KR20050001175A - 노루궁뎅이버섯의 2단계 배양방법 및 이의 배양 생성물을함유하는 뇌기능 개선제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 노루궁뎅이버섯의 2단계 액체배양방법 및 이의 배양 생성물을 함유하는 뇌기능 개선제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceum)을 액체 배양하는데 있어서 마늘을 기질로 사용하여 마늘-노루궁뎅이버섯 배양 생성물을 얻어 각종 생리활성의 상승 또는 수식(modification)작용으로 노루궁뎅이버섯 단독 액체배양 생성물과는 달리 새로운 효과를 가지는 노루궁뎅이버섯의 2단계 액체배양방법, 이의 배양 생성물 및 이를 함유하는 뇌기능 개선제에 관한 것이다.

Description

노루궁뎅이버섯의 2단계 배양방법 및 이의 배양 생성물을 함유하는 뇌기능 개선제{Two staged liquid cultivation of Hericium erinaceum and the promoting agent for neuronal activities containing its cultured products}

본 발명은 노루궁뎅이버섯의 2단계 액체배양방법 및 이의 배양 생성물을 함유하는 뇌기능 개선제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceum)을 액체 배양하는데 있어서 마늘을 기질로 사용하여 마늘-노루궁뎅이버섯 배양 생성물을 얻어 각종 생리활성의 상승 또는 수식(modification)작용으로 노루궁뎅이버섯 단독 액체배양 생성물과는 달리 새로운 효과를 가지는 노루궁뎅이버섯의 2단계 액체배양방법, 이의 배양 생성물 및 이를 함유하는 뇌기능 개선제에 관한 것이다.

담자균류(Basidiomycetes)인 버섯은 지구상의 귀중한 생물자원의 하나로 옛부터 식용이나 한방 및 민간 생약의 우수한 상품약으로 사용되어 왔다.

최근에 와서는 이들 버섯의 각종 약효성분이 규명되고, 그 효과도 보고되어 이제 버섯 유래 생리활성 물질의 개발과 이용은 산업적인 중요과제로 등장하기에까지 이르렀고, 그 산업적 생산체제도 확대되고 있는 실정이다[Lee. S.Y. 1996. Characteristics and production of antitumor polysaccharides from mushroom origin(in Korean). Biotechnology News, 3(2): 95-109].

이 중에서도 노루궁뎅이버섯[Hericium erinaceum(Bull.ex.Fr) Pers.]은 담자균류, 민주름버섯목(Aphyllophorales), 턱수염버섯과(Hydnaecae), 산호침버섯속(Hericium)으로 분류되는 버섯으로, 우리나라를 비롯한 중국, 일본 등 북반구 온대이북에 널리 분포하는 식용버섯이다. 이 버섯은 참나무, 밤나무 등 활엽수에 기생하는 백색 부후균의 일종이며, 가을철에 많이 발생하는데, Liu에 의해 재배기술이 개발되어 인공재배도 가능해졌다[Liu. C.Y. 1981. Technique of cultivation of monkeyhead mushroom. Edible Fungi, No. 4, 33]. 일본에서는 할목 재배나 PE(polyethylene)병을 이용한 균상재배 방법 등 인공재배법이 확립되어 연중 시장에 출하되고 있는 실정이며, 우리나라에서도 최근 인공재배가 시작된 버섯이다[Ko. H.K. 1998. Cultural characteristics of Hericium erinaceum. M.S. thesis, Korea Univ.]

노루궁뎅이버섯의 화학성분은 당질과 단백질을 주성분으로 하고, 미네랄을 함유하나 지방함량은 적다[Eisenhut, R., Fritz, D. and Tiefel, P. 1995. Investigations on nutritionally valuable constituents ofHericium erinaceus(Bull.:Fr) Pers.Gartenbauwissenschaft,60(5), 212-218]. 미네랄은 Na, P, Mg 등의 순으로 많은데, 재배용의 원목이나 균상에 따라 회분조성도 영향을 받는다.

맛 성분으로는 유리 아미노산, 유리당(trehalose, manitol,arabinitol, glucose 등), 유기산(malic acid, fumaric acid, citric acid, α-ketoglutaric acid 등)이 존재한다. 기타 정미성분으로서 아데노신, 구아닌산, 구아노아데닌산 등의 핵산 성분이 존재하는데, 이들은 아미노산과의 상승작용에 의해 지미를 주는 것으로 알려지고 있다.

비타민으로서는 B1, B2, 니아신(niacin)은 존재하나 비타민 A와 C는 검출되지 않는다. 또한, 광과 가열건조에 의해 비타민 D2로 변화하고 Ca의 흡수대사에 도움을 주어 골다공증의 예방 역할이 기대되는 에르고스테롤(ergosterol)이 보편적으로 존재한다.

그러나, 지금까지의 연구에 의하면 이러한 영양성분 외에도 노루궁뎅이버섯에는 약리활성 성분으로 헬라 세포(Hella cell) 증식저해물질, 신경성장인자(NGF) 합성유도 촉진 물질, 면역기능조절 성분(BRM 효과), 항종양 다당류, 렉틴(lectin), 식이섬유(β-glucan, chitin질, hetro 다당) 등이 있으며, 이들에 의해 대응하는 각종의 생리활성이 보고되고 있다[Mizuno, T. 1995. Yamabushitake, Hericiumerinaceum: Bioactive substances and medicinal utilization. Food Reviews International, 11(1), 173-175].

중국에서는 한방약으로 유명한데, 노루궁뎅이 자실체의 복합 다당류(hetero- polysaccharides)는 면역기능 조절에 기초한 항암작용(위암, 식암, 간장암, 피부암 등)을 갖는 것이 알려지고 있으며, 또한 노루궁뎅이버섯의 면역체계 강화에 의한 위, 십이지장 궤양 및 위암, 식도암에의 치료효과를 보고한 바 있고[Yang, Q.Y., and Jong, S.C. 1989. Medical mushrooms in China. Mush. Sci., 12(Part 1), 631-643], 항암 및 면역기능을 촉진시킴을 보고한 바 있다[Ahn, D.K. 1992. Medicinal fungi in Korea.Kor. J. Mycol.,20,154-165 ].

특히, 신경성장인자(NGF)의 합성유도 촉진활성을 나타내는 자실체 유래의 페놀 관련 화합물(hericenone C, D, E, Y-A-8-c)이나 균사체 유래 에리나신(erinacine) A ∼ I 등에 의한 중추신경 재생과 알쯔하이머형 치매의 개선 효과를 밝혀 이들의 치료제로서의 이용가능성을 보고한 바 있다[Kawagishi, H., Shimada, A., Shirai, R., Okamoto, K., Ojiima, F., Sakamoto, H., Ishiguro, Y., and Furukawa, S. 1994. Erinacines A, B and C, strong stimulators of nerve growth factor (NGF)-synthesis, from the mycelia ofHericium erinaceum.Tetrahedron Letter,35(10), 1569-1572; Kawagishi, H., Shimada, A., Hosokawa, S., Mori, H., Sakamoto, H., Ishiguro, Y., Sakemi, S., Bordner, J., Kojima, N., and Furukawa, S.1996. Erinacines E, F and G, stimulators of nerve growth factor(NGF)-synthesis, from the mycelia ofHericium erinaceum.Tetrahedron Letter,37(41), 7399-7402; Kawagishi, H., Shimada, A., Shizuki, K., Mori, H., Okamoto, K., Sakamoto, H., Furukawa, S. 1996. Erinacines D, a stimulator of nerve growth factor(NGF)-synthesis, from the mycelia ofHericium erinaceum.Heterocycl. Commun., 2(1), 51-54; Furukawa, S. and Kawagishi, H. 1991. Physiological significance and the synthesis-prmoting substances of nerve growth factor(NGF).Chemistry & Biology,29(10), 640-646; Kawagishi, H., Ando, M., Shinba, K., Sakamoto, H., Yoshida, S., Ojima, F., Ishiguro, Y., Ukai, N., and Furukawa, S. 1993. Chromans, hericenones F, G and H from the mushroomHericium erinaceum.Phytochemistry, 32(1), 175-178]. 현재 자실체 유래의 헤리세논(hericenone)류는 천연물의 탐색에서 얻어진 최초의 화합물로 아드레날린과 비슷한 정도의 활성을 보이는 것으로 알려져 있다. 아울러, 균사체 유래 에리나신 A ∼ I는 자실체 유래의 헤리신(hericine) C ∼ H로 명명된 화합물군과는 전혀 구조가 다른 것으로 지금까지 알려져 있는 물질 중에서 가장 강력한 활성을 보이는 부류로 보고되고 있다. 또한, 이러한 약효와 더불어 각종 식품기능 및 안전성도 확인되어 점차 각종 기능성 식품소재 및 건강기능성식품(nutraceutical)으로서의 잠재적 가능성이 매우 높은 것으로 인식되었다.

하지만, 일반적으로 버섯(자실체)의 생산은 광선, 온도, 습도의 제어를 필요로 하며, 유효성분의 추출 수율도 매우 낮아 이들 성분을 이용한 산업화는 비교적 미미한 실정이다.

