CN110913706A - 具有丝状真菌的食用组合物和用于其培养的生物反应器系统 - Google Patents

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Abstract

提供生产食用丝状真菌生物垫配制剂作为食品中的独立蛋白质来源和/或蛋白质成分的方法以及一次性使用或重复使用的自含式生物膜‑生物垫反应器，该反应器包含具有至少一个区室和置于区室内的容器、原料、真菌接种物、透气膜和任选的液体营养物培养基。

Description

具有丝状真菌的食用组合物和用于其培养的生物反应器系统
发明领域
本申请涉及食用真菌，并提供了制备用于食品、食用真菌的液体和固体配制剂的食用真菌的方法以及与之相关的用途和方法、含有食用真菌的食品及其方法和用途。
发明背景
联合国在2017年8月将世界人口列为75亿，并预测该数字将在2023年增长到80亿并且在2056年增长到100亿。在相关报告中，联合国粮食农业组织(FAO)估计，若到2050年全球人口达到91亿，世界粮食产量将需要增加70％，并在发展中国家倍增。尽管能源成本上升，地下含水层资源减少，农田因城市蔓延而损失，以及由气候变化造成的日益恶劣的天气(例如温度升高、干旱增加、洪水泛滥等)，粮食产量仍将需要增加。对于诸如根据2009年的数据已经具有不足的蛋白质摄入的非洲和面临蛋白质摄入不足的风险的中国、印度、巴基斯坦和印度尼西亚的国家而言，这是一个特别的挑战。此外，预计2040年全球肉类需求增长60％，乳制品需求增长50％。
但并非所有蛋白质来源平等创建。动物性食品(肉、蛋、奶制品)提供“完全”蛋白质，因为它们包含所有必需氨基酸；即甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、组氨酸、色氨酸和赖氨酸。植物性食品虽然含有一些必需氨基酸，但通常缺乏完全组。例如，存在于淀粉根中的蛋白质缺少必需的氨基酸赖氨酸，其必须从饮食中的另一种食物中获取。豆类和豆荚含有高水平的赖氨酸，但它们缺少必需的氨基酸甲硫氨酸。尽管可以通过配对植物性食物来构建完整的蛋白质，但是使用完整的蛋白质来确保营养均衡的饮食要容易得多。
完全蛋白质的一种非动物来源是从食用丝状真菌中获得的，例如Fusariumvenenatum(以前分类为禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum))。但是，迄今为止，从这些来源生产蛋白质需要在能源和生产设备(例如资本密集型生物反应器和离心机)上进行大量投资。仍然需要低能量，消耗较少自然资源且成本低的生长、收获和食品生产方法。本发明解决了这些问题。
此外，减少与应对自然灾害、后勤隔离环境或军事和/或太空/地外任务相关的物流供应的一个领域是在提供任务关键产品，诸如营养和开胃食物、燃料、代谢物表达平台、建筑材料和/或微生物工厂情况下的生命支持回路，特别是废物流的闭合。通常，这些类型的环境无法接触或有限接触到无菌设施或/或需要密封的无菌系统来完全容纳废物流和/或所产生的食物、燃料和材料。例如，欧洲航天局的工作(第25-28号探险，太空中有色真菌的生长和生存(CFS-A))表明，真菌可以在空间站内生长，并能在湿条件下分解食物和其他有机物质；在这里，真菌系统的防范对于防止其他供应和表面的无意污染至关重要。除了需要在太空旅行的发展领域中分解食物和废物之外，在应对自然灾害、剧院内军事行动、荒野行动以及卫生和制冷不可靠的第三世界情况、密闭空间、后勤困难的场所以及一些农业/工业运营中时，也存在这些需求。需要拥有自含式(self-contained)无菌系统，该系统以最小的空间、能源和维护来高效运行。
强大且高效的便携式自含式生物膜-生物垫反应器系统解决这些问题，所述系统能够将极其多种废物流转化为多种有价值的产品。本公开内容描述了一种简单的无菌生物反应器平台，该平台在发酵期间(除了温度控制之外)不需要搅拌，不需要主动通气，不需要能源，产生最少的废物残留至无废物残留，需要很少的水并且产生密集的，易于收获的，有织纹的生物垫。另外，自含式生物膜-生物垫反应器系统可以是便携式的和/或可扩展的，以用于更大、更集中的任务和/或群体。
发明概述
本公开内容提供了食用丝状真菌的配制剂。在表面发酵条件下在液体培养基上培养食用丝状真菌，以产生丝状真菌生物垫(biomats)。在一个实施方案中，提供了用于表面发酵生产可食用真菌生物垫的方法，该方法包括用浮游和/或小分生孢子真菌细胞接种含有碳源的液体合成生长培养基，在室温温育接种的生长培养基并收获由真菌产生的粘合生物垫。在一些实施方案中，在开放式托盘或至少包含在半无菌环境中的开放式托盘中温育接种的生长培养基。
在另一个实施方案中，用于表面发酵食用真菌生物垫生产的生产方法允许收获生物垫的部分，而维持剩余生物垫的生长潜力。
在另一个实施方案中，丝状真菌是尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)菌株MK7(ATCC PTA-10698保藏于美国典型培养物保藏中心，1081 University Boulevard,马纳萨斯,弗吉尼亚,美国)，其具有46-51％的完全蛋白质含量，具有高水平的所有必需氨基酸，特别是42-43％的必需氨基酸和4-21％的BCAA，其高于蛋。此外，尖孢镰孢菌菌株MK7具有8-10％的矿物质和灰分含量，包括高水平的钙(1.3mg/100g份)、铁(5.5毫克mg/100g份)、1-2％的核酸和6-11％的脂质，其中85％是不饱和的。
在另一个实施方案中，丝状真菌是Fusarium venenatum或藤仓镰孢菌(Fusariumfujikuroi)。
在又一个实施方案中，丝状真菌选自下组：双孢子蘑菇(Agaricus bisporus)(褐菇和白菇(crimini and white))、美味牛肝菌(Boletus edulis)(牛肝菌(porcinini))、鸡油菌(Cantarellus cibarius)(黄菇(chantrelle))、大秃马勃(Calvatia gigantea)(大秃马勃(giant puffball))、Cyclocyb eaegerita(velvet piopinni)、灵芝(Ganodermalucidum)(灵芝(Reishi))、多叶奇果菌(Grifola frondosa)(椎茸(maitake))、羊肚菌属(Morchella)物种(羊肚菌(Morel))、真姬菇(蟹味菇(clamshell))、榆蘑(Hypsizygusulmarius)(榆蘑(elm oyster))、硫磺菌属(Laetiporus)物种(硫磺菌(chicken of thewoods))、埃杜拉香菇(Lentinula edodes)(香菇(shiitake))、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)(trumpet royale,king oyster)、大秃马勃、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)(珍珠平菇)、糙皮侧耳columbinus变种(Pleurotus ostreatus var.columbinus)(蓝平菇(blue oyster))和其它侧耳属(Pleurotus)种(例如榆黄蘑(P.citrinopileatus),tuberregium)、榆蘑(Hypsizygus ulmarius)(榆蘑)、滑菇(Pholiotami crospora)(森林滑菇)、绣球菌(Sparassis crispa)(花椰菜)和块菌属(Tuber)物种(松露(truffles))。
