫产品。本发明的泡沫产品具有液体分散体的组成特征，并且另外具有以稳定的方式掺入泡沫中的空气或其他气体。例如，本发明的起泡材料可通过与发泡前的液体分散体的初始体积相比掺入至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％或至少约500％的空气而具有增加的体积(即，起泡率)。在各种实施方案中，起泡材料稳定至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、或至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天或至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、或至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天、至少约30天。在一些实施方案中，液体分散体保持稳定至少约一个月、至少约两个月或至少约三个月。如体积泡沫使用，稳定性是指保持其最初气泡体积的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％。
约12％的平均起泡率适用于制备冰淇淋(具有更多的脂肪和乳化剂)、冷冻酸奶、酪饼糊(cheesecake batter)、搅打浇头(whipped toppings)等。在一些实施方案中，泡沫可掺入氮气以提供不同的起泡率特征。
在一些实施方案中，食物材料是培养的食物产品。如本文所用，除非另有说明，术语“培养的食物材料”是指将微生物食物培养物，即活细菌、酵母或霉菌引入丝状真菌的食品。作为非限制性实例，根据本发明的真菌食物材料可以与乳杆菌属种或其他乳酸菌一起培养(以制备例如酸奶类似物食物产品或其他乳制品类似物食物产品)，酿酒酵母或其他用于酿造或烘焙的酵母(以制备例如烘焙好的类似物食物产品或酒精饮料模拟物食物产品)，传统上用于制作香肠(例如Penicillium chyrsogenum或Penicillium nalgiovense，制作香肠类似物食物产品)或酱油(例如米曲或酱油曲霉，制作酱油类似物食物产品)等等的霉菌。在一些实施方案中，根据本发明的培养的食物产品可以与两种或更多种微生物食品培养物同时或依次培养，以产生通过两种或更多种微生物培养物发酵制成的食物产品类似物；作为非限制性实例，根据本发明的培养的食物产品可包括半软熟干酪类似物食物产品(通过使真菌材料经受乳酸杆菌属种或其他乳酸菌的第一次培养和干酪熟化酵母的第二次培养而制成)、蓝纹奶酪类似物食物产品(通过将真菌材料通过乳杆菌属种或其他乳酸菌进行第一次培养和通过霉菌如Penicillium roqueforti进行第二次培养制成)、软熟化干酪(例如Brie或Camembert)类似物食物产品(通过将真菌材料进行乳杆菌属种或其他乳酸菌的第一次培养和Penicillium camemberti的第二次培养制成)等。
在一些实施方案中，食物材料包括酸奶类似物食物产品，其包含分散在水性培养基中的本发明的丝状真菌生物垫的颗粒。在酸奶类似物的一些实施方案中，丝状真菌颗粒与水的比率可以的范围为约1:10至约10:1。预期更高比率的丝状真菌颗粒与水的比率将增加酸奶类似食物产品的质地并降低半液体性(runniness)。在一些实施方案中，丝状真菌颗粒与水的比率可以为约1:3、1:2、1:1或2:1。
在一些实施方案中，酸奶类似物食物产品包含转化糖(invert sugar)或经转化的糖(inverted sugar)。转化糖对结晶是有抗性的，并促进水分的保持。并且可以在商业上用于各种食物中，例如烘焙产品、糖果(confections)或水果罐头(fruit preserves)和饮料，以增强风味和质地并延长货架期。例子包括蜂蜜或通过蔗糖水解获得并且比蔗糖甜的葡萄糖和果糖的混合物。
在一些实施方案中，酸奶类似物食物产品包含增稠剂或胶凝剂。此类试剂是本领域已知的，包括但不限于：琼脂、明胶、淀粉(即竹芋、木薯、玉米、马铃薯)、较高脂肪液体(椰奶)、脂肪(即椰子片，除臭的或其他方式)、鹰嘴豆水、亚麻籽、黄原胶、瓜尔豆胶、车前子壳、研磨的奇亚籽、坚果/种子黄油、南瓜泥、煮过的蕃薯/甘薯泥、苹果酱、磨碎熟透的香蕉或车前草、枣或梅干泥、浸泡和煨过的无花果炖、水果/蔬菜丝、椰子丝、无谷蛋白粉状物(例如苔麸粉、荞麦粉、苋菜粉、鹰嘴豆粉、高粱粉、杏仁粉)、煮过的豆泥、可可粉、植物胶、多糖、蔬菜黏液、海藻衍生物、果胶、谷蛋白、豆和蛋类似物。增稠剂可以是脂肪，其可以是液体，例如椰奶，或固体，例如脱臭的椰子片。
在一些实施方案中，丝状真菌的细胞是裂解的，其释放更多的蛋白质并导致营养物的增加的增稠和潜在更大的生物利用度。裂解可以通过本领域已知的任何方法例如超声处理来实现。
在一些实施方案中，酸奶类似物食物产品包含乳酸菌(LAB)。这些细菌产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物。LAB的实例包括乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、乳球菌属(Lactococcus)和链球菌属(Streptococcus)。在一些实施方案中，它包含细菌保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)和/或嗜热链球菌。
在一些实施方案中，酸奶类似物食物产品进一步包含凝乳酶。凝乳酶可以源自动物来源、素食来源或微生物来源。在素食或严格素食食物产品中，凝乳酶源自素食来源和/或微生物来源。
在一些实施方案中，酸奶类似物食物产品还包含酶促水。例如，可以如下生产酶促水。将100gm全黑麦或硬质小麦种子(或其他合适的全谷物种子)与1升水混合，并且萌发2-4小时。当种子开始发芽并且出现第一根时，可以将种子放入装有1升水的干净罐中。罐可以用可渗透的布(亚麻布或棉布)覆盖，并在室温温育24小时，结束时罐中的水改变颜色和气味。此水称为酶促水，并且可用于生产酸奶和奶酪。
在一些实施方案中，酸奶类似物食物产品进一步包含益生菌(probiotic)。益生菌是活微生物(如细菌和酵母菌)的混合物，其提供健康益处，包括改善的消化。
在一些实施方案中，酸奶类似物食物产品包括源自动物乳的乳固体。在一些实施方案中，酸奶类似物食物产品不含源自动物乳的乳固体，即它不包含任何乳固体。
应明确地理解，除了酸奶类似物食物产品之外，本发明的食物材料可包含任何一种或多种其他乳制品类似物食物产品。作为第一非限制性实例，本发明的食物材料可包括奶酪类似物食物产品，诸如硬奶酪(例如帕尔玛干酪(Parmesan))类似物食物产品、半硬奶酪(例如Gouda)类似物食物产品、半软奶酪(例如Havarti)类似物食物产品、软或软成熟奶酪(例如Brie)类似物食物产品、奶油奶酪类似物食物产品、酸乳奶酪类似物食物产品、蓝奶酪类似物食物产品、马斯卡彭(mascarpone)奶酪类似物食物产品、帕斯塔菲拉塔(pastafilata)(例如Mozzarella)奶酪类似物食物产品、盐水奶酪(例如Feta)类似物食物产品、乳清奶酪(例如Ricotta或Brunost)类似物食物产品或新制奶酪(例如茅屋奶酪(cottagecheese))类似物食物产品。作为第二非限制性实例，本发明的食物材料可包括黄油类似物食物产品，诸如生奶油黄油类似物食物产品、乳脂类似物食物产品、澄清黄油类似物食物产品、乳清黄油类似物食物产品、经培养的黄油类似物食物产品、经温和培养的黄油类似物食物产品、甜奶油黄油类似物食物产品或传统酪乳类似物食物产品。作为第三非限制性实例，本发明的食物材料可包括乳清类似物食物产品，诸如酸乳清类似物食物产品或甜乳清类似物食物产品。作为第四非限制性实例，本发明的食物材料可包括奶油类似物食物产品，诸如奶油乳霜类似物食品、斯美塔那(smetana)类似物食物产品、酸奶油类似物食物产品、半类似物食物产品(half-and-half analog food product)、餐用奶油(table cream)类似物食物产品、搅打奶油类似物食物产品、双奶油类似物食物产品、凝结奶油类似物食物产品、酸奶油类似物食物产品、巴氏灭菌奶油类似物食物产品或浓缩奶油类似物食物产品。作为第五非限制性实例，本发明的食物材料可包括酸乳类似物食物产品，诸如夸克(quark)类似物食物产品、凝乳奶酪类似物食物产品、酸化乳类似物食物产品、开菲尔(kefir)类似物食物产品、有机乳酸或温和酸奶类似物食物产品、酸奶类似物食物产品、奶油酸奶类似物食物产品或经培养的酪乳类似物食品。作为第六非限制性实例，本发明的食物材料可包括乳类似物食品，诸如生乳类似物食物产品、低脂或脱脂生乳类似物食物产品、巴氏灭菌乳类似物食物产品、新鲜全乳类似物食物产品、低脂乳类似物食物产品、脱脂乳类似物食物产品、延长存放期(ESL)乳类似物食物产品、超高温度加工(UHT)乳类似物食物产品、灭菌乳类似物食物产品、经浓缩或蒸发之乳类似物食物产品、部分脱脂浓缩乳类似物食物产品或浓缩脱脂乳类似物食物产品。作为第七非限制性实例，本发明的食物材料可包括粉状乳制品类似物食物材料，诸如粉状乳清类似物食物材料、粉状乳类似物食物材料或粉状脱脂乳类似物食物材料。在实施例中，根据本发明的乳制品类似物食物材料是纯素食产品，亦即，不含动物产品的食物材料，且因此允许纯素食饮食的观察者将此类乳制品类似物并入其饮食中。
丝状真菌生物垫的颗粒可以作为蛋白质或其他营养来源添加，以增加食物的营养含量，或者可以是例如唯一的蛋白质成分。对于完全由丝状真菌生物垫或此类生物垫的大小减少的颗粒构成的食物，可以针对特定质地、口感和咀嚼度优化颗粒。改变质地、口感和咀嚼性的能力允许定制以适应具有特殊饮食需求的个体，例如咀嚼困难的个体、需要/渴望较软食物而仍提供相同营养和口味体验的个体或期望具有更多的质地、更多的口感和更多咀嚼的食物的个体。由于容易控制颗粒大小的能力，因此用丝状真菌生物垫增强或仅从丝状真菌生物垫制成的食物具有与它们模仿的标准蛋白质食物非常相似的质地，如可以在表2中看到。
表2-来自Stable Micro Systems TA XT plus质地分析仪的结果
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Figure GDA0003479952310000401
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丝状真菌生物垫的颗粒可以用作食物材料中的唯一蛋白质组分，或者可以用于增加其他食物材料中的蛋白质含量。可以在添加或不添加调味剂的情况下仅使用减小粒径的丝状真菌生物垫产生的食物的实例包括但不限于肉样的素食或严格素食产品(诸如碎牛肉、碎鸡肉、碎火鸡肉、鸡块、鱼排或小馅饼、肉干)、零食(例如薯条)、汤、思慕雪(smoothies)、饮料、乳类似物、面包、意大利面、面条、饺子、糕点(例如Pate a Choux)、饼干、蛋糕、馅饼、点心、冷冻点心、冰淇淋类似物、酸奶、甜食和糖果。
用减小粒径的丝状真菌生物垫增强的食物可显著增加蛋白质含量，这对于遵循严格素食饮食的个体而言尤其重要。例如，可以用菌株MK7液体分散体增强汤、饮用物或思慕雪。
减小大小的生物垫颗粒是用于提升食物的蛋白质含量还是用作唯一的蛋白质成分，在某些情况下，粘合剂有助于实现期望的质地。批准的食品粘合剂是合适的，例如蛋清、面筋、鹰嘴豆粉、素食粘合剂、竹芋粉(arrowroot)，明胶、果胶、瓜尔豆胶、角叉菜胶、黄原胶、乳清、鹰嘴豆水、研磨的亚麻籽、蛋替代品、粉状物、奇亚籽(Chia seeds)、蚤草(psyllium)等，它们可以单独使用或组合使用。除食物粘合剂外，减小粒径的丝状真菌生物垫还可以与批准的调味剂、香料、味道增强剂、脂肪、脂肪替代品、防腐剂、甜味剂、色素添加剂、营养物、乳化剂、稳定剂、增稠剂、pH控制剂、酸化剂、膨发剂、抗结块剂、湿润剂、酵母营养物、面团增强剂、面团调节剂、固化剂、酶制剂、气体及它们的组合混合。通常，选择粘合剂、调味剂、香料等以满足特定人群的需求。例如，乳和/或乳固体不用于接待患有乳制品变态反应/敏感性的个体，小麦粉可能不用于接待谷蛋白变态反应/敏感性的个体，等等。
在一些应用中，可以使用基本上单峰的粒度分布，即其中所有颗粒基本上是相同大小的，而在其它应用中，可以使用宽的或多峰的分布或粒度分布的组合。类似地，大小减小的颗粒可以衍生自丝状真菌生物垫的单一来源或不同来源的丝状真菌生物垫的组合；例如单独的菌株MK7或菌株MK7和Fusarium venenatum，或菌株MK7和Fusarium venenatum和大秃马勃生物垫等。
过去用于商业生产的丝状真菌的应用通常需要大量的基础设施和/或设备、能量需求、昂贵的试剂和/或大量的人力资源。丝状真菌以具有地球上所有微生物的最大代谢多样性而闻名，包括产生一大批有机酸、抗生素、酶、激素、脂质、真菌毒素、维生素、有机酸、色素和重组异源蛋白质的能力(Wiebi(2002)Myco-protein from Fusarium venenatum:awell-established product for human consumption.Appl Microbiol Biotechnol58,421–427；El-Enshasy(2007)第9章-Filamentous Fungal Cultures–ProcessCharacteristics,Products,and Applications.于.Bioprocessing for Value-AddedProducts from Renewable Resources.Editor:Shang-Tian Yang.Elsevier；Gibbs et al(2000)Growth of filamentous fungi in submerged culture:problems and possiblesolutions.Crit.Rev.Biotechnol.20,17–48)以及降解多种类型的顽固性材料，例如木质纤维素和土壤中的腐殖质的能力。
虽然被广泛使用，但深层发酵生产仍然面临着重大挑战，并且包括重要的因素，例如由于受限制的氧气供应和搅拌所产生的过大的剪切力而导致生长受限(Gibbs et al(2000)Growth of filamentous fungi in submerged culture:problems and possiblesolutions.Crit.Rev.Biotechnol.20,17–48)。由于在地球表面条件下水中的氧溶解度约为8mg/L，因此它在深层培养物中快速生长期间容易耗尽。因此，需要使用复杂、昂贵且耗能大的充气和搅动系统进行连续充气以维持高生长速率。丝状真菌的培养甚至更具挑战性，因为丝状形态赋予非牛顿流变行为，其进一步抑制了氧气向溶液中的转移(
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etal.(2014)Filamentous Fungi Fermentation.In Industrial Scale SuspensionCulture of Living Cells,H.-P.Meyer,and D.R.Schmidhalter编(Wiley-VCH VerlagGmbH&Co.KGaA),pp.130–162)。随着培养物密度增加，对培养物进行充气和混合所需的能量的量非线性增加，而对致密培养物进行充气的能量要求也非常高。对于许多丝状物种，培养物的强烈搅动和通气对菌丝的生长变得不利，因此大大降低生长速率。丝状微生物的深层发酵面临的这些和其他挑战需要创新的解决方案，以有效在航天器和地球外站可用的有限资源的情况下利用这些生物体。
公开的气密反应器系统(1)解决了这些问题，并且具有以下优点：
-对液体培养物进行主动充气或搅拌不是必要的；
-将生物质原位聚集成单一具有显著拉伸强度(>0.1kg/cm的生物垫宽度)的粘合垫，其允许容易的收获；
-有质地的生物垫可用于极其多种任务关键产品(即食品、生物塑料、生物燃料、营养补充剂以及作为多种药物的表达平台)；
-在维持高生物质产量(80-120g/m2/d或0.55g/L/h)的情况下最少的水使用以及来自过程的最小和/或无残留废水或营养物；
-生长速率可以在短短2天内转化为完全成型的生物垫的生产，或者可以进一步扩展超过10天，在一些实施方案中长达至少约21天；
-高生物质密度(生物垫通常是0.684g/cm3湿重或0.123g/cm3干重)
-高产率(6.9kg/m2湿重或1.23Kg/m2干重总计，且在一些实施方案中多达至少约每天206g/m2干重)；
-可以生长出对不同过程具有特殊优势的多种丝状真菌(包括极端微生物，以及已知的可食用且商业相关的蘑菇)；
-放大或缩小是相对简单的，并且不导致生产率下降直至至少约150cm2的生长面积。
-过程可以使用源自自然灾害和/或太空任务的极其多种富含C和N的废物底物。
公开的反应器系统提供了一种自含式的生物垫反应器，该反应器包含容器，并将原料、真菌接种物、至少半透膜(例如透气、液体可透过和/或液体半透性)和任选的液体营养物培养基放置在容器中。根据情况，反应器可以是一次性使用的反应器或可重复使用的反应器。