따라서, 최근에는 자실체와는 달리 배양이 보다 용이한 자실체 발생이전의단계인 균사체의 액체배양에 의해 생리활성 물질을 생산하는 연구가 널리 시도되고 있다. 이들 액체배양은 1948년 미국에서 Humfeld[Humfeld, H. 1948. The production of mushroom mycelium(Agaricus campestris) in submerged culture.Science,107, 373-375]가 주름버섯(Agaricus campestris)에 대해 최초로 시도한 이래, 지금까지 60종 이상의 식용버섯에 대해 액체배양이 검토되었다. 무엇보다도 액체배양법은 일정 조건에서의 배양이 가능하여 품질이 균일한 균사체를 고효율 및 대량으로 얻을 수 있으며, 또 낮은 비용으로 생산할 수 있어 최근 들어 활발히 수행되고 있는 실정이다.

그 동안 노루궁뎅이버섯의 액체배양 관련 연구로는 콘 브란(corn bran) 또는 MPGA(malt extract-peptone-glucose-agar) 배지를 사용하여 노루궁뎅이버섯 균사체를 생산한 연구가 있고[Aronone, A.R., Cardillo, G., Nasini, and O.V. de Pava. 1994. Secondary mold metabolites: Part 46. Hericines A-C and erinapyrone C, new metabolites produced by the fungus Hericium erinaceus. J. Nat. Prod. 57, 602-606], 국내에서도 액체배양에 의한 노루궁뎅이 균사체 생산을 위한 기초연구[Baek, G.Y. 2000. Studies on the growth characteristics and functional screening of mycelia and fruiting body ofHericium erinaceum, MS thesis, Chungju National University] 및 식품부산물을 이용한 노루궁뎅이버섯 균사체의 액체배양 연구[Cho, J. Y. 1996. Liquid cultivation ofH. erinaceummycelium using by food byproducts and compositions of health beverage containing the extract of this mycelium. Korean Patent Application No. 1996-070586]가 있다. 하지만, 아직도 이 노루궁뎅이버섯의 액체배양에 대해서는 다른 버섯류에 비해 매우 제한되어 있으며, 더구나 이들 액체배양 생성물의 생리활성에 대해서는 거의 보고되지 않고 있다.

특히, 대량 액체배양을 위해서는 임펠러 타입(impeller type) 배양장치의 동력소모를 줄이며, 전단응력(shear stress)에 의해 균사체 펠렛의 파편화를 방지할 새로운 발효장치가 필요하다. 더구나 버섯균은 생육 속도가 비교적 느리며, 벽면 성장(wall growth) 등의 생리적 특성을 고려할 때, 생산성의 향상을 위하여 이에 알맞은 새로운 형태의 발효조를 설계 고안하고, 새로운 액체배양 시스템을 적용하는 연구의 필요성이 매우 높다.

그러므로 본 발명자들은 각종 기능성을 발현하는 노루궁뎅이버섯의 기능성 제품화 연구 일환으로, 지금까지 체계적으로 연구된 바 없는 air-lift 발효조에서 노루궁뎅이버섯의 액체배양을 시도하였고, 이 버섯의 액체배양 특성 규명 및 공정 최적화를 수행한 바 있으며, 배양 생성물의 몇몇 성분 및 생리 기능성의 변화를 자실체와 비교한 결과, 이들 배양생성물(균사체 추출물)의 암세포주 증식에 미치는 효과, 비장세포의 증식유도능 및 IL-2 생산능, 골수세포의 증식효과, 복강세포의 NO 생산능 및 탐식능, 항산화능 등의 생리활성은 자실체와 비교할 때, 대부분의 생리활성에서 비슷하거나 다소 뒤지는 것으로 나타났다. 따라서, 액체배양 생성물의 산업화를 위해서는 대량 생산공정개발과 더불어 생리활성의 향상을 위한 시도가 이루어져야 할 것으로 판단하였다.

한편, 마늘(Garlic: Allium sativum L.)은 중앙 아시아 원산의 백합과 다년초(宿根性 草本)이다. 기원전 1세기 경에 인도, 아프카니스탄을 거쳐 중국으로 들어왔고, 그 후 우리나라에 전래된 것으로 알려지고 있는, 현재는 아시아 전역, 아프리카, 호주, 미국, 남유럽 등 각지에서 재배되고 있다.

이들 마늘은 많은 나라에서 5,000년 이상이나 식품 및 전통의약으로서 널리 사용되어 왔으며, 현재 향신료서 전세계적으로 널리 이용되고 있다. 그러나, 과학적 관심은 지난 50여년 동안에 이루어 졌으며, 최근에 와서야 이들 마늘이 면역력과 각종 질병에 저항력을 길러주는 식품으로 점차 인식하게 되었다. 이에 따라 지금은 전세계적으로 관심이 고조되었으며, 현재 120개국에서 마늘에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 1996년 건강식품으로서 판매한 마늘 가공품은 미국이 연간 1조원, 독일이 5000억원 이상인 것으로 알려지고 있는 바, 그 시장성도 매우 높다.

이시진의 본초강목에 의하면 마늘은 강정, 강장, 정장작용, 식욕증진, 변비, 구충퇴치, 이뇨 작용, 보온, 항균, 전신안정, 혈압강하, 각기 신경통 신경마비 예방에 효험이 있는데, 최근의 연구에 의하면 항산화 및 유리 라디칼 소거능, 혈소판응집 저해능, 항트롬빈 효과, 방부 및 항균(AIDS) 효과, 항종양 및 면역자극 활성, 항당뇨 효과, 항변이원성 등이 알려지고 있다[Milner, J.A. 2001. Garlic: The mystical food in health promotion. In: Handbook of Nutraceuticals and Functional Foods(R.E.C. Wildman, ed.). CRC Press, Boca Raton,, pp.193-207; Kemper, K.J. 2000. Garlic(Allium sativum). The Lonwood Herbal Task Force. In-Depth Monographs(March 8, 2000), Massachusetts College of Pharmacy and HealthSciences and the Dana Farber Cancer Institute. pp.1-49; Freeman, F., and Kodera, Y. 1995. Garlic chemistry: Stability of S-(2-propyl) 2-propene-1-sulfinothioate(allicin) in blood, solvents, and simulated physiological fluids. J. Agric. Food Chem., 43: 2332-2338; Agarwal, K.C. 1996. Therapeutic actions of garlic constituents. Med. Res. Rev., 16(1): 111-124; Delaquis, P. and Mazza, G. 1998. Functional vegetable products. In: Functional Foods: Biochemical & Processing Aspects(G. Mozza, ed.). Technomic Publishing Co. Inc., Lancaster, pp.193-233; Satoshi, F. 1994. Garlic and health. New Food Industry, 36(11): 1-10; Block, E. 1985. The chemistry of garlic and onions. Sci. Am. 252: 114-119].

그러나, 마늘은 주로 아릴 설파이드(C₃H5S-SC₃-H₇, C₃H₅S-SC₃-H₅)에 기인한 냄새가 있으며, 생 마늘은 일시에 많이 먹으면 위의 점막을 자극해서 위통을 일으킨다. 특히, 마늘 속의 알리신(allicin)은 적혈구의 용혈작용이 있으므로 너무 많이 먹으면 적혈구가 파괴되고 빈혈을 유발된다. 또한, 마늘의 우수한 살균작용은 인체에 유용한 장내세균도 사멸시켜 비타민 B군의 합성을 불가능하게 하므로 비타민 B복합체의 부족을 일으키는 등 결점을 갖는다.

따라서, 상기와 같은 마늘의 결점을 보완하고 동시에 각종 새로운 생리 기능을 발현할 수 있는 적정 제품의 개발 필요성은 매우 높으나 이에 대한 연구는 미미한 실정이다.

지금까지의 단순 가공을 통한 마늘의 제품화로는 냄새성분의 제거 및 활성의 유지 등에서 그 한계가 있고, 생리기능의 과학적 검증에서도 문제점을 갖고 있다. 따라서 체계적이고 제품화와 연계된 생리활성의 연구 및 이에 기초한 새로운 개념의 기능성 제제화로 고부가 가치화하는 것이 필요하며, 이를 위한 기능성 자료화 마련은 매우 절실한 실정이라 하겠다.

일반적으로 야채류 등은 미생물로 배양하여 처리하면 미생물의 작용으로, 원료 내의 기능성 성분 및 냄새가 개선 향상될 수 있고, 각종 생리 기능을 갖는 발효 균주의 첨가 효과를 갖게 되며, 균주의 발효에 의해 생성된 생성물에 의하여 원료에는 없었던 새로운 효과를 갖는 제품의 생산이 가능하다[Fleming et al., 1983. Storage stability of vegetable fermented with pH control. J. Food Sci. 48: 975-981].