在另一个实施方案中，碳源是糖(例如蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、稀有糖等)、糖醇(例如甘油，多元醇等)、淀粉(例如玉米淀粉等)、淀粉衍生物、淀粉水解物、氢化淀粉水解物、木质纤维素纸浆或原料(例如甜菜纸浆、农用纸浆、木材纸浆、干酒糟(distiller drygrain)、啤酒废物(brewery waste)等)、玉米浆、酸乳清、甜乳清、乳清、小麦浆(wheatsteep liquor)、工业用液(industrial liquor)、食品精炼产品/废物流和/或它们的组合。
在另一个实施方案中，提供了一种表面发酵生产从丝状真菌的子实体或孢子引发的食用丝状真菌生物垫的方法。对于从子实体引发的生物垫，该方法包括对真菌的子实体进行表面灭菌，减小经灭菌的真菌的子实体的大小，对减小的真菌的子实体进行表面灭菌，用来自经灭菌的减小的真菌的子实体的细胞接种含有碳源的合成液体生长培养基，在室温温育接种的培养基，并收获由真菌产生的粘合丝状生物垫。对于从丝状真菌孢子引发的生物垫，该方法包括用无菌孢子接种含有碳源的合成液体生长培养基，在室温温育接种的生长培养基，并收获由真菌孢子产生的粘合丝状生物垫。
在一些实施方案中，丝状真菌的子实体或孢子选自下组：双孢子蘑菇(褐菇和白菇)、美味牛肝菌(牛肝菌)、鸡油菌(黄菇)、大秃马勃、Cyclocyb eaegerita(velvetpiopinni)、灵芝、多叶奇果菌(椎茸)、羊肚菌属物种(羊肚菌)、真姬菇(蟹味菇)、榆蘑、硫磺菌属物种(硫磺菌)、埃杜拉香菇(香菇)、刺芹侧耳(trumpet royale)、糙皮侧耳(珍珠平菇和蓝平菇)、滑菇(森林滑菇)、绣球菌(花椰菜)和块菌属物种(松露)。丝状真菌的无菌孢子获自商业供应商，诸如Myco Direct(Huntley,Illinois)。
在另一个实施方案中，从浮游细胞、小分生孢子细胞、大小减小的子实体或丝状真菌的孢子产生的丝状生物垫包含小于5mm长的菌丝体和/或菌丝聚集体。在又一个实施方案中，大小减小的丝状生物垫包含大于5mm长的聚集体。
在另一个实施方案中，子实体细胞接种的生长培养基具有约4.0-4.l的pH。
在另一个实施方案中，用于子实体和/或细胞生长的合成生长培养基的碳源包括甘油、淀粉、玉米浆、酸乳清或它们的组合和/或温育时间为约2-10天或更长。
另一个实施方案涉及食用真菌丝状生物垫的配制剂，其包含从食用真菌丝状生物垫分离的食用真菌丝状生物垫颗粒，所述食用菌丝状生物垫通过在合成液体培养基上的表面发酵培养。
另外的实施方案涉及液体、固体或凝胶形式的配制剂。
还有更多的实施方案涉及配制剂，其为糊剂、粉状物、多孔/充气物质(aeratedmass)和/或硬质物质(firm mass)。
另一个实施方案涉及食品，其包含食用真菌丝状生物垫的一种或多种配制剂，具有或不具有其他成分。
另外的实施方案涉及从一种或多种配制剂制成的食品，例如肉替代品、饮用物(drinks)、饮料(beverages)、酸奶、点心、甜食或糖果。
另一个实施方案涉及从一种或多种配制剂制成的在室温不融化的食品，其是慕斯或冷冻点心，例如冰淇淋类似物。
进一步的实施方案涉及配制剂作为配料增强和/或模拟食品中肉(例如汉堡(burger)、香肠、热狗、鸡或火鸡块和/或鱼片)的质地和/或增加食品的蛋白质含量的用途。进一步的实施方案涉及液体分散配制剂作为乳替代品和/或增加乳、乳制品和/或乳替代品产品的蛋白质含量的用途。
另一个实施方案涉及从食用丝状真菌生物垫分离油。
本公开还提供了一种自含式生物膜-生物垫反应器。在一个实施方案中，自含式生物膜-生物垫反应器包含容器，并且将原料、真菌接种物、透气膜和任选的液体营养物培养基置于容器内。在一些实施方案中，反应器是一次性使用的反应器，而在其他实施方案中，反应器可以重复使用。
通常，各个实施方案中的容器能够被密封，并且除了密封件之外还可以包括容器盖。在一些实施方案中，容器是有盖的托盘。在其他实施方案中，容器是有盖的培养皿或其他类型的有盖容器。在其他实施方案中，容器是袋。在其他实施方案中，容器是具有由透气膜(2)制成的上部的管(见图23)。在一些实施例中，容器包括多个生长区室。在一些实施方案中，容器具有歧管设计和/或挡板系统。在一些实施方案中，容器完全或部分地从一种或多种消耗性原料(consumable feedstock)制成。
在一些实施方案中，给原料接种子囊菌(ascomycetes)真菌菌株，例如镰孢菌(Fusarium)，其实例是尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)菌株MK7(ATCC PTA-10698，保藏于美国典型培养物保藏中心，1081University Boulevard,马纳萨斯,弗吉尼亚,美国)、Fusarium venenatum、和燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)、藤仓镰孢菌、根霉属(Rhizopus)种、曲霉属(Aspergillus)种和/或它们的组合。
在其他实施方案中，给原料接种担子菌(basidiomycetes)真菌菌株，例如双孢子蘑菇(褐菇和白菇)、美味牛肝菌(牛肝菌)、鸡油菌(黄菇)、大秃马勃、Cyclocyb eaegerita(velvet piopinni)、灵芝、多叶奇果菌(椎茸)、羊肚菌属物种(羊肚菌)、真姬菇(蟹味菇)、榆蘑、硫磺菌属物种(硫磺菌)、埃杜拉香菇(香菇)、刺芹侧耳(trumpet royale)、糙皮侧耳(珍珠平菇和蓝平菇)、滑菇(森林滑菇)、绣球菌(花椰菜)和块菌属物种(松露)。
