KR102620997B1 - 노각나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 시력 보호용 또는 망막 질환의 개선 및 예방용 조성물 - Google Patents
노각나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 시력 보호용 또는 망막 질환의 개선 및 예방용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 출원은 노각나무 추출물을 포함하는 시력 보호, 망막 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 출원의 노각나무 추출물은 망막상피세포를 증식시키는 활성을 가지므로, 시력 보호 효과, 망막 질환의 개선 및 예방 효과, 또는 치료 효과가 우수하다는 장점이 있다.
Description
본 출원은 노각나무 추출물을 포함하는 시력 보호용 또는 망막 질환의 개선 및 예방용 조성물에 관한 것이다.
생활을 통해 얻을 수 있는 정보의 약 80%는 눈으로부터 얻을 수 있을 정도로 눈은 가장 중요한 감각기관이다. 따라서 눈의 기능적 장애 또는 상실은 생활의 질을 떨어뜨리는 가장 큰 요인의 하나가 된다.
망막색소상피세포(Retinal Pigment Epithelial Cells, RPE)는 광 수용체와 맥락막 모세혈관층 사이의 계면에 위치한 단층 세포로, 빛 수용, 물질 수송, 시각회로 조절, 식세포작용, 면역 조절 등의 생화학적 기능을 수행하며, 정상 시력을 유지하는데 핵심적인 역할을 한다.
망막질환은 사망에 이르는 치명적인 질환은 아니지만 노인 인구의 증가와 함께 산업화 및 식생활의 변화에 따라 최근 급격하게 증가하고 있다. 따라서, 수술적인 방법 이외에도, 인위적인 방법으로 합성된 치료제가 아니라 종래에 우리가 섭취하고 있는 생약재 등의 형태로 공급할 수 있는 조성물의 개발이 시급한 상황이다.
한편, 노각나무(Stewartia pseudocamellia Maxim)는 한국의 고유식물로 주로 남부지방에서 자라는 낙엽교목이다. 높이는 7~15 m 정도이고, 나무껍질은 검은빛이 도는 적갈색이지만 나무껍질 곳곳이 동그랗게 또는 길게 떨어져나가 붉은빛이 도는 노란색 무늬가 나타난다. 잎은 타원형이며, 어긋나기로 달리고, 잎 가장자리에는 작은 톱니가 있다. 꽃은 흰색이며 6-7월 무렵 잎이 달리는 자리에 핀다. 꽃은 갈래꽃으로 꽃잎이 다섯 장이며, 수술이 많다. 10월에 익는 단단한 열매는 부드러운 털로 겉이 덮여 있다. 잎이 가을에 노랗게 물들고, 꽃이 마치 동백꽃처럼 생겨 흔히 정원이나 공원 등에 관상수로 심는다. 목재는 단단해서 가구용으로 많이 쓰이며, 현재는 귀한 약재 및 마시는 차로 많은 사람들이 찾는다. 노각나무의 알려진 효능으로는 항암, 간보호 효능 등이 있다.
최근 눈의 산화적 손상 예방 등의 눈 건강 유지 의약품 및 건강기능식품의 개발이 활발하며, 특히 마리골드 추출물 유래의 루테인을 주성분으로 사용하는 시력개선제가 개발되어 있다. 그러나, 노각나무를 이용한 눈 건강과 관련된 연구는 보고된 바가 없으므로, 눈 건강 관련 식품이나 의약품을 개발할 필요가 있다
본 출원이 해결하고자 하는 과제는 노각나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 시력 보호용 또는 망막 질환의 개선 및 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원이 해결하고자 하는 다른 과제는 노각나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 망막 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원이 해결하고자 하는 다른 과제는 노각나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 시력 보호용 또는 망막 질환의 개선 및 예방용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원이 해결하고자 하는 다른 과제는 노각나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 눈 세척용, 시력 보호용, 또는 망막 질환의 개선 및 예방용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원이 해결하고자 하는 다른 과제는 노각나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 망막 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 일 실시예는 노각나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 시력 보호용 또는 망막 질환의 개선 및 예방용 식품 조성물을 제공한다.
본 출원의 일 실시예에서 상기 망막 질환은 망막변성(retinal degeneration), 황반변성(macular degeneration), 당뇨병성 망막질환 (diabetic retinopathy), 고혈압성 망막질환(hypertensive retinopathy) 망막색소변성(retinitis pigmentosa), 레베르선천성흑암시(Leber congenital amaurosis), 망막박리(retinal detachment), 안구건조증(dry eye syndrome), 녹내장(glaucoma), 스타가트병(Stargardt disease), 맥락막 결손(choroideremia), 맥락망막 위축(gyrate-atrophy), 안구 건조증(dry eye syndrome), 눈 피로(eye strain), 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity), 황반 원공(Macular hole), 황반 모세혈관확장증(Macular Telangiectasia, MacTel) 및 시신경병증(optic neuropathy)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 출원의 일 실시예에서 상기 노각나무 추출물은 망막색소상피세포를 증식시키는 활성을 가질 수 있다.
본 출원의 일 실시예에서 상기 노각나무 추출물은 망막색소상피세포에서 산화적 스트레스에 의해 유도된 활성 산소종의 생성을 저해할 수 있다.
본 출원의 일 실시예에서 상기 노각나무 추출물은 망막색소상피세포의 사멸을 방지할 수 있다.