通常，容器能够被密封并且除了密封件之外还可以包括容器盖。一些容器的例子是有盖的托盘、有盖的培养皿、另一种类型的有盖的容器、或袋。对于某些用途或在某些环境中，容器具有多个生长区室，例如遵循歧管设计和/或挡板系统。
给原料接种如上文描述的丝状真菌菌株。子囊菌菌株的实例是菌株MK7(ATCCPTA-10698，保藏在美国典型培养物保藏中心，1081University Boulevard,Manassas,Virginia,USA)、Fusarium venenatum、燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)和/或它们的组合。原料的接种可以在原料被放置在容器内时发生，或者可以在原料被放置后的某个时间发生。即，密闭反应器(1)可以用与原料接触后恢复的冻干丝状真菌接种物引发，或者原料可以在置于密闭反应器通道(4)中后直接接种或可以接种原料，然后置于密闭反应器通道中。
关于在反应器中使用的原料，原料可以如上文描述。例如，它可以是废物，例如天然存在的尿液和/或粪便、食物废物、植物材料、工业废物，例如甘油和废物副产物、淀粉和/或淀粉水解副产物、酸乳清、糖醇和/或它们的组合。也可以使用合成或制造的废物替代物，例如替代人类尿液。植物材料原料通常是木质纤维素的。木质纤维素原料的一些例子是农作物残余物(例如小麦秸秆、大麦秸秆、稻秸秆、细粮秸秆、玉米秸秆、玉米纤维(例如玉米纤维胶(CFG)、干酒糟(DDG)、玉米面筋均值(corn gluten mean，CGM)、柳枝稷、甜菜浆、来自棕榈油生产的废物流、苜蓿草、甘蔗渣、非农业生物质(例如藻类生物质、蓝细菌生物质、城市树木残渣)、森林产品和工业残留物(例如，软木第一/二级磨渣、硬木第一/二级磨渣、再生纸浆污泥)，含木质纤维素的废物(例如新闻纸，废纸，酿造谷物，废旧橡胶轮胎(URT)，城市有机废物和副产物，庭院废物及副产物、临床有机废物和副产物、以及生物燃料生产期间产生的废物和副产物(例如经加工的藻类生物质，甘油)及它们的组合。
在实施方案中，可渗透膜可包含聚合物材料，诸如例如作为非限制性实例，聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚酰胺(例如尼龙)、聚吡咯烷酮、聚(酰胺基胺)(poly(amidoamine))树枝状聚合物复合物、聚偏二氟乙烯、聚醚砜、乙酸纤维素、纤维素酯的混合物和/或丁二烯-丙烯腈。另外/或者，渗透膜可包含玻璃纤维材料、多孔陶瓷材料和/或织物，例如，作为非限制性示例，聚丙烯织物、聚四氟乙烯织物和/或尼龙网滤器。尽管可渗透膜(2)的孔径通常可以是约0.2μm至约25μm之间的任何0.01μm增量值或数值范围，但作为非限制性实例，包括0.2μm、0.22μm、0.45μm、1.0μm、5μm、10μm和11μm，并且膜(2)可以是无菌的布状材料的形式或纸状的材料的形式。
可渗透膜(2)允许以图15-18所示的几种不同方式优化系统。尽管图中所示的反应器系统共有九个通道(4)，但熟练的技术人员应理解，可以存在从单个通道(4)到多个通道(4)的任何数量的通道(4)，取决于可用于放置反应器(1)的空间。类似地，通道(4)的形状不限于矩形棱柱或圆柱体，并且可以采取适合于反应器(1)可用的空间的任何形状。
在某些情况下，如图12所示，将膜(2)直接与容器中存在的原料、任选的液体培养基和接种物的表面接触。也可以将膜密封以与原料的表面接触，例如，通过将其附着到带有集成橡胶垫圈的塑料框。
在其他情况下，将膜悬浮在原料上，使得随着真菌生长和消耗氧气，膜朝着垫下落或落到位于膜和原料之间的挡板系统上，从而允许气生菌丝的生长。图15中显示了此类系统。这里，密闭反应器(1)由多个通道(4)构成，所述通道在反应器前部(7)的入口阀(6)处起始，反应器背部(5)的出口阀(8)处终止，并由挡板/壁(9)隔开。透气膜(2)形成反应器的顶部。反应器的底部(3)可以由任何合适的物质形成，包括但不限于硬塑料和软塑料两者，例如聚对苯二甲酸乙二酯、高密度聚乙烯、聚氯乙烯、聚乳酸、聚碳酸酯、丙烯酸、乙缩醛、尼龙、丙烯腈丁二烯苯乙烯、玻璃、金属如铝、钛、不锈钢等和/或它们的组合。挡板/壁(9)可以由类似的材料制成。合适的前(6)和后(8)阀包括但不限于单向阀、二向阀、球阀、蝶形阀、闸阀、旋塞阀、截止阀、夹管阀、蝶式止回阀、连接阀、分离阀和/或它们的组合。入口阀(6)用于提供进入区室(4)的通道，以将原料/培养基递送到区室，而出口阀(8)允许取出排出的原料和/或丝状真菌生物垫。透气膜(2)可以由聚合物材料构成，例如作为非限制性实例，聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚酰胺(例如尼龙)、聚吡咯烷酮、聚(酰胺基胺)树枝状聚合物复合物、聚偏二氟乙烯、聚醚砜、乙酸纤维素、纤维素酯的混合物和/或丁二烯-丙烯腈。另外和/或备选，可渗透膜可以包含玻璃纤维材料、多孔陶瓷材料和/或织物，诸如作为非限制性实例，聚丙烯织物、聚四氟乙烯织物和/或尼龙网滤器。虽然透气膜(2)的孔径范围通常为约0.2μm-约25μm之间的任何0.01μm增量或数值范围，包括作为非限制性实例，0.2μm,0.22μm,0.45μm,1.0μm,5μm,10μm和11μm，但是膜(2)可以为无菌的布样材料的形式或纸样材料的形式。对于某些用途，膜的表面质地光滑，对于其他用途，表面质地粗糙。另外，用于气体扩散的路径可以从基本直接变化到遵循更曲折的路径。
在其他情况下，膜促进氧气的进入和真菌生长期间产生的其他气体的排出(图14)。在此情况下，密闭反应器(1)具有气体收集室(14)，其紧接在透气膜(2)的顶部(见图16)。气体收集室(14)可以由与用于反应器的壁/挡板(9)或底部(3)的材料相似的材料制成；即硬和软塑料两者，例如聚对苯二甲酸乙二酯、高密度聚乙烯、聚氯乙烯、聚乳酸、聚碳酸酯、丙烯酸、乙缩醛、尼龙、丙烯腈丁二烯苯乙烯、玻璃、金属如铝、钛、不锈钢等和/或它们的组合。或者，气体收集室由通道(15)构成，该通道(15)可以反映气密反应器(1)的通道(4)，或者包括气密反应器通道(20)的超过一个(见图17)。
在其他系统中，分开的透气膜用于气体的进入和外出。图18显示了此类系统。在此种情况下，两个不同的透气膜(2、50)进料到分开的气体收集通道(30、40)中，并存在于单个反应器通道(4)上。这种类型的系统允许不同的有用气体进入、外出和/或收集和/或分离。例如，一个膜可以针对氧气通过校准，而第二膜针对二氧化碳或氢气通过或其他相关的气体系统校准。
可以接种丝状真菌，并且可以在膜的任一侧或任何一侧上培养生物垫，包括但不限于，上侧、下侧、面向大气侧和/或面向气体顶部空间侧、或面向原料侧。培养生物垫的生长特性(包括但不限于密度和生物垫生长的膜的侧面)可以通过控制生物反应器的各种参数来控制，例如接种真菌的膜侧面、膜材料、膜孔径和厚度、温度、湿度、压力、波长或光量等。通常已经发现，当原料与可渗透膜不断相互作用(即物理接触)，并且生物垫生长在膜的相对(即面向大气或气体顶部空间)侧上时，实现生物垫的最佳质量。特别地，在一些实施方案中，生物垫生长到气体顶部空间中可能是有利的，该气体顶部空间被密封或以其他方式与周围大气隔离并且随着生物垫生长和产生水而允许变湿。生物反应器配置为允许生物垫，特别是生物垫的丝状真菌的菌丝在生物垫生长期间保持基本干燥(即不与液体生长培养基或其他游离液体水分接触)也是有利的。
随着生物垫生长，生长的真菌的呼吸过程产生水，水积累在生物反应器内(通常在膜的气相侧)。除了提供适合于进一步的生物垫生长的潮湿环境外，此积累的水本身也可以作为有价值的产物收集起来，并用于任何合适的目的。因此，本发明的一个优点是可以将一部分原料(其可以包括废物如动物的粪便或尿液)转化成干净水。可以适当地产生干净水的其他原料可以包括但不限于下列任一种或多种：糖(例如蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、稀有糖等)、糖醇(例如甘油、多元醇等)、淀粉(例如玉米淀粉等)、淀粉衍生物、淀粉水解产物、氢化淀粉水解产物、木质纤维素浆或原料(例如甜菜浆，农用浆、木材浆、酒糟、啤酒废料等)、玉米浆、酸乳清、甜乳清、乳清、小麦浆、工业液(industrial liquor)、食物提炼产品/废料流、农作物残留物(例如小麦秸秆、大麦秸秆、稻秸秆、豌豆、燕麦、细粮(small grain)秸秆、玉米秸秆，玉米纤维(例如玉米纤维胶(CFG)、干酒糟(distiller dry grain，DDG)、玉米面筋粉(corn gluten meal，CGM)、柳枝稷(switch grass)、苜蓿草(hay-alfalfa)、甘蔗渣(sugarcane bagasse)、非农业生物质(例如藻类生物质、蓝细菌生物质、城市树木残渣(urban tree residue))、蔬菜(例如胡萝卜、绿花椰菜(broccoli)、大蒜、马铃薯、甜菜、花椰菜)、森林产品和工业残留物(例如，软木第一/二级磨渣(mill residue)、硬木第一/二级磨渣、再生纸浆污泥、厌氧消化物)、含木质纤维素的废物(例如新闻纸、废纸、酿造谷物、用过的橡胶轮胎(URT)、市政有机废物、庭院废物、临床有机废物、糖、淀粉、废油、橄榄油、橄榄油加工废物、蟋蟀排泄物(cricket excrement)以及生物燃料生产期间产生的废物(例如经加工的藻类生物质，甘油)。
随着生物垫生长，生长的真菌的呼吸过程也可产生一种或多种气体，例如氨、氢气和/或挥发性酯。在实施方案中，膜可以是选择性的透气膜，其允许分开和/或分离由真菌呼吸产生的至少一种气体。
可以利用膜的一侧和膜的另一侧之间的压力差来影响生物垫的丝状真菌的各种特性。例如，本发明考虑了在膜的一侧或两侧上的非大气压，例如在一侧上的超大气压或亚大气压和在另一侧上的大气压，或者在两侧上的超大气压或亚大气压或在一侧上的超大气压和另一侧上的亚大气压。作为非限制性实例，生物垫的生长速率可以受到影响，例如膜的原料侧的正压可以类似于“强制补料(force-feeding)”生物质并加速生物垫的生产和/或增加产率，而膜的“干”侧的正压可以导致生物量的产生变慢，导致真菌生物量的组成或物理性质变化。相反，在一些实施方案中，生物垫在生长期间保持干燥对于生长速率可能是有利的，因此可以观察到相反的效果，即正压导致“更湿”、生长更慢的垫，而负压导致“干燥”的、生长更快的垫。压力的选择性施加也可以适合于确定对于给定的生物反应器的应用最有利的膜类型，例如压力变化对于给定孔径的膜可以是更有利的或不太有利的。气体顶部空间和/或环境中的大气压变化也可以影响生物垫的生长特性，例如气生菌丝的产生、菌丝、菌丝体和/或细丝的产生以及生物量的密度，并且甚至可以用来促进膜上丝状真菌的接种。
在实施方案中，可以自然地或通过接种在生物反应器内的膜的任一侧上有利地提供蓝细菌。蓝细菌(无论是活的还是死的)可以有利地促成作为碳和氮源的原料的营养特性。另外，活的蓝细菌可以作为呼吸的产物，充当氧源以促进生物质的生长。这些优点中的任一个或两个都可以使本公开的生物反应器特别适用于其中其他解决方案是无法实现的各种应用，例如长期载人航天任务。图29显示了包含呼吸蓝细菌的生物反应器的实施方案的示例性示意图。
尽管在大多数实施方案中必须施加轻微的力来收获(即从膜表面取出)生物垫，但是在一些实施方案中，生物垫可以是“自收割的”，即，它们可以自发与膜分离。本发明人特别地观察到此种现象，例如，当生物垫具有高的水含量时，当原料中存在油酸时，和/或当膜相对较薄(例如，小于0.2mm厚)、光滑和以低曲折因子为特征时。在一些实施方案中，可以通过施加压力来实现自收获。生物垫对膜的粘附强度可以取决于任何一种或多种生物反应器参数，并且因此可以通过控制任何一种或多种生物反应器参数来选择，例如，丝状真菌种类、原料组成、膜特性(例如材料、孔径、几何形状/粗糙度等)、膜的任一侧上的压力和/或跨膜的压差等。因此，本公开内容的一方面在于提供垫，该垫通过自发地与膜表面分离而自身收获。
反应器(1)产生生物垫，其充当食物来源，例如蛋白质来源和/或油来源。然而，生物垫还可以充当皮革类似物、生物塑料、生物燃料前体的来源、生物燃料和/或它们的组合。在其他实施方案中，生物垫用于产生有机产物，例如有机酸、抗生素、酶、激素、脂质、真菌毒素、维生素、色素和重组异源蛋白质。
公开的生物垫反应器发酵技术使得能够在标准以及极端原料和培养基如人废物(尿/粪便)上生长，并且在无需分离或浓缩步骤的情况下产生高度固结且有质地的产物。相对较高的生物质生产率-即至少约0.05g/L/h的干生物质(即每小时每升原料产生的干生物质的克数)，或至少约0.10g/L/h的干生物质，或至少约0.15g/L/h干生物质，或至少约0.20g/L/h干生物质，或至少约0.25g/L/h干生物质，或至少约0.30g/L/h干生物质，或至少约0.35g/L/h干生物质，或至少约0.40g/L/h干生物质，或至少约0.45g/L/h干生物质，或至少约0.50g/L/h干生物质，或至少约0.55g/L/h干生物质，或至少约0.60g/L/h干生物质，或至少约0.65g/L/h干生物质，或至少约0.70g/L/h干生物质，或至少约0.75g/L/h干生物质，或至少约0.80g/L/h干生物质，或至少约0.85g/L/h干生物质，或至少约0.90g/L/h干生物质，或至少约0.95g/L/h的干生物质，或至少约1.00g/L/h的干生物质-和/或例如在分批过程的核心中，至少约10g/L，或至少约20g/L，或至少约30g/L，或至少约40g/L，或至少约50g/L，或至少约60g/L，或至少约70g/L，或至少约80g/L，或至少约90g/L，或至少约100g/L，或至少约110g/L，或至少约120g/L，或至少约130g/L，或至少约140g/L，或至少约150g/L，或至少约160g/L，至少约170g/L，或至少约180g/L，或至少约190g/L，或至少约200g/L的高产量(例如每升原料产生的生物垫的克数)在不需要主动通气或搅动的情况下实现。垂直、水平和/或在超过两个维度上按比率放大系统是简单的，并且不导致降低的生产率。生产的生物垫通常厚0.2至2.5cm，干物质含量为10％至30％，并且可以容易用于任务关键需求，例如肉类备选、无数其他美味食品和建筑材料。
在公开的反应器系统中培养的真菌生物垫可以描述为厚菌膜，其在许多方面类似于在表面上培养但与本文描述的生物垫厚度一致并且在气-液界面处存在的微生物生物膜。例如，已显示生物膜内的细菌细胞承受用次氯酸钠(漂白剂)和氢氧化钠的极端消毒处理(Corcoran，2013)。公开的反应器系统利用生物膜结构，能够在苛刻的人类和工业废物以及副产物上生长，所述人类和工业废物以及副产物可以是在极端条件下产生的，例如在太空任务中产生的那些或由自然灾害引起的其他苛刻条件产生的那些。
公开的反应器设计并入直接位于原料液体表面上或刚好悬浮在原料液体表面上方的可渗透膜。在一个实施方案中，包囊的反应器设计允许与外部大气进行气体交换，但经过气密密封以防止污染物进入或气体/液体逸出。包囊的反应器设计还可以通过透气膜将消耗性气体与逸出气体分离。为实现这点，在某些情况下，使用具有相同或不同特性的阀和/或其他多孔膜在一种或多种原料和任选的液体培养基的各个方面之间形成不同的层。
已经使用多种可渗透膜材料证明了使用公开的反应器设计的快速生物垫生长。图13显示了在反应器中培养的约7mm厚的生物垫，其中容器是覆盖有聚丙烯膜的培养皿，该膜直接置于原料/液体培养基表面上。最初的生物膜是通过直接附着于膜形成的，并随时间向下生长到液体培养基中(见图12)。到5天的生长期结束时，基本上所有的原料/液体培养基都被消耗掉，并且致密的生物质完全充满膜下的体积。
产生的生物垫仅温和粘附于膜，并且通过简单地将生物垫从膜上剥离而容易收获(见图13A-13D)。用聚碳酸酯膜的其他实验产生相似的结果(数据未显示)。因此，总反应器体积可以有效地用于生产致密的、易于收获的生物质。作为非限制性实例，本发明的生物反应器可以采用密封“包囊”的形式，包括四个膜：外上膜、内上膜、内下膜和外下膜。在此类实施方案中，可以在内上膜和内下膜之间提供原料，由此原料“夹在”任一垂直侧的气体顶部空间之间(即在外和内上膜之间以及在外和内下膜之间)。因此，生物垫可以在内膜的外表面上生长，进入原料任一侧的气体顶部空间中，而由于外膜(在实施方案中其可以是透气性或半透气膜)而与周围大气至少部分隔离。“包囊”生物反应器可以是高体积效率的生物反应器，其可在空间珍贵时使用，例如在航天器上或在紧急和救援情况下。
如本文所述，在所公开的反应器中通常产生的生物垫是高度致密的，并且根据真菌和生长条件而呈现出纤维质地。纤维生物质的生产对于某些关键任务产品至关重要，例如需要质地模拟肉类的食物产品以及模拟皮革和木材的纤维材料。生物质的致密性质也使得容易收获而无需浓缩步骤(例如，离心，过滤)。生物垫的密度可以在约0.01g干生物垫重量/cm3至约1g/cm3的范围，以及此范围内的任何子范围内。在一些实施方案中，密度可以大于约0.01、大于约0.02、大于约0.03、大于约0.04、大于约0.05、大于约0.06、大于约0.07、大于约0.08、大于约0.09、大于约0.1、大于约0.2、大于约0.3、大于约0.4、大于约0.5、大于约0.6、大于约0.7、大于约0.8、大于约0.9或大于约1g/cm3。