마늘의 경우, 마늘 장아찌 등 초 및 염절임 방법[Rejano et al., 1997. Chemical characteristics and storage stability of pickled garlic prepared using different processes. J. Fd. Sci., 62(6): 1120-1123; Kim, et al., 1994. The study of pretreated GE-132 on the mepatic glutathione S-transferase activity in rat. J. Korean Soc. Food Nutr., 23(4): 581-586]에 의한 제품은 있지만 미생물에 의한 발효제품은 거의 찾아보기 힘들다. 특히, 다양한 미생물 종, 이 중에서도 담자균류에 의한 발효 제품화에 대해서는 전혀 보고된 바 없었다.

통상 숙성에 의해 유효성분이 소멸된다는 주장도 있지만 이에 대한 과학적 근거 자료는 없다. 이는 주로 알리신(allicin)의 효과만을 고려하였기 때문이라 할 수 있다. 실제 최근에는 알리신 보다는 마늘 중의 지용성 및 수용성 황 화합물에 대해 오히려 더욱 많은 연구가 진전되고 있는데, 이에 의하면 이들 황 화합물들은 알리신과는 다른 서로 다른 많은 생리활성을 갖는다. 결국, 현재에는 생마늘의 효과를 보이는 알리신뿐만 아니라 가열마늘의 효과 성분으로서 스코르디닌(scordinin), 항혈전 작용의 성분으로서 아조엔(ajoene)의 효과가 널리 보고되고 있다[Watanabe, T. 1988. Utilization of active principles of garlic. Up-to-date Foodprocessing. 23(6),40-42].

이에, 본 발명자들은 지금까지 검토된 바 없는 마늘을 기질로 한 노루궁뎅이의 액체배양을 시도하고자 연구한 결과, 마늘을 기질로 사용하여 식용 및 약용으로 널리 사용되는 노루궁뎅이버섯의 액체배양을 실시하고, 이의 특성 규명 및 공정 최적화를 수행하였다. 또한, 이의 배양 생성물을 시료로 생리 기능성의 변화를 비교, 조사함으로써 마늘을 기질로 한 노루궁뎅이 액체배양의 특성과 이때의 수식 및 상승효과를 평가, 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 마늘을 기질로 사용한 노루궁뎅이버섯의 2단계 액체배양방법 및 이의 배양 생성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 상기 배양 생성물을 함유하는 뇌기능 개선용 의약품 및 건강식품을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

도 1은 노루궁뎅이버섯의 배양시 마늘 추출물(20%, v/v)을 초기 기질로 사용한 경우의 균사 생육의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 2는 노루궁뎅이버섯의 배양시 마늘 추출물(20%, v/v)을 초기 기질로 사용한 경우의 균사형태 변화를 나타낸 사진이다.

도 3은 노루궁뎅이버섯의 1단계 배양액에 마늘 즙액을 농도별로 첨가하고 진탕배양하면서 균사체 및 세포외 다당의 경시변화를 나타낸 것이다.

도 4는 노루궁뎅이버섯의 1단계 배양 후 마늘 즙액(30%, v/v)을 첨가하고 시간대별로 균사형태 변화를 나타낸 것이다.

도 5는 노루궁뎅이버섯의 2단계 배양을 진탕배양 및 정치배양하여 얻은 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 노루궁뎅이버섯의 2단계 배양을 진탕배양 및 정치배양하였을 때 균사형태의 경시변화를 나타낸 것이다.

도 7은 마늘 물 추출물과 압착즙액을 사용하여 진탕배양한 후의 균사형태를나타낸 것이다.

도 8은 노루궁뎅이버섯의 2단계 배양 후 배양여액의 당 및 단백질의 경시변화를 나타낸 것이다.

도 9는 노루궁뎅이버섯의 2단계 배양 전후의 UV 주사 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 서로 다른 가공법으로 추출한 마늘 추출액 시료의 2단계 배양 전후의 티오설피네이트 함량을 조사한 결과이다.

도 11은 노루궁뎅이버섯의 2단계 배양 중 배양 온도의 영향을 검토한 결과이다.

도 12는 노루궁뎅이버섯의 2단계 배양 전후 배양액의 티오설피네이트에 대한 HPLC 크로마토그램을 표준 마늘시료와 비교한 것이다.

도 13은 1단계 및 2단계 액체배양 생성물(HM, HGM)이 배양경과에 따라 신경세포 증식 및 신경돌기 신장을 확인한 그래프이다.

도 14는 1단계 및 2단계 액체배양 생성물(HM, HGM)의 신경돌기세포 함유수(%)를 비교한 그래프이다.

도 15는 신경세포인 PC-12의 세포 증식 및 신경돌기의 신장에 미치는 2단계 배양 생성물(HGM)의 영향을 조사한 결과이다.

도 16은 0.4 g/L의 HGM 농도에서 배양 1일부터 8일까지의 신경세포 생육형태를 사진 촬영하여 조사한 결과이다.

도 17은 게르빌루스 쥐(Mongolian gerbils)에 의한 일과성 뇌 허혈 모델을 사용하여 허혈 부하전에 1종의 노루궁뎅이 자실체 추출물(HFE) 및 4종의 노루궁뎅이버섯 액체배양 생성물(HM, HBr, HGM, HGBr)의 시료를 경구투여하고 해마 CA1 영역의 지연성 신경세포사를 조사한 것이다.

도 18은 지연성 신경세포사의 보호효과를 음성 대조군에 대한 상대적인 신경세포의 생존 비율로 나타낸 것이다.

도 19는 1단계 및 2단계 배양 균사체의 열수 추출 시료들(3 mg/㎖)의 AChE에 대한 저해 활성을 조사한 결과이다.

도 20은 배양 생성물의 농도에 따른 AChE 저해 활성을 나타낸 것이다.

도 21은 FTC법으로 측정한 각종 시료(1단계 및 2단계 배양 균사체의 열수 추출 시료)의 항산화 활성을 나타낸 것이다.

도 22는 TBA-RS법으로 측정한 각종 시료(1단계 및 2단계 배양 균사체의 열수 추출 시료)의 항산화 활성을 나타낸 것이다.

본 발명은 마늘을 기질로 사용한 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceum)의 2단계 액체배양방법 및 이의 배양 생성물을 그 특징으로 한다.

또한, 상기 배양 생성물을 함유하는 뇌기능 개선제 및 건강식품을 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceum)을 액체 배양하는데 있어서 마늘을 기질로 사용하여 마늘-노루궁뎅이버섯 배양 생성물을 얻어 각종 생리활성의 상승 또는 수식(modification)작용으로 노루궁뎅이버섯 단독 액체배양 생성물과는 달리 새로운 효과를 가지는 노루궁뎅이버섯의 2단계 액체배양방법, 이의 배양 생성물 및 이를 함유하는 뇌기능 개선제에 관한 것이다.

버섯 및 마늘은 현재 전세계적으로 가장 주목되고 있는 기능성 소재들 중의 하나이다. 하지만 이의 각 제품은 단독 제품으로서의 제품화 한계를 가지며, 상승효과를 고려한 제품화는 거의 이루어지지 않았다.

본 발명에서는 마늘 추출액을 기질로 이용한 버섯-마늘의 발효 제품화를 시도하여 지금까지 보고된 바가 전혀 없었던 마늘-버섯의 신규 2단계 액체배양방법을 확립하고, 이에 유래하는 생성물 분획들의 각종 생리활성을 탐색하여 2단계 액체배양 생성물의 생리활성이 버섯 또는 마늘 단독의 효과보다 크게 향상된 상승효과를 가짐을 규명함으로써 기능성 제품화의 새로운 배양 기술로서의 가능성을 입증하였다.

본 발명에 따른 노루궁뎅이버섯의 2단계 액체배양방법을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 노루궁뎅이버섯의 통상적인 액체배양법으로 1단계 액체배양을 수행한다. 바람직하기로는 최적 배지(glucose 30 g/L, yeast extract 2 g/L, polypeptone 2 g/L, malt extract 10 g/L), KH₂PO₄1 g/L, MgSO₄·7H₂O 1 g/L(pH 5.5)) 하에서 20 ∼ 30 ℃, 통기속도 1 ∼ 2.5 vvm , 교반속도 100 ∼ 400 rpm으로 6 ∼ 8 일간 액체배양한다.

만약 각종 생리기능성이 우수한 마늘 추출물을 초기 기질로 하여 노루궁뎅이버섯의 액체배양을 실시하면 마늘의 항균 및 살균작용에 기인하여 균사생육은 저해된다. 하지만, 마늘의 첨가시기가 늦어지면 이에 따라 균사생육의 저해정도도 비례하여 낮아져서 균사생육이 충분히 이루어진 배양 후기에 첨가함으로써 균사생육의 저해에 대한 방지 가능성을 확인함으로써, 균사생육이 충분히 이루어진 3일 이후에 2단계 배양을 실시하여 마늘 성분이 풍부한 2단계 배양공정을 개발, 확립하였다. 이때, 마늘 추출물은 5 ∼ 70%(v/v)(바람직하게는 30 ∼ 50%(v/v))로 첨가하며, 25 ∼ 50 ℃(바람직하게는 30 ∼ 40℃)에서 정치 또는 진탕배양하여 2단계 배양을 실시하는 것이 바람직하다.