본 출원의 일 실시예에서 상기 조성물은 정제, 캡슐제, 액제 중에서 선택되는 제형으로 이루어질 수 있다.
본 출원의 일 실시예는 노각나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 망막 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
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본 출원의 일 실시예는 노각나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 망막 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 망막 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 출원의 노각나무 추출물은 망막상피세포를 증식시키는 활성을 가지므로, 눈 보호, 시력보호, 망막 질환을 개선, 예방 또는 치료 효과가 있다.
또한, 본 출원의 노각나무 추출물은 망막상피세포에서 산화적 스트레스에 의해 유도된 활성 산소종 생성을 저해하여 망막상피세포의 사멸을 방지하므로, 눈 보호, 시력보호, 망막 질환을 개선, 예방 또는 치료 효과가 있다.
도 1은 노각나무 추출물의 ARPE-19 세포에 대한 독성을 나타낸 것이다.
도 2는 노각나무 추출물 및 마리골드 추출물의 ARPE-19 세포에 대한 증식 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 H2O2 세포독성에 대한 ARPE-19 세포 사멸 농도를 나타낸 것이다.
도 4는 노각나무 추출물 및 마리골드 추출물의 H2O2 세포독성에 대한 ARPE-19 세포 보호효과를 나타낸 것이다.
도 5는 노각나무 추출물 및 마리골드 추출물의 ROS 생성 저해 활성을 나타낸 것이다.
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도 3은 H2O2 세포독성에 대한 ARPE-19 세포 사멸 농도를 나타낸 것이다.
도 4는 노각나무 추출물 및 마리골드 추출물의 H2O2 세포독성에 대한 ARPE-19 세포 보호효과를 나타낸 것이다.
도 5는 노각나무 추출물 및 마리골드 추출물의 ROS 생성 저해 활성을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
이하의 특정한 기능적 설명들은 단지 본 발명의 개념에 따른 실시예를 설명하기 위하여 예시된 것으로, 본 발명의 개념에 따른 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본 명세서에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명의 개념에 따른 실시예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시예들은 본 명세서에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명의 개념에 따른 실시예들을 특정한 개시 형태에 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 출원의 일 실시예는 노각나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 눈 보호용, 시력 보호용 또는 망막 질환의 개선 및/또는 예방용 식품 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 다양하게 제품화될 수 있으며, 예를 들어, 약학 조성물, 건강기능식품을 포함하는 식품 조성물, 사료 첨가제, 의약외품 조성물 등으로 제형화될 수 있다.
본 출원에서 용어 "유효성분으로 포함"은 질병, 장애의 징후 또는 증상의 예방, 감소, 경감 또는 제거를 포함하나, 이에 제한되지 않는 유익한 결과와 같은 바람직한 생물학적 효과에 영향을 미치기에 충분한 양을 포함하는 것을 의미하며, 이 양을 "유효량"이라 한다. 따라서, 조성물 또는 첨가물의 각 활성 성분의 총량은 유의미한 개체의 이익을 나타내기에 충분하다. 따라서, 유효량은 투여되는 상황에 따라 달라질 것이다.
본 출원에서 용어 "개선"은 상기 조성물의 섭취로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 출원에서 용어 "예방"은 질환 원인에의 노출에 의해 질병이 생길 위험이 있는 무증상 대상체에서, 질병 또는 질병과 관련된 증상의 출현을 차단함을 지칭한다. 또한, 본 출원의 조성물의 투여에 의해 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 출원에서 용어 "치료"는 발병된 후에 질병 또는 병리학적 상태의 징후 또는 증상을 개선하는 치료적 개재를 지칭한다. 상기 질병 또는 병리학적 상태의 징후 또는 증상과 관련한 "개선" 및 "완화"는 치료의 관찰 가능한 이로운 모든 효과를 지칭한다. 상기 이로운 효과는 걸리기 쉬운 대상에서 질병의 임상적인 증상의 지연된 발병, 질병의 일부 또는 모든 임상 증상의 중증도의 감소, 질병의 보다 느린 진행, 대상의 전반적인 건강 또는 복지의 개선, 또는 특정 질병에 특이적인 것으로 당업계에 널리 공지된 다른 변수에 의해 증명될 수 있다. 예를 들어, 망막 질환의 치료는 시력의 개선, 망막 질환으로 인한 임상 증상의 감소, 또는 안구의 건조 정도 등 망막 질환에 특이적인 것으로 당업계에 널리 공지된 다른 변수에 의해 증명될 수 있다.
노각나무(Stewartia pseudocamellia Maxim.)는 차나무과 (Theaceae)의 낙엽교목으로 나무껍질에 얼룩무늬가 있어 비단나무 또는 금수목(錦繡木)이라고도 한다. 잎이 가을에 노랗게 물들고, 꽃이 마치 동백꽃처럼 생겨 흔히 정원이나 공원 등에 관상수로 심는다. 목재는 단단해서 가구용으로 많이 쓰이며 현재는 귀한 약재 및 마시는 차로 많은 사람들이 찾는다. 수피는 얇은 조각으로 떨어져 적갈, 회백, 회갈색의 무늬가 생겨 얼룩얼룩하고, 새 가지의 기부에서 액생하고 과실은 삭과로 5각난형이다. 본 식물은 이명인 Stewartia koreana Nakai 또는 Stewartia pseudocamellia Maxim. var. koreana (Nakai) Kim 이라 하여 꽃이 컵 모양이고 가지가 곧고 둥글다고 특산종으로 보는 견해도 있으나 현재 일본 등에도 분포하는 Stewartia pseudocamellia Maxim.로 주로 기록하고 있고, 또 다른 이명으로는 Stewartia ptero-petiolata Cheng var. koreana (Rehd.) Sealy가 기록되어 있다. 노각나무는 꽃이 크고 화려하여 관상용으로, 목재는 단단하고 무늬가 아름다워 가구재, 장식재 등으로 사용했으며, 나무껍질과 뿌리껍질은 모란(帽蘭)이라 하여 서근활혈(舒筋活血)의 효능이 있어 타박상으로 어혈이 진 것을 풀어주고 풍습성으로 인한 관련 활성 또한 연구되었다.