现在参考图23，显示了几种不同的生物反应器配置，每种都在本公开的范围内。在标记为1的配置中，原料布置于膜下方并与膜物理接触，并且生物垫从膜的上表面向上生长(尽管在某些实施方案中，真菌材料也可以从膜的下(即原料侧)表面向下生长。在标记为2的配置中，生物垫直接在原料表面上生长(即，在生物垫和原料之间不存在膜)进入气体顶部空间，并且原料、生物垫和顶部空间通过膜与周围环境分开；该实施方案的膜可以与其他实施方案中布置于原料和生物垫之间的膜相似或不同。在标记为3的配置中，提供了两个膜：分开原料与生物垫的下部膜(如在标记为1的配置中)和分开生物垫和生物垫上方的气体顶部空间与周围环境的上部膜(如标记为2的配置中)。在标记为4的配置中，提供了“倒置(upside-down)”的生物反应器方案，其中原料在膜的上表面上提供，并且生物垫从膜的下表面向下生长到气体顶部空间和/或周围环境中(尽管在一些实施方案中，真菌材料也可以从膜的上部(即原料侧)表面向上生长)。
现在参考图24A和24B，显示了在生物垫产生之前(图24A)和之后(图24B)根据图23中标记为“1”的配置的生物反应器的“气密”(相对于环境紧密密封)实施方案。如图24B所示，通过丝状真菌的呼吸产生的淡水已经冷凝并在膜的气相侧上积累。
现在参考图33，显示了尼龙网滤膜。在此实施方案中，尼龙网滤器由两个尼龙膜(孔径为11μm)组成，它们“堆叠”(即物理接触放置，使第一膜的第二表面邻接第二膜的第一表面)，以减少膜的有效孔隙率，并使膜保持在原料表面上方。根据本公开，此种类型的膜适合于培养真菌生物垫。
现参考图35A及35B，说明膜包膜生物反应器(MEBR)。在该实施方案中，MEBR包括与培养基储槽流体连通且封闭多个膜包膜的封闭腔室或储物柜。如图35A中所说明，随着生长培养基从培养基储槽进入MEBR，其流入至多个膜包膜的各者中。如图35B中所说明，各膜包膜包括在各侧上经半透膜围绕的多孔内核材料。随着生长培养基流过膜包膜，其与多孔内核材料接触并流过，从而使丝状真菌生物垫藉由半透膜进入生长培养基且因此生长于半透膜的外表面上。
应清楚地明了，生物反应器的各种其他配置是可预期的且在本发明的范畴内。作为非限制性的实例，一个此类配置是“槽”生物反应器，其中提供具有相对小孔径(例如0.2μm)的向上开放弓形亲水性膜作为槽，及纵向平行于膜提供具有穿过其的孔的软管。可提供原料，例如藉由喷涂穿过软管中的孔以确保槽的内/上弓形表面始终与生长培养基均匀饱和。然后，生物质可生长于槽膜的相对侧，亦即外/下表面，且在实施方案中当达成一定质量时可藉此在其自身重量下从膜掉落。
在零重力下使用生物垫反应器
控制公开的反应器中生物垫的形成和生长的主要物理力是对膜的附着。不受理论的束缚，认为在公开的反应器中培养的生物垫将不受空间飞行期间经历的零重力条件的影响。重力驱动的定向生长或通过物理混合或流动控制的生长不是系统中的首要因素，如在重力环境中往往如此。先前在太空中进行的实验成功地证明了真菌的生长，欧洲航天局，第25-28号探险，太空中有色真菌的生长和生存(CFS-A)，为所公开的反应器系统将在空间环境中发挥功能提供了更多的信心。
为了太空任务和易于部署，可将冷冻干燥的接种物和支持在特定原料上生长的必要成分(若需要的话)预加载在反应器中。然后，宇航员和太空旅行者可以准备原料、接种物和任何培养基成分。温育时间取决于原料、微生物的菌株以及其他生长参数，例如pH、温度和水含量。温育条件是简单的，因为发酵是在静态条件下进行的，在该条件下仅允许反应器就地温育。可以通过简单打开反应器密封物(例如
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型)并取出垫收获致密的固结生物垫。
虽然已经详细描述了本发明的各种实施方案，但是显然本领域技术人员会想到那些实施方案的修改和改编。然而，应明确理解，如所附权利要求书中所阐述的，此类修改和改编在本发明的范围内。提供这些实施例和附图仅出于说明的目的，而并不意图限制本发明的范围。在不与本公开内容不一致的程度上，将本文公开的每个出版物或其他参考文献通过引用整体并入本文。
实施例
实施例1：镰孢菌菌株MK7和其他真菌在静态盘式反应器中的生长。
在PCT/US2017/020050中所述的浅静态托盘反应器中培养丝状嗜酸性镰孢菌菌株MK 7、灵芝(灵芝；图1A)、糙皮侧耳(珍珠蚝菇，图1B：和蓝蚝菇，图1C)、绣球菌(花椰菜；图1D)、榆菇(榆耳；图1E)、大秃马勃(大秃马勃菌；图1F)和Fusarium venenatum生物垫。
实施例2：镰孢菌菌株MK7生物垫在每天更换的营养物培养基上的生长(半静态条件)。
在21天中在每天更换的营养物培养基中培养约3cm厚的致密的镰孢菌菌株MK7生物垫。使用在12.7x17.8cm
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玻璃托盘中含有pH 3.0的7.5％甘油的无菌MK7-1液体培养基(在PCT/US2017/020050中描述)生成生物垫。为了开始实验，如先前在PCT/US2017/020050中所述，在指数增长后期，用5％(体积/体积)的镰孢菌菌株MK7培养物接种200mL的营养物培养基。将200mL接种的培养基添加到三个无菌托盘的每个，所述托盘以无菌粗尼龙网筛为衬里。将培养物在室温(约22℃)不受干扰地温育4天，以形成在液体表面处形成的初始生物垫层。生长4天后，使用尼龙网筛将生物垫轻轻地从托盘中提出，并以45度角倾斜，以使液体从垫中排出。使生物垫在该位置中排干，直到每五秒滴出少于1滴液体。平均约3分钟后发生足够的排干。将在其筛中滴干的生物垫放在含有200mL新鲜MK7-甘油培养基(在PCT/US2017/020050中描述)的新鲜预先称重的12.7x17.8cm
Figure GDA0003479952310000531
托盘中。重新称重带有生物垫的托盘。将生物垫移动到另一个含有新鲜培养基的托盘的过程约每天重复再进行17天。在第12天、第15天和第21天对生物垫之一进行取样，并测定这些生物垫的含水量。生物垫的平均含水量为17.3％(标准差＝0.7)，并且该值用于计算实验持续时间内干生物质产量。从第4天到第18天，干生物质产量呈线性(r2＝0.995)，此后生物质重量稳定在约2.5Kg干/m2(图1，相对于每m2标准化的y轴，生长通常在第0天和第4天之间呈指数)。在此线性增长时间段内的平均生长率为6.04g/m2/h。图2显示了使用此方法在总共生长21天后形成的约3cm厚的生物垫。
为证实这些发现，重复相同实验方案，此次是在其中生物垫生长期间不更新培养基的对照盘旁边。该比较实验的结果绘示于图36中。如图36显示，其中更新培养基的盘显示在长两倍(21天相对于10天)的时间内生物垫生长快约三倍(每天每平方米109公克相对于34克干生物质)。令人意外地，已发现更新生长培养基不仅保持与对照相同的生长速率，但事实上促进生长；其中直至第3天(在首次更新培养基之前)，经更新的盘及对照均显示相似生长量，在始于第3天与第4天之间的经更新的盘中观察到生长率显著增加，且该增加几乎持续整个实验过程。
实施例3.在连续流动条件下生物垫的生长。
制作连续流生物反应器系统，以证明生物垫在流动液体培养基表面上的生长。系统由2.44m长的透明塑料覆盖板制成，具有一系列用作流动通道的波纹(图3)。每个通道的末端都用硅(100％硅树脂，DAP Products Inc.,Baltimore,MD)拦起，使液体能够保留在通道内。通过经由蠕动泵将液体培养基递送到通道的一端来促进通过通道的流动，液体通过通道底部的孔离开通道的另一端。整个塑料覆盖板系统以每1m运行1厘米上升的角度倾斜，以使约500mL的液体能够保留在每个通道中，并且恒定流是液体量和倾斜角度的函数。
将板系统进行消毒，并且用
Figure GDA0003479952310000532
样塑料膜包裹起来以使系统与周围的室环境隔离。以400mL/min的速率在塑料膜下泵送无菌空气，在系统上创建正压。为了在开始流动之前启动生物垫的形成，每个通道添加500mL体积的用期望丝状真菌接种的营养物培养基，并且允许在静止/静态条件下温育4天。4天后，蠕动泵以400mL/d的连续脉冲流递送以给生物膜“补料”(以2.016mL/min开启49分钟39秒；关闭5小时10分钟21秒)。进行两个独立的实验，每个实验使用两个分开的流动通道作为重复(图3)。
在营养物培养基上生长10天后(在静止/静态条件下4天，然后在连续流动下6天；图4)收获固结的生物垫。对于重复流动通道，所产生的生物质的平均干重为2.38g的平均值。在连续流动期期间(第4天到第10天)，生长中的生物垫从流动液体培养基中的C和N的平均除去速率分别为11.9和1.2mg/L/h。通过使用Costech总C和N分析仪(ECS 4010，CostechAnalytical Technologies，Valencia，CA)测量液体体积以及生物反应器系统的总C和N输入和输出来确定从液体培养基中的C和N除去速率。因此，连续流系统支持表面处的生物垫生长。实验还充当镰孢菌菌株MK7生物垫生长的连续补料和固结生物垫生成的实验室规模演示。应当注意的是，用此种类型的系统可以实现其他原料、流速和所得的生长速率。例如，凭借pH 2.8的MK7-1培养基中的10％的甘油(PCT/US2017/020050中所述)，预期产率是每m2每天大于40克干生物质。
实施例4.镰孢菌菌株MK7生物垫的半连续和连续生产。
在19天的时段内半连续培养并收获致密的镰孢菌菌株MK7生物垫。使用酸乳清作为原料/碳源产生生物垫，所述原料/碳源补充有1/2强度MK7-1培养基盐(在PCT/US2017/020050中描述)，调整至pH 4.0。为了启动实验，将200mL接种有指数生长期后期的镰孢菌菌株MK7菌株(5％体积/体积)的营养物培养基添加到经灭菌的12.7x17.8cm
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玻璃托盘中，所述托盘然后用
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膜覆盖，并在室温温育。生长5天后，通过切割并取出5.9x12.7cm的生物垫切片来取出来自托盘一端的1/3生物垫(图5A)。然后，将剩余的2/3生物垫物理移动到培养基的开放区域，该区域是通过取出生物垫的1/3部分创建的。如下转移生物垫：通过用无菌的带手套的指物理抓取它，并拉动生物垫，直到其接触托盘的末端以开放培养基，在托盘的另一端没有形成的生物垫(图5B)。定期重复以下过程：收获生物垫的最成熟部分的1/3部分，然后将剩余的2/3生物垫移到开放区域。每4天从托盘中无菌取出50mL培养基，并用50mL新鲜无菌培养基(具有1/2强度MK7-1的酸乳清)替换，以补充通过取出生物垫而从液体培养基中除去的营养物。在第5天到第19天之间，使用此方法的干生物质产量产生0.57g/天/托盘或25.2g/d/m2(图6)。因此，证明了半连续生产系统，由此以1.56cm/天的平均速率收获生物垫的最成熟端，并且在托盘另一端的培养基的开放区域开始新鲜的生物垫生长。
系统还适合于生物垫的连续收获和生长，由此通过附着于生物垫的成熟端的滚轮促进连续取出(图7)。滚轮缓慢转动并收获成熟的生物垫，同时在托盘的另一端创建用于新生物垫生长的开放培养基。滚轮以1.56cm/天的速率转动并收获生物垫，以重现上述的半连续系统。期望以通过生物垫除去营养物的速率来补充液体培养基中的营养物。
实施例5.膜包囊的生物反应器。
在液体生长培养基中培养致密的镰孢菌菌株MK7生物垫，该培养基包囊在没有气体顶部空间的生物反应器系统中。将无菌培养皿底部(直径55mm)用57mL接种有MK7-1的含有8％甘油的培养基(在PCT/US2017/020050中描述)填充至边缘。将聚丙烯和聚碳酸酯的透气/半透膜直接放在液体培养基的表面上，并用橡皮筋紧密密封。生长期开始时没有提供气体顶部空间。
接种培养基并密封膜后，允许生物反应器在不受干扰的情况下静置直至收获。图8显示了镰孢菌菌株MK7的约5mm和约1mm厚的生物膜，它们分别在五天内直接在聚丙烯(图13A-13C)和聚碳酸酯(图13D)膜下面生长。生物垫温和粘附于膜，并且通过简单地将生物垫从膜上剥离容易地收获(图13)。
实施例6：通过用UVB照射镰孢菌MK7生物垫产生色素和维生素D2
使用UVB光(290-320nm)触发由镰孢菌菌株MK7生物垫的色素产生。用UVB光照射在7.5％甘油MK7-1培养基(在PCT/US2017/020050中描述)上在3天内产生的镰孢菌菌株MK7生物垫达4小时时间段。UVB光从放置在生物垫上方10cm的50W灯泡(Slimline Desert 50UVBT8荧光灯泡，46cm；Zilla，Franklin，WI)发出。照射0.5小时后视觉检测橙色色素沉着，并且照射4小时后是明显的(图9)。此外，尚未暴露于UVB光的生物垫具有小于50IU/100g生物垫的维生素D2含量，而在UVB光暴露约12小时后，维生素D2含量增加至约120万IU/100g生物垫。
实施例7：在甘油、淀粉和玉米浆的混合物上培养的镰孢菌菌株MK7生物垫
从甘油、淀粉、玉米浆和MK7-1盐(在PCT/US2017/020050中描述)的混合物在短短4天内生产尖孢菌菌株MK7生物垫。甘油购自Duda Energy LLC(Decatur,AL；99.7％纯度；USP级；Lot#466135376340)；Argo Food Companies,Inc(Memphis,TN)生产的100％Argo玉米淀粉购自Bozeman,MT的Albertson超市，而玉米浆则购自Santa Cruz Biotechnology,Inc.(Dallas,TX；Lot#B0116)。生长培养基是7.5％甘油(重量/重量)、2.5％淀粉和2.5％玉米浆与MK7-1盐的混合物。通过添加适量的HCl将混合物调节至pH 3.3，并在合适的容器中煮沸15分钟。冷却至室温后，将混合物的pH重新调节至3.3，然后用如PCT/US2017/020050中制备的5％镰孢菌菌株MK7接种物(vol/vol)接种。将1.5L接种培养基的等分试样添加到三个经过消毒的0.25m2聚丙烯托盘中，放置在已完全用铝箔覆盖以创建黑暗条件的经过消毒的托盘架系统中，并在23°±1℃温育。在培养基表面生长的丝状真菌生物垫在4天后通过简单地将生物垫从托盘上提起而收获。
三个托盘中残留液体的平均最终pH为4.45(标准差＝0.14)。在随机位置从每个生物垫中切出三个56.7cm2的圆形部分并取出，并将这些部分在50℃干燥48小时以获得干重。平均生物质干重(标准差)为124.6g/0.25m2(43.4)或498.4g/m2(173.6)。湿生物垫的平均厚度为7.5mm，并且以干重计的平均密度为0.66g/cm3。
为了暴露生物垫细丝并通过场发射扫描电子显微术(FE-SEM)进行检查，通过用乙醇清洗来除去细丝之间的胞外基质(ECM)。为了实现这点，在收获前立即用剃须刀片切下1cm2的部分(1cm x 1cm)的生物垫，并将切下的部分如下进行乙醇清洗/脱水系列：在40mL乙醇混合物中序贯浸没样品达记录的时间：25％乙醇，75％去离子H2O达20分钟；50％乙醇，50％去离子H2O达20分钟；75％乙醇，25％去离子H2O达20分钟；95％乙醇，5％去离子H2O达20分钟；100％乙醇，0％去离子H2O达60分钟。再将100％乙醇处理重复2次，然后将样品存储在100％乙醇中。
为保留FE-SEM的生物垫的微观结构完整性，乙醇清洗/脱水继之以临界点干燥，其按照制造商的说明(Tousimis Samdri-795操作手册；Tousimis,Rockville,MD)，使用Tousimis Samdri-795临界点干燥机进行。临界点干燥后，将样品直接安装到铝制短管上或在安装前用剃须刀片切成<0.3mm厚的切片。然后，将样品用铱(20μm,EMITECH K575X,Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA)包被，并用JEOL 6100FE-SEM用1keV的入射光束能量(JEOL USA,Inc.,Peabody,MA)进行检查。
FE-SEM成像揭示了交织的菌丝细丝的复杂网络(图10)，与如PCT/US2017/020050中报告的通过光学显微术对在甘油上培养的生物垫揭示的结构非常相似。观察到三个不同的层：(a)顶表面的气生菌丝层，(b)致密的底层，和(c)顶层和底层之间的过渡层。过渡层仅松散地附着于致密的底层，因此可以容易地将底层与其他生物垫分离。过渡层的细丝密度范围从比两层相遇区域的底层密度稍低到与生物垫顶部附近的气生菌丝相当的密度。
还通过按照以下所示的顺序和时间缓慢浸入以下溶液中制备切下的样品用于光学显微术：
二甲苯，3min；二甲苯，3min；100％乙醇，3min；100％乙醇，3min；95％乙醇，3min；95％乙醇，3min；70％乙醇，3min；去离子水，3min；苏木素1，1.5min；流动自来水漂洗，1min；澄清剂溶液，1min；流动自来水漂洗，1min；发蓝溶液，1min；流动自来水漂洗，1min；70％乙醇，30次浸入；95％乙醇，30次浸入；95％乙醇，30次浸入；100％乙醇，30次浸入；100％乙醇，30次浸入；100％乙醇，30次浸入；二甲苯，30次浸入；二甲苯，30次浸入；二甲苯，30次浸入；施加盖玻片。