이렇게 2단계 배양하여 얻은 배양생산물은 신경성장인자(NGF) 유도합성 촉진 효과 및 일과성 뇌허혈에 의한 뇌신경 세포사의 보호효과 등이 우수함을 확인하였다.

따라서, 상기 배양방법으로 얻은 마늘-노루궁뎅이버섯의 배양 생성물은 뇌기능 개선제로 사용 가능하다.

의약품으로 제조시, 본 발명의 배양 생성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 배양 생성물은 실제 임상 투여시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캅셀제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 리그난과 락톤 화합물 및 그의 유도체에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제가 포함된다. 비수용성제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 제제 내 함유량은 체내에서의 활성 성분의 흡수도, 불활성화율, 배설속도, 사용자의 연령, 성별 및 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 본 발명의 배양 생성물의 경우, 10 ∼ 100㎎/㎏이고, 바람직하게는 15 ∼ 20 ㎎/㎏이며, 하루 1 ∼3회 투여할 수 있다.

또한, 상기 배양 생성물은 뇌기능 개선용 건강식품으로도 사용 가능하다.

건강식품이란, 상기 배양 생성물을 일반 식품에 첨가하거나, 캅셀화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시 예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

참조예

(1) 재료

본 연구에 사용한 마늘은 고흥, 남해 또는 의성산으로 모두 시중 구입하여 4 의 저온으로 유지하면서 실험에 사용하였다. 또한, 비교 표준으로 사용한 마늘분말은 일본에서 시판되는 무취 마늘분말[Garlic extract-S powder, 100×, 일본분말약품(주)]이었다. 본 실험의 재료는 노루궁뎅이버섯의 액체배양 생성물(균사체 및 배양여액)이었다.

(2) 균주 및 배지

본 실험의 공시 균주는 본 연구실에 보관 중인 노루궁뎅이버섯(Hericium erinacem)이며, PDA(Potato-Dextrose Agar) 배지에 사면배양하여 보존하였다. 배지는 16종 배지로부터 최적화 실험하여 얻은 배지[glucose 30 g/L, yeast extract 2 g/L, polypeptone 2 g/L(또는 yeast extract 2 g/L +p olypeptone 2 g/L + malt extract 10 g/L), KH₂PO₄1 g/L, MgSO₄ㆍ7H₂O 1 g/L]을 사용하였고, 배양조건은 pH 5.5, 온도 25 ℃, 접종비 10% 이었다. 이때, pH는 0.1N HCl 또는 0.1N NaOH를 사용하여 조절하였다.

(3) 배양방법

플라스크 배양은 250 ㎖ 플라스크를 사용하여 작업용량(working volume) 50 ㎖로 접종비 5%, 25 ℃, 100 rpm 조건 하에서 실시하였다.

Air-lift 발효조 배양은 자체 제작한 3L 용량의 air-lift 발효조 시스템에서 역시 접종비를 5%로 하여 온도 25 ℃, 통기속도 2.5 vvm으로 배양하였다.

또한, 5L 자 발효조[Kobiotec]에서는 온도 25 ℃, 통기속도 1 vvm, 교반속도 100 ∼ 400 rpm으로 6일간 배양하였으며, 대량 생산시에는 500 L 자 발효조[Kobiotec]를 사용하였다.

한편, 마늘 첨가 후의 2단계 배양은 1단계 배양액에 마늘 추출액을 넣어(5 ∼ 70%, v/v) 발효조에서 그대로 또는 카보이 자(carboy jar)에서 30 ∼ 50 ℃에서정치배양 또는 진탕배양하여 실시하였다.

(4) 균사체 및 세포외 다당의 정량

액체 배양의 균사 생육은 다음과 같이 측정하였다.

배양액을 원심분리(8000 rpm, 15 분) 후 침전된 균사체를 여과지(Whitman No.2)로 여과하였다. 증류수로 2 ∼ 3회 세척한 다음, 70 ℃에서 24시간 건조하였고, 데시케이터(desiccator)에서 항량이 될 때까지 방치하여, 균사체 건조중량(mycelial dry weight, MDW)으로 정량하였다. 또한, 세포외 생성물인 다당 생성량은 원심분리(8000 rpm, 15 분)하여 균사체를 제거한 다음, 얻어진 배양여액에 2배량의 아세톤을 가하여 침전물을 얻었으며, 이를 70 ℃에서 24시간 건조하였다. 건조중량을 측정하고 조다당(crude exopolysaccharide)으로 정량하였다.

(5) 균사형태의 분석

액체배양의 균사형태는 형태는 이미지 분석 시스템(Optimas Co. U.S.A.)으로 분석하였다. 장치는 CCD 카메라(Parasonic, WV-CP410), PCI 비디오 프레임 그래버(Flashpoint Ver. 3.11, Integral Tech., Inc.) 및 PC로 구된 것을 사용하였다. 이때, 면적, 길이, 원형도, 거침도(%) 등의 각종 형태변수는 이미지 소프트웨어(Optimas 61.)를 사용하여 구하였다. 분석시 CCD 카메라의 화상은 640 ×640 pixels 및 256 grey level의 해상도로 촬영하였고, 오차를 최소화하기 위해400 ×400 pixels로 수정하였다.

(6) 마늘 추출액의 제조

생 마늘 또는 무취 분말을 시료로 처리하였다. 주로 생 마늘 200 g을 그대로 또는 레토르트파우치(retort pouch)에 넣어 자동멸균기에서 가열하였으며, 이 생 및 가열 마늘에 마늘 무게의 50배가 되게 물을 가하여(200 g/L) 주로 40 ℃에서 추출하였다.

(7) 총 티오설피네이트(thiosulfinate) 함량의 측정

총 티오설피네이트는 Freeman과 Whenham의 분광학적 방법(1975)에 따라 다음과 같이 측정하였다. 고체시료 0.1 g(또는 액상 시료 1 ㎖)을 취하여 증류수로 10 ㎖가 되도록 한 다음, 헥산(hexane) 10 ㎖를 가하고 5분간 혼합하였다. 혼합물을 3000 rpm에서 30분간 원심분리하고, 헥산층의 상징액 2 ㎖를 헥산으로 5배 희석하였다. 각 상징액의 흡광도를 분광광도계(Spectronic Genesys, Spectronic Inc., USA)로 262 nm에서 측정하였으며, 표준곡선으로부터 총 티오설피네이트 함량을 계산하였다.

(8) HPLC 분석

HPLC는 Waters HPLC(Model M600E, 996 Photodiode Array Detector, USA)를 사용하였으며, 분석조건은 column: Waters, μBond pakTM C18, pore size-5㎛, 100Å, 3.9 ×300㎜, detector: UV detector(240 ㎚), mobile phase: methanol/water (50:50) 또는 acetonitrile/water(45:55), flow rate: 1.0㎖/min, injection vol.: 20/㎕, run time: 16min이었다(Lawson et al., 1991).

이때, 메탄올은 99.99%의 HPLC 등급을 사용하였고, 자료는 Millenium 32 software를 사용하여 분석하였다. 또한, 시료는 pore size 0.45 ㎛인 여과막 (membrane filter)을 통과시켜 분석하였다.

(9) UV 흡수스펙트럼

시료 3 ㎖에 메탄올 6 ㎖를 가해 혼합하고 원심분리(6,000 rpm, 25 분)하였다. 상징액을 감압, 농축한 후, 여기에 증류수 10 ㎖를 첨가하여 분광광도계(Spectronic Genesys, Spectronic Inc., USA)로 200 ∼ 400 nm에서 UV 스캐닝하였다.

실시예 1: 노루궁뎅이버섯의 2단계 액체배양 확립

(1) 마늘 첨가 시기 및 농도의 영향

노루궁뎅이버섯의 액체 배양시 마늘의 첨가 시기의 영향을 조사하기 위하여 마늘(20%,v/v)의 첨가시기를 0, 1, 2, 3일로 달리하여 배양하고 균사의 생육 및 형태의 변화를 조사하였다. 그 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이 마늘을 초기 기질로 한 노루궁뎅이버섯의 액체배양은 마늘의 항균작용에 의한 균사생육의 저해로 배양 수행이 불가함을 보여주고 있었다. 하지만, 마늘의 첨가시기를 늦추면 균사생육의 저해 정도도 낮아지는 경향이어서 만약 균사생육이 충분히 이루어진 배양 후기에 첨가한다면 균사생육의 저해를 방지할 수 있음을 보여주는 결과이기도 하다. 즉, 균사생육이 충분히 이루어진 후(3 또는 4일)에 마늘을 첨가하여 2차 배양한다면, 이러한 저해 현상도 일어나지 않을 수 있음을 예측할 수 있다.

따라서, 이 점에 착안하여 노루궁뎅이버섯의 1차 액체배양이 완료되는 3일 후 여기에 5 ∼ 50%(v/v) 농도의 마늘 추출액을 넣어 진탕배양하는 2단계 배양을 시도하였다.