在一些实施方案中，原料是废物，例如天然存在的尿液和/或粪便，以及食物废物和副产物、工业废物和/或副产物、农业废物和副产物、植物材料和/或它们的组合。在其他实施方案中，原料可以是合成或制造的替代物，例如人尿液替代物。就作为植物材料或包括植物材料的原料而言，该植物材料通常是木质纤维素的。木质纤维素原料选自下组：农业作物残余物(例如小麦秸秆、大麦秸秆、稻秸秆、豌豆、燕麦、细粮(small grain)秸秆、玉米秸秆，玉米纤维(例如玉米纤维胶(CFG)、干酒糟(DDG)、玉米面筋粉(corn gluten meal，CGM)、柳枝稷(switch grass)、苜蓿草(hay-alfalfa)、甘蔗渣(sugarcane bagasse)、非农业生物质(例如藻类生物质、蓝细菌生物质、城市树木残渣(urban tree residue))、蔬菜(例如胡萝卜、绿花椰菜(broccoli)、大蒜、马铃薯、甜菜、花椰菜)、森林产品和工业残留物(例如，软木第一/二级磨渣(mill residue)、硬木第一/二级磨渣、再生纸浆污泥、厌氧消化物)、含木质纤维素的废物(例如新闻纸、废纸、酿造谷物、用过的橡胶轮胎(URT)、市政有机废物、庭院废物、临床有机废物、糖、淀粉、废油、橄榄油、橄榄油加工废物、蟋蟀排泄物(cricketexcrement)以及生物燃料生产期间产生的废物(例如经加工的藻类生物质，甘油)及它们的组合。通常，透气膜与存在于容器中的一种或多种原料、任选的液体培养基和接种物直接接触并密封到它们的表面上。在一些实施方案中，存在任选的培养培养基。
在一些实施方案中，透气膜由聚合物材料组成，例如聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚吡咯烷酮、聚(酰胺基胺)树枝状聚合物复合物、乙酸纤维素、丁二烯-丙烯腈、TeflonAF2400和尼龙。在一些实施方案中，透气膜的孔径范围为0.05-1.5μm，例如0.2μm、0.45μm和1.0μm。在一些实施方案中，透气膜为无菌布状材料的形式，而在其它实施方案中，膜为纸状材料的形式。在一些实施方案中，表面的质地是光滑的，在其他实施方案中，表面的质地是粗糙的。在一些实施方案中，用于气体扩散的路径基本上是直接的，而在其他实施方案中，路径是曲折的。
在一些实施方案中，反应器产生生物膜-生物垫，其充当食物来源，例如蛋白质来源和/或油来源。在其他实施方案中，生物膜-生物垫充当皮革类似物和/或生物塑料。在其他实施方案中，生物膜-生物垫充当生物燃料前体的来源或生物燃料本身。在其他实施方案中，生物膜生物垫用于产生有机产物，例如有机酸、抗生素、酶、激素、脂质、真菌毒素、维生素、色素和重组异源蛋白质。
附图简述
图1.在营养物培养基中尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫的生长，所述营养物培养基在最初的4天生物垫形成阶段后每天进行更新。
图2.三厘米厚的尖孢镰孢菌菌株MK7生物膜，其在每天(第四天后)更新的液体营养物培养基中形成。显示了生物垫下面的尼龙网筛，并且用于将生物垫提起并移动到新鲜培养基。
图3.连续流系统，其经设计以连续供给尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫生长物并从培养基中除去营养物。从接种时间起生长7天后通道中显示白色生物垫。
图4.从接种时间起生长10天后(连续流动下6天+静止/静态条件下4天)后生物垫生长。
图5.生物垫的半连续生产，显示(A)在第12天时取出最成熟的生物垫部分。在托盘下端收获最成熟的生物垫的1/3之后，剩余的生物垫沿箭头方向物理向下移动，直到生物垫的边缘接触到托盘的末端(B)。移动生物垫在托盘上端创建新的开放空间，在此形成新的生物垫。
图6.使用半连续生产方法随时间累积生产生物质。虚线是第5天到第19天的线性回归线(y＝0.57x-1.52，r2＝0.973)。误差棒是三个重复托盘的平均值的标准差。小于数据点符号时的误差棒不可见。
图7.生物垫的连续生产，右侧显示生物垫的最成熟部分的除去。在托盘右侧连续收获最成熟的生物垫时，在托盘的左端创建新的开放空间，使得能够形成新的生物垫。托盘中的液体培养基可以根据需要或连续进行补充和/或提升。
图8.用UVB光照射四个小时后，尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫(右侧两个切下的盘)的橙色色素沉着。左侧显示了两个从未照射的对照生物垫切下的盘。
图9.使用具有甘油、玉米淀粉和玉米浆的MK7-1培养基(描述于PCT/US2017/020050中)生产的4天龄尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫的场发射扫描电子显微术。图像A、B和C显示了通过乙醇清洗除去EPS基质的生物垫。A)带有气生菌丝的生物垫的顶面视图。B)致密底层的横截面，箭头描绘该层。通过用剃须刀片切割生物垫来创建横截面图。生物垫的底部显示在图像的左下角，而密实底层上方的粘附不良的过渡层显示在右上角。C)生物垫的底面视图。D)具有适当位置的EPS基质(即未用乙醇清洗除去EPS)的生物垫底部表面视图。
图10.在甘油、淀粉和玉米浆上培养的生物垫的透射光显微镜图像(100x)。空中菌丝层左侧的图像揭示了细丝的主要近垂直方向。右图显示了密集的底层和相邻的过渡层。
图11.A：左侧的鸡胸肉和右侧的甘油上培养的具有类似质地的新鲜生物垫。B：由著名厨师Brooks Headley使用真菌生物垫制备的“MycoBurger”。
图12.使用本公开的方法生产的生物垫。A：灵芝蘑菇；B：珍珠平菇蘑菇；C：蓝平菇蘑菇；D：花椰菜蘑菇；E：榆蘑蘑菇；G：大秃马勃蘑菇。
图13.A.从在甘油、淀粉和玉米浆的混合物上培养的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫生产的鸡块。B.从在麦芽培养基001(40g麦芽、4g蛋白胨、1.2g酵母提取物、20滴/1ml芥花油、4g研磨燕麦、1000mL水)上培养的大秃马勃生物垫生产的鸡块。
图14.使用A.25％MK7液体分散体：75％全脂奶，B.50％MK7液体分散体：50％全脂奶和C.100％MK7液体分散体从活酸奶培养物制备的酸奶。在这些培养物中使用的MK7液体分散体从在酸乳清上培养的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫制备。
图15.从尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫生产的严格素食冰淇淋类似物。
图16.当细胞附着到可容易获得氧气的透气膜时，在包囊的反应器中开始形成生物膜-生物垫。随着时间的流逝，生物膜-生物垫向下生长，并最终充满反应器的空间，消耗所有液体和营养物。
图17.在静态条件下在培养皿中在五天内培养的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫，该培养皿覆盖有由(A)-(C)聚丙烯和(D)聚碳酸酯构成的半透膜。基本上没有游离液体留在培养皿中，并且所有营养物都掺入生物垫中。反应器的空隙/液体体积基本上充满生物垫。