상기 노각나무 추출물은 상기 노각나무의 천연, 잡종 또는 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고, 예를 들어 노각나무의 종자(씨앗), 뿌리, 지상부, 줄기, 잎, 꽃, 열매의 몸통, 열매의 껍질뿐만 아니라 식물 조직 배양물로부터도 추출이 가능하다. 이에 한정되는 것은 아니나, 노각나무 추출물은 노각나무의 줄기 추출물 및 노각나무 잎 추출물 중 1종 이상일 수 있다.
본 출원에서의 용어, "추출물(extract)"이란, 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 추출물은 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온, 저온 또는 가온 상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다. 상기 노각나무 추출물은 조성물 내에 0.1 ㎍/ml 내지 5 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이 바람직하다. 0.1㎍/ml의 농도 미만이면 효과가 미미하고, 5 ㎍/ml의 농도를 초과하여 포함되면 망막색소상피세포에 대한 독성을 나타낼 수 있다.
예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획물, 크로마토그래피에 의한 분리 등 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획물도 본 출원의 추출물에 포함된다.
본 출원에서 노각나무 추출물을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 포함하며, 이들을 단독으로 수행하거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 추출에 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 추출 용매로는 물(또는 증류수); 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 탄소수 1 내지 4의 알코올; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 용매를 사용하여 가지를 1 회 이상 추출하여 용매 추출물을 제조할 수 있고, 상기 용매 추출물을 감압 증류한 후 동결건조 또는 분무 건조하여 얻은 건조 추출물을 제조할 수 있다.
본 출원에서 상기 추출물의 제조를 위해 10 내지 95 %(v/v)의 에탄올을 용매로 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 50 내지 95 %(v/v)의 에탄올, 더욱 바람직하게는 70 내지 95 %(v/v)의 에탄올을 사용하는 것이 좋다. 또한 상기와 같은 용매의 양은 추출원료의 중량 기준 1 내지 25 배로 하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 5 내지 20 배로 하는 것이 좋다. 추출온도는 50 내지 90 ℃가 바람직하며, 보다 바람직하게는 60 내지 80 ℃가 좋다. 추출시간은 1 내지 12 시간이 바람직하며, 보다 바람직하게는 5 내지 7 시간이 좋다. 이러한 추출조건에 따르면 상기 원재료로부터 본 발명에서 목적으로 하는 효과를 나타내는 성분을 효율적으로 추출할 수 있다.
상기 제조된 추출물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 예컨대, 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 농축은 감압 농축기, 건조는 동결건조법 등을 수행할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서의 용어, "분획물"이란, 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 출원에 있어서, 상기 분획물은 상기 노각나무 추출물을 다양한 분획방법에 적용하여 수득한 분획물로 해석될 수 있다. 상기 추출물의 분획물은 상기 추출물을 다양한 분획방법에 적용하여 수득할 수 있는데, 상기 분획방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법 등이 될 수 있다.
특히, 상기 용매 분획법에 사용되는 용매는 특별히 이에 제한되지 않으나, 극성 용매 또는 비극성 용매를 사용할 수 있고, 구체적으로는 비극성 용매를 사용할 수 있다. 상기 용매 분획법은 비극성 수준이 높은 용매로부터 낮은 용매를 사용하여 상기 추출물을 순차적으로 분획하는 방식으로 수행될 수 있는데, 예를 들어 핵산 또는 에틸아세테이트를 이용하여 상기 추출물을 순차적으로 분획하는 방법을 사용할 수 있다. 상기 분획 용매로는 물, 알코올 등의 극성 용매; 헥산(hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane) 등의 비극성 용매를 사용할 수 있고, 이들을 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "망막 질환"은 외래적인, 내재적인 또는 유전적인 원인으로 인하여 망막의 이상 또는 손상이 발생하여 발병되는 질환을 의미한다. 상기 망막 질환은 산화적 스트레스에 의해 유발된 것일 수 있다.
본 출원의 일 실시예에서 상기 망막 질환은 망막변성(retinal degeneration), 황반변성(macular degeneration), 당뇨병성 망막질환 (diabetic retinopathy), 고혈압성 망막질환(hypertensive retinopathy) 망막색소변성(retinitis pigmentosa), 레베르선천성흑암시(Leber congenital amaurosis), 망막박리(retinal detachment), 안구건조증(dry eye syndrome), 녹내장(glaucoma), 스타가트병(Stargardt disease), 맥락막 결손(choroideremia), 맥락망막 위축(gyrate-atrophy), 안구 건조증(dry eye syndrome), 눈 피로(eye strain), 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity), 황반 원공(Macular hole), 황반 모세혈관확장증(Macular Telangiectasia, MacTel) 및 시신경병증(optic neuropathy)으로 이루어진 군에서 선택되는 질환일 수 있다.