用剃须刀片从新鲜的生物垫切下约2cm2大小的生物垫切片，之后立即收获。然后将这些切片浸入50mL锥形底部离心管中的35mL去离子水中。将管超声处理(CP200TUltrasonic Cleaner,Crest Ultrasonics,Ewing,NJ)0、40、90或150秒，以将细丝分散到液体中并进行显微镜观察。将来自这些管的液体等分试样(约100uL)放在载玻片上，盖上盖玻片，然后用光学显微镜(B400B，Amscope，Irvine，CA)以100倍放大倍数观察。测量未破碎细丝的平均长度(标准差)，并且对于0、40、90和160秒的超声处理，测定分别为1.1(0.6)、1.2(0.4)、1.0(0.4)和1.2(0.2)mm。在每种处理中观察到的最大细丝长度分别为2.5、1.4、1.8和1.4mm。与平均长度小于0.02mm的浸没式摇瓶培养物中的尖孢镰孢菌菌株MK7的生长相比，这些细丝的长度明显更长。
实施例8：使用在甘油、淀粉和玉米浆的混合物上培养的镰孢菌菌株MK7生物垫生产鸡块
使用如上所述生产的镰孢菌菌株MK7生物垫来产生鸡块。将湿的生物垫在97℃的锅蒸锅中蒸0.5小时，冷却至室温，并用作生产鸡块的基础。将蒸过的湿生物垫(200g)切成小于0.5mm长的碎片，并用4％(重量/重量；8g)鸡基础和4％蛋清蛋白(8g)同质化，所得混合物包含超过90％的镰孢菌菌株MK7生物垫。将此生物垫混合物的部分(约30g)形成块形状，并在锅蒸锅中蒸煮。通过在蛋清上包被，然后与粘附于表面的面包屑混合，然后油炸，以使制成的块成为面包。制备的块表现出鸡肉样质地，并散发出典型的鸡肉香气。由5个人进行的味觉测试认为，就口味和质地而言，块紧密模拟含有实际鸡肉的鸡块。
实施例9：镰孢菌菌株MK7生物垫提取物的生产。
从镰孢菌菌株MK7生物垫中产生高浓缩且粘合的提取物。如前所述，将培养4至16天后收获的生物垫冲洗和蒸煮，在多孔的塑料网上滴干5分钟，然后置于塑料袋中并密封。在将剩余培养基液体的pH调节至pH 4-6后将密封袋在-20℃或-80℃冷冻24小时，之后60℃培养箱中在原始密封袋中温育48小时。热处理后，将生物垫压过孔径<1.5mm的滤器，并收集所得液体。将收集的液体在无反应性的容器中煮沸10分钟，然后在60℃干燥直至水分含有约6-8％，形成粘的糊状提取物。提取物的营养价值类似于经蒸煮的生物垫的营养价值和由经蒸煮的生物垫制成的粉状物。
实施例10.从在酸乳清上培养的镰孢菌菌株MK7生物垫生产酸奶。
直接使用镰孢菌菌株MK7生物垫生产酸奶。在托盘上在作为希腊酸奶生产副产物生成的酸性乳清原料/碳源上培养生物垫，在6天后收获，并在收获后20分钟内蒸煮。将200g冷却的，湿的生物质与600g饮用质量的自来水混合在一起，制成乳状的悬浮液，称为“MK7液体分散体”。MK7液体分散体单独或与牛奶组合用作成分以产生酸奶。
制备了三种混合物，它们含有不同比率的MK7液体分散体与全脂奶：1)25％MK7液体分散体:75％全脂奶，2)50％MK7液体分散体:50％全脂奶，和3)100％MK7液体分散体。通过将每种混合物加热至83℃，并在恒定搅拌的情况下于该温度保持14分钟，将混合物用于制备三批酸奶。允许混合物冷却至43℃，然后添加活酸奶培养物作为接种物。将所得混合物在酸奶机(YM80型；EuroCuisine,Los Angeles,CA)中于44℃温育8小时。所有所得混合物均具有酸奶的外观和质地，以及与典型酸奶相似的气味和味道。
实施例11：在甘油上蘑菇生物垫的生长。
使用甘油作为主要碳源(原料)，在短短10天内生产出由Baby Bella Brown褐菇(双孢子蘑菇)和白蘑菇(White Mushrooms)构成的生物质生物垫。这些常见的食用蘑菇购自Bozeman,MT的Albertson超市，并于4℃贮存。用于培养蘑菇的培养基由1L的7.5％甘油与MK7-1盐组成(在PCT/US2017/020050中描述)，其煮沸10分钟，然后冷却至室温(约23℃)。将混合物的pH调节至2.7，并将200mL的经pH调节的混合物倒入两个无菌的12.7x17.8cm
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托盘中。接种物由5g混合的、经表面灭菌的褐菇或白菇组成，将其添加到每个托盘的培养基中。蘑菇接种物如下制备：1)将10g湿的褐菇或白菇添加到200mL的5％漂白剂溶液，并将悬浮液搅拌2分钟以对蘑菇进行表面消毒，2)然后通过转移到200mL无菌甘油/MK7-1盐培养基(在PCT/US2017/020050中描述)并搅拌2分钟将蘑菇冲洗，3)将经表面消毒的蘑菇在通过用70％乙醇漂洗消毒的咖啡研磨机中混合30秒，4)通过用经研磨的生物质重复步骤1和2再次对经研磨的蘑菇生物质(<5mm长的聚集体)进行表面灭菌，5)将5克经研磨的蘑菇生物质添加到
Figure GDA0003479952310000592
托盘中的液体培养基中(添加蘑菇后，最终pH＝4.0-4.1)，并且6)将托盘覆盖，并允许在黑暗中于室温(22±2℃)温育。
温育3天后，观察到生物垫在培养基表面上形成，并且生长10天后收获固结的生物垫。褐菇的生物垫覆盖托盘中液体培养基的整个表面，而白菇的生物垫生长以五个浮动生物垫岛覆盖约1/2液体培养基。褐菇的生物垫平均厚度为1.5mm，并且白菇的生物垫平均厚度为1.7mm。生物质生物垫在50℃干燥48小时，并且对于褐菇和白菇每个托盘产生的干重分别为1.14g和2.12g。干生物质生物垫的干重密度分别为褐菇和白菇的0.033和0.111g/cm3。
显微镜图像揭示了生物垫的菌丝体性质。褐菇和白菇生物垫的平均菌丝厚度分别为25.2μm(标准差＝6.2)和18.7μm(4.0)。
使用生产的褐菇生物垫产生鸡块。将生物垫在97℃蒸煮0.5小时，冷却至室温，并用作生产鸡块的基础。将经蒸煮的湿生物质(2.5g)与3％(重量/重量；75mg)Better ThanBouillon鸡基础(Southeastern Mills,Inc.Rome,GA)和3％蛋清蛋白(Eggwhite Protein)(75mg；Now Foods,Bloomingdale,IL)混合，然后用剃须刀片切成少于2mm长的碎片。将混合物形成块，并蒸煮0.5小时。制备的块提供了典型的鸡肉香气，带有轻微的蘑菇香气。在品尝时，块具有鸡肉风味至中性风味。
实施例12.在麦芽和甘油培养基上蘑菇生物垫的生长。
使用麦芽提取物培养基001、甘油培养基002、Hansen培养基、MK7-SF培养基、麦芽提取物+NH4NO3培养基003(表3)，在短短5天内生产生物质生物垫，其包括大秃马勃、刺芹侧耳(珍珠平菇)、糙皮侧耳columbinus变种(蓝平菇)、榆蘑、绣球菌(花椰菜)和灵芝。所有最终培养基均包含0.01％的氯霉素。
表3.添加到去离子水或饮用质量的自来水以制备营养物培养基的成分。
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使用表3中的上述配方，根据期望培养基的体积，通过将规定的成分混合到特定体积的水中，在2升
Figure GDA0003479952310000624
瓶或8升不锈钢锅中制备培养基。将成分添加到水中，期间用搅拌棒或汤匙连续搅拌液体。在添加下一个组分之前，将培养基的每种组分彻底混合到液体中，将MK7-SF培养基的pH值调节到5.0，并对该溶液进行高压灭菌。其他所有pH值源自简单地混合成分。将培养基和容器在20psi和121℃下高压灭菌至少20分钟。液体的渗透压(以重量摩尔渗透压浓度计)使用Advanced Instruments,Inc.渗透计3250型(Two Technology Way,Norwood,MA)测量。
高压灭菌后，使培养基冷却至室温，并用表4所示的蘑菇物种接种各个容器。
表4.蘑菇孢子(10cc注射器)购自MycoDirect(12172Route 47,Ste 199Huntley,Il 60142)，并于8/2/2018收到。榆蘑孢子购自Everything Mushrooms(1004Sevier AveKnoxville,TN 37920)，并且于8/3/2018收到。
批次 公司生产日期
蓝蚝菇 3-P7 2-2018
珍珠菇 9P8 12-2017
大秃马勃 N/A 3-2018
花椰菜蘑菇 N/A 4-2018
榆蘑(1cc干的) N/A 10-2017
使用无菌技术应用以下方法进行生长培养基的接种。这些实验中的所有无菌工作均在II级生物安全柜中进行。使用孢子注射器直接在之前高压灭菌的12.7x17.8cm
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玻璃托盘中接种约75mL生长培养基。这通过将液体培养基无菌转移到高压灭菌的
Figure GDA0003479952310000633
托盘中，允许培养基冷却到室温，并用2cc孢子注射器中的悬浮液接种来完成。将托盘用无菌铝箔覆盖，然后轻轻旋转以混合接种的培养基。
通过高压灭菌MEA无菌制备麦芽提取物琼脂(MEA；表5)板，允许冷却至50℃，并将约25mL倒入100x15mm无菌培养皿中。
表5.用于制备麦芽提取物琼脂的成分
Figure GDA0003479952310000631
通过将来自孢子注射器内包含的悬浮液的1cc液体等分取样到板上来接种MEA板。然后将琼脂板用
Figure GDA0003479952310000642
密封，并在室温下放入干净的深色抽屉中。
在菌丝体覆盖了MEA板的整个表面后，将它们用于在2L带挡板的摇瓶中接种1.5L培养基。用无菌剃刀刀片从板中切下具有菌丝体的琼脂培养基的约2cm2部分，并用无菌剃刀刀片切成约2mm2的部分，然后将其加入到含有1.5L麦芽提取物001培养基的两个烧瓶中。将培养基在室温(23±1℃)下温育3天，用手间歇摇动(用手将烧瓶剧烈摇动1分钟，每天最少摇动5次)。
然后，将摇瓶中的培养物用作6L麦芽提取物培养基001和6L麦芽提取物+NH4NO3003培养基的接种物。用15％(vol:vol)接种培养物接种培养基，并充分混合。将2升接种的培养基倒入三个0.25m2塑料托盘的每个中，所述托盘放置在托盘架中。将架用
Figure GDA0003479952310000643
包裹，并允许温育6天。相对致密的生物垫在4天内覆盖整个表面，并且在6天后收获生物垫。
通过将生物垫从托盘中提起并用手轻轻挤压收获来自12.7x17.8cm
Figure GDA0003479952310000644
玻璃托盘和0.25m2塑料托盘的生物垫。在设置在厨房烤箱燃烧器上的锅蒸锅中，将部分生物垫(3-50g)在沸水(水面以上约5cm)上蒸煮20分钟。蒸煮后，允许生物质冷却至室温，并且立即在
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袋中装袋，并送至Eurofins(Des Moines,IA)进行蛋白质分析(燃烧法测定N，测试代码QD252)。
表6.来自在各种类型的培养基中托盘中的一系列不同丝状真菌生长的结果
Figure GDA0003479952310000641
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Figure GDA0003479952310000661
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实施例13.镰孢菌菌株MK7鸡块
鸡肉风味的镰孢菌菌株MK7是许多食谱的基本成分，包括带或不带面包屑的鸡块、亚洲菜鸡肉或其他鸡肉菜作为鸡肉替代品。从不同的原料/碳源生产的镰孢菌菌株MK7生物垫导致鸡肉风味略有不同。甘油鸡肉更甜，而酸性乳清鸡肉往往更酸一点。
食物加工量和所使用的刀片(即锋利的金属刀片、钝的金属刀片、塑料刀片)导致不同的鸡块质地。此外，可以从极其多种生物质大小产生可接受的鸡块。也就是说，可以用刀切割生物质，进行轻度食品加工或高度食物加工，并且仍然导致可接受的鸡肉类似物。
使用镰孢菌菌株MK7:鸡汤:粘合剂(binder)的50–20:1:1比率，具有或没有约66.6％镰孢菌菌株MK7:脂肪比率。合适的脂肪包括鸭脂肪、椰子油和可可脂。混合后，将混合物蒸煮约30分钟以固化粘合剂；但是，一些粘合剂可能需要更多或更少的时间。然后可以添加额外的面包屑，并且所得到的块如此类食品典型的那样加工。
实施例14：早餐香肠和/或热狗和/或汉堡
根据需要将适当的香料混合物添加至大小减小的镰孢菌菌株MK7生物垫，以形成期望的风味，其可以介于10重量％香料混合物对镰孢菌菌株MK7的量直至20％之间，通常比率为10镰孢菌菌株MK7:1香料混合物，具有或没有其他成分，例如洋葱、粘合剂和脂肪如可可脂。然后将混合物油炸以除去适量的水分。然后，在成型为期望形状并烹调之前，可以添加其他成分，例如蒸谷麦(bulgur)、蔬菜汤、土豆等。
实施例15：冰淇淋和慕斯
产生约1:3镰孢菌菌株MK7生物垫:水的比率，其具有含有小于900微米的平均细丝长度的粒径。将此混合物逐渐加热直到不再有真菌味，然后与腰果以约4:1比率使用，任选地与适量的黄原胶和/或调味品一起使用，以生成混合物，该混合物可以任选加热，然后冷却以形成慕斯。对于冷冻点心，然后将混合物放入冰淇淋搅拌器中，并且搅拌后冷冻形成不可融化的冷冻点心(图14)。
实施例16：从松露生物垫生产松露油。
可以从如上所述培养的松露(块菌)生物垫制备油提取物。在一种情况下，使用麦芽提取物、葡萄糖和蛋白胨作为主要碳源(原料)，在短短7天中在托盘中培养松露生物垫。食用松露蘑菇购自Amazon Marketplace的IGB Trading LLC，并在4℃贮存。通过将约3mm3的松露部分(用无菌剃刀刀片切割)放在麦芽提取物琼脂+0.01％氯霉素(用于抑制细菌生长)上从购买的松露中制备块菌真菌的纯培养物。如下制备麦芽提取物琼脂：在1L去离子水中混合20g麦芽提取物、20g葡萄糖、1g蛋白胨和20g琼脂，然后高压灭菌30分钟，并且冷却至50℃，然后添加0.01％氯霉素。然后将无菌混合物倒入9cm直径的培养皿中，并且允许冷却并固化。
观察到真菌在3天后在托盘上生长。生长4天后，用无菌微生物环挑选菌丝，并在新的一组麦芽提取物琼脂+氯霉素板上划线。允许真菌在所述板上生长5天，然后用微生物环挑出菌丝，并用于通过DNA测序确认培养物纯度。通过提取和纯化DNA(FastDNA Spin Kit，MP Biomedicals)并测序宏基因组的ITS区域，然后使用Blast(NCBI数据库)对该序列进行系统发育分类来完成确认。
通过在1L去离子水中混合20g麦芽提取物、20g葡萄糖和1g蛋白胨来制备麦芽提取物肉汤并灭菌。也使用用微生物环得到的菌丝刮物在用无菌纱布材料加帽的无菌带挡板摇瓶中接种50mL无菌麦芽提取物肉汤。使用无菌纱布，因为它允许气体进出摇瓶的交换。然后，将摇瓶以185rpm旋转5天。然后，使用旋转培养物在无菌的12.7x17.8cm
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玻璃托盘中接种350mL的无菌麦芽提取物肉汤。此培养基的接种物密度为7.5％接种物至92.5％肉汤。在托盘中生长7天后，通过从液体培养基中提起生物垫来收获表面上形成的丝状生物垫。将收获的生物垫在40℃干燥48小时。尽管可以使用其他提取方法，但可以通过机械压榨或使用己烷的溶剂提取法从这些收获的生物垫中提取脂质/油。
实施例17：MK7粉状物。
使用如上所述生产的镰孢菌菌株MK7生物垫来创建在粒度和粒度分布上与标准烘焙粉状物相似的干粉末。在这里，在97℃的锅蒸锅中将湿的生物垫蒸煮0.5小时，冷却至室温，并在Cuisinart脱水器(DHR-20型)中脱水2–8小时，平均脱水时间为4小时。脱水时间是加载到脱水器中的生物质数量、影响脱水器中的空气流动的脱水器中生物垫的分布和生物垫的含水量(平均含水量约为75％)和室温的函数。脱水后的含水量在4％至14％之间变化，脱水后的平均含水量低于12％。使用咖啡研磨机(KRUPS，电咖啡和香料研磨机，不锈钢刀片F2034251)将脱水的生物质减小大小，直至将其细磨。经研磨的生物垫粉状物的平均粒径为75微米至120微米。小分数的较大颗粒(约5wt％)具有大于180微米的粒径。小分数的较小颗粒(约5wt％)具有小于75微米的粒度。所述较小的颗粒的大小使得较小的颗粒能够长时间段保持在空气中传播。通过在具有180μm、120μm和75μm开口的筛中提起100克大小减小的生物垫样品测定粒径。由于较高的含水量可以导致干燥且磨碎的生物质团集，优选低于6％的脱水后和大小减小后的含水量。
然后，使用生物垫粉状物作为其他标准面粉(King Arthur面粉、Bob’s Red磨面粉(Mill Flour)和Bob’s Red磨小麦面粉)的添加，并制备多种烘焙食品。以5wt％、10wt％、20wt％和30wt％加载生物垫粉状物，对最终烘焙的良好味道、发面(rising)、质地、外观或气味没有有害影响。展示的产品包括面包(7种谷物，white&wheat)、糕点(Pate a Choux)、饼干、意大利面和饺子。所得产品在味道测试中表现良好，并且品尝产品的人均无法检测到菌株MK7粉状物的纳入。