图18.通过透气膜与液体培养基分开附着袋用于供应和捕获气体。集成的多功能膜允许氧气进入和CO2和其他产生气体的流出。在下部液体区室(黄色)中培养的真菌生物质将原料和营养物转化为生物垫，随着其生长，所述生物垫充满该区室。通过打开反应器封闭系统(例如
Figure BDA0002293114410000091
类型)并从袋中取出，可以容易收获致密的固结生物垫。
图19.基本密闭反应器(1)。显示了具有共用壁/挡板(9)、前阀(6)和后阀(8)以及透气膜(2)的多个通道(4)。
图20.具有单个气体收集室(14)的基本密闭反应器(1)。
图21.具有带通道的气体收集室(15，20)的基本密闭反应器(1)。
图22.基本密闭反应器(1)，其具有带通道的气体收集室(15)，该室具有气体特异性通道(30、40)，所述气体特异性通道具有气体特异性可透膜(2、50)。
图23.基本密闭反应器(1)，其具有圆柱形通道(4)、壁/挡板(9)、前阀(6)和后阀(8)和透气膜(2)。
发明详述
食用丝状真菌可单独或掺入食品中用作蛋白质来源。例如，珍珠平菇蘑菇的蛋白质含量为27.25％，蓝平菇蘑菇的蛋白质含量为24.65％，灵芝蘑菇的蛋白质含量为15.05％(Stamets(2005)Int J Medicinal Mushrooms 7:103-110)，大秃马勃的蛋白质含量为27.3％(Agrahar-Murugkar and Subbulakshmi(2005)Food Chem 89:599-603)，花椰菜蘑菇的蛋白质含量为32.61％(Kimura(2013)BioMed Res.Int.Article ID 982317)。
然而，尽管担子菌丝状真菌的子实体，如双孢子蘑菇(褐菇和白菇)、美味牛肝菌(牛肝菌)、鸡油菌(黄菇)、灵芝(灵芝(Reishi))、羊肚菌属物种(羊肚菌)、真姬菇(蟹味菇)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)(珍珠平菇和蓝平菇)、刺芹侧耳(trumpet royale)、滑菇(森林滑菇)、绣球菌(Sparassis crispa)(花椰菜)、榆蘑、Cyclocyb eaegerita(velvetpiopinni)、多叶奇果菌(Grifola frondosa)(椎茸)、埃杜拉香菇(Lentinula edodes)(香菇)、硫磺菌属物种(硫磺菌)、大秃马勃和块菌属物种(松露)常用于食品中，几乎没有主要包含担子菌或子囊菌丝状真菌的营养菌丝体的产品。这部分是由于菌丝体是地下的或者在很大程度上与它生长的物质不可分。
在特定条件下，丝状真菌可通过在厌氧、微需氧或需氧条件或它们的组合下的表面发酵形成真菌生物垫。在此，丝状真菌生物垫主要以菌丝体、菌丝体的片段、菌丝、菌丝的片段的形式包含真菌物种和/或菌株和/或其后代，并且在较小程度上含有分生孢子、小分生孢子、大分生孢子或任何以及所有它们的组合，并且在一些情况下也可以含有分生孢子器和厚壁孢子。
通常，丝状生物垫主要由菌丝体组成；也就是说，交织的营养菌丝细丝的复杂网络。生物垫内未破碎细丝的平均长度通常至少为0.1mm，诸如0.1mm–0.5mm、0.5mm–50cm、0.6mm–40cm、0.7mm–30cm、0.8mm–25cm、1.0mm–20cm、1.4mm–15cm、1.6mm–10cm、1.7mm–8cm、1.8mm–6cm、2.5mm–4cm、and 5mm–2cm、2cm–25cm、4cm–30cm、5cm–40cm、6cm–50cm、8cm–60cm、10cm–100cm。
丝状真菌生物垫的生长可以通过表面发酵完成。这涉及用丝状真菌细胞接种包含碳源和氮源的液体培养基。合适的碳源包括糖(例如蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、日本稀有糖等)、糖醇(例如甘油，多元醇等)、淀粉(例如玉米淀粉等)、淀粉衍生物(例如麦芽糊精、环糊精、葡萄糖浆、水解物和改性淀粉)、淀粉水解物、氢化淀粉水解物(HSH；例如氢化葡萄糖浆、麦芽糖醇浆、山梨糖醇浆等)、木质纤维素纸浆或原料(例如甜菜纸浆、农业纸浆、木材纸浆、干酒糟、啤酒废物等)、玉米浆、酸乳清、甜乳清、乳浆、小麦浆，碳水化合物、食品废物、橄榄油加工废物、来自木质纤维素材料的水解产物和/或它们的组合。丝状真菌细胞产生位于生长培养基表面上的生物垫；也就是说，它们基本上漂浮在生长培养基上。
在许多情况下，尤其是对于子囊菌真菌，对生长培养基接种包含浮游丝状真菌细胞的接种物。高质量的接种物由浮游细胞构成，所述浮游细胞定义为不成团或不聚集在一起的单一细胞，优选从指数生长期分离出来，并且可以包括小分生孢子。理想地，接种物的细胞漂浮在生长培养基的表面上，诸如具有高脂质含量的那些细胞，并导致增加的生长速率。浸没在生长培养基内的细胞或细胞团对漂浮在表面的细胞及其形成的生物垫产生负面影响。具体而言，源自含有大量成团的浸没细胞的生长培养基的生物垫通常会变色，并且往往不生长同质致密的垫。
对于担子菌孢子接种，使用约2cc悬浮于来自孢子注射器(例如，MycoDirect,Huntley,IL)的去离子水中的无菌孢子接种小的Pyrex盘中的约75mL生长培养基。或者，使用标准无菌条件将1cc悬浮于来自孢子注射器的去离子水中的孢子铺在具有麦芽提取物琼脂培养基+CF(30g干麦芽提取物、20g琼脂、1000mL水+0.01％氯霉素)的容器上。用石蜡膜密封容器，并在室温下温育直至菌丝体完全覆盖琼脂表面。然后将切成楔形的宽度约2cm的来自琼脂制备物的一段菌丝体切成尽可能小的大小，然后转移到有生长培养基的管中。密封液体培养管，在室温温育，用手摇动或通过机械手段摇动(即连续摇动或连续搅拌釜反应器)约1分钟，每天至少五(5)次，以使菌丝体尽可能分解。将液体培养物温育直至视觉混浊，通常三天或更多天。然后将液体培养物用于以总生长培养基体积的10％或15％接种托盘中的生长培养基。
担子菌子实体也用于产生接种物以启动丝状生物垫。在一些情况下，可通过以下方式制备接种物：(a)对子实体进行表面灭菌，例如在5％的漂白剂溶液中灭菌；(b)用无菌培养基冲洗；(c)取决于最终用途，在无菌条件下研磨成小于5mm长的聚集体或大于5mm的聚集体，(d)对经研磨的蘑菇生物质进行表面灭菌处理，例如在5％的漂白剂溶液中灭菌，然后再次用无菌培养基冲洗。将5克经研磨的经表面灭菌的子实体生物质直接用作接种物。在其他情况下，使用源自子实体的纯培养物。在这里，将约3mm3的子实体部分放在含有0.01％氯霉素的琼脂培养基上，并在室温下温育。生长2-5天后，将菌丝转移到新鲜的琼脂+氯霉素培养基上，再培养3-7天。通过提取和纯化DNA(FastDNA Spin Kit，MP Biomedicals)，对16SrRNA序列和/或ITS区域进行测序，并使用Blast(NCBI数据库)对该序列进行系统发育分类，确认培养物的纯度。确认后，使用菌丝接种50mL无菌液体培养基，并以185rpm搅拌/旋转约5天，然后以约7.5％接种物与92.5％液体培养基的比率用作接种物。