망막(retina)은 신체 내에서 대사 작용이 가장 활발한 조직 중의 하나로 산소요구량이 높으며 지속적으로 빛에 노출되고 고농도의 불포화 지방산을 포함하고 있어 이러한 요소들이 산화적 손상의 발생에 관여하는 것으로 알려져 있다.
본 출원에서 용어 "망막색소상피세포(retinal pigment epithelium cell, RPE)"란, 외부 혈관 망막 베리어의 일부분을 형성하는 단층의 색소세포들은 의미한다. 이들 세포들은 망막의 기능을 유지하는데 있어서 중요한 역할을 수행하는 것을 특징으로 하며, 광에너지를 흡수, 시각 사이클의 유지를 위한 광수용체와 상호작용, 광수용체와 맥락모세 혈관층의 결합구조를 유지하는 다양한 성장인자들을 분비하고, 이온, 물, 대사 산물을 서브레티날 공간으로부터 혈액으로 이송하는 역할, 광수용체의 outer segment의 식세포 작용을 수행할 수 있다고 알려져 있다. 망막색소상피세포는 망막과 맥락모세혈관 사이에 단일층을 이루고 있는 세포로서 생리적으로 광수용체의 영양공급과 대사물질의 배출 및 세포탈락물의 탐식 등 시력의 유지에 중요한 역할을 하며 산소 소모량이 많아 산화스트레스에 노출되어 있다.
산화적 스트레스는 상기 RPE의 구조적 결함 및 기능 손상을 초래한다. 산화적 스트레스에 의해 유도된 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 산소 대사의 부산물에서 나오는 자유 라디칼, 과산화수소 및 산소 이온을 포함하며 다양한 세포에서 세포 손상 및 세포 자멸사를 유도한다. 특히, RPE와 같이 대사율이 높은 세포의 경우 산화적 손상에 더욱 취약하며, 지속적인 고농도 산화적 스트레스에 대한 노출은 RPE의 미토콘드리아 DNA 손상을 유발함으로써, 미토콘드리아의 기능을 파괴할 뿐만 아니라 궁극적으로 RPE의 세포사멸(apoptosis)을 초래한다. 망막 손상으로 인한 시력 장애는 실명의 가장 중요한 원인 중 하나이며, 산화적 스트레스는 망막 질환의 원인으로 여겨지고 있다.
본 출원에서 상기 망막색소상피세포는 ARPE-19 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 인간 망막색소상피세포의 종류에 해당하는 경우 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 노각나무 추출물은 망막색소상피세포를 증식시키는 활성을 가질 수 있다. 상기 노각나무 추출물은 조성물 내에 0.1 ㎍/ml 내지 5 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이 세포 증식 활성이 우수하다는 장점이 있다. 0.1 ㎍/ml의 농도 미만이면 효과가 미미하고, 5 ㎍/ml의 농도를 초과하여 포함되면 망막색소상피세포에 대한 독성을 나타낼 수 있다.
또한, 상기 노각나무 추출물은 망막색소상피세포에서 산화적 스트레스에 의해 유도된 활성 산소종의 생성을 저해할 수 있고, 구체적으로 1 ㎍/ml 내지 5 ㎍/ml의 농도로 포함되면 농도 증가에 따라 활성 산소종 생성 저해 효과가 더 우수하다는 장점이 있다. 노각나무 추출물이 5㎍/ml의 농도를 초과하여 포함되면 망막색소상피세포에 대한 독성을 나타낼 수 있다.
상기 노각나무 추출물은 H2O2 독성에 대하여 망막색소상피세포의 사멸을 방지하는 효과가 있다. 구체적으로 1 ㎍/ml 내지 5 ㎍/ml의 농도로 포함되면 세포 보호 효과가 더욱 우수하다는 장점이 있다. 노각나무 추출물이 5 ㎍/ml의 농도를 초과하여 포함되면 망막색소상피세포에 대한 독성을 나타낼 수 있다.
산화적 스트레스에 의한 과도한 활성 산소종(reactive oxygen species, RO S)의 생성은 망막색소상피세포의 주요 세포 구성 성분을 산화시키고 미토콘드리아 기능 저하 및 DNA 손상과 연계된 내재적 세포사멸(intrinsic apoptosis) 경로를 활성화하여 황반변성(AMD, age-related macular degeneration) 뿐만 아니라 당뇨병성 망막질환, 증식성 망막질환 등 다양한 망막 질환의 주요 원인 중 하나로 작용한다. 따라서 산화적 스트레스로부터 망막색소상피세포를 보호하는 것은 AMD를 포함하는 다양한 망막 질환의 예방과 치료에 사용할 수 있다.
본 출원은 노각나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 눈 보호용, 시력 보호용 또는 망막 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다. 본 출원의 식품 조성물은 노각나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어, "개선"은 노각나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 예방 또는 치료되는 망막 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 출원의 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 눈 보호, 시력 보호, 눈 피로 저하, 망막 질환의 예방 및 개선 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.
본 출원에서 상기 "식품"이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본 출원에 따른 눈 보호, 시력 보호 또는 망막 질환 증상의 예방 및 개선용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 출원에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 "기능성 식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어, "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조(가공을 포함한다)한 식품을 의미하며, '기능성'은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 한편, 건강식품은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품은 건강 보조 목적의 식품을 의미하는데, 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다. 본원의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하다. 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어날 수 있다.