实施例18：MK7填充剂
使用如上所述生产的镰孢菌菌株MK7生物垫创建生物质颗粒，所述颗粒作为填充剂用作肉类和鱼类的添加(即，通过将菌株MK7添加到其他出口食品增加总食品量)。将湿的生物垫在锅蒸锅中于97℃蒸煮0.5小时，冷却至室温。对生物垫进行大小减小(即，用刀切碎或在食品加工器中进行食品加工)至期望的粒度分布。然后，将大小减小的生物质添加到不同的食品中，以增加肉(在肉填充剂的情况下)或鱼(在鱼填充剂的情况下)的量。作为肉填充剂的一个例子，向牛肉汉堡肉添加大小减小的生物质的10％、20％、30％、40％和50％添加。以许多不同的大小分布评估生物质的大小减小。较小的粒度往往产生较稠密且较为乳脂状的质地。较大的颗粒往往产生更具质地、更具口感并且在吞咽前需要更多咀嚼的产品。然后，对有填充剂的肉加工成就像未添加生物质一样。在牛肉汉堡填充的情况下，可以任选地添加香料或粘合剂，并将有填充剂的肉形成肉饼或肉丸，并烹调脂质将肉烹调至消费者期望的温度。烹调方法包括炉顶、烤箱、油炸和烤架。味道测试显示了在所有加载水平和添加的生物质的所有大小分布下产生可接受的食品。也在类似的加载水平尝试鸡肉和猪肉填充，具有类似的烹调和品尝结果。
还以10％、20％、30％和40％加载演示鱼填充剂。通过添加多种不同大小分布的经加工的菌株MK7产生鱼片和鱼丸，所述大小分布范围为小颗粒(小于1.0mm)至大颗粒(大于2mm)，对味道、颜色、气味或全部饮食体验没有有害影响。在小粒径添加的情况下，所得食品具有较为乳脂状的质地。在大粒径添加的情况下，所得食品具有较硬的质地，其以在吞咽之前需要更多咀嚼的较大颗粒为特征。味道测试显示了在所有测试的加载和大小分布水平下生产可接受的食品。
实施例19：MK7肉干
使用如上所述生产的镰孢菌菌株MK7生物垫来创建真菌肉干(mycojerky)，在外观和味道上类似于肉干(例如牛肉干、水牛肉干、猪肉干、鸡肉干、火鸡肉干等)。将湿的生物垫在锅蒸锅中于97℃蒸煮0.5小时，冷却至室温。对生物垫进行大小减小到与通常在肉干产品中发现的大小一致的大小。在一些情况下，对大小减小的生物垫块针对风味进行调味，并在Cuisinart脱水器(DHR-20型)中脱水20-200分钟，平均脱水时间为40-120分钟。脱水时间是以下项的函数：加载到脱水器中的生物质的量、影响脱水器中的空气流动的脱水器中生物垫的分布、生物垫的含水量(平均含水量为约75％)、室温和最终产品中期望的含水量。取决于期望的产品特性，脱水后的含水量在8％至12％之间变化。在一些情况下，在脱水前对生物质进行穿孔产生产品，该产品更容易撕成小块，从而易于食用。通过使用叉、刀或嫩化器(tenderizer)工具对生物质进行穿孔，这既对生物质进行了穿孔，又破坏了细丝网络，从而使其更容易撕裂。评估了极其多种香料混合物(即Cajun、奶酪、大豆、醋、药草、酸奶油和洋葱、烟熏液、严格素食肉香料(vegan meat flavor)等)。在脱水前和脱水后均评估香料混合物。与脱水后处理的样品相比，在脱水前添加香料的那些样品提供更多的味道并更好地附着于生物质。所得的肉干在味觉测试中均表现良好。
实施例20：真菌片(Myco-chips)
如上所述生产的镰孢菌菌株MK7生物垫用于薄片，外观和味道类似于薯片或玉米片。将湿的生物垫在锅蒸锅中于97℃蒸煮0.5小时，冷却至室温。对生物垫进行大小减小到与片产品中通常发现的大小一致的大小，并且经高度加工成糊状物并形成片样的几何形状。然后将真菌片放入热油的煎锅中(温度约等于380°F)，直到变成棕色。烹调时间随生物质的几何形状而变化，但烹调非常快，通常不到15秒。生产的油炸片证明是非常可口的，并且能够根据油炸前添加到生物质或涂覆到生物质上的香料而提供极其多种味道体验。
表8：来自刺芹侧耳的营养数据
Figure GDA0003479952310000711
Figure GDA0003479952310000721
Figure GDA0003479952310000731
表11：来自羊肚菌的营养数据
Figure GDA0003479952310000741
表12：来自大秃马勃的营养数据
Figure GDA0003479952310000742
Figure GDA0003479952310000751
表13：来自大秃马勃的营养数据
Figure GDA0003479952310000752
Figure GDA0003479952310000761
表14：来自Fusarium Venenatum的营养数据
Figure GDA0003479952310000762
Figure GDA0003479952310000771
Figure GDA0003479952310000781
Figure GDA0003479952310000791
Figure GDA0003479952310000801
表17:来自Lenitnula edodes的营养数据
Figure GDA0003479952310000811
表18：来自双孢子蘑菇的营养数据
Figure GDA0003479952310000812
实施例22：来自在两种不同培养基上培养的菌株MK7生物垫的蛋白质含量数据。
在烤箱中将生物垫干燥几天(在99℃)，然后在干燥器中放置几天。将样品研磨并准备进行总氮分析。估计约5％的H2O在干燥的菌株MK7样品中。
总蛋白质经计算为：
对于MK102培养基上的膜生长菌株MK7-41.2％
对于AUM培养基上的膜生长菌株MK7-43.8％
培养基特征(特别适用于膜反应器)
Figure GDA0003479952310000813
Figure GDA0003479952310000821
*最佳产率，膜上的菌株MK7生物垫，8.5mL培养基，35mm培养皿，5-7天**木质纤维素生物质来源干草，用硫酸处理
生长培养基化学
Figure GDA0003479952310000822
Figure GDA0003479952310000823
Figure GDA0003479952310000824
Figure GDA0003479952310000831
实施例23：本实施例显示了来自两种镰孢菌丝状真菌菌株MK7和Fusariumvenenatum的比较营养数据。
从菌株MK7和Fusarium venenatum总蛋白质分析获得的比较营养数据
Figure GDA0003479952310000832
*产物包括来自非真菌来源(蛋，蛋清，酵母，小麦谷蛋白)的蛋白质
分支氨基酸分析
Figure GDA0003479952310000833
Figure GDA0003479952310000841
维生素
Figure GDA0003479952310000842
Figure GDA0003479952310000851
脂肪酸分析
Figure GDA0003479952310000852
实施例24：来自各种丝状真菌的RNA含量测量。
嘌呤分析实验程序：制备1000μg/ml嘌呤标准品：将100mg每种嘌呤碱(腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤)分别添加到4个100ml容量瓶中。向每个烧瓶中加入90ml超纯净水，摇动烧瓶以分离嘌呤固体。逐滴加入在超纯水中制备的10M NaOH，直到嘌呤碱开始溶解。反复摇动烧瓶，直到所有固体完全溶解。根据需要添加额外的碱以提供完全溶解。将烧瓶加盖并冷藏保存。
200μg/ml混合嘌呤标准品的制备：将各20ml的1000ml/ml嘌呤标准品加入100ml容量瓶中，并且通过加水使体积达到100ml。冷藏保存。
pH 2.5-2.8、150mM磷酸盐缓冲液的制备：通过将74.88g NaH2PO4溶解在2升超纯水中来制备150mmol磷酸钠缓冲溶液。在真空下通过0.45um孔径的滤器过滤溶液。将7.88ml的80％磷酸添加到2升超纯净水中，并且合并所得溶液。若在pH 2.5-2.8的缓冲范围之外，则可以通过逐滴添加80％磷酸至约pH 2.6的终点来调节pH。
样品制备：冷冻干燥的蘑菇样品如所获得进行处理。将湿样品转移到配衡的15mlFalcon管中。然后将样品在-80F冷冻以备冻干。将预冷冻的样品在Labconco冻干机上冻干24-48小时，直至干燥。
称重干燥的样品，并记录重量。将干燥的材料在研钵和研杵中研磨成细粉，并称重入50ml锥形瓶中，获得约500mg样品。将15ml的70％高氯酸加入到反应烧瓶中。然后通过磁力搅拌棒搅拌下，在水浴中将反应加热至95℃达1小时。从水浴中取出烧瓶，并从每个反应中取出5ml样品，并转移至15ml falcon管中。通过逐滴添加10M KOH溶液提高pH，直到溶液为pH 4。记录中和样品的体积，并将溶液以4000rpm离心30分钟。离心后检查pH，并根据需要调节，记录最终体积。用注射器吸取3ml上清液，并通过45um注射器滤器过滤以进行HPLC分析。
HPLC条件：
HPLC：Waters e2695分离模块
色谱柱：Shodex Asahipak GS-320HQ 7.5mm x 300mm
溶剂：150mM磷酸钠缓冲液(pH 2.5-2.8)
进样量：10uL
流速：.6mL/min
柱温：35℃
检测波长：260nm
RNA含量
Figure GDA0003479952310000871
实施例25：来自丝状真菌Fusarium venenatum和尖顶羊肚菌(黑羊肚菌)的生物垫的毒性数据。
用大型蚤(Daphnia magna)的毒性/生长研究Fusarium venenatum不对大型蚤产生急性毒性，大型蚤是一种常用于毒性测定法的高度敏感的大型无脊椎动物(EPAPublication,1987；Guilhermino et al.,2000)。
活的大型蚤购自Carolina Carolina Biological Supply(目录号142330，Burlington,NC)。从供应商接受培养物后立即在经过消毒的玻璃碗(用70％异丙醇冲洗并干燥)中将100毫升的含有活大型蚤的液体培养基与800mL Arrowhead泉水(Nestle WatersNorth America,Inc.Stamford,CT)混合。通过用消毒过的塑料勺搅拌将培养物轻轻混合，然后取出400mL没有任何大型蚤的此液体，并且在4℃在Arrowhead泉水瓶中贮存以备后用。将四分之一的大型蚤食物团粒(Carolina Biological Supply，目录号14-2316)添加到含有大型蚤的碗中剩余的500mL液体中。给碗覆盖松散配合的塑料膜，然后在室温(21±2℃)温育培养物，如供应商提供的手册中指示。在生长和观察48小时后，将活大型蚤用于生长/毒性实验。
无菌培养皿(Fisherbrand 100x15mm，目录号08-757-13，Thermo-Fisher)装满35mL液体生长培养基(泉水/Carolina Biological Supply培养基的混合物)，其于4℃贮存(上文所述)。使液体培养基平衡至室温。用滴眼管(Carolina Biological Supply，捕获方法在供应商手册中描述)捕获四个活跃的大型蚤，每个长度约为1-1.2mm，并添加到八个培养皿之每个。另外，四个培养皿接受0.15g湿的F.venenatum生物垫(18％固体)，并且四个培养皿接受0.03g干的大型蚤食物。在MK7-102培养基上生长5天后产生生物垫，从托盘中收获，然后用手轻轻按压以除去多余的培养基，然后蒸30分钟以杀死细胞。将蒸过的生物质在Francesco Palumbo葡萄压榨机中压榨以除去液体，直到获得约18％的固体水分含量(82％液体)。在毒性实验中，含有对照和F.venenatum生物质的培养皿两者中的pH的范围为7.4至7.8。在每个培养皿中每24小时对活大型蚤进行计数，如下表中所示。
四天后，对照处理具有每盘3.50个活大型蚤的平均值(标准差＝1.29)，而F.venenatum处理具有每盘3.75个活大型蚤的平均值(标准差＝0.50)。此时，对照处理具有每盘0.75个死亡的平均值(标准差＝0.96)，而F.venenatum处理具有每盘0.25个死亡的平均值(标准差＝0.5)。
总的来说，这些数据指示蒸煮的F.venusatum生物量不导致对水蚤的急性毒性，如以描述的方式评估的。
关于Fusarium Venenatum的水蚤毒性研究
Figure GDA0003479952310000881
Figure GDA0003479952310000891
真菌毒素含量
方法参考US-多毒素LCMSMS 45-2-LWI
Figure GDA0003479952310000892
Figure GDA0003479952310000901
实施例26：包含菌株MK7生物垫颗粒的液体分散体的表征。
材料：MK7严格素食的乳样品：水中约8.25％固体
除非另有说明，否则所有测量均在室温(25℃)下进行。
外观和颜色：外观略灰白色，略带米色调。气味是极略微木质的。
在图20中显示了10-1000倍稀释样品的折射率、密度和粒度分析。
动态光散射(DLS)用于分析溶液中的粒度。
在图21A(10x)和21B(100x)中显示了在光学显微镜下的乳结构。
发现样品(8.25％)的脂肪含量为0.6g/100g。
发现pH含量如下所示。
浓度 0.0825％ 0.825％ 4.125％ 8.25％
pH 6.73 6.17 5.99 5.91
粘度：研究初始浓度(8.25％)的严格素食乳样品的粘度。通过对三个重复测量取平均值获得图22。样品粘度随剪切速率的增加而降低，指示它是具有剪切稀化行为(sheer-thinning behavior)的非牛顿流体。这也意味着颗粒在大剪切速率下更容易变形。对于给定的剪切速率，可以通过幂律方程确定样品的粘度。这提供了将此种严格素食乳样品与其他牛乳或慕斯进行比较的机会。
2周和4周后没有观察到可见的乳分离。
实施例27：使用菌株MK7丝状真菌制备液体分散体的方法。
在高速搅拌器(Vitamix)中，将200克菌株MK7、600克水和1汤匙香草提取物组合并混合直到调匀(至少90秒)。将混合的混合物在低热下加热直至真菌气味降低，优选降低至不存在的程度(约20-30分钟)。保持较低的热量以实现最大的慢速滚煮，所述慢速滚煮在MK7乳达到约80C时开始。将MK7乳轻轻煮沸，在90-92C之间的温度，并且可以在不搅拌或搅动的情况下煮沸而不破裂。使加热的混合混合物冷却并使用。
在完成热循环并将乳从锅中取出后，在容器内部在MK7乳和空气的交点处观察到残留线。残留物是脱水/煮过的菌株MK7的硬的并且附着良好的合并。
实施例28：可丽饼(Crepes)
成分：
·King Arthur通用面粉(All Purpose Flour)-11.7％谷蛋白含量。
·C&H砂糖。
·菌株MK7生物量-QCB-249-10％甘油-09/03/2018.
·MK7乳-QCB-249-10％甘油-09/03/2018(煮前25％的生物量)
·香草膏(Nielsen Vanilla Paste)。
·Plugra淡奶油82％脂肪。
设备：
·De Buyer Teflon Crêpe Pan.
MK7可丽饼1
通用面粉 120g
海盐 0.5g
砂糖 50g
新鲜全蛋 100g
新鲜蛋黄 30g
MK7乳 250g
香草膏 5g
无盐黄油 30g
净化黄油 根据需要
精原糖(Fine Turbinado Sugar) 根据需要
总计 585.5g
可丽饼黄油的最初新鲜乳含量用MK7乳替换。如下产生乳：200克菌株MK7、600克水、2克香草。在vitamix中将混合物降低大小，并且在没有氮处理的情况下以低温煮沸热处理20分钟。可丽饼黄油过稠。
MK7可丽饼2
Figure GDA0003479952310000911
Figure GDA0003479952310000921
使用液体的组合调节黄油稠度(全蛋、新鲜乳和水)。此调节产生合适的质地和风味。对于有香味的可丽饼可以省略糖，并且添加有香味的香料，如洋葱和大蒜粉和草药。
MK7可丽饼3
通用面粉 80g
MK7粉状物 40g
海盐 0.5g
砂糖 50g
新鲜全蛋 150g
新鲜蛋黄 30g
MK7乳 250g
新鲜全乳 100g
水 50g
香草膏 5g
无盐黄油 30g
净化黄油 根据需要
精原糖 根据需要
总计 785.5
面粉的部分用MK7粉状物替换以增加蛋白质。观察到MK7粉状物可丽饼黄油需要更多液体，因为菌株MK7具有150％水合能力(面粉标准是60至70％)。可丽饼的质地在不添加额外水的情况下更具玉米饼(tortilla)质地。
实施例29：意大利面食(Pasta)面团
成分：
·菌株MK7生物量-QCB-249-10％甘油-09/03/2018
·MK7粉状物-QCB-249-10％甘油-09/03/2018
·Bob’s Red Mill粗面粉(Semolina)。
·Delallo 100％Organic Double 00面粉。
·包装饮用水-PH:6.5.