즉, 노루궁뎅이버섯의 1차 배양액에 대해 마늘 즙액을 5, 10, 20, 30 및 50%(v/v) 첨가하고 40 ℃에서 48시간 동안 진탕배양하면서 균사체 및 세포외 다당의 경시변화를 조사한 결과를 도 3에 나타내었다.

마늘 즙액의 첨가로 초기 pH가 상승하였고, 배양시간이 경과하면서 대조구와 마찬가지로 서서히 감소하였으나 그 감소 수준은 낮았다. 대조구의 경우, 균사체는 배양 초기(6 ∼ 12 hr)에 균사생육의 급격한 증가가 있었으나 이후 배양 경과에 따라 배양 48시간까지 이 수준을 유지하였고, 세포외 다당의 생성도 비슷한 경향이었다.

반면, 마늘 시료 첨가구의 균사체 농도는 마늘 즙액의 첨가 농도 10%까지는 대조구의 대응하는 균사체 농도보다 낮은 값 범위이었다. 그러나, 마늘 첨가 농도 20% 이상에서는 배양 6시간 후 급격히 증가하여 배양 6 ∼ 12시간에 대조구보다 더 높은 최대값을 보였으며, 이후 다시 감소하였으나 대조구의 수준을 유지하였다. 세포외 다당의 경우도 12시간에 최대값을 보이며 균사체의 경우와 비슷한경향을 나타내었다. 그러나, 전반적으로 균사생육의 저해 현상은 보이지 않아서 도 4에서 보는 바와 같이, 고농도 마늘 첨가의 경우도 균사형태가 초기의 거친 펠렛(rough pellet) 형태를 48시간 동안 잘 유지하였으며, 용균현상도 관찰되지 않았다. 따라서, 노루궁뎅이버섯의 1단계 배양 완료 후, 마늘을 첨가하여 2단계 배양함으로써 마늘-노루궁뎅이버섯의 액체배양이 가능함을 알 수 있었다.

한편, 마늘의 심한 냄새는 바람직하지 못하므로 마늘 냄새의 강도가 또한 중요한데, 자료로서 나타내지는 않았으나 마늘의 냄새는 균사생육이 최대가 된 이후 감소하기 시작하여 36 ∼ 48시간에 가장 적었다. 또한, 우수한 생육을 보였던 30%와 50% 첨가구는 두 시료간 균사생육의 차이가 미미하였고, 마늘 냄새의 제거효과도 30%가 더 효과적임을 보였다. 그러므로 2단계 배양의 마늘 즙액농도는 30%, 그리고 배양온도 및 시간은 40 ℃에서 48시간이 바람직한 것으로 판단하였다.

(2) 정치배양과 진탕배양의 비교

2차 배양을 진탕배양과 정치배양하여 나타난 효과를 비교하기 위해 30% 마늘 첨가구의 정치 및 진탕배양(100 ∼ 150 rpm)을 48시간 수행하였으며, 그 결과는 도 5와 같다.

무첨가 마늘의 진탕배양(Control)에서는 균사체의 경시변화가 초기 6 ∼ 12시간 급격히 증가한 후 그 수준을 유지하였다. 30% 마늘 첨가구의 진탕배양 경우도 대조구와 마찬가지의 경향으로 균사체 생육을 보였으며, 최대값은 대조구 보다 다소 높았다. 그러나, 마늘 첨가구의 정치배양에서는 배양 초기 수준보다다소 생육이 저해되는 현상을 보였다.

한편, 대조구의 세포외 다당의 농도는 미미한 다당의 생성을 보였으나 마늘 첨가구의 정치 및 진탕배양에서는 모두 배양경과에 따라 큰 증가를 보였다. 진탕배양의 경우는 배양 12시간 후 약 2.5배나 높아졌으며, 이후 서서히 감소하였으나 배양 48시간 후에도 초기값의 약 1.5배량을 함유하였다. 반면, 정치배양의 경우는 배양 48시간까지 계속 증가되어 진탕배양과는 다소 다른 경향을 보였지만 진탕배양의 최대값에는 미치지 못하였다.

따라서, 진탕배양 및 정치배양은 세포외 다당 생성에서는 서로 비슷하나, 균사 생육에 있어서는 진탕배양하는 것이 훨씬 더 유리하였다. 이는 아마도 진탕에 의한 용존산소의 영향으로 생각되며, 진탕배양의 경우 세포외 다당의 감소는 균사 생육의 증가로 영양분이 고갈되어 다당이 기질로서 재사용되기 때문인 것으로 보인다.

실제로 균사형태를 관찰한 결과(도 6)를 보면 정치 배양의 경우는 진탕배양과는 달리, 마늘 첨가구에서 용균현상이 관찰되었다.

이상으로부터 정치 또는 진탕 배양방법에 따라 균사생육의 영향이 다름을 알 수 있는데, 진탕배양과 정치배양을 비교해 보면 30% 마늘 첨가구의 경우 진탕 배양이 정치배양보다 균사체 생육에 유리하며, 또 관능에 의한 냄새의 제거 효과도 더 큰 것으로 나타났다. 따라서, 진탕배양이 정치배양보다 더 유리한 것으로 판단하였으며, 이하에서는 진탕배양에 의해 실험하였다.

(3) 서로 다른 마늘 추출물 시료의 영향

마늘 추출물의 조제방법에 따라서도 서로 다른 배양특성을 나타낼 수 있으므로 이의 영향을 조사하기 위해 압착즙액과 물 추출물을 사용하여 진탕배양하였으며, 그 결과는 도 7과 같다.

물 추출액의 경우는 배양시간 경과에 따라 균사생육의 저해 현상을 보인 반면, 압착즙액은 앞서 살펴본 바와 같이 배양 6 ∼ 12시간에 증가하였고, 이후 초기 수준을 유지하다가 배양 후기 다시 증가하였다. 자료로서 나타내지는 않았으나 두 시료 모두 균사체 형태는 대조구의 경우와 비슷하였고, 마늘 냄새는 압착 즙액에서 더 심하였다. 따라서, 균사체 생육의 증가 효과 측면에서는 압착즙액이, 그리고 냄새 제거 효과면에서는 물 추출물이 더 유리하였으며, 용도에 따라 서로 다른 추출액을 사용하는 것이 바람직하다고 생각되었다.

실시예 2: 2단계 액체배양 생성물의 이화학적 특성

(1) 배양액의 당 분석

마늘-노루궁뎅이 2단계 배양 중 배양여액의 당 및 단백질의 경시변화를 확인하기 위하여 배양액을 원심분리(8000 rpm, 15 분)하여 균사체를 제거한 다음, 얻어진 배양여액의 환원당, 세포외 다당 및 단백질을 측정하는 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

환원당의 마늘의 첨가로 1차 배양액의 15 g/L에서 약 10 g 증가한 25 g/L이었으며 배양이 끝날 때까지 거의 이 수준을 유지하였다. 단백질 함량도 마늘의첨가로 3.5 g/L의 증가가 있었으며, 배양경과에 따라 증가 후 배양말기 감소하여 약 6.7 g/L의 수준을 유지하였다. 특히, 세포외 다당은 배양 6 ∼ 12시간 후 약 6.5 g/L까지 증가하였으며 이후 서서히 감소하여 배양 완료시 4.5 g/L를 함유하였다.

노루궁뎅이의 고분자 당분획은 경구투여에 의한 면역조절 및 항종양 효과를 갖는 것으로 알려졌는데, 노루궁뎅이의 다당이 항노화(antiaging) 효과를 가져 쥐의 뇌 및 간에서 SOD(super oxide dismutase)의 활성을 증가시킴을 보고한 바 있다[Zhou, H., Liou, W., Chen, Q., and Wang S. 1991. Antiaging effect ofH. erinaceuspolysaccharides.Journal of China Pharmaceutical University,22(2), 86-88]. 따라서, 2단계 배양 중 세포외 다당의 증가로 이러한 효과의 향상이 있을 것으로 기대된다.

(2) UV 흡수 스펙트럼

일반적으로 마늘의 많은 건강상의 이점은 주로 적어도 133종에 이르는 그의 유기 황(sulfur) 성분에 기인한다.

마늘 구근 중에 있는 일차적인 황 함유 구성성분은 γ-글루타밀-S-알케닐(또는 알킬)-L-시스테인과 S-알케닐(또는 알킬)-L-시스테인 설폭사이드이며, 마늘 중 S-알케닐(또는 알킬)-L-시스테인 설폭사이드의 함유량은 전형적으로 생물 중량의 0.53 ∼ 1.3%이다. 이중 비단백질 아미노산인 알리인(S-알릴시스테인 설폭사이드, 티오-2-프로펜-1-설폰산, S-알릴 에스테르)이 가장 많은데, 이 알리인은 막의파괴 또는 손상 시 액포 효소인 알리인 리아제(alliin lyase, EC 4.4.1.4)의 유리결과로 유기 황의 분해산물을 생성한다. 즉, 이 효소에 의해 알리인이 알리신을 포함한 냄새가 나는 알킬 알칸 티오설피네이트로 빠르게 전환되는데, 마늘의 많은 유효성질은 바로 이 티오설피네이트(R-S-S(O)-R)에 기인한다.