또한, 본 출원에서 상기"음료"란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 눈 보호, 시력 보호 또는 망막 질환 증상의 예방 및 개선용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본 출원의 눈 보호, 시력 보호 또는 망막 질환 증상의 예방 및 개선용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 출원의 눈 보호, 시력 보호 또는 망막 질환 증상의 예방 및 개선용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001 중량% 내지 90 중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 40 중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100 ml를 기준으로 0.001 g 내지 2 g, 바람직하게는 0.01 g 내지 0.1 g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 식품 첨가물은 식품 조성물은 외관, 향미, 조직 또는 저장성을 향상시키기 위한 목적으로 보통 적은 양이 식품에 의도적으로 첨가되는 것을 가리키며, 식품의 품질을 개량하여, 보존성 또는 기호성을 향상시킬 뿐 아니라 영양가 및 식품의 실질적인 가치를 증진시킬 목적으로 사용하는 것을 의미한다. 이는, 식품위생법 제2조 제2호에서 정의하고 있는 바와 같이, 식품을 제조가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가, 혼합, 침윤, 기타의 방법으로 사용되는 물질일 수 있다.
본 출원의 일 실시예는 노각나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 망막 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 출원에 따른 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양의 노각나무 추출물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
또한, 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 출원에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 약제학적으로 허용되는 부형제, 보조제, 무통화제, 등장화제, 보존제 및 기타 보조제와 혼합하고 약제학적으로 허용되는 제제 형태로 제제화하여 약학적 제제를 제조할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
이러한 약제학적 제제 형태에 있어서, 본 출원은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직한 투여 경로는 경구 투여이다. 경구 투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있다. 또한, 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되며, 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함되지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
상기에서 약학적으로 유효한 양이란 망막 질환 증상을 예방, 개선 및/또는 치료 효과를 달성하기에 충분한 양을 말한다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 상기 약학 조성물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 0.5 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수 있다. 그러므로 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학 조성물을 임상적으로 이용 시에는 약학적 분야에서 통상적인 담체와 함께 배합하여 약학적 분야에서 통상적인 제제, 예를 들면 정제, 캡슐제, 분말제, 과립제, 환제, 액상제 및 현탁제 등의 경구투여용 제제; 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사 시에 주사용 증류수로 제조하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조분말 등의 형태인 주사용 제제; 또는 연고제 등의 다양한 제제로 제형화할 수 있다. 통상적인 담체를 상용하여 제조된 약학적 제제는 경구적으로 투여하거나, 비경구적으로 예를 들면 정맥내, 피하, 복강내 또는 국소 적용할 수 있다. 따라서 본 발명의 약제 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 출원의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 점막, 정맥 내, 피하에 적용)할 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예는, 노각나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 눈 보호용, 시력 보호용 또는 망막 질환의 개선 및 예방용 사료 조성물을 제공한다.
상기 사료용 조성물은 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 본 출원의 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다.
본 출원에서 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박 류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어 "사료 첨가물"은 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 포함한다. 본 출원의 사료 첨가물은 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨, 벤토나이트 (bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 라이신 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예는, 노각나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 망막 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 출원의 용어 "개체"란 망막 질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 모든 동물을 의미한다.
본 출원에 따른 사료 조성물은 망막 질환의 개선, 예방 또는 완화를 목적으로 하는 인간을 제외한 개체이면 제한없이 적용가능 하다. 예를 들면, 개, 고양이, 원숭이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간 동물, 조류 및 어류 등 어느 개체에도 적용이 가능하다.
본 출원의 하나의 실시예는 노각나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 것인, 눈 세척용, 눈 보호용, 시력 보호용, 망막 질환의 개선 및/또는 예방용 외약외품 조성물을 제공한다.
본 출원의 명세서에서 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이 란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것을 말한다.
의약외품은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 외용제 및 개인위생용품도 포함한다. 구체적으로 점안액 제제, 눈 세척 제제일 수 있다.
본 출원의 조성물을 의약외품 조성물로 사용하는 경우, 노각나무 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분 과 함께 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 출원의 의약외품 조성물에 대하여 상기 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물의 내용이 준용될 수 있다. 본 출원에 따른 눈 세척제 또는 눈 세척용 의약외품 조성물은 망막 질환의 예방 또는 개선을 위하여 통상의 치료용 항알레르기제 또는 항염증 제제를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 조성물은 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제, 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가 상기 조성물의 투여 방식은 스프레이 방식, 스퀴즈 방식, 또는 전동식 기계 등에 의한 투여 방식이 사용될 수 있고, 임의의 제제 형태로 사용 가능하지만, 세척에 편리하도록 액상인 것이 바람직하며, 페이스트상, 연고, 스프레이용 제제, 점안액 제제 등으로도 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 실시예, 비교예 및 실험예들을 통해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 비교예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예> 노각나무 추출물의 제조
노각나무 잎과 줄기부위를 음지에서 건조한 다음 마쇄하여 분말화하였다. 추출물을 제조하기 위해 분말을 제조하였으며 잎과 줄기부위 분말을 100% 사용하였다.
70% 에탄올을 이용하여 분말과 1:20 비율로 혼합한 후 이를 65℃에서 6시간 동안 환류 추출하고 농도를 달리하여 실시예 1 내지 실시예 5의 에탄올 추출물을 제조하였다.