虽然可以使用多种不同的培养基，但有些培养基不能充分适应丝状真菌生物垫的生长，例如Hansen培养基(每升＝1.0g蛋白胨、0.3g KH2PO4·7H2O、2.0g MgSO4·7H2O 5.0g的葡萄糖，C:N比率为26.9)，此时不产生完整的粘合生物垫。起极好作用的那些培养基包括MK7A、MK7-1、MK7-3(均在WO 2017/151684中进行了描述)，以及下面介绍的培养基。
麦芽培养基001(C:N比率19.1)
Figure BDA0002293114410000111
Figure BDA0002293114410000121
MK-7 SF培养基(C:N比率7.5)
成分 量 等级
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub> 7.553g ACS
尿素 2.548g USP
CaCl<sub>2</sub> 2.000g 试剂
MgSO<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O 2.000g USP
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 7.500g 试剂
痕量* 2.000mL *
甘油 0.075Kg 食物/USP
酵母提取物 1.750g 研究
FeCL<sub>2</sub>*4H<sub>2</sub>O 0.020g 试剂
DI H<sub>2</sub>O 0.940L N/A
Figure BDA0002293114410000122
补充有H4NO3的麦芽培养基001(C:N比率7.5)
成分 量 等级
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub> 5.0g ACS
Light Pilsner麦芽 40.0g 食物
蛋白胨 4.0g 研究
酵母提取物粉末 1.2g 研究
芥花油 1.0mL 食物
研磨燕麦 4.0g 食物
自来水 1000mL N/A
通过无菌取出250μl培养基并使用能够测量高达5000mOsm的渗透压的最新校准的渗透压仪(型号3250SN：17060594)采集渗透压读数。采集三次读数，并且提供以下结果：Hansen’s＝39,39,38；麦芽001＝169,168,169；MK-7SF＝1389,1386,1387；麦芽001+NH4NO3＝288,287,286。
此外，我们方法中使用的培养基可以限定所得生物垫的蛋白质含量。例如，尽管据报道，蓝平菇蘑菇子实体的天然蛋白质含量为24.65％(Stamets(2005)Int J MedicinalMushrooms 7:103-110)，按照我们的方法在麦芽001培养基上培养的蓝平菇生物垫具有29.82％的较高的经水分校正的蛋白质含量，蛋白质含量增加了5.71％。更引人注目的是，据报道，大秃马勃子实体的蛋白质含量为27.3％(Agrahar-Murugkar and Subbulakshmi(2005)Food Chem 89:599-603)，但是用我们的方法在麦芽001培养基上培养的大秃马勃生物垫具有32.04％的经水分校正的蛋白质含量，而MK7-1 SF培养基产生46.33％的经水分校正的蛋白质含量，并且麦芽001+NH4NO3培养基产生46.88％的经水分校正的蛋白质含量，基本上比Agrahar-Murugkar和Subbulakshmi报道的蛋白质含量增加19.85％。
生物垫的收获通常在生长2-3天后进行，尽管在一些情况下期望更长的生长期，例如当期望/需要更厚或更密的生物垫时。例如，可以期望3.5-4天、3-5天、4-6天、5-7天、6-9天、7-10天、19-21天或者甚至长达2个月的生长期。由于在PCT/US2017/020050和本文所述的表面发酵条件下培养的丝状生物垫的粘合结构，丝状生物垫具有足够的拉伸强度，以在生长期结束时从培养基表面基本完整地提起。表1呈现了一些测得的拉伸强度示例。
表1-一些丝状真菌生物垫的平均抗张强度
Figure BDA0002293114410000131
Figure BDA0002293114410000141
表面发酵可以在各种条件下进行，包括静态培养基条件(如PCT/US2017/020050中所述)、半静态培养基条件和连续培养基流动条件。
在半静态培养基条件下培养意味着在收获丝状真菌生物垫之前，至少更换一部分培养基。这些条件允许从第4天到第18天的线性干生物质生产(r2＝0.995)，此后生物质重量稳定于约2.5Kg干物质/m2。
生物垫也可以在连续培养基流动条件下生产，其中生物垫的生长限制于生长培养基的表面，在那里连续更新或半连续更新垫下面的培养基。
但是，在一些情况下，期望半连续地收获生长的生物垫。在这里，发生生物垫的某个部分的取出，然后将剩余部分物理移动到培养基的开放区域，其通过取出部分生物垫创建。这可以通过物理抓取生物垫并拉动它直至它接触到表面发酵容器的末端来实现，或者通过其他机械手段实现。由于培养基已经含有活的真菌细胞，所得的开放区域可用于新的生物垫生长，而没有分开或额外的接种步骤。此过程可以定期重复，这在更新培养基或重新引入已经变得有限的营养物时特别有用。
生物垫收获也可以连续完成。可以通过多种机制促进连续取出。一个此类例子是附着于生物垫的成熟端的滚轮(见图7)。滚轮缓慢转动并收获成熟的生物垫，同时在表面发酵容器的另一端创造开放的培养基，用于新生物垫的生长。典型的收获速度为1.56cm/天，尽管这可以针对具体需要或用户的期望进行更改。
在膜包囊/气密密封生物反应器条件下生长包括在合适的系统/容器中在没有气体顶部空间的情况下包囊液体生长培养基。合适的系统/容器例如是托盘、培养皿或具有相对较大的表面积与深度比的任何容器。透气膜直接放置在液体培养基的表面上，并紧紧密封到系统/容器。合适的膜包括例如聚丙烯膜(例如KC100 Kimguard，Kimberly-Clark，Roswell，GA)、聚酯膜、聚碳酸酯膜、硅树脂膜、聚酰胺膜、纤维素膜和陶瓷膜，等等。生长的生物垫层与周围大气之间的气体交换仅通过半透膜发生。
在一些情况下，UVB光(290-320nm)可以触发丝状真菌的色素产生，诸如对于尖孢镰孢菌菌株MK7，产生色素沉着的生物垫。除了可以用于创建各种食物效果的颜色变化之外，用UVB处理还可以将真菌细胞膜中存在的麦角固醇转化为维生素D2，并增加类胡萝卜素(如beta胡萝卜素和虾青素)的产生。因此，用UVB照射丝状真菌，例如尖孢镰孢菌菌株MK7可用于增加所得生物垫中的维生素D2和类胡萝卜素。