본 발명에 따른 배양 생성물의 UV 주사결과는 도 9에서 보는 바와 같이, 티오설피네이트의 전형적인 UV 흡수 거동을 보였다. 따라서, 상기 배양 생성물은 마늘의 생리활성성분 지표가 되는 티오설피네이트를 함유하는 것으로 판단하였다.

(3) 마늘 시료의 티오설피네이트 함량

① 추출방법의 비교

마늘 물 추출액은 주로 생 마늘 200 g을 그대로 또는 레토르트파우치(retort pouch)에 넣어 자동멸균기에서 가열하였으며, 이 생 마늘 및 가열 마늘에 마늘 무게의 50배가 되게 물을 가하여(200 g/L) 주로 40 ℃에서 추출하였다. 반면, 압착추출액은 생 또는 가열마늘에 적당량의 물을 넣어 마쇄 후 압착하고 여과한 여액을 사용하였다.

이와 같이 서로 다른 가공법으로 추출한 마늘 추출액 시료의 2단계 배양 전후의 티오설피네이트 함량을 조사한 결과는 도 10과 같다.

물 추출 및 압착 추출한 각 시료의 티오설피네이트 함량은 각각 1.0 및 2.0 mM 수준으로 압착 추출액이 2배나 높았다. 마늘의 티오설피네이트 함량은 종에 따라 큰 차이를 보여서 1.73 ∼ 10.15 mg/g wet weight로, 평균 5.37 ±1.11 mg/g습량이다. 따라서, 티오설피네이트 1 ∼ 2 mM은 162 ∼ 324 mg으로 약 30 ∼ 60 g 습량에 해당한다. 마늘-노루궁뎅이 배양액 1L는 생마늘 60 g 분량의 추출물로 마늘 함량만을 고려하면 약 25 ∼ 50회 분량으로 볼 수 있다.

한편, 물 추출물의 경우는 발효 전후 티오설피네이트 함량의 변화가 없었으나 압착 추출한 경우의 티오설피네이트 함량은 발효 공정을 거치면서 다소 감소하였다. 하지만 압착 추출물의 발효 후 잔존 티오설피네이트 함량은 약 1.5 mM로 물 추출물보다는 약 1.7배 정도 높았으며, 발효에 의해 티오설피네이트 함량의 감소는 비교적 적은 것으로 판단되었다. 따라서, 압착 추출물을 마늘 추출액 시료로 하여 이하의 실험을 수행하였다. 본 발명의 배양 생성물의 티오설피네이트 함량은 무취 표준분말 시료와 비교할 때, 무취 마늘분말(100X)의 약 2 ∼ 3% 수준이었다.

② 배양온도의 비교

2단계 배양 중 배양 온도의 영향을 검토한 결과는 도 11과 같다.

배양온도가 높아질수록 배양여액 중의 티오설피네이트의 잔존 함량도 높아져서 순수한 마늘즙액의 경우 온도가 높을수록 티오설피네이트가 파괴된다는 보고와는 서로 다른 경향을 나타내었다. 이는 고온 발효에 의해 티오설피네이트가 안정화되는 것으로 생각되었는데, 40 ℃와 50 ℃의 차이가 크지 않으므로 40 ℃를 최적 발효온도로 선정하였다.

실제로 40 ℃의 2단계 배양공정 전후 배양액의 티오설피네이트에 대한 HPLC크로마토그램을 표준 마늘시료와 비교하였으며, 그 결과는 도 12와 같다.

배양 전후 시료의 HPLC 크로마토그램 양상은 서로 비슷하였고, 표준시료와도 큰 차이를 보이지 않았다. 따라서, 이러한 티오설피네이트 변화 양상으로부터 본 공정은 안정성이 있는 것으로 판단하였다.

실시예 3: 2단계 액체배양 생성물의 신경성장인자(NGF)의 유도합성 촉진효과

(1) 신경세포 생육 촉진활성 측정

노루궁뎅이버섯의 2단계 액체배양 생성물의 생물학적 활성 측정을 위해 쥐의 PC12(pheochromocytoma) 신경세포주를 이용하였다. 10% FBS를 함유한 RPMI 1640의 기본배지에서 배양한 세포를 0.25% 트립신-EDTA로 배양 플라스크로부터 떼어낸 후 0.5 ×10⁴viable cells/웰의 농도로 세포 배양판(24 well plate)에 접종하였다. 접종 24시간 후에 배지 2 ㎖를 새 배지로 교체한 후 곧바로 노루궁뎅이버섯의 액체배양 생성물을 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 및 1.0 g/L의 농도로 0 또는 100 ㎕ 첨가하여 36.5 ℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다. 전 배양 기간 중 매일 무작위적으로 선택한 필드의 현미경사진(Olympus: IMT2-RFC)을 찍었다. 또한, 이를 토대로 노루궁뎅이버섯의 액체배양 생성물의 첨가에 따른 신경돌기의 연장길이를 측정하였다.

도 13에서와 같이 1단계 및 2단계 액체배양 생성물(HM, HGM)의 1.0 mg/㎖의 첨가로 신경세포 증식 및 신경돌기 신장은 배양경과에 따라 증가하고 배양 4일 후최대값을 나타낸 후 비교적 빠르게 감소하였다. 전반적으로 시료 처리구는 모두 대조구보다 현저하게 신경세포의 증식을 촉진하였다. 즉, 시료 처리구의 최대 신경세포 증식은 배양 4일 후 17 ∼ 18.75 ×10⁴/㎖로 대조구의 최대값 11 ×10⁴/㎖보다 현저하게 촉진하였다. 최대 신경돌기 신장도 시료 처리구(226.2 ∼ 232.2 ㎛)는 대조구(171.3 ㎛)보다 현저히 높았다.

또한, 신경돌기세포의 활성에 미치는 영향을 비교, 조사한 결과인 도 14에서도 시료 처리구의 신경돌기세포 함유수(%)는 대조구 보다 현저히 높았다. 배양 3일 후의 최대값을 비교하면 시료처리구는 78.3 ∼ 83.8%인 반면, 대조구는 61.5%로 시료 처리구가 대조구의 약 1.26배 높았다.

아울러 2단계 액체배양 생성물(HGM)은 1단계 배양 생성물(HM)보다 신경세포증식, 신경돌기세포 함유수 등에서 5 ∼ 10%의 증가현상을 보여 2단계 배양의 쪽이 신경세포 증식 및 분화 활성에의 향상을 가져오는 것으로 판단하였다.

(2) 세포 생육활성 측정

T-플라스크 상에서 10%의 혈청배지로 생육시킨 PC12 신경세포주를 0.25% 트립신-EDTA로 처리하여 세포를 플라스크 바닥에서 떨어뜨린 후 PBS(Ca²⁺, Mg²⁺- free)로 2회 세척하였다. 이어서 세포배양판(24 well plate)에 4 ×10⁴viable cells/well의 농도로 접종하고 10% 혈청배지를 이용하여 최종 부피를 2 ㎖로 하였다. 그 후 액체배양 생성물을 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 및 1.0 g/L의 농도로 100 ㎕ 첨가하였으며, 대조군은 PBS 100 ㎕를 첨가하였다. 그 후 매일 총 세포수를 측정하였으며, 트리판 블루염색 배제(trypan blue dye exclusion) 방법으로 생 세포수를 측정하였다. 각각은 3개 웰에서 반복 실험하였으며, 세포의 생존활성은 세포들이 사멸기에 접어든 시료투여 8일 후 측정한 세포 생존율을 기초로 하였다.

따라서, 2단계 배양 생성물(HGM)에 대하여 신경세포인 PC-12의 세포 증식 및 신경돌기의 신장에 미치는 HGM의 영향을 조사한 결과는 도 15와 같다.

세포 증식 및 신경돌기 연장은 배양 4일째 가장 높은 활성을 나타내었다가 5일째부터 점차로 감소하였다. 또한, HGM의 각 농도에서의 세포 증식은 농도 의존성을 보이면서 배양 1일째 5 ∼ 8 ×10⁴cells/㎖이었으며, 이는 대조구의 약 2.5 ∼ 4배에 달하였다. 가장 높은 세포증식을 나타낸 배양 4일째에는 16 ∼ 18 ×10⁴cells/㎖로, 대조구에 비해 1.45 ∼ 1.63배의 viable cell/㎖를 나타내었다.

(3) 신경돌기의 신장길이 및 신경돌기를 지니는 세포수의 측정

T-플라스크 상에서 10%의 혈청배지로 생육시킨 PC12 신경세포주를 0.25% 트립신-EDTA로 처리하여 세포를 플라스크 바닥으로부터 떨어뜨린 후 PBS(Ca²⁺, Mg²⁺- free)로 2회 세척하였다. 그리고 세포 배양판(24 well plate)에 0.5 ×10⁴viable cells/well의 농도로 접종한 후 액체배양 생성물을 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 및1.0 g/L의 농도로 0, 100 ㎕ 첨가하여 매일 ×100의 배율로 사진 촬영하였다. 이 현미경 사진을 이용하여 신경돌기의 길이를 측정한 다음, 본래의 길이로 환산하여 신경돌기의 길이로 하였으며, 각각의 사진에서 신경돌기의 길이가 가장 길게 연장된 세포를 기초로 하여 본 실험에 이용하였다.