设备：
KitchenAid食物加工器和意大利面滚筒。
1.用粗面粉、MK7粉状物和水制备的意大利面食面团。
成分 重量
粗面粉 100克
MK7粉状物 50克
冷水 100克(66.66％水合)
海盐 4克
总计 254克
用手混合面团，并且未检测到菌株MK7味道。MK7粉状物将液体水合的需要从常规意大利面食面团中的50％增加到对于用2/3粗面粉和1/3MK7粉状物制备的面团的约66.66％。
2.用粗面粉、MK7粉状物和蛋制备的意大利面食面团。
成分 重量
粗面粉 100克
MK7粉状物 50克
冷全蛋 100克(66.66％水合)
海盐 5克
总计 255克
用手混合面团。未检出菌株MK7味道。蛋基底面团具有更丰富的风味。质地类似于试验#1，但是由蛋中脂肪引起的略小的谷蛋白形成(蛋黄中的1/3脂肪，因此试验#2的总质量的约13％)。蛋基底面团由于干扰谷蛋白的脂肪而更难以用手混合。可以使用食物加工器产生更平滑(smooth)并且如试验#1一样的质地。意大利面食面团中的盐的20％增加给出良好的结果。
3.MK7粉状物水合
Figure GDA0003479952310000931
Figure GDA0003479952310000941
用手混合面团。菌株MK7需要约150％水以与标准面粉和淀粉比较面团相似的方式水合。对于参照：白色小麦面粉需要60至70％水合和淀粉70至90％。
4.用double 00面粉、MK7粉状物和水制备的意大利面食面团以与试验#1比较。
成分 重量
Double 00面粉 100克
MK7粉状物 50克
冷水 100克(66.66％水合)
海盐 5克
总计 255克
用手混合面团。未检出菌株MK7味道。质地比用double 00面粉的试验#1更平滑，这确认细得多的碾碎的MK7粉状物的性能。
5.用double 00面粉、MK7粉状物和蛋制备的意大利面食面团以与试验#2比较。
成分 重量
Double 00面粉 100克
MK7粉状物 50克
冷全蛋 100克(66.66％水合)
海盐 5克
总计 255克
在食物加工器中混合面团。未检出菌株MK7味道。质地比用食物加工器，然后手动完成的试验#2更平滑，这确认食物加工器对于脂肪基底意大利面食面团表现得更好。
6.用粗面粉、double 00面粉、MK7粉状物和水制备的意大利面食面团以与试验#1和#4比较。
Figure GDA0003479952310000942
Figure GDA0003479952310000951
通过食物加工器混合面团，然后手动完成。未检出菌株MK7味道。质地就平滑度而言非常类似于试验号4。两种面粉与MK7粉状物的组合导致粗面粉样质地的减少并且减轻小麦面粉质地。
7.用粗面粉、double 00面粉、MK7粉状物和蛋制备的意大利面食面团以与试验#2和#5比较。
成分 重量
粗面粉 50克
Double 00面粉 50克
MK7面粉 50克
冷全蛋 100克(66.66％水合)
海盐 5克
总计 255克
通过食物加工器混合面团，然后手动完成。未检出菌株MK7味道。质地平滑，类似于试验号5，并且就配对两种面粉与MK7粉状物而言与上文相同。
实施例30：面疙瘩(Spatzle)
成分：
·MK7生物量-QCB-249-10％甘油-09/03/2018
·MK7粉状物。
·King Arthur通用面粉11.7％谷蛋白
设备：
无
试验#1：
Figure GDA0003479952310000952
Figure GDA0003479952310000961
用手混合面团，并且用切面刀分配。未检出MK7味道。确定面疙瘩可以是内部更湿的，并且会受益于奶油或类似物，即浓奶油(heavy cream)、生奶油(crème fraiche)、酸奶油、酪乳、酸奶的添加以及肉豆寇(Nutmeg)的添加。允许在煮后干燥过夜，并且次日完成。
试验#2：
成分 重量
通用面粉 200克
MK7粉状物 100克
全蛋 200克(66.66％水合)
汽水 160克
生奶油 40克
海盐 8克
肉豆寇粉末 0.5克
总计 708.5克
用手混合面团。未检出菌株MK7味道。静置过夜的面疙瘩在黄油中完成后具有正确的颜色。奶油添加带来必需的湿度。French Pastry School的许多厨师批准产品。
实施例31：咸肉
成分：
·菌株MK7
·2汤匙大豆
·1.5汤匙A1
·1汤匙熏液(liquid smoke)
·2汤匙营养酵母
·1/2汤匙红辣椒
·1汤匙蜂蜜
将菌株MK7生物垫切成条。制备腌料(marinade)/涂层。菌株MK7的两面都涂上涂层，并在油中炸至褐色，拍干，并在脱水器中脱水以除去多余的水分，直至获得期望的质地。所得的咸肉类似物在质地(即酥脆)和风味(具有吸引人的咸肉样风味)两者而言均表现良好。French Pastry School的厨师批准该产品。
实施例32：面包
成分：
·0.5杯不加糖的7谷谷物(商店购买)
·2杯开水
·1包干酵母
·3杯面包粉
·1杯MK7粉状物
·1汤匙橄榄油
·1汤匙黑糖(dark brown sugar)
·1.5汤匙盐
·2汤匙芝麻
·2汤匙亚麻籽
·2杯水
将2杯沸水倒在7谷系列上，然后浸泡20分钟以软化谷物。将酵母添加到软化谷物中。加入1杯面包粉、油、糖和盐，并轻轻搅拌直至平滑。将MK7粉状物与剩余的面包粉混合，并缓慢地混合到上面，直到形成面团。遮盖并静置(15–20分钟)。注意：应在温暖的地方中静置。将面团揉成平滑且有弹性。根据需要添加额外的面粉。捏合约10-15分钟。给1大碗加油。面团涂上油，放在油碗中并且盖上。使面团在温暖的地方升温直至倍增，约1.5小时。混合种子，并且将面团打孔。(将面团倒在轻度加油的表面上。用约1/2种子轻轻揉捏。)将面团成型为面包条。给烤盘撒上约2汤匙种子。将面包条放在种子上，用毛巾覆盖，在温暖的地方升温，直到几乎倍增，约30分钟。烤箱架位于烤箱中心，并且另一个烤箱架位于烤箱底部。将烤箱预热至425F。面包条用水刷。将剩余的种子混合物撒在面包条上。在面包条的表面上切成1/8”深的对角斜杠，并且将带有面包条的烤盘放在烤箱中。(将2杯水倒入烤箱中较低架上的热锅中进行蒸煮。)将面包条烘烤至金黄和硬皮，并且将测试器插入中心，干净出来，约35分钟。所得面包具有良好的面包屑和很好的味道。在所得面包条中未检测到MK7粉状物的添加。
实施例33：严格素食巧克力冰淇淋
成分
·95克生腰果(raw Cashews)
·750克MK7乳
·0.7克黄原胶
·0.2克Instant Espresso
·20克可可粉
·1克盐
·2克香草提取物
·110克原糖(融入MK7乳)
·150.5克Green&Blacks黑巧克力70％
·20克Ghirardelli甜可可粉(烘焙巧克力)
·15克Rumford玉米淀粉(非GMO)
1:3MK7乳类似物：在高速搅拌机(Vitamix)中，将200克菌株MK7、600克水和1汤匙香草提取物组合，并混合至平滑(约90秒)。将混合的混合物在低热下加热20分钟。(在该配方的另一种形式中，混合和热处理两者也都在氮气下进行(即在Vitamix的大小减小和/或热循环之任一或两者期间，通过MK7乳类似物通过鼓泡氮气进行)。氮气的使用导致乳类似物乳脂状的增加并且产生甜味)。保持低热；至慢速滚沸的最大值。在热处理的最后5分钟期间，将糖加到MK7乳，并且混合以融化成乳。(若预制MK7乳，则加热乳并加糖融化。)顶部可见泡沫，下部液体的小部分显示出缓慢煮沸的迹象。
在高速搅拌机中，将所有成分混合并高速搅拌120秒。根据标准的教导，提出保留小部分混合物并将淀粉分开溶解在混合物中，期间活跃搅拌以避免结块。若分开制备淀粉混合物，则应逐步将其添加到主混合物中，以避免结块。
将混合物倒入冰淇淋制备容器中，并用保鲜膜(cling film)覆盖，保鲜膜压在混合物表面上，因此在冷却混合物时不会形成皮。将混合物冷却但不冷冻。将混合物在冰淇淋机中搅拌至少30分钟但不超过1小时(取决于期望的稠度)。包装到适当的容器中并冷冻过夜。
实施例34：鸡块
成分
·200克菌株MK7
·4克鸡汤(可以是基于肉类的鸡汤或基于素食的鸡汤)
·4克粘合剂(蛋清或素食粘合剂)
·3克脂肪(鸭脂肪与可可脂一样好。其他脂肪也已成功使用)用刀减小生物垫粒度以达到期望的粒度。合并并处理所有成分，直到获得期望的粒度分布。(若使用食物加工器，则推荐将食物加工器脉冲5秒钟，然后使用刮铲除去粘在侧面的生物质，然后重新整合到靠近刀片的生物质中，并重复3次。可以根据最终产品的需要或多或少加工)。将大小减小的生物质用汤匙/刮铲充分混合，以确保所有成分都紧密混合。形成期望大小的小馅饼(Patties)，并蒸30分钟以固化粘合剂。(注意，某些粘合剂可能需要更多或更少的时间。)将蒸过的小馅饼冷却。在一些小馅饼中，应用拌粉并进行热处理，以确保对小馅饼的拌粉。
实施例35：堡早餐香肠
成分：香料混合
·30克糖蜜
·30克酱油(tamari)
·15克葵花籽油
·15克A1酱(sauce)
·21克研磨亚麻籽
·21克营养酵母
·14克全麦面粉
·6克黑胡椒
·6克鼠尾草
·1克百里香
·0.5克肉豆蔻
成分：堡
·100克食物产品加工的菌株MK7(淀粉原料)
·100克TVP(有质地的植物蛋白：在各一半的蔬菜和蘑菇汤混合物中从干燥状态重建)
·20克香料混合物
·20克煮过的糙米
·15克煮过的洋葱(油中煮熟的黄洋葱直到变软)
·4克干蛋清
·4克可可脂
·可选但建议：食物级红色染料(参见Pic)
在混合碗中，将香料混合物合并并混合，直到获得均匀的混合物。将这静置15分钟，以使液体被充分吸收，产生糊状混合物。在食物加工仪中，将生物质的颗粒大小减小至期望的大小，即与堡(或香肠)期望的大小一致的大小。将堡成分在碗中混合并混合至均匀。用弄湿的手，形成堡小馅饼。将小馅饼蒸30分钟或在350烘烤30分钟，然后炸。
实施例36：热狗大红肠(Hot dog bologna)
成分
·250克菌株MK7
·1克孜然粉(ground cumin)
·1克小豆蔻粉
·1克肉豆蔻干皮(mace)
·1.5克黑芥末籽
·1克芫荽籽粉(ground coriander)
·4克黑胡椒粉
·4克盐
·5克新鲜蒜末
·6克砂糖
·4克红辣椒
·50克洋葱，去皮切碎
·18克植物油(约3汤匙)
·9克酱油(约2汤匙)
·30克杏仁粉
·140克小麦谷蛋白
·2克竹芋粉
除了谷蛋白和竹芋粉以外的所有成分都添加到食物产品加工仪中。将混合物处理直至完全平滑至少60秒钟，然后将处理过的混合物转移到带刮铲的大碗中。用木勺搅拌小麦谷蛋白和竹芋粉，并且制成面团。注意，添加谷蛋白和竹芋粉形成致密的面团。可以根据需要减少谷蛋白量和菌株MK7的加工量，以达到期望的密度。
将面团放在干净的表面上，并分成8等份。制备了8张蜡纸和8张A1箔，具有能够容纳适当大小的热狗的大小。在桌上用来自手的一致压力将面团的每部分轧成类似于热狗的形状。若面团干燥或有裂纹，则可用湿手将其加工，从而形成平滑的表面。每个热狗分别用蜡纸包裹并且用铝箔再次包裹。箔的端部扭曲成图齐罗尔形(tootsie roll shape)。热狗在蒸锅中蒸45分钟。将每个热狗解开并放凉。
实施例37：膜比较
构建许多简单的生物反应器设置，以比较对膜材料生物垫生长的影响。在每个生物反应器中，在相同的条件下(密封，潮湿，26℃，通过生长培养基接种真菌)培养生物垫，并在第6天取样。结果示于表19。
表19.膜材料的比较
Figure GDA0003479952310001011
Figure GDA0003479952310001021
如表19所示，亲水性PVDF膜(MilliporeSigma，Burlington,MA)是在提供的条件下表现最佳的膜材料，产生了测试的任何膜排列的生物垫的向上生长(即在膜的上侧生长)和向下生长(即在膜的下侧生长)两者的最佳密度。除了提供最佳的生长特性外，该膜还具有柔韧性，并保持“清洁”，即适合于在收获生物垫后再次使用；随后的实验显示，无需清洗步骤可重复使用同一膜，从而达到初始效率的80％。随后的另一项实验证明了，当将真菌接种在膜的顶侧(即与原料相对)时，表19中所示的5μm PVDF膜和0.2μm PVDF膜之间的相当的结果。聚丙烯和尼龙膜也提供了一致的高收率，尽管发现聚丙烯膜可以被堵塞。低孔隙度的尼龙膜不提供足够的结构完整性，并且往往会在实验中期破裂。
实施例38：“倒置”烧瓶生物反应器
现在参考图25A，显示了根据图23中标记为“4”的配置的生物反应器的“密封”(针对环境紧密密封)实施方案。如图25A所示，生物反应器是通过将两个125mL锥形烧瓶在颈部密封在一起而形成的“倒置”生物反应器；将膜(PVDF，孔径为5μm)放置在烧瓶的颈部内，将原料放置在上烧瓶中，并且生物垫从膜向下生长到下烧瓶内的气体顶部空间。同样，在下烧瓶的底部可以看到冷凝水。该实施方案允许原料的连续补充以及生物垫的半连续收获和/或取样。将真菌接种在原料内(即膜上方)。
现在参考图25B，生长12天后(接种后第20天，从第8天开始进行第一次收获)，已从生物反应器中作为第二次收获的部分收获具有厚度约1cm的生物垫。生物垫以平均速率每天约1mm厚度生长，产生达约100g/m2的生物垫的干产率，在接种后持续至少前三周。图25C提供了8天(第一次收获)和另外12天(第二次收获)之后生物反应器的干和湿产率。该生物反应器实施方案允许每平方米每周生产至少约0.7千克的干生物质，相当于每平方米每周约0.35千克蛋白质，利用源自食物废物或人类废物的原料。每周0.35千克大致等于73千克人类的蛋白质需求；因此，1平方米的膜生长面积可足以供应一个成年人的蛋白质需求，例如，在可用空间有限的载人航天应用或陆地应用中。
收获后，该实施例的PVDF膜没有保留肉眼可见的生物量；如图25B所示，该膜看起来“干净”。但是，在膜上保留了足够的细胞以有效地重新接种该膜，从而继续快速生长。其他类似的实验表明，生物垫可以在以前使用的膜上重新生长，而无需主动重新接种该膜。
如在其他几个实施例中一样，就结构完整性。清洁度、生物垫生产和生物垫收获容易而言，PVDF作为膜材料表现特别好；其他材料，尤其是尼龙，仅在几天后就趋于失效、开裂、阻塞或以其他方式降低性能，因此其稳健性和长期(例如2至7周)实验中使用的适用性不如PVDF。
实施例39：袋式生物反应器
对两种类型的“袋式生物反应器”进行设计和制作，并且评估生物垫的生长性能。通过从Gore-Tex材料制成袋来构建第一个袋式生物反应器，将原料置于袋内，并将丝状真菌的接种物置于袋的外部上。7天后，已经形成了厚度范围为从袋顶部附近的约1mm至袋底部附近的约6mm的生物垫；可以认为，此种差异可以归因于施加在袋各个部分上的流体压力的变化(即，袋底部上的流体压力大于顶部上的流体压力)。生物垫的产率按湿计为498g/m2(按干计为124.5g/m2)，给出约17.8g/m2/天的干生产率和约35.8％的碳转化效率。
通过从具有5μm孔径的双层PVDF膜制成袋来构建第二个袋生物反应器。在该实施方案中，通过培养基(即从袋内)接种丝状真菌。7天后，基本上所有的原料都已消耗完，并且碳转化效率估计为73.4％。在图26中显示该袋式生物反应器的生物垫生长过程。
实施例40：“倒置”梅森罐(mason jar)生物反应器
现在参考图27A，显示了根据图23中标记为“4”的配置的生物反应器的“密封”(相对于环境紧密密封)实施方案。该生物反应器是“倒置”的生物反应器，上部的梅森罐(未示出)位于下部的梅森罐上方(图27A)，并被具有0.45μm孔径的尼龙膜隔开。生长10天后，生产出具有约10mm厚度的生物垫。图27A显示了在第10天的生长容器，其中原料在膜的一侧，而生长的生物垫在膜的另一侧。图27B显示了在第10天收获的生物垫，并且图27C显示了用于拉伸强度测试(下文实施例41)的其薄切片。
表20提供了图27B所示的生物垫的各种特征。
表20.“倒置”梅森罐生物反应器培养的生物垫的特征
Figure GDA0003479952310001041
Figure GDA0003479952310001051
实施例41：“倒置”梅森罐生物反应器生长的生物垫的拉伸强度测试
如图27B所示，用剃刀刀片将图27C所示的5cm x 1cm的生物垫切片分开。用游标卡尺记录该切片的厚度，并且将切下的样品放置在两个载玻片之间，以便将5cm长的样品中的1cm压在两个载玻片之间，注意不通过经由载玻片施加过度压力而损坏样品。然后，将玻璃载玻片通过夹子连接到拉伸强度测试设备，以使夹子的张力防止样品滑动。使用另外两个载玻片在相对端压住另外1cm长的样品。将适合于拉伸强度测试设备使用的储水器连接到载玻片上，并以每秒1mL的速度充满水，直到样品失效。失效时，将水、容器、夹子和剩余样品的质量一起称重；通过将该重量除以样品的厚度，计算出样品的拉伸强度。如通过此种方法测定的实施例40中生产的生物垫样品的拉伸强度为每平方厘米1784克-力。
实施例42：“生物膜”的用途
现在参考图28A和28B，显示了在接种后3天(图28A)和6天(图28B)的典型生物反应器设置。将真菌接种在与原料相对的尼龙膜(孔径为0.2μm)的一侧，并且生物垫以每天约1mm的速度生长。在第3天初始收获(此时观察到尼龙膜明显变形)后，重复使用相同的膜，并且在接下来的三天中生长出大致相同厚度的生物垫。接种后6天，发现尼龙膜已经失效，但是尼龙和生物垫本身的组合继续充当膜。因此，已经出乎意料地发现，即使当最初提供的膜失效时，生物垫本身也可以在生物反应器的实践中充当“生物膜”。
实施例43：人类废物产物作为原料/生长培养基
本公开的生物反应器及其使用方法的一个优点是可以将包括但不限于人类尿液和人类粪便的动物废物、农业废物和工业废物用作原料或生长培养基。对于该实施例，根据表21和22所示的组成制备人工尿液培养基(AUM)和人工粪便培养基(AFM)。
表21.AUM组成
Figure GDA0003479952310001052
Figure GDA0003479952310001061
表22.AFM组成
组分 质量份
水 0.8
干面包酵母(Dry baker’s yeast) 0.06
微晶纤维素 0.03
蚤草 0.035
味噌(Miso paste) 0.035
油酸 0.04
氯化钠 0.004
氯化钾 0.004
氯化钙 0.002
除了使用木质纤维素生物量(有效碳源)作为原料的样品外，使用制备的AUM和AFM作为原料在简单生物反应器中的各种膜上培养生物垫。表23中给出源自这些原料/膜组合的生物反应器产率。
表23.在AUM、AFM和木质纤维素生物量上的生物反应器产率
Figure GDA0003479952310001062
Figure GDA0003479952310001071
在这些测试中产生的生物垫在图30A和30B中示出。另外，观察到，以1：1，AFM，AUM生长的生物垫非常松散地附着在PVDF膜上，当达到一定的厚度/重量时，它们会掉下来。因此，设想了一种自我收集系统，在达到一定重量后，生物垫会从膜片上掉下来，无需从膜片上进行物理/手动移除
实施例44：在不存在反压的情况下原料的连续进料
构建能够使原料能够连续进料到生物反应器的生物反应器，其消除由液体原料的消耗而引起的反压，并且使得液体原料培养基通过透气性滤器与外部环境平衡；这通过在顶部锥形烧瓶上钻孔并在由此创建的孔中放置空气滤器来实现。在图31A中示出该实施方案，并且在图31B中示出更一般化的生物反应器设置。
在该实施方案中，使用具有孔径0.2μm的尼龙膜证明是低效的，因为该膜往往泄漏。相比之下，具有孔径10μm的聚丙烯膜可以承受生物反应器内部的压力，并且不会失效、破裂或泄漏。
实施例45：膜-袋生物膜反应器(MBBR)系统
可以提供膜-袋生物膜反应器(MBBR)系统用于生产致密的可用生物质的可扩展且方便的手段，包括通过使用预期可用的废物和碳底物，例如在载人航天任务或地面应用中。MBBR可以提供用于培养丝状真菌的轻质、紧凑、简单且可重复使用的系统，作为非限制性示例，其可以不仅用作食物，而且可以用于药物、营养食品、燃料、皮革类似物、纺织品和/或建筑材料。
三层Gore-Tex织物因其耐用性、耐水性和气体交换性能而选择作为MBBR膜。袋是通过使用可热流动(heat-fluxable)的密封带制成的，以提供不透水的接缝，并采用用于密封袋的顶部并将其连接到支撑物的简单的卷封系统(roll closure system)。将袋的外表面接种丝状真菌菌株MK7并填充生长培养基，然后将袋的顶部密封，并将袋悬挂在密封的、温度和湿度可控的盒(50cm x 50cm x 70cm，25±1℃，相对湿度约95％)中的架子上。3天后，每个袋都被一层菌株MK7生物膜完全覆盖，显示出厚厚的菌丝、气生菌丝和菌丝体层析。图32中显示了5天后的生物垫生长。到7天生长期结束时，袋中的甘油原料已完全耗尽，并且计算出的甘油原料向干生物垫的转化率约为35％，这不计膜织物吸收的任何甘油。