在一些情况下，形成的丝状真菌生物垫由外观均匀的细胞层构成，丝状生物垫的一个表面与空气接触，而一个表面与合成培养基接触。在其他情况下，存在至少两个不同的层：在顶表面的气生菌丝层和与合成培养基接触的致密的多细胞底层。通常出现三个不同的层：(a)顶表面的气生菌丝层，(b)致密的底层和(c)顶层和底层之间的过渡层。过渡层可以仅松散地附着到致密的底层，在那些情况下，能够使底层容易地与生物垫的剩余部分分开。过渡层的丝密度范围从比两层相遇的区域中的底层密度稍低到与生物垫顶部附近的气生菌丝相当的密度。
丝状真菌生物垫灭活
灭活过程开始于培养后至少2天收获的生物垫。尽管可以冲洗生物垫以除去过量的生长培养基，但是不需要进行生物垫冲洗，尽管在一些情况下，优选除去生长培养基或过量的生长培养基。类似地，可以挤压生物垫以除去过多的生长培养基，这同样不是必需的，但是对于一些应用可以是优选的。
在一些情况下，例如用于将生物垫用作独立的蛋白质来源或食品中的蛋白质成分时，期望消除细胞存活力和进一步的生物垫生长的潜力。这可以通过加热、照射和/或蒸煮来实现。
对于加热过程，可以根据例如WO 95/23843或英国专利号1,440,642来处理丝状真菌生物垫，或在破坏生物RNA的绝大部分而没有不利地影响生物体的蛋白质组成的温度下温育。
在照射中，将丝状真菌生物垫暴露于电离能，例如由60Co(或不经常由137C)放射性同位素产生的电离能，在低于5MeV的标称能量下运行的机器产生的X射线以及由低于标称能量10MeV运行的机器产生的加速电子。
蒸煮是使一些丝状真菌生物垫，例如由尖孢镰孢菌菌株MK7和F.venentatum产生的那些生物垫失活的优选方法，因为蒸煮也可以从生物垫构建体中除去一些特定的代谢产物，若产生那些代谢物的化。这里，将生物垫置于使生物垫排出的液体和冷凝的蒸汽可以容易从生物垫滴落下来。合适的生物垫保持系统包括多孔塑料网和多孔托盘。其他生物垫保持系统包括但不限于将生物垫固定于垂直位置的系统，例如具有夹持机构的系统，该夹持机构夹持生物垫的至少一个末端，而生物垫的剩余末端悬挂于夹持生物垫的至少两侧的所述夹和网孔系统，等等。
将生物垫置于蒸锅内，以使加热的蒸汽，例如温度高于85℃，例如95℃的蒸汽与生物垫接触。在将多个托盘置于单个蒸锅中的那些情况下，例如一个托盘在另一个托盘上，优选保护较低位置的生物垫免受较高位置的生物垫的滴落。保护的形式应允许蒸汽与生物垫接触，从而使生物垫存活力失活，并也使生物垫排出的液体和蒸锅中较高水平产生的冷凝蒸汽偏离而不与位于蒸锅中较低水平的生物垫接触。在一个实施方案中，圆锥体位于上托盘和下托盘之间以实现此结果。在其他实施方案中，上托盘和下托盘之间的分开还包括至少一种其他几何形状，例如圆柱体、立方体和/或长方体、角锥、球形、圆环面(tori)和/或其他柏拉图式立体。在又一个实施方案中，使用至少一个圆柱体、立方体和/或长方体、角锥、球形、圆环面、其他柏拉图式立体或它们的组合来分离托盘。
将生物垫至少蒸煮至降低生物垫存活力的点，使得生物垫内进一步的生物垫生长和/或细胞繁殖可忽略不计。生物垫存活力是原始底物、生物垫形成、蒸汽/传热特性、蒸锅中的生物垫位置以及生物垫相对于放出的蒸汽的方向的函数。例如，在甘油或酸乳清底物上培养的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫在蒸煮5分钟后和在一些情况下小于5分钟是非活的。可以清洗和/或挤压蒸过的垫，以除去垫排出物和冷凝的蒸汽。
灭活的食用丝状真菌生物垫可直接用作蛋白质来源，例如用于制备很大程度上与豆腐、咸肉(bacon)和肉干等等相当的食品中。
灭活的食用丝状真菌生物垫也可以大小减小的，以用作食品中的蛋白质来源。大小减小可以通过机械手段，例如切割、剁碎、切块、切碎、研磨、混合等发生，或者通过超声处理发生，并且在与其他成分或液体混合之前进行。大小减小的颗粒可以是大小均匀的或可变的。通常，大小减小的颗粒的长度在0.05-500mm之间，宽度在0.03-7mm之间，并且高度在0.03-1.0mm之间。例如，面粉型颗粒的范围通常在0.03mm至0.4mm之间，肉干型颗粒范围在100mm至500mm之间，等等。可以生产更大大小的颗粒，已经在可充气池(直径66”)中培养生物垫，产生直径66”且完全圆形的单一生物垫。较大的容器可用于培养出甚至更大的垫。
每个生物垫产生的大小减小的颗粒的数目取决于初始生物垫大小和使用生物垫大小减小的颗粒的目的。
根据食品，大小减小的颗粒含有至少0.1mm，诸如0.1mm–2.0mm、0.5mm–10cm、0.5mm–30cm、0.8mm–25cm、1.0mm–20cm、1.4mm–15cm、1.6mm–10cm、1.7mm–8cm、1.8mm–6cm、2.5mm–4cm、5mm–2cm、0.5–2.5mm、0.5–1.8mm、0.5–1.7mm、0.5–1.6mm、0.5–1.4mm、0.5–1.0mm、0.5–0.8mm、0.5–0.6mm、0.6–2.5mm、0.6–1.8mm、0.6–1.7mm、0.6–1.6mm、0.6–1.4mm、0.6–1.0mm、0.6–0.8mm、0.8–2.5mm、0.8–1.8mm、0.8–1.7mm、0.8–1.6mm、0.8–1.4mm、0.8–1.0mm、1.0–2.5mm、1.0–1.8mm、1.0–1.7mm、1.0–1.6mm、1.0–1.4mm、1.4–2.5mm、1.4–1.8mm、1.4–1.7mm、1.4–1.6mm、1.6–2.5mm、1.6–1.8mm、1.6–1.7mm、1.7–2.5mm、1.7–1.8mm、或1.8–2.5mm的平均未破碎细丝长度，以及更大的大小分布，例如0.1–1.0cm、0.5–2.0cm、1.0–5.0cm、2.0–7.0cm、5.0–10.0cm、7.0–20cm、10.0–50.0cm、和15.0–100.0cm。
丝状真菌生物垫的大小减小的颗粒也包含破碎的细丝，在一些情况下，破碎细丝主要存在，例如100％破碎的细丝，99％破碎的细丝，98％破碎的细丝，97％破碎的细丝，96％破碎的细丝，和95％破碎的细丝。同样，为最终生产的食品选择破碎的细丝的大小。平均破碎的细丝长度范围可以为至少0.01mm，诸如0.01–0.10mm、0.05–0.20mm、0.1–1.0mm、0.50–2.5mm、1.0–5.0mm、2.0–10.0mm、5.0mm–15.0mm、10.0mm–1.0cm、1.0cm–5.0cm、5.0cm–10.0cm,0.3mm–30cm、0.8mm–25cm、1.0mm–20cm、1.4mm–15cm、1.6mm–10cm、1.7mm–8cm、1.8mm–6cm、2.5mm–4cm、5mm–2cm、0.3–2.0mm、0.3–1.8mm、0.3–1.7mm、0.3–1.6mm、0.3–1.4mm、0.3–1.0mm、0.3–0.8mm、0.3–0.6mm、0.3–0.5mm、0.6–2.5mm、0.6–1.8mm、0.6–1.7mm、0.6–1.6mm、0.6–1.4mm、0.6–1.0mm、0.6–0.8mm、0.8–2.5mm、0.8–1.8mm、0.8–1.7mm、0.8–1.6mm、0.8–1.4mm、0.8–1.0mm、1.0–2.5mm、1.0–1.8mm、1.0–1.7mm、1.0–1.6mm、1.0–1.4mm、1.4–2.5mm、1.4–1.8mm、1.4–1.7mm、1.4–1.6mm、1.6–2.5mm、1.6–1.8mm、1.6–1.7mm、1.7–2.5mm、1.7–1.8mm、或1.8–2.5mm。