아울러 신경돌기를 지니는 세포를 현미경상에서 측정하였으며, 신경돌기가 세포동체와 같거나 보다 큰 세포를 신경돌기를 지니는 세포로 측정하였다. 모든 실험은 100개 이상의 세포를 측정하여 실시하였다.

한편, 도 16은 대표적으로 0.4 g/L의 HGM 농도에서 배양 1일부터 8일까지의 신경세포 생육형태를 사진 촬영하여 조사한 결과이다.

모든 실험에서 배양 4일째(D) 최고의 활성을 나타내었고, 배양 5일째부터 점차로 감소하였다. 신경돌기 신장의 경우는 신경돌기의 길이가 243.5 ㎛로, 대조구에 비하여 1.42배 더 연장되었으며, 세포 증식의 경우는 17 ×10⁴cells/㎖로 대조구에 비하여 1.55배의 증식을 나타내었다. 또한, 신경돌기 형성의 경우는 신경돌기 함유 세포의 비율이 80.4%로 대조구에 비하여 1.40배의 세포에서 신경돌기가 형성되었다.

실시예 4: 2단계 액체배양 생성물의 일과성 뇌 허혈에 의한 뇌 신경 세포사의 보호효과

본 실험의 재료는 노루궁뎅이버섯 자실체의 열수 추출물(HFE)과 액체배양 균사체 물 추출물(HM, HGM) 및 배양여액(HBr, HGBr)이었다.

뇌 허혈(ischemia)은 마취 하에서 실험동물(Mongolian gerbils)의 뇌 및 직장온도를 37 ±0.2 ℃로 유지하고 3분간의 양쪽 온목동맥(common carotid arteries) 결찰에 의해 일과성의 전뇌 허혈을 부하하여 실시하였다. 이때, 실험동물은 대조군과 실험군으로 나누어 실시하였으며, 성별(gender)에 의한 차이가 나타날 것을 대비해 암컷과 수컷도 각각 나누어 실험하였다. 대조군은 위수술군(negative control) 및 시료 투여없는 3분간의 허혈군(positive control)으로 하였고, 실험군은 시료 투여 30분 후의 3분간 허혈군 및 허혈 유발 30분 후의 시료 투여군으로 하였다. 시료 투여는 뇌허혈 유발 30분 전 또는 30분 후에 버섯추출물(1.5 g/kg in 1 ㎖ DMSO, 9 ㎖ saline)을 경구로 투여하였으며 대조군은 용매인 10% DMSO/saline를 1.5 g/kg 투여하였다.

실험 동물은 허혈 재관류(reperfusion) 4일 후에 동물을 희생하여 뇌를 적출하고 해마 슬라이스 표본체를 만든 다음 크레실 바이올렛 염색(cresyl violet staining)하여 신경세포 손상 정도를 관찰하였다. 아울러 이미지 분석기를 이용하여 해마 CA1 영역 중앙부의 100 ×500 ㎛의 그리드(grid) 내에 잔존하는 정상 신경세포의 수를 계수하였으며, one-way ANOVA 시험으로 약제의 효용성을 검증하였다.

게르빌루스 쥐(Mongolian gerbils)에 의한 일과성 뇌 허혈 모델을 사용하여 허혈 부하전에 1종의 노루궁뎅이 자실체 추출물(HFE) 및 4종의 노루궁뎅이버섯 액체배양 생성물(HM, HBr, HGM, HGBr) 등, 총 5종 시료를 경구투여하고 해마 CA1 영역의 지연성 신경세포사를 조사하였고, 그 결과를 도 17에 나타내었다.

수술하지 않은 정상조직에 대한 염색을 수행한 음성 대조군의 경우는 도 17의 A에서와 같이 CA1 영역의 밴드를 보이고 이상이 인정되지 않았다. 반면, 시료 첨가가 없었던 3분간의 일과성 전뇌 허혈군인 양성 대조군의 경우는 CA1 영역의 염색이 되지 않아 밴드를 보이지 않았고, 따라서 해마 CA1 영역의 신경세포가 광범위하게 사멸되었음을 보였다[도 17의 B].

한편, 허혈부하 30분전 및 후에 각종 시료를 투여한 전투여군은 HM 및 HBr 시료를 제외한 나머지 시료에서 해마 CA1 영역의 신경세포가 보호됨을 보였다[EH 17의 C-J]. 결국, 3분간 허혈부하에 대해서 시료의 전후투여에 의해 신경세포사가 억제되었으며, 이들 결과로부터 일과성 전뇌 허혈에 의한 해마 CA1영역의 지연성 신경세포사는 HFE, HGBr 및 HGM 시료의 전후 투여로 보호됨을 보였다.

이들의 효과를 음성 대조군에 대한 상대적인 신경세포 생존 비율로 나타내었으며, 그 결과는 도 18과 같다.

시료 중 HFE의 경우는 수술 30분 후의 경구투여 효과는 없었으나 수술 30분전 경구투여에 의해서는 29.5%의 세포 생존율을 보였고, 대조군에 비해 유의성이 있었다. 하지만 대조약물로서의 엡셀렌(Ebselen, 2-phenyl-1,2-benzi -soselenazol- 3(2H)-one) 효과(40 ∼ 50%) 보다는 미약하였다. 반면, HGBr의 경우는 수술 전 투여의 경우 42.6%의 신경세포가 살았으며, 수술 후 투여한 경우에는 58.3%가 살아 엡셀렌 보다도 더 양호한 효과를 보였다.

엡셀렌은 유기 셀렌 화합물(분자량: 274.2)로 강력한 항산화력과 항염증 작용을 가지며 신경보호 작용을 갖는 약제이다.

특히, HGM의 경우는 수술 전 투여의 경우 84%, 수술 후 투여의 경우 75.4%의 신경세포가 살아 매우 효과가 높은 것으로 나타났으며, 이는 HGM이 앞으로 임상적으로 허혈성 신경손상 방지 등 치매예방에의 이용 가능성을 지적한다.

실시예 5: 2단계 액체배양 생성물의 AChE 저해 효과

AChE(acetylcholinesterase) 활성은 Ellman 등(1961)의 방법에 따라 정제 효소(Electrophorous electriccus, Sigma)를 사용하여 다음과 같이 측정하였다. 반응혼합물(1 ㎖)은 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0) 및 120 mM NaCl 존재하의 240 mM 수크로오스를 함유하였다. 배양 혼합물의 단백질 농도는 정제효소에 대해서 0.13 ㎍/㎖이었다. 반응혼합물에 0.030 ㎖의 DTNB(5,5'-dithionitrobenzoic acid)와 기질로서 0.050 ㎖의 아세틸콜린 요오다이드(acetylcholine iodide)를 가하고 반응을 시작하였다. DTNB와 기질의 최종 농도는 각각 0.125 및 0.5 mM이었다.

정제 효소에서의 AChE 활성은 서로 다른 기질 농도를 사용하여 측정되었고, KM 및 Vm는 Lineweaver-Burk 플롯에 의해 결정하였다. 이때, 효소반응은 분광광도계에 의해 412 nm에서 흡광도의 증가(△OD)로 측정하였다.

한편, 50% 효소저해에 요구되는 화합물의 농도(IC₅₀)는 효소저해의 용량-반응곡선(dose-response curve)의 선형 평가에 의해 계산하였다.

모든 자료는 평균 ±SD로 나타내었으며, 통계분석은 SAS(StatisticalAnalysis System)를 사용하여 Student's t test로 수행하였다.

본 실험에서는 노루궁뎅이버섯의 배양생성물 및 그 분획들이 일렉트로포러스 일렉트리커스(Electrophorous electriccus) 유래 AChE의 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 1단계 및 2단계 배양 균사체의 열수 추출 시료들(3 mg/㎖)의 AChE에 대한 저해 활성을 조사한 결과는 도 19와 같다. 마늘의 AChE 저해활성은 매우 낮았으나(8.7%) 마늘을 기질로 2단계 배양한 노루궁뎅이 버섯 배양 생성물(HGM, HGBr)은 현저하게 높은 활성을 보였다(54.7 및 23.4%). 또한, 이들의 저해활성은 대응하는 1단계 배양 생성물(HM, HBr)의 저해율(17.4 ∼ 19.6%)보다도 현저하게 높았다. 그러나, HBr의 에탄올 침전 상등액인 HBr/EtOH는 HBr의 약 3배인 52%의 저해율을 보여 1단계 배양여액의 EtOH에 가용성인 물질이 AChE 저해활성의 주성분으로 작용하는 것을 추론할 수 있었다.