实施例46：膜材料和孔径对生物垫生长的影响
在相同的条件下，使用四种不同的膜材料以五个不同的孔径(总共20种不同的膜)在简单的生物反应器中进行测试。在表24中给出膜的特性。
表24.膜材料和特性
Figure GDA0003479952310001081
在表25上给出了这些膜上培养的生物垫的选定特性。
表25：生物垫特征
Figure GDA0003479952310001091
在这些实验中观察到的最小生物垫密度是湿的0.22g/cm3和干的0.036g/cm3。
对该实施例的样本进行目视检查提供了一些见解。在以更大的厚度和迂曲度为特征的PTFE和PP膜中，似乎大量的生物量积累在膜本身内部，因此无法收获；此外，在PTFE膜中，真菌接种物并未“散布”以覆盖膜的整个表面，而必须通过喷雾、真空泵、Q形尖端(Q-tip)、画笔等施加，因此，生物垫不贯穿整个膜区域生长。另外，PET支撑的尼龙膜没有遭受较早实施例的纯尼龙膜所证明的相同的结构完整性问题(开裂，失效等)。假设具有PET支撑的膜的疏水性PVDF膜的较差结果是由这些实验中使用的较薄、较光滑的膜引起，该膜可以导致真菌体抓牢膜的能力较小(可潜在通过使膜变粗糙来解决的问题)，但PVDF膜的特征还在于形成了厚的“粘泥”，其需要进一步研究。另一个可能性是与相同的薄且光滑的尼龙膜相比，具有PET支撑性能的疏水性PVDF更多是由于穿过膜的液体流速显著更低所致(参见表24)。尼龙和PVDF膜出现得相当“干净”，即适合重复使用。0.2疏水性PVDF-PET相当干净，但0.45、1、3或5有粘泥。亲水性PVDF 0.2或5.0没有粘泥(参见表19中的数据)。
一个进一步值得注意的结果是，虽然产率会随着PTFE和PP膜孔径的增加而增加，但PET支撑的尼龙膜观察到相反的趋势。不希望受任何特定理论的束缚，据推测，在大孔的实施方案中，该膜的亲水性性质可以提供了对于最佳生物垫生长而言太“湿”的条件，并且若该膜的趋势可能会有所不同。被“翻转”以试图取而代之在疏水表面上培养生物垫，则趋势可以是不同的。
实施例47：拉伸强度测试
根据实施例41中所述的程序测试了各种生物垫样品的拉伸强度。表26给出了生物垫特性和测试结果。
表26.生物垫的特征
Figure GDA0003479952310001101
实施例48：反压消除型生物反应器
构建消除源自原料消耗的反压的生物反应器(基本上符合图31A中所示的概括示意图)，并用于测试各种膜的流体压力下的性能。在表27中给出这些测试的结果。
表27.各种膜类型的流体压力性能
Figure GDA0003479952310001102
Figure GDA0003479952310001111
这些结果倾向于指示亲水膜和具有较大孔径的膜比小孔疏水膜更不能够承受液体静压强。假设不希望受任何特定理论的束缚，容易使原料通过的亲水膜和大孔膜可能更适合于将原料放置在膜下方的应用，而小孔疏水膜可能更适合于将原料置于膜上方的应用。还假设流体压力的变化可以允许生物反应器的操作者调节或微调生物垫的生长速率或其他生物垫的特性，和/或促进生物垫从膜的原位去除。
实施例49：光照条件对生物垫生长的影响
将真菌菌株MK7接种到尼龙和聚丙烯膜上，并在光照和黑暗条件下生长成生物垫。尽管生长4天后所有垫似乎相同，但是到7天，在光照条件下生长的生物垫已经开始死亡，这可能是由于原料中的营养耗尽所致。相比之下，在黑暗条件下生长的生物垫在第7天后表现得健康，并且似乎出现小气泡，这表明与光照条件下培养的生物垫的代谢途径不同的代谢途径。在黑暗条件下培养的生物垫直到第14天才开始变黑并且看起来不健康。图34中显示了这些结果(“N”代表尼龙膜，“P”代表聚丙烯膜)。
实施例50：比较蛋白质含量
几种丝状真菌中的各者藉由选自根据本发明的表面发酵、根据先前技术的方法的浸没发酵及子实体(亦即“天然”)生长的至少一种方法生长。在表面发酵的每种情况下，液体生长培养基的碳与氮比为7.5。藉由每种方法生长的每种真菌的平均蛋白质含量呈现于表28中。
表28.比较蛋白质含量
Figure GDA0003479952310001121
本实施例的结果证实本发明的表面发酵方法产生具有比可藉由真菌子实体的浸没式发酵或自然生长所达成的含量大的蛋白质含量的丝状真菌生物垫。甚至更特别地，本发明的方法产生具有至少约40重量％的蛋白质含量的生物垫，这对于许多丝状真菌物种而言不能藉由任何先前已知的方法来达成。
实施例51:筛网固体支持物
将含在M2培养基中的1.75千克1:1蔗糖:果糖碳源倒入至10”x 13”英寸Pyrex盘中。将0.09m2截面的#7聚烯烃筛网(筛孔尺寸2mm，认为是LDPE的材料)涂布菌株MK7的接种物且施加至生长培养基的表面，然后在27℃下培养该盘72小时。观察到初始生物垫形成在筛网表面上比在盘中的散装培养基上更快速。
藉由围绕聚烯烃筛网的周边切割从盘收获生物垫的第一部分，及藉由围绕盘的周边切割从盘收获生物垫的第二部分。显而易见的是，从筛网表面(湿块70g)收获的生物垫具有比从培养基的表面(湿块144g)的样品低得多的夹带液体生长培养基含量。
藉由蒸煮30分钟，接着在50℃下在水中浸泡15分钟并手工按压，处理两个生物垫样品。从筛网表面收获的生物垫的最终(干燥)质量为30g(333.33g/m2)，而从散装培养基收获的生物垫的最终(干燥)质量为24g(266.67g/m2)。因此，该实施例提供可简单地藉由提供固体筛网作为生物垫结构可附着至其的支架或基底使生物垫的产率提高约20％的证据。
实施例52：利用皇子菇(king oyster)及灵芝蘑菇的更新培养基实验
重复实施例2的实验程序(包括对照比较)，但排除使用皇子菇(杏鲍菇(Pleurotyseryngii))及灵芝蘑菇(赤芝(Ganoderma lucidum))替代菌株MK7，使用如实施例51中的筛网支持物，且允许实验进行22天时间，且在第5天、第10天及第22天获得总生物垫生长的测量值。结果提供于表29中(所有产率均以千克干质量/平方米表示)。
表29.筛网支持物相对对照上的蘑菇生长
Figure GDA0003479952310001131
实施例53：培养基特性及对蛋白质含量的影响
分别根据表28、29和30的组成制备人工尿液培养基(“AUM”)、木质纤维素生物质培养基(“LCBM”)和MK102培养基。
表30.人工尿液培养基组成
Figure GDA0003479952310001132
Figure GDA0003479952310001141
表31：木质纤维素生物质组成
成分 浓度(g/L)
研磨的干草 100
硝酸铵 10.5
尿素 3.5
氯化钙 1
七水硫酸镁 1
磷酸氢二钾 4
无EDTA的痕量 0.4
酵母提取物 2
水 平衡
表32：MK102培养基组成
成分 浓度(g/L)
硝酸铵 10.5
尿素 3.5
氯化钙 1
七水硫酸镁 1
磷酸氢二钾 4
无EDTA的痕量 0.4
甘油 10
酵母提取物 2
水 平衡
然后，用盐酸(对于AUM和MK102)或硫酸(对于LCBM)将培养基酸化以实现pH 3.5。测定培养基的离子强度和重量摩尔渗透压浓度，并且在每种培养基上培养垫，然后弄干和/或干燥并且进行测定法以测定蛋白质含量。表31中给出了这些测定的结果。
表31：培养基的组成和自其培养的垫
Figure GDA0003479952310001151

Claims (141)

1.食物材料，其包含丝状真菌的颗粒，所述丝状真菌属于选自下组的目：毛霉菌目(Mucorales)、黑粉菌目(Ustilaginales)、红菇目(Russulales)、多孔菌目(Polyporales)、伞菌目(Agaricales)、盘菌目(Pezizales)和肉座菌目(Hypocreales)，其中所述丝状真菌包含大于约40重量％蛋白质含量和小于约8重量％RNA含量。
2.权利要求1的食物材料，其中所述丝状真菌属于选自下组的科：毛霉菌科(Mucoraceae)、黑粉菌科(Ustilaginaceae)、猴头菌科(Hericiaceae)、多孔菌科(Polyporaceae)、灰树花菌科(Grifolaceae)、离褶伞科(Lyophyllaceae)、球盖茹科(Strophariaceae)、马勃科(Lycoperdaceae)、伞菌科(Agaricaceae)、侧耳科(Pleurotaceae)、泡头菌科(Physalacriaceae)、线虫草科(Ophiocordycipitaceae)、块菌科(Tuberaceae)、羊肚菌科(Morchellaceae)、绣球菌科(Sparassidaceae)、丛赤壳科(Nectriaceae)、生赤壳科(Bionectriaceae)和虫草菌科(Cordycipitaceae)。
3.权利要求1的食物材料，其中所述丝状真菌属于选自下组的种：少孢根霉(Rhizopusoligosporus)、茭白黑粉菌(Ustilago esculenta)、Hericululm erinaceus、宽鳞多孔菌(Polyporous squamosus)、Grifola frondosa、真姬菇(Hypsizygus marmoreus)、榆菇(Hypsizygus ulmarius)(榆耳(elm oyster))、香杏丽蘑(Calocybe gambosa)、光帽鳞伞(Pholiota nameko)、大秃马勃(Calvatia gigantea)、双孢子蘑菇(Agaricus bisporus)、大球盖菇(Stropharia rugosoannulata)、砖红垂幕菇(Hypholoma lateritium)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)(珍珠菇(pearl))、糙皮侧耳columbinus变种(蓝蚝菇)、波氏块菌(Tuber borchii)、羊肚菌(Morchella esculenta)、尖顶羊肚菌(Morchella conica)、梯棱羊肚菌(Morchella importuna)、绣球菌(Sparassiscrispa)(花椰菜)、Fusarium venenatum、菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)、肋状皱盘菌(Disciotis venosa)、粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)、北冬虫夏草(Cordycepsmilitaris)、彩绒革盖菌(Trametes versicolor)、灵芝(Ganoderma lucidum)、绒状火菇(Flammulina velutipes)、埃杜拉香菇(Lentinula edodes)、红平菇(Pleurotus djamor)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、和白环蘑属种(Leucoagaricus spp)。
4.权利要求1的食物材料，其中所述丝状真菌是镰孢菌属物种。
5.权利要求1的食物材料，其中所述丝状真菌是Fusarium venenatum。
6.权利要求1的食物材料，其中所述丝状真菌是菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)。
7.权利要求1的食物材料，其中所述丝状真菌具有选自下组的特征：
a.包含大于约45重量％蛋白质含量；
b.包含大于约50重量％蛋白质含量；
c.包含大于约55重量％蛋白质含量；
d.包含大于约60重量％蛋白质含量；
e.包含小于约5重量％RNA含量；
f.包含小于约4重量％RNA含量；
g.包含小于约3重量％RNA含量；
h.包含小于约2重量％RNA含量；和
i.a-d之一和e-h之一的组合。
8.权利要求1的食物材料，其中所述丝状真菌包含小于约10ppm的选自下组的真菌毒素：黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、烟曲霉毒素B1、烟曲霉毒素B2、烟曲霉毒素B3、赭曲毒素A、瓜萎镰菌醇、脱氧瓜萎镰菌醇、乙酰基脱氧瓜萎镰菌醇、镰刀菌烯酮X、T-2毒素、HT-2毒素、新茄镰孢菌醇、蛇形菌素、玉米赤霉烯酮、白僵菌素(beauvericin)、镰菌素(fusarin)C、镰刀菌酸及它们的任意组合。
9.权利要求1的食物材料，其中所述丝状真菌包含小于约10ppm的总真菌毒素含量。
10.权利要求1的食物材料，其中所述丝状真菌包含小于约5ppm的总真菌毒素含量。
11.权利要求1的食物材料，其中所述丝状真菌包含大于约15重量％支链氨基酸或大于约20重量％支链氨基酸。
12.权利要求1的食物材料，其中所述丝状真菌的颗粒为粉状物形式。
13.权利要求12的食物材料，其中所述粉状物具有30-400微米的粒度。
14.权利要求1的食物材料，其中所述颗粒具有约0.05mm至约500mm的颗粒长度，约0.03mm至约7mm的颗粒宽度和约0.03mm至约1.0mm的颗粒高度。
15.权利要求1的食物材料，其中所述食物材料是所述丝状真菌的颗粒的液体分散体。
16.权利要求15的食物材料，其中所述液体分散体是在富含氮气的大气下产生的。
17.权利要求15的食物材料，其中所述丝状真菌的颗粒的液体分散体稳定至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天或至少约5天。
18.权利要求1的食物材料，其中所述食物材料是严格素食的。
19.权利要求1的食物材料，其中所述丝状真菌的颗粒是所述食物材料中存在的唯一蛋白质组分。
20.权利要求1的食物材料，其中所述丝状真菌的颗粒包含所有必需氨基酸。
21.权利要求1的食物材料，其中所述丝状真菌的颗粒是非活的。
22.酸奶类似物食物产品，其包含丝状真菌的颗粒，所述丝状真菌属于选自下组的目：毛霉菌目、黑粉菌目、红菇目、多孔菌目、伞菌目、盘菌目和肉座菌目，其中所述丝状真菌包含大于约40重量％蛋白质含量和小于约8重量％RNA含量。
23.权利要求22的酸奶类似物食物产品，其中所述丝状真菌属于选自下组的科：毛霉菌科、黑粉菌科、猴头菌科、多孔菌科、灰树花菌科、离褶伞科、球盖茹科、马勃科、伞菌科、侧耳科、泡头菌科、线虫草科、块菌科、羊肚菌科、绣球菌科、丛赤壳科、生赤壳科和虫草菌科。
24.权利要求22的酸奶类似物食物产品，其中所述丝状真菌属于选自下组的种：少孢根霉(Rhizopus oligosporus)、茭白黑粉菌(Ustilago esculenta)、Hericululm erinaceus、宽鳞多孔菌(Polyporous squamosus)、Grifola frondosa、真姬菇(Hypsizygusmarmoreus)、榆菇(Hypsizygus ulmarius)(榆耳(elm oyster))、香杏丽蘑(Calocybegambosa)、光帽鳞伞(Pholiota nameko)、大秃马勃(Calvatia gigantea)、双孢子蘑菇(Agaricus bisporus)、大球盖菇(Stropharia rugosoannulata)、砖红垂幕菇(Hypholomalateritium)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)(珍珠菇(pearl))、糙皮侧耳columbinus变种(蓝蚝菇)、波氏块菌(Tuber borchii)、羊肚菌(Morchella esculenta)、尖顶羊肚菌(Morchella conica)、梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)、绣球菌(Sparassis crispa)(花椰菜)、Fusarium venenatum、菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)、肋状皱盘菌(Disciotis venosa)、粉红螺旋聚孢霉(Clonostachysrosea)、北冬虫夏草(Cordyceps militaris)、彩绒革盖菌(Trametes versicolor)、灵芝(Ganoderma lucidum)、绒状火菇(Flammulina velutipes)、埃杜拉香菇(Lentinulaedodes)、红平菇(Pleurotus djamor)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、和白环蘑属种(Leucoagaricus spp)。
25.权利要求22的酸奶类似物食物产品，其中所述丝状真菌是镰孢菌属物种。
26.权利要求22的食物材料，其中所述丝状真菌是Fusarium venenatum。
27.权利要求22的食物材料，其中所述丝状真菌是菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)。
28.权利要求22的食物材料，其中所述丝状真菌具有选自下组的特性：
a.包含大于约45重量％蛋白质含量；
b.包含大于约50重量％蛋白质含量；
c.包含大于约55重量％蛋白质含量；
d.包含大于约60重量％蛋白质含量；
e.包含小于约5重量％RNA含量；
f.包含小于约4重量％RNA含量；
g.包含小于约3重量％RNA含量；
h.包含小于约2重量％RNA含量；和
i.a-d之一和e-h之一的组合。
29.权利要求22的酸奶类似物食物产品，其中所述丝状真菌颗粒与水的比率范围为约1:10至约10:1。
30.权利要求22的酸奶类似物食物产品，其中所述丝状真菌颗粒与水的比率选自下组：约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1和约4:1。
31.权利要求22的酸奶类似物食物产品，其进一步包含转化糖。
32.权利要求22的酸奶类似物食物产品，其进一步包含增稠剂。
33.权利要求22的酸奶类似物食物产品，其中所述丝状真菌的细胞是裂解的。
34.权利要求22的酸奶类似物食物产品，其进一步包含保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
35.权利要求22的酸奶类似食物产品，其中所述产品是严格素食的。
36.权利要求22的酸奶类似物食物产品，其中所述丝状真菌颗粒包含所有必需氨基酸。
37.权利要求22的酸奶类似物食物产品，其中所述丝状真菌颗粒是唯一的蛋白质组分。
38.权利要求22的酸奶类似物食物产品，其中所述丝状真菌颗粒是非活的。
39.权利要求22的酸奶类似物食物产品，其进一步包含凝乳酶(rennet)。
40.权利要求39的酸奶类似物食物产品，其中所述凝乳酶来自选自下组的来源：动物来源、素食来源和微生物来源。
41.权利要求39的酸奶类似物食物产品，其中所述凝乳酶包括选自下组的来源：素食来源和微生物来源。
42.权利要求35的酸奶类似物食物产品，其中所述产品不含乳固体。
43.权利要求22的酸奶类似物食物产品，其进一步包含益生菌(probiotic)。
44.权利要求22的酸奶类似物食物产品，其进一步包含酶促水。
45.泡沫材料，其包含：
a.丝状真菌生物垫的颗粒；
b.水相；
其中所述泡沫材料的固体含量在约5％至约30％之间，并且其中所述泡沫是稳定的。
46.权利要求45的泡沫材料，其中所述泡沫材料在其生产期间停止发泡过程后不立即自发塌陷。
47.权利要求45的泡沫材料，其中所述泡沫材料稳定至少约7天。
48.权利要求45的泡沫材料，其中所述泡沫材料具有至少约10％的起泡率。
49.权利要求45的泡沫材料，其中所述丝状真菌生物垫包括镰孢菌属物种。
50.权利要求45的泡沫材料，其中所述泡沫材料不含乳固体。
51.食物产品，其包含权利要求45的泡沫材料。
52.生物反应器，其包含：
容器；和
在容器内或容器表面上布置的至少一个膜，所述至少一个膜包含第一表面和第二表面；
用于丝状真菌生长的原料，其接触所述至少一个膜的所述第一表面；和