在一些情况下，丝状真菌生物垫的减小颗粒中的平均破碎细丝长度小于1um，例如小于950nm、小于900nm、小于850nm、小于800nm、小于750nm、小于700nm、小于650nm、小于600nm、小于550nm、小于500nm或小于400nm。
减小粒度的丝状真菌生物垫可以作为蛋白质来源添加，以增加食品的蛋白质含量，或者可以是唯一的蛋白质成分。对于完全由丝状真菌生物垫构成的食品，可以针对特定的质地、口感和咀嚼度优化大小减少的颗粒。例如，形状和调味为类似于牛肉汉堡(hamburger)的丝状真菌生物垫食物可具有90％的具有长度小于1.5mm，且大多数长度是1mm或更小，宽度小于1mm和深度小于0.75mm的颗粒。此类食物的特征是在口腔中具有较高的感知密度，更易于咀嚼，提供乳脂状的口感和更精致的食物体验。高度加工过的生物垫颗粒已与高级餐饮场所(fine dining establishment)中找到的汉堡类型进行了比较。为了获得更丰盛的食物体验，类似于汉堡餐厅或BBQ中常见的汉堡类型，90％的颗粒具有4mm-10mm的长度、1.0mm-3mm的宽度和小于0.75mm的深度。改变质地、口感和咀嚼度的能力允许定制以适应具有特殊饮食需求的个体，例如咀嚼困难的个体，或需要/期望较软食物同时仍提供相同营养和味道体验的个体或期望更具质地、更具口感和更具咀嚼感的食物的个体。由于容易控制粒度的能力，用丝状真菌生物垫提升或仅由丝状真菌生物垫制成的食物的质地与它们模仿的标准蛋白质食物非常相似，如表2中可以看出。
表2-来自Stable Micro Systems TA XT加质地分析仪的结果
Figure BDA0002293114410000181
Figure BDA0002293114410000191
Figure BDA0002293114410000201
可以在添加或不添加甜味剂的情况下仅使用丝状真菌生物垫的减少粒度产生和/或可以用生物垫的减少粒度提升的食物的例子是肉产品(诸如碎牛肉、碎鸡肉、碎火鸡肉、鸡块(chicken nugget)、鱼排或小馅饼(patties)、肉干(jerky)、零食(snacks)(例如片(chips))、汤(soups)、思慕雪(smoothies)、饮料、乳类似物、面包、意大利面(pastas)、面条(noodles)、饺子、糕点(pastries)(例如Pate a Choux)、饼干(cookies)、蛋糕、馅饼(pies)、点心(desserts)、冷冻点心、冰淇淋类似物、酸奶、甜食(confections)和糖果(candy)。
用减小粒径的丝状真菌生物垫提升的食物可显著增加蛋白质含量，这对于接受纯素饮食的个体而言特别重要。例如，用68.1g MK7液体分散体提升一杯汤(227g)(即1份MK7至3份水)增加8.5g蛋白质，和用136g MK7液体分散体提升一碗汤(340g)增加17g蛋白质。使用MK7液体分散体作为主要成分，例如素汤、饮用物、思慕雪等进一步增加这些食物的蛋白质含量。改变MK7与水比率将继而改变蛋白质增强的程度。
减小粒径的生物垫是用于提升食物的蛋白质含量还是用作唯一的蛋白质成分，在一些情况下，粘合剂有助于实现期望的质地。设想批准的食品粘合剂，例如蛋清、面筋、鹰嘴豆粉、严格素食粘合剂、竹芋淀粉(arrowroot)，明胶、果胶、瓜尔豆胶、角叉菜胶、黄原胶、乳清、鹰嘴豆水、研磨的亚麻籽、蛋替代品、面粉、奇亚籽(Chia seeds)、蚤草(psyllium)等，它们可以单独使用或组合使用。除食品粘合剂外，减小粒径的丝状真菌生物垫还可以与批准的调味剂、香料、味道增强剂、脂肪、脂肪替代品、防腐剂、甜味剂、色素添加剂、营养物、乳化剂、稳定剂、增稠剂、pH控制剂、酸化剂、膨发剂、抗结块剂、湿润剂、酵母营养物、面团增强剂、面团调节剂、固化剂、酶制剂、气体及它们的组合混合。通常，选择粘合剂、调味剂、香料等以满足特定人群的需求。例如，乳和/或乳固体不用于接待患有乳制品变态反应/敏感性的个体，小麦粉可能不用于接待谷蛋白变态反应/敏感性的个体，等等。
在一些应用中，减小粒径的丝状真菌生物垫用于模拟鸡块、火鸡肉、猪肉、鱼、汉堡、香肠、肉干、咸肉等的食品。这里，可以使用单一类型的减小粒径的丝状真菌生物垫，或多种减小粒径的。类似地，减小的粒径可以来自丝状真菌生物垫的单一来源或来自不同来源的丝状真菌生物垫的组合；例如单独的MK7或MK7+大秃马勃生物垫。
在一些应用中，将减小粒径的丝状真菌生物垫干燥，研磨成足够小的粒径，并用作生产增强型蛋白质烘焙商品的面粉，例如面包、面包卷(rolls)、松饼、蛋糕、饼干、馅饼等。
将蛋白质引入食品的一个方面是使用由丝状真菌生物垫制成的液体分散体作为乳或乳类似物的替代成分。液体分散液可用于多种食谱，包括汤、冰淇淋、酸奶、思慕雪，软糖和糖果(例如焦糖和松露)。在一些情况下，由不同原料/碳源生产的丝状真菌生物垫导致具有不同风味的液体分散体。例如，当原料/碳源是甘油时，由尖孢镰孢菌菌株MK7产生的所得液体分散体更甜，而由在酸乳清原料/碳源上培养的尖孢镰孢菌菌株MK7产生的液体分散体趋于变酸。丝状真菌，例如尖孢镰孢菌菌株MK7的天然甜味或酸味转移至最终食品。例如，酸乳清液体分散体将其自身带给酸奶，而甘油液体分散体往往将自身带给慕斯、焦糖或软糖。
可以调节丝状真菌生物垫:水比率以产生适当稠度和密度的液体分散体。比率可以为1:2至10:1，优选比率为1:3、1:4和7:3。例如，相对密度比率1:3适合于冰淇淋类似物、饮料和酸奶。
在一些情况下，丝状真菌生物垫可用作油的来源，例如从块菌属种的表面发酵食用真菌生物垫产生的松露油(truffle oil)。
过去已经利用丝状真菌作为有价值的微生物工厂，但是通常需要大量的基础设施和/或设备、能量需求、昂贵的试剂和/或大量的人力资源。丝状真菌以具有地球上所有微生物的最大代谢多样性而闻名，包括产生一大批有机酸、抗生素、酶、激素、脂质、真菌毒素、维生素、有机酸、色素和重组异源蛋白质的能力(Wiebi(2002)Myco-protein from Fusariumvenenatum:a well-established product for human consumption.Appl MicrobiolBiotechnol58,421–427；El-Enshasy(2007)Chapter 9-Filamentous Fungal Cultures–Process Characteristics,Products,and Applications.In.Bioprocessing for Value-Added Products from Renewable Resources.Editor:Shang-Tian Yang.Elsevier；Gibbset al(2000)Growth of filamentous fungi in submerged culture:problems andpossible solutions.Crit.Rev.Biotechnol.20,17–48)以及降解多种类型的顽固性材料，例如木质纤维素和土壤中的腐殖质的能力。