<비교예> 마리골드 추출물의 제조
시판되는 눈보호 마리골드추출물(제조원 nutraceuticals International Group, 중량 100g)을 구매하여 60% 에탄올에 녹여 비교예로 사용하였다.
<실험예 1> 망막색소상피세포(ARPE-19)의 독성 측정
1. 망막색소상피세포(ARPE-19)의 배양
인간 망막색소상피세포(human retinal pigmented epithelial cell)인 ARPE-19 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였다.
배지는 10 % Feral Bovine Serum (FBS)를 함유한 DMEM High glucose 성장배지를 사용하였다. ARPE-19 세포는 습도 95 %, 5 % CO2, 37 ℃로 조절된 배양기에서 배양하였으며, 이때 미생물의 오염이나 증식을 억제하기 위해 배지용 항생제(Penicillin streptomycin, Gibco, CA, USA)를 사용하였다. 상기 ARPE-19 세포가 80 % 정도 dish를 덮으면 phosphated-buffered saline-EDTA(PBS-EDTA, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)로 세척한 후 0.25 % Trypsin-EDTA(Gibco, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)를 처리하여 dish 바닥에 부착되어 있는 세포를 떼어내 계대배양하였다. 배지는 48 ~ 72 시간마다 교환하여 ARPE-19 세포를 배양하였다.
2. 독성 측정
ARPE-19 세포주를 1Х104 cells/well의 농도로 96 well plate에 분주하고, 24 시간 동안 37 ℃, 습도 95 %, 5 % CO2로 조절된 CO2 배양기에서 배양하였다. 새로운 배지에 각 시료를 세포독성이 나타나지 않는 알맞은 농도 범위로 세포에 처리한 후 24 시간 동안 배양하였다. 세포주의 생존율을 측정하기 위해 MTS (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)를 이용하여 microplate reader (Molecular Devices, Versa Max ELISA Microplate Reader, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 독성은 추출물을 처리하지 않은 대조군(Control)에 대비한 추출물 처리군의 흡광도로 표시하였다.
상기 ARPE-19 세포에 대한 독성을 측정하기 위해 실시예 1인 노각나무 에탄올 추출물을 0.1 내지 10 ㎍/ml 로 농도를 달리하여 상기 세포에 처리하였으며, 결과를 도 1 및 표 1에 나타냈다.
구분 | 추출물 농도 (㎍/ml) | ARPE-19 cell Viability (%) |
Control | - | 100.0 ± 13.8 |
실시예 1 | 0.1 | 101.7 ± 4.7 |
실시예 2 | 0.5 | 106.9 ± 1.8 |
실시예 3 | 1 | 108.3 ± 4.6 |
실시예 4 | 5 | 109.9 ± 4.7 |
실시예 5 | 10 | 86.7 ± 2.0* |
* p<0.05 indicates a significant difference as compared to the control group.
상기 노각나무 에탄올 추출물은 10 ㎍/ml 처리 농도일 때 세포 독성을 보인 반면, 5 ㎍/ml 이하의 처리 농도에서는 세포 독성이 관찰되지 않았다. 따라서, 망막색소상피세포의 개선, 예방 또는 치료 연구를 위한 노각나무 추출물의 농도는 0.1 - 5 ㎍/ml의 농도 범위에서 효능을 확인하였다.
실험예 2: 망막색소상피세포(ARPE-19)의 증식 활성
ARPE-19 세포주를 1Х104 cells/well의 농도로 96 well plate에 분주하고, 24 시간 동안 37 ℃, 습도 95 %, 5 % CO2로 조절된 CO2 배양기에서 배양하였다. 새로운 배지에 각 시료(추출물)를 세포독성이 나타나지 않는 알맞은 농도 범위로 세포에 처리한 후 2일 동안 배양하였다. 세포주의 생존율을 측정하기 위해 Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo Mol. Tech., Rockville., MD, USA)를 이용하여 microplate reader (Molecular Devices, Versa Max ELISA Microplate Reader, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 증식 활성은 시료(추출물)를 처리하지 않은 대조군(Control)에 대비한 시료 처리군의 흡광도로 표시하였다.
상기 ARPE-19 세포에 대한 증식 활성을 측정하기 위해 실시예인 노각나무 에탄올 추출물과 비교예인 마리골드 추출물을 0.1 내지 5 ㎍/ml 농도로 ARPE-19 세포에 처리하였으며, 그 결과는 도 2 및 표 2와 같다.
구분 | 추출물 농도 (㎍/ml) | ARPE-19 cell Proliferation (%) |
Control | - | 100.0 ± 4.9 |
실시예 1 | 0.1 | 110.3 ± 13.6 |
실시예 2 | 0.5 | 130.3 ± 9.7 |
실시예 3 | 1 | 142.8 ± 9.1* |
실시예 4 | 5 | 135.2 ± 3.8* |
Control | - | 100.0 ± 4.6 |
비교예 1 | 0.1 | 103.2 ± 9.0 |
비교예 2 | 0.5 | 108.1 ± 4.8 |
비교예 3 | 1 | 105.8 ± 5.2 |
비교예 4 | 5 | 115.4 ± 10.1 |
* p<0.05 indicates a significant difference as compared to the control group.