在所述至少一个膜的所述第一表面或所述第二表面上布置的丝状真菌接种物，
其中培养所述生物反应器中的所述接种物后，在生物垫生长期后在所述至少一个膜的所述第二表面上形成所述丝状真菌的生物垫。
53.权利要求52的生物反应器，其中所述容器是袋，其中所述至少一个膜的所述第一和第二表面是所述袋的至少一部分的第一和第二表面。
54.权利要求52的生物反应器，其中所述原料经受对所述至少一个膜的所述第一表面和所述第二表面中的至少一个相对的所述原料侧赋予的正压或负压。
55.权利要求52的生物反应器，其进一步包含蓝细菌，其中所述蓝细菌提供氧气和碳中的至少一种以促进所述生物垫的生长。
56.权利要求52的生物反应器，其中以下至少一项是真实的：
i)所述生物垫的密度为至少约0.05克/立方厘米；和
ii)干燥后的所述生物垫的密度为至少约0.01克/立方厘米。
57.权利要求52的生物反应器，其中所述生物垫包含至少一个层。
58.权利要求52的生物反应器，其中所述生物垫具有至少约3千帕斯卡或至少约30克-力/平方厘米的拉伸强度。
59.权利要求58的生物反应器，其中所述生物垫具有至少约100千帕斯卡或至少约1,020克-力/平方厘米的拉伸强度。
60.权利要求52的生物反应器，其中所述至少一个膜包含选自下组的至少一种聚合物：聚丙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚酰胺、乙酸纤维素、聚偏二氟乙烯、混合纤维素酯、聚醚砜、聚乙烯和聚吡咯。
61.权利要求52的生物反应器，其中所述至少一个膜包含选自下组的至少一种材料：聚丙烯织物、聚四氟乙烯织物和尼龙网滤器。
62.权利要求52的生物反应器，其中所述至少一个膜包含玻璃纤维材料和多孔陶瓷材料中的至少一种。
63.权利要求52的生物反应器，其中所述至少一个膜的平均孔径在约0.2μm至约25μm之间。
64.权利要求63的生物反应器，其中所述至少一个膜的平均孔径在约5μm至约11μm之间。
65.权利要求52的生物反应器，其中所述容器是封闭的并且基本上是气密的，其中所述容器封闭所述生物垫生长于其中的气体顶部空间。
66.权利要求52的生物反应器，其中所述生物垫自发与所述至少一个膜分开。
67.权利要求52的生物反应器，其中当从所述至少一个膜取出所述生物垫时，新的丝状真菌接种物保留在所述至少一个膜上。
68.权利要求52的生物反应器，其中所述丝状真菌属于选自下组的目：毛霉菌目、黑粉菌目、红菇目、多孔菌目、伞菌目、盘菌目和肉座菌目。
69.权利要求52的生物反应器，其中所述丝状真菌属于选自下组的科：毛霉菌科、黑粉菌科、猴头菌科、多孔菌科、灰树花菌科、离褶伞科、球盖茹科、马勃科、伞菌科、侧耳科、泡头菌科、线虫草科、块菌科、羊肚菌科、绣球菌科、丛赤壳科、生赤壳科和虫草菌科。
70.权利要求52的生物反应器，其中所述丝状真菌选自下组：少孢根霉(Rhizopusoligosporus)、茭白黑粉菌(Ustilago esculenta)、Hericululm erinaceus、宽鳞多孔菌(Polyporous squamosus)、Grifola frondosa、真姬菇(Hypsizygus marmoreus)、榆菇(Hypsizygus ulmarius)(榆耳(elm oyster))、香杏丽蘑(Calocybe gambosa)、光帽鳞伞(Pholiota nameko)、大秃马勃(Calvatia gigantea)、双孢子蘑菇(Agaricus bisporus)、大球盖菇(Stropharia rugosoannulata)、砖红垂幕菇(Hypholoma lateritium)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)(珍珠菇(pearl))、糙皮侧耳columbinus变种(蓝蚝菇)、波氏块菌(Tuber borchii)、羊肚菌(Morchella esculenta)、尖顶羊肚菌(Morchella conica)、梯棱羊肚菌(Morchella importuna)、绣球菌(Sparassiscrispa)(花椰菜)、Fusarium venenatum、菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)、肋状皱盘菌(Disciotis venosa)和北冬虫夏草(Cordyceps militaris)、彩绒革盖菌(Trametesversicolor)、灵芝(Ganoderma lucidum)、绒状火菇(Flammulina velutipes)、埃杜拉香菇(Lentinula edodes)、红平菇(Pleurotus djamor)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、Leucoagaricus holosericeus、Calvatia fragilis、龟裂秃马勃(Handkea utriformis)和多脂鳞伞(Pholiota adipose)。
71.权利要求52的生物反应器，其中所述原料包含动物的粪便和动物的尿液中的至少一种。
72.权利要求71的生物反应器，其中所述动物是人。
73.权利要求52的生物反应器，其中所述至少一个膜是单一复合膜，其中所述第一表面包含第一材料，并且所述第二表面包含第二材料。
74.权利要求52的生物反应器，其中所述至少一个膜包含至少第一膜和第二膜，其中所述第一表面是所述第一膜的表面并且所述第二表面是所述第二膜的表面。
75.权利要求74的生物反应器，其中所述第一膜和第二膜彼此物理接触。
76.权利要求52的生物反应器，其进一步包括选择性透气膜，其中将所述生物垫的生长期间产生的第一气体选择性分离到所述选择性透气膜的第一侧上的气体顶部空间中。
77.权利要求76的生物反应器，其中将所述生物垫的生长期间产生的第二气体选择性分离到所述膜的第二侧上的气体顶部空间中。
78.用于生产丝状真菌的生物垫的方法，其包括：
在生物反应器中接种丝状真菌，其中所述生物反应器包含：
容器；
在所述容器内或所述容器的表面上布置的至少一个膜，所述至少一个膜包含第一表面和第二表面，其中所述第一和第二表面中的任一个或两者适合于在其上接受所述丝状真菌的接种物；和
用于丝状真菌生长的原料，其接触所述至少一个膜的所述第一表面。
79.权利要求78的方法，其中所述容器是袋，其中所述至少一个膜的所述第一和第二表面是所述袋的至少一部分的第一和第二表面。
80.权利要求78的方法，其中所述原料经受对所述至少一个膜的所述第一表面相对的所述原料侧赋予的正压或负压。
81.权利要求80的方法，其中所述正压或负压促进所述接种步骤。
82.权利要求78的方法，其进一步包括在所述生物反应器中提供蓝细菌，其中所述蓝细菌提供氧气和碳中的至少一种以促进所述生物垫的生长。
83.权利要求78的方法，其中以下至少一项是真实的：
i)收获后所述生物垫的密度为至少约0.6克/立方厘米；和
ii)收获和干燥后所述生物垫的密度为至少约0.1克/立方厘米。
84.权利要求78的方法，其中所述生物垫包含至少一个层。
85.权利要求78的方法，其中在收获步骤期间或之后，所述生物垫具有至少约3千帕斯卡或至少约30克-力/平方厘米的拉伸强度。
86.权利要求85的方法，其中在收获步骤期间或之后，所述生物垫具有至少约100千帕斯卡或至少约1,020克-力/平方厘米的拉伸强度。
87.权利要求78的方法，其中所述至少一个膜包含选自下组的至少一种聚合物：聚丙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚酰胺、乙酸纤维素、聚偏二氟乙烯、混合纤维素酯、聚醚砜、聚乙烯和聚吡咯。
88.权利要求78的方法，其中所述至少一个膜包含选自下组的至少一种材料：聚丙烯织物、聚四氟乙烯织物和尼龙网滤器。
89.权利要求78的方法，其中所述膜包含玻璃纤维材料和多孔陶瓷材料中的至少一种。
90.权利要求78的方法，其中所述至少一个膜的平均孔径在约0.2μm至约25μm之间。
91.权利要求90的方法，其中所述至少一个膜的平均孔径在约5μm至约11μm之间。
92.权利要求78的方法，其中所述容器是封闭的并且基本上是气密的，其中所述容器封闭所述生物垫生长于其中的气体顶部空间。
93.权利要求78的方法，其中所述生物垫自发与所述至少一个膜分开。
94.权利要求78的方法，其进一步包括收获所述生物垫，其中当从所述至少一个膜取出所述生物垫时，新的丝状真菌接种物保留在所述至少一个膜上。
95.权利要求78的方法，其中所述丝状真菌属于选自下组的目：毛霉菌目、黑粉菌目、红菇目、多孔菌目、伞菌目、盘菌目和肉座菌目。
96.权利要求78的方法，其中所述丝状真菌属于选自下组的科：毛霉菌科、黑粉菌科、猴头菌科、多孔菌科、灰树花菌科、离褶伞科、球盖茹科、马勃科、伞菌科、侧耳科、泡头菌科、线虫草科、块菌科、羊肚菌科、绣球菌科、丛赤壳科、生赤壳科和虫草菌科。
97.权利要求78的方法，其中所述丝状真菌选自下组：少孢根霉(Rhizopusoligosporus)、茭白黑粉菌(Ustilago esculenta)、Hericululm erinaceus、宽鳞多孔菌(Polyporous squamosus)、Grifola frondosa、真姬菇(Hypsizygus marmoreus)、榆菇(Hypsizygus ulmarius)(榆耳(elm oyster))、香杏丽蘑(Calocybe gambosa)、光帽鳞伞(Pholiota nameko)、大秃马勃(Calvatia gigantea)、双孢子蘑菇(Agaricus bisporus)、大球盖菇(Stropharia rugosoannulata)、砖红垂幕菇(Hypholoma lateritium)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)(珍珠菇(pearl))、糙皮侧耳columbinus变种(蓝蚝菇)、波氏块菌(Tuber borchii)、羊肚菌(Morchella esculenta)、尖顶羊肚菌(Morchella conica)、梯棱羊肚菌(Morchella importuna)、绣球菌(Sparassiscrispa)(花椰菜)、Fusarium venenatum、菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)、肋状皱盘菌(Disciotis venosa)、和北冬虫夏草(Cordyceps militaris)、彩绒革盖菌(Trametesversicolor)、灵芝(Ganoderma lucidum)、绒状火菇(Flammulina velutipes)、埃杜拉香菇(Lentinula edodes)、红平菇(Pleurotus djamor)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、和白环蘑属种(Leucoagaricus spp)。
98.权利要求78的方法，其中所述原料包括动物粪便和动物尿液中的至少一种。
99.权利要求98的方法，其中所述动物是人。
100.权利要求78的方法，其中所述至少一个膜是单个复合膜，其中所述第一表面包含第一材料并且所述第二表面包含第二材料。
101.权利要求78的方法，其中所述至少一个膜包括至少第一膜和第二膜，其中所述第一表面是所述第一膜的表面并且所述第二表面是所述第二膜的表面。
102.权利要求101的方法，其中所述第一和第二膜彼此物理接触。
103.权利要求78的方法，其中所述生物反应器还包括选择性透气膜，其中将在所述生物垫生长期间产生的第一气体选择性地分离到所述选择性透气膜的第一侧上的气体顶部空间中。
104.权利要求103的方法，其中将所述生物垫生长期间产生的第二气体选择性地分离到所述膜的第二侧上的气体顶部空间中。
105.一种生产淡水的方法，包括：
在生物反应器中接种丝状真菌，其中所述生物反应器包含：
容器；和
用于丝状真菌生长的原料；
培养所述丝状真菌以在原料表面和生物反应器膜表面中的至少一个上形成生物垫，其中所述丝状真菌在所述生物垫的生长期间产生作为代谢副产物的水；和
收集由所述生物垫生长产生的水。
106.权利要求105的方法，其中所述原料包括动物粪便和动物尿液中的至少一种。
107.权利要求106的方法，其中所述动物是人。
108.权利要求105的方法，还包括将所收集的水循环到所述生物反应器。
109.权利要求105的方法，还包括制备包含所收集的水的原料。
110.权利要求109的方法，还包括将包含所收集的水的制备的原料循环到所述生物反应器。
111.一种生产气体的方法，包括：
在生物反应器中接种丝状真菌，其中所述生物反应器包括：
容器；和
用于丝状真菌生长的原料；
培养所述丝状真菌以在原料表面和生物反应器膜表面中的至少一个上形成生物垫，其中所述丝状真菌在生物垫生长期间产生作为代谢副产物的气体；和
收集由生物垫生长产生的气体。
112.权利要求111的方法，其中所述气体选自由氨、铵物质、氢气和挥发性酯组成的组。
113.一种生产丝状真菌生物垫的方法，包括：
(a)将有效量的至少一种丝状真菌的细胞接种到生长培养基的第一等分试样中以产生接种的生长培养基；
(b)将接种的生长培养基温育第一时间以产生初始生物垫；
(c)取出所述生长培养基的第一等分试样的至少一部分，并添加生长培养基的第二等分试样以提供更新的生长培养基；和
(d)将所述更新的生长培养基温育第二时间以产生成品生物垫，
其中所述成品生物垫的厚度和干质量密度中的至少一项大于初始生物垫的厚度和干质量密度。
114.权利要求113的方法，其中所述成品生物垫的干质量密度为至少约75克/升。
115.权利要求113的方法，其中所述生物垫包含大于约40重量％的蛋白质和小于约8重量％的RNA。
116.权利要求113的方法，其中所述至少一种丝状真菌属于选自下组的目：黑粉菌目、红菇目、多孔菌目、伞菌目、盘菌目和肉座菌目。
117.权利要求113的方法，其中所述至少一种丝状真菌属于选自下组的科：黑粉菌科、猴头菌科、多孔菌科、灰树花菌科、离褶伞科、球盖茹科、马勃科、伞菌科、侧耳科、泡头菌科、光茸菌科、块菌科、羊肚菌科和虫草菌科。
118.权利要求113的方法，其中所述至少一种丝状真菌选自下组：菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)、Fusarium venenatum、茭白黑粉菌、Hericululm erinaceus、宽鳞多孔菌、Grifola fondrosa、真姬菇、香杏丽蘑、光帽鳞伞、大秃马勃、双孢子蘑菇、大球盖菇、砖红垂幕菇、刺芹侧耳、波氏块菌、羊肚菌、尖顶羊肚菌、肋状皱盘菌、冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)和北冬虫夏草。
119.权利要求113的方法，其中所述成品生物垫具有选自下组的特征：
a.包含大于约45重量％蛋白质含量；
b.包含大于约50重量％蛋白质含量；
c.包含大于约55重量％蛋白质含量；
d.包含大于约60重量％蛋白质含量；
e.包含小于约5重量％RNA含量；
f.包含小于约4重量％RNA含量；
g.包含小于约3重量％RNA含量；
h.包含小于约2重量％RNA含量；和
i.a-d之一和e-h之一的组合。
120.权利要求113的方法，其中所述成品生物垫包含小于约10ppm选自下组的真菌毒素：黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、烟曲霉毒素B1、烟曲霉毒素B2、烟曲霉毒素B3、赭曲毒素A、瓜萎镰菌醇、脱氧瓜萎镰菌醇、乙酰基脱氧瓜萎镰菌醇、镰刀菌烯酮X、T-2毒素、HT-2毒素、新茄镰孢菌醇、蛇形菌素、玉米赤霉烯酮、白僵菌素、镰菌素C、镰刀菌酸及它们的任意组合。
121.权利要求113的方法，其中所述成品生物垫包含小于约10ppm的总真菌毒素含量。
122.权利要求113的方法，其中所述成品生物垫包含小于约5ppm的总真菌毒素含量。
123.权利要求113的方法，其中所述成品生物垫包含大于约15重量％支链氨基酸。
124.至少一种丝状真菌的生物垫，其具有至少约75克/升的干质量密度。
125.权利要求124的生物垫，其包含大于约40重量％蛋白质和小于约8重量％RNA。
126.权利要求124的生物垫，其中所述至少一种丝状真菌属于选自下组的目：毛霉菌目、黑粉菌目、红菇目、多孔菌目、伞菌目、盘菌目和肉座菌目。
127.权利要求124的生物垫，其中所述至少一种丝状真菌属于选自下组的科：毛霉菌科、黑粉菌科、猴头菌科、多孔菌科、灰树花菌科、离褶伞科、球盖茹科、马勃科、伞菌科、侧耳科、泡头菌科、线虫草科、块菌科、羊肚菌科、绣球菌科、丛赤壳科、生赤壳科和虫草菌科。
128.权利要求124的生物垫，其中所述至少一种丝状真菌选自下组的种：少孢根霉、茭白黑粉菌、Hericululm erinaceus、宽鳞多孔菌、Grifola frondosa、真姬菇、榆菇(榆耳)、香杏丽蘑、光帽鳞伞、大秃马勃、双孢子蘑菇、大球盖菇、砖红垂幕菇、刺芹侧耳、糙皮侧耳(珍珠菇)、糙皮侧耳columbinus变种(蓝蚝菇)、波氏块菌、羊肚菌、尖顶羊肚菌、梯棱羊肚菌、绣球菌(花椰菜)、Fusarium venenatum、菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)、肋状皱盘菌和北冬虫夏草、彩绒革盖菌、灵芝、绒状火菇、埃杜拉香菇、红平菇、糙皮侧耳和白环蘑属种(Leucoagaricus spp)。
129.权利要求124的生物垫，其中所述成品生物垫具有选自下组的特征：
a.包含大于约45重量％蛋白质含量；
b.包含大于约50重量％蛋白质含量；
c.包含大于约55重量％蛋白质含量；
d.包含大于约60重量％蛋白质含量；
e.包含小于约5重量％RNA含量；
f.包含小于约4重量％RNA含量；
g.包含小于约3重量％RNA含量；
h.包含小于约2重量％RNA含量；和
i.a-d之一和e-h之一的组合。
130.权利要求124的生物垫，其包含小于约10ppm选自下组的真菌毒素：黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、烟曲霉毒素B1、烟曲霉毒素B2、烟曲霉毒素B3、赭曲毒素A、瓜萎镰菌醇、脱氧瓜萎镰菌醇、乙酰基脱氧瓜萎镰菌醇、镰刀菌烯酮X、T-2毒素、HT-2毒素、新茄镰孢菌醇、蛇形菌素、玉米赤霉烯酮、镰菌素C、镰刀菌酸及它们的任意组合。
131.权利要求124的生物垫，其包含小于约10ppm的总真菌毒素含量。
132.权利要求124的生物垫，其包含小于约5ppm的总真菌毒素含量。
133.权利要求124的生物垫，其包含大于约15重量％支链氨基酸。
134.权利要求124的生物垫，其通过权利要求113的方法生产。
135.用于生产丝状真菌生物垫的方法，其包括：
在生物反应器中接种丝状真菌，其中所述生物反应器包含：
容器；
布置于所述容器的表面内或表面上的至少一个网状支架，所述至少一个网状支架包含第一表面和第二表面，其中所述第一和第二表面之一或两者适于在其上接收丝状真菌的接种物；和
用于丝状真菌生长的原料，其接触所述网状支架的第一表面。
136.权利要求135的方法，其中所述网状支架包括尼龙材料。
137.培养的食物产品，其包含：
丝状真菌的颗粒，所述丝状真菌属于选自下组的目：毛霉菌目、黑粉菌目、红菇目、多孔菌目、伞菌目、盘菌目和肉座菌目，其中所述丝状真菌包含大于约40重量％蛋白质含量和小于约8重量％RNA含量；和
微生物食物培养物。
138.权利要求137的培养的食物产品，其中所述微生物食物培养物包含乳酸菌。
139.一种制备培养的食物产品的方法，包括：
用微生物食物培养物接种丝状真菌的颗粒，其中所述丝状真菌属于选自下组的目：毛霉菌目、黑粉菌目、红菇目、多孔菌目、伞菌目、盘菌目和肉座菌目，其中所述丝状真菌包含大于约40重量％蛋白质含量和小于约8重量％RNA含量。
140.权利要求139的方法，其中所述微生物食物培养物包括乳酸菌。
141.权利要求137的培养的食物产品，其通过权利要求139的方法制备。
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