한편, 비교적 높은 저해 활성을 보인 각 시료들은 도 20에서와 같이, 농도 의존적으로 AChE 활성을 저해하였다. 효소활성을 50% 저해하는데 요하는 농도(IC₅₀)는 1단계 및 2단계 배양 생성물 시료 HGM, HGBr, HM 및 HBr에서 각각 2.67, 3.02, 3.23 및 4.79 mg/㎖이었다.

실시예 6: 2단계 액체배양 생성물의 항산화 활성

항산화 활성은 지질의 과산화로 생성되는 하이드로퍼옥사이드에 의해 2가 철이 3가 철로 산화되고, 이 3가 철이 티오시안산 암모늄(thiocyanic acid ammonium)과 반응하여 적색의 Rhodan-철[Fe(SCN)₃]이 생성되므로 이를 비색정량하여 지질의 과산화도를 측정하는 방법인 Rhodan-Fe법[Osawa, T., and Namiki, M. 1981. A novel type of antioxidant isolated from leaf wax of Eucalypstus leaves. Agric Biol. Biohem., 45(3), 735-739]과, 과산화 지질의 분해에 의해 생성되는 MDA(malondialdehyde)와 MDA 유사물질이 산성 조건하에서 2분자의 TBA (2-thiobarbituric acid)와 결합하여 생성되는 적색물질을 비색정량하여 지질 과산화도를 측정하는 방법인 TBA 방법[Du, Z., and Bramlage, W.J. 1992. Modified thiobarbituric acid assay for measuring lipid oxidation in sugar-rich plant tissue extracts. J. Agric. Food Chem., 40: 1566-1570]을 사용하여 측정하였다.

1) Rhodan-Fe법(Ferrous thiocyanate: FTC)

지질의 과산화 초기에 생성되는 지질 하이드퍼옥사이드의 정량을 위해 사용하였으며, 다음과 같이 측정하였다. 0.11M 리놀렌산(linoleic acid) 20 ㎖와 0.1M 포스페이트 완충액(pH 7.0) 20 ㎖의 혼합액에 적정 시료액(질소 함유량이 1 mg이 되는 양)을 50 ㎖로 하였다. 이 시험액을 45 ℃의 항온조에서 차광 보존하면서 경시적으로 시험액 0.1 ㎖를 취하여 75% 에탄올 4.7 ㎖에 가하였으며, 여기에 30% NH₄SCN 0.1 ㎖와 20 mM FeCl₂-3.5% HCl 0.1 ㎖를 가하여 3분간 방치한 후, 500 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

도 21은 FTC법으로 측정한 각종 시료(1단계 및 2단계 배양 균사체의 열수 추출 시료)의 항산화 활성을 항산화제 표준품과 비교하여 조사한 결과이다.

FTC 법은 지질 과산화 초기의 변화를 보는데 적합한 방법으로 4일째까지 조사하였다. 낮은 흡광도는 항산화 활성의 높은 수준을 지적하는 것으로 4일째를 기준으로 볼 때 마늘의 항산화 활성은 별로 나타나지 않았으나 0.1 mg/㎖의 농도에서 마늘 첨가구인 HGM 시료의 흡광도 값은 HM보다 낮았다. 이는 표준품으로 사용한 비타민 C보다 낮고 토코페롤과 비슷한 값으로 비교적 강한 항산화 활성으로 볼 수 있다. 그러나, 1단계 및 2단계 배양여액은 균사체 추출물보다 더 강한 항산화 활성을 보였고 이들의 항산화 활성은 표준품인 루틴(rutin)과 비슷하였다.

2) TBA 법

지질의 과산화 후기에 생성되는 MDA 및 카보닐 화합물을 정량하기 위해 사용하였으며, 항산화능은 지방의 과산화를 TBA-RS(2-thibarbituric acid-reactive substances) 형성에 의해 측정하는 변형된 티오바르비툴산(modified thiobarbituric acid)법으로 구하였다. 즉, 시료를 20% TCA(pH 3.5) 0.5 ㎖와 0.78% TBA 수용액 0.5 ㎖로 배양하고 95 ℃에서 45분간 가열한 후 4000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상징액 중의 적색소 분획을 분광광도계로 532 nm에서 측정하였으며, 이때 표준곡선은 MDA(malonaldehyde bis(dimethyl acetal)) 기준에 의해 작성하였다.

한편, 도 22는 TBA-RS법으로 조사한 결과로, 반응 5일 후 각 시료의 지방과산화 저해경향은 FTC법으로 조사한 결과와 비교적 비슷하였다.

2차 배양 배양생물(HGM, HGBR, HGP)은 1차 배양 생성물(HM, HBr, HP) 및 마늘(CS, CSP) 단독보다 높았다. 지질과산화 억제율은 HGM > HGP > HP > HGBr > CSP > CS > HBr > HM의 순이었다. 1차 배양 생성물의 경우는 HBr의 에탄올 침전물인 HP가 가장 높았고, 이어서 HM으로 HBr보다 더 높았으나 2차 배양생성물에서는 HGM이 가장 높았다. HGM은 농도 의존적으로 리놀렌산에 의한 과산화를 억제하였으며, 250 ㎍/㎖ 농도에서 약 85%의 저해효과를 나타내었다.

실시예 7: 독성시험

본 발명에 따른 배양 생성물의 생체내 치사성 확인 및 급성독성에 대한 정보를 획득하기 위해 실험동물(Sprague-Dawley rat; 6주령, 암컷)을 사용하여 급성독성시험을 실시한 결과(경구로 300 mg/kg을 7일간 연속 반복투여), 투여기간 중 임상적으로나 병리조직학적으로 독성변화를 시사하는 어떤 변화도 관찰되지 않았고, 치사 및 행동에도 영향을 주지 않았으며, 해부하여 내부 장기를 살펴본 결과도 변화가 없었다.

제조예 1: 분말 및 캅셀제의 제조

유효성분 10 ㎎을 락토오스 14.8 ㎎, 결정성 셀룰로오스 3 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎과 함께 섞었다. 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 No.5 젤라틴 캅셀에 채웠다.

상기 분말 및 캅셀제의 구성성분은 다음과 같다.

유효성분 · ············ · 10 ㎎

락토오스 ··················14.8 ㎎

결정성 셀룰로오스··············· 3 ㎎

마그네슘 스테아레이트 ·········· 0.2 ㎎

제조예 2 : 주사액제의 제조

유효성분 10 ㎎, 만니톨 180 ㎎, Na₂HPO₄ㆍ12H₂O 26 ㎎ 및 증류수 2974 ㎎을 혼합하여 주사제를 제조하였다. 상기 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30분간 가열하여 멸균 처리하였다.

유효성분 ················ 10 ㎎

만니톨 ··················· 180 ㎎

Na₂HPO₄ㆍ12H₂O ·· ············· 26 ㎎

증류수 ·················· 2974 ㎎

제조예 3: 건강식품(정제, 캅셀 또는 음료)의 제조

1일 복용 기준으로 유효성분 0.2 g, 분말비타민 E, 젖산철, 산화아연, 니코틴산 아미드, 비타민 A, 비타민 B1 및 비타민 B2를 혼합하여 제조하였다.

상기 건강식품의 구성성분은 다음과 같다(사람 1일복용량 기준).

유효성분 ················· 300 mg

인삼 추출물 ················· 100 mg

녹차 추출물 ················· 100 mg

비타민 C ·················· 100 mg

분말비타민 E ·············· 120 mg

젖산철 ···················· 2 mg

산화아연 ··················· 2 mg

니코틴산아미드 ·················20 mg

비타민 A ·········· ········ 5 mg

비타민 B1 ··················· 2 mg

비타민 B2 ··················· 2 mg

옥수수전분···················200 mg

스테아린산 마그네슘 ·············· 20 mg

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 마늘을 기질로 사용하는 노루궁뎅이버섯의 2단계 액체배양방법은 뇌기능 개선에 매우 우수한 배양 생성물을 얻을 수 있으며, 이로 인한 고령화 사회를 대비한 치매예방 등의 각종 생리 기능성 소재화로 사용 가능하리라 기대된다.

Claims (5)

1) 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceum)을 20 ∼ 30 ℃, 통기속도 1 ∼ 2.5 vvm , 교반속도 100 ∼ 400 rpm으로 6 ∼ 8 일간 액체배양하는 단계 및

2) 상기 배양액에 마늘 추출물을 첨가한 후, 25 ∼ 50 ℃에서 정치배양 또는 진탕배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 노루궁뎅이버섯의 2단계 액체배양 방법.

제 1 항에 있어서, 상기 마늘 추출물은 5 ∼ 70%(v/v)을 첨가하는 것을 특징으로 하는 노루궁뎅이버섯의 2단계 액체배양 방법.

청구항 1의 노루궁뎅이버섯의 2단계 액체배양 방법으로 얻어진 것을 특징으로 하는 배양 생성물.

청구항 3의 배양생성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 뇌기능 개선제.

청구항 3의 배양생성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 뇌기능 개선용 건강식품.