상기 노각나무 에탄올 추출물인 실시예 1 내지 4는 농도가 증가함에 따라 ARPE-19 세포의 증식 활성이 증가하였다. 또한, 상기 노각나무 에탄올 추출물의 결과를 참조하면, 상기 노각나무 에탄올 추출물은 1 ㎍/ml 농도일 때 증식 활성이 142.8 %로, Control에 비해 증식이 약 1.43 배 우수하였다. 반면, 상기 마리골드 추출물인 비교예 1 내지 4는 대조군에 비하여 차이가 매우 적음을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 통해, 본 출원에 따른 노각나무 추출물은 망막색소상피세포의 증식 활성이 우수하다는 것을 알 수 있다.
실험예 3: H
2
O
2
세포독성에 대한 망막색소상피세포(ARPE-19) 보호효과
H2O2로 ARPE-19 세포에 손상을 주고, ARPE-19 세포 손상에 대한 보호 효능을 세포 생존율로 측정하였다.
1) H
2
O
2
세포독성에 대한 ARPE-19 세포 사멸 농도
H2O2에 의한 ARPE-19 사멸 농도를 측정하기 위해, Hydrogen peroxide 30 % (DAEJUNG, 4104-4405)를 구입하여 사용하였다.
상기 ARPE-19 세포주를 96 well plate에 1Х104 cells/well 농도로 분주 후, 안정화를 위하여 습도 95 %, 5 % CO2, 37 ℃에서 24 시간 배양하였다. 배지제거 후 새로운 배지로 희석한 H2O2를 농도별로 10 ㎕씩 처리하여 습도 95 %, 5 % CO2, 37 ℃에서 24 시간 동안 반응시켰다.
ARPE-19 세포주의 생존율 측정은 MTS (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)시약을 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다. 상기 MTS 시약을 well 당 10 ㎕씩 처리하여 37 ℃에서 60 분간 반응 후, microplate reader (Molecular Devices, VersaMax ELISA Microplate Reader, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. ARPE-19 세포의 생존율은 시료를 처리하지 않은 대조군(Control)에 대비한 시료 처리군의 흡광도로 표시하였다.
H2O2를 농도별로 처리하여 약 50 %의 세포 생존율로 확인되는 농도를 찾고자 하였다. H2O2를 0.5 - 10 mM 농도로 처리하였으며, 그 결과는 도 3 및 표 3과 같다.
구분 | H2O2 농도 (㎍/ml) | ARPE-19 cell Viability (%) |
Control | - | 100.0 ± 5.8 |
H2O2 | 0.5 | 94.2 ± 15.6 |
1 | 79.4 ± 5.4* | |
2 | 64.7 ± 2.3* | |
4 | 0.0 ± 0.4* | |
6 | 0.0 ± 0.4* | |
8 | 0.0 ± 0.4* | |
10 | 0.0 ± 0.5* |
* p<0.05 indicates a significant difference as compared to the control group.
실험 결과, 도 3 및 표 3을 참조하면 H2O2의 농도가 증가할수록 세포 생존율이 감소하였으며, 2 mM 농도에서 세포 생존율이 약 60 %로 확인하였다. 따라서, H2O2 세포독성에 대한 ARPE-19 세포 보호 효과 연구를 위한 H2O2의 농도는 2 mM에서 ARPE-19 세포 보호 효능을 확인하였다.
2) H
2
O
2
세포독성에 대한 ARPE-19 세포 보호효과
ARPE-19 세포주를 96 well plate에 1Х104 cells/well 농도로 분주 후, 안정화를 위하여 습도 95 %, 5 % CO2, 37 ℃에서 24 시간 배양하였다. 배지제거 후 새로운 배지로 2 mM H2O2를 처리한 후, 시료(추출물)를 농도별로 10 ㎕씩 처리하여 습도 95 %, 5 % CO2, 37 ℃에서 24 시간 동안 반응시켰다.
ARPE-19 세포주의 생존율 측정은 MTS (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)시약을 이용하여 ARPE-19 세포의 생존율을 측정하였다. 즉, 상기 MTS 시약을 well 당 10 ㎕씩 처리하여 37 ℃에서 60 분간 반응 후 microplate reader (Molecular Devices, VersaMax ELISA Microplate Reader, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. ARPE-19 세포의 생존율은 시료(추출물)를 처리하지 않은 대조군(Control)에 대비한 시료 처리군의 흡광도로 표시하였다.
상기 H2O2 처리에 의한 ARPE-19 세포 보호효과를 측정하기 위하여 실시예인 노각나무 에탄올 추출물과 비교예인 마리골드 추출물의 세포 보호 효능을 확인하였다. 그 결과는 도 4 및 표 4와 같다.
구분 | 추출물 농도 (㎍/ml) | ARPE-19 cell Viability (%) |
Control | - | 100.0 ± 11.7 |
+ | 55.0 ± 3.5 | |
실시예 1 | 0.1 | 59.0 ± 5.0 |
실시예 2 | 0.5 | 60.8 ± 5.1 |
실시예 3 | 1 | 64.4 ± 4.7* |
실시예 4 | 5 | 62.6 ± 2.5* |
비교예 1 | 0.1 | 58.1 ± 2.6 |
비교예 2 | 0.5 | 57.3 ± 3.2 |
비교예 3 | 1 | 56.1 ± 1.9 |
비교예 4 | 5 | 52.6 ± 3.1 |
* p<0.05 indicates a significant difference as compared to the (+)control group.
상기 노각나무 에탄올 추출물인 실시예 3 및 실시예 4를 참조하면, ARPE-19 세포 보호효과가 나타났고, 1 μg/ml 농도 이상부터 더 우수한 ARPE-19 세포 보호효과가 나타났다. 반면, 상기 마리골드 추출물인 비교예 1 내지 비교예 4를 참조하면, 모든 농도에서 유의미한 ARPE-19 세포 보호효과는 나타나지 않았다.
상기 결과를 통해, 본 출원에 따른 노각나무 추출물은 H2O2 세포독성에 대한 망막색소상피세포 보호 효능이 우수하다는 것을 알 수 있다.
실험예 4: 망막색소상피세포(ARPE-19)에서의 활성 산소종(ROS) 생성 저해능
활성 산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)의 생성은 DCF-DA를 이용한 형광물질 발생의 강도를 가지고 측정하며, Reduced 또는 Acetylated 된 형태의 2',7'-Dichlorofluorescin(DCF)은 세포 내에 있는 Esterase와 세포 내에 생성되는 ROS들의 산화작용에 의해 아세테이트 그룹이 제거되면 형광물질(FITC)을 방출하는 원리를 이용한다.
ARPE-19 세포를 1Х104 cells/well의 농도로 96 well plate에 100 ㎕씩 분주한 후, 24 시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 시료(추출물)를 알맞은 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 24 시간 후 PBS 100 ㎕를 넣은 후 세척하였고 이 과정을 3회 반복하여 수행하였다. DMSO에 녹아 있는 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA)를 20 μM (in PBS)로 희석하여 100 ㎕ 넣은 후 20 분 배양하였다. H2O2 1 mM (in PBS) 100 ㎕ 넣은 후 30 분간 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 486 nm, 535 nm에서 형광의 세기를 측정하였다.
상기 ARPE-19 세포에서 ROS 생성 저해 활성을 측정하기 위해 실시예인 노각나무 에탄올 추출물과 비교예인 마리골드 추출물을 0.1 내지 5 μg/ml의 농도로 처리하였으며, 그 결과는 도 5 및 표 5와 같다.
구분 | 추출물 농도 (㎍/ml) | 1M H2O2 | Reactive Oxygen Species Activity (%) |
Control | - | - | 20.1 ± 1.7* |
+ | 100.0 ± 6.9 | ||
실시예 1 | 0.1 | + | 97.1 ± 7.5 |
실시예 2 | 0.5 | + | 93.5 ± 5.9 |
실시예 3 | 1 | + | 68.5 ± 1.6* |
실시예 4 | 5 | + | 65.1 ± 11.4* |
비교예 1 | 0.1 | + | 95.0 ± 7.7 |
비교예 2 | 0.5 | + | 90.7 ± 2.8 |
비교예 3 | 1 | + | 92.5 ± 5.4 |
비교예 4 | 5 | + | 99.3 ± 6.3 |
* p<0.05 indicates a significant difference as compared to the (+)control group.
상기 노각나무 에탄올 추출물인 실시예 1 내지 4를 참조하면, 농도가 증가함에 따라 유의미하게 ROS 생성 저해 활성이 증가하였고, 특히 5 μg/ml의 농도에서 34.9 %의 우수한 ROS 생성 저해능을 확인하였다. 반면, 상기 마리골드 추출물인 비교예 1 내지 4를 참조하면, 유의미한 ROS 생성 저해 효과를 확인할 수 없었다.
상기 결과를 통해, 본 출원에 따른 노각나무 추출물은 ROS 생성 저해 효능이 우수하다는 것을 알 수 있다.
이상으로 본 출원의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예 일뿐이며, 이에 본 출원의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 출원의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 또한, 청구범위에서 정의하고 있는 본 출원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태도 본 출원의 권리범위에 속하는 것이다.
Claims (11)
- 노각나무 추출물을 유효성분으로 0.1 ㎍/ml 내지 5 ㎍/ml의 농도로 포함하고,
망막색소상피세포를 증식시키는 활성을 가지는 것인, 시력 보호용 또는 망막 질환의 개선 및 예방용 식품 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 망막 질환은,
망막변성(retinal degeneration), 황반변성(macular degeneration), 당뇨병성 망막질환 (diabetic retinopathy), 고혈압성 망막질환(hypertensive retinopathy) 망막색소변성(retinitis pigmentosa), 레베르선천성흑암시(Leber congenital amaurosis), 망막박리(retinal detachment), 안구건조증(dry eye syndrome), 녹내장(glaucoma), 스타가트병(Stargardt disease), 맥락막 결손(choroideremia), 맥락망막 위축(gyrate-atrophy), 안구 건조증(dry eye syndrome), 눈 피로(eye strain), 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity), 황반 원공(Macular hole), 황반 모세혈관확장증(Macular Telangiectasia, MacTel) 및 시신경병증(optic neuropathy)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 시력 보호용 또는 망막 질환의 개선 및 예방용 식품 조성물.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서,
상기 노각나무 추출물은,
망막색소상피세포에서 산화적 스트레스에 의해 유도된 활성 산소종의 생성을 저해하고, 망막색소상피세포의 사멸을 방지하는 것인, 시력 보호용 또는 망막 질환의 개선 및 예방용 식품 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 노각나무 추출물을 유효성분으로 0.1 ㎍/ml 내지 5 ㎍/ml의 농도로 포함하고,
망막색소상피세포를 증식시키는 활성을 가지는 것인, 시력 보호용 또는 망막 질환의 개선 및 예방용 사료 조성물.
- 삭제
- 삭제
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