虽然被广泛使用，但深层发酵生产仍然面临着重大挑战，并且包括重要的因素，例如由于受限制的氧气供应和搅拌所产生的过大的剪切力而导致生长受限(Gibbs et al(2000)Growth of filamentous fungi in submerged culture:problems and possiblesolutions.Crit.Rev.Biotechnol.20,17–48)。由于在地球表面条件下水中的氧溶解度约为8mg/L，因此它在深层培养物中快速生长期间很容易耗尽。因此，需要使用复杂，昂贵且耗能大的充气和搅动系统进行连续充气以维持高生长速率。丝状真菌的培养更具挑战性，因为丝状形态赋予非牛顿流变行为，其进一步抑制了氧气向溶液中的转移(
Figure BDA0002293114410000221
etal.(2014)Filamentous Fungi Fermentation.In Industrial Scale SuspensionCulture of Living Cells,H.-P.Meyer,and D.R.Schmidhalter编(Wiley-VCH VerlagGmbH&Co.KGaA),pp.130–162)。随着培养物密度增加，对培养物进行充气和混合所需的能量的量非线性增加，而对致密培养物进行充气的能量要求也非常高。对于许多丝状物种，培养物的强烈搅动和通气对菌丝的生长变得不利，因此大大降低生长速率。丝状微生物的深层发酵面临的这些和其他挑战需要创新的解决方案，以有效在航天器和地球外站可用的有限资源的情况下利用这些生物体。
公开的气密反应器系统(1)解决了这些问题，并且具有以下优点：
-对液体培养物进行主动充气或搅拌不是必要的-将生物质原位聚集成单一具有显著拉伸强度(>0.1kg/cm的生物垫宽度)的粘合垫允许容易的收获
-有质地的生物垫可用于极其多种任务关键产品(即食品、生物塑料、生物燃料、营养补充剂)，以及作为多种药物的表达平台
-在维持高生物质产量(80-120g/m2/d或0.55g/L/h)的情况下最少的水使用以及来自过程的最小和/或无残留废水或营养物
-生长速率可以在短短2天内转化为完全成型的生物垫的生产，或者可以进一步扩展超过10天
-高生物质密度(生物垫通常为100-180g/L)
-可以生长出对不同过程具有特殊优势的多种丝状真菌(包括极端微生物)
-放大或缩小是相对简单的，并且不导致生产率下降。
-过程可以使用源自自然灾害和/或太空任务的极其多种富含C和N的废物底物。
公开的密闭反应器系统(1)提供了一种自含式的生物膜-生物垫反应器，该反应器包括容器，并将原料、真菌接种物、透气膜(2)和任选的液体营养物培养基放置在容器中。根据情况，反应器可以是一次性使用的反应器或可重复使用的反应器。
通常，容器能够被密封并且除了密封件之外还可以包括容器盖。一些容器的例子是有盖的托盘、有盖的培养皿、另一种类型的有盖的容器、或袋。对于某些用途或在某些环境中，容器具有多个生长区室，例如遵循歧管设计和/或挡板系统。为了在某些环境条件下使效率最大化，容器由一种或多种原料制成；这些可以或不可以与置于容器内的原料相同。
给原料接种真菌菌株，例如子囊菌或担子菌真菌菌株。子囊菌菌株的实例是尖孢镰孢菌菌株MK7(ATCC PTA-10698，保藏在美国典型培养物保藏中心，1081UniversityBoulevard,马纳萨斯,弗吉尼亚,美国)、Fusarium venenatum、燕麦镰孢菌和/或它们的组合。原料的接种可以在原料被放置在容器内时发生，或者可以在原料被放置后的某个时间发生。即，密闭反应器(1)可以用与原料接触后恢复的冻干丝状真菌接种物引发，或者原料可以在置于密闭反应器通道(4)中后直接接种或可以接种原料，然后置于密闭反应器通道中。
关于在反应器中使用的原料，原料可以是废物，例如天然存在的尿液和/或粪便、食物废物、植物材料、工业废物，例如甘油和废物副产物、淀粉和/或淀粉水解产物、酸乳清、糖醇和/或它们的组合。也可以使用合成或制造的废物替代物，例如替代人尿液。植物材料原料通常是木质纤维素的。木质纤维素原料的一些例子是农作物残余物(例如小麦秸秆、大麦秸秆、稻秸秆、细粮秸秆、玉米秸秆、玉米纤维(例如玉米纤维胶(CFG)、干酒糟(DDG)、玉米面筋均值(corn gluten mean，CGM)、柳枝稷、甜菜浆、来自棕榈油生产的废物流、苜蓿草、甘蔗渣、非农业生物质(例如藻类生物质、蓝细菌生物质、城市树木残渣)、森林产品和工业残留物(例如，软木第一/二级磨渣、硬木第一/二级磨渣、再生纸浆污泥)，含木质纤维素的废物(例如新闻纸，废纸，酿造谷物，废旧橡胶轮胎(URT)，城市有机废物和副产物，庭院废物及副产物、临床有机废物和副产物、以及生物燃料生产期间产生的废物(例如经加工的藻类生物质，甘油)及它们的组合。
透气膜(2)允许以图19-22中显示的几种不同的方式优化系统。尽管图中所示的气密反应器系统共有九个通道(4)，但是熟练技术人员理解，可以存在从单个通道(4)至过多通道(4)的任何数量的通道(4)，取决于密闭反应器(1)可用于放置的空间。类似地，通道(4)的形状不限于矩形棱柱或圆柱体，并且可以采取密闭反应器(1)可用的适合于配合的任何形状。
在一些情况下，如图16所示，将膜(2)置于直接与容器中存在的原料、任选的液体培养基和接种物的表面接触。也可以将膜密封以与原料的表面接触，例如，通过将其附着到具有集成橡胶垫圈的塑料框上。
在其他情况下，将膜悬浮在原料上，使得随着真菌生长和消耗氧气，膜朝着垫下落或落到位于膜和原料之间的挡板系统上，从而允许气生菌丝的生长。图19中显示了此类系统。这里，密闭反应器(1)由多个通道(4)构成，所述通道在反应器前部(7)的入口阀(6)处起始，反应器背部(5)的出口阀(8)处终止，并由挡板/壁(9)隔开。透气膜(2)形成反应器的顶部。反应器的底部(3)可以由任何合适的物质形成，包括但不限于硬塑料和软塑料两者，例如聚对苯二甲酸乙二酯、高密度聚乙烯、聚氯乙烯、聚乳酸、聚碳酸酯、丙烯酸、乙缩醛、尼龙、丙烯腈丁二烯苯乙烯、玻璃、金属如铝、钛、不锈钢等和/或它们的组合。挡板/壁(9)可以由类似的材料制成。合适的前(6)和后(8)阀包括但不限于单向阀、二向阀、球阀、蝶形阀、闸阀、旋塞阀、截止阀、夹管阀、蝶式止回阀、连接阀、分离阀和/或它们的组合。入口阀(6)用于提供进入区室(4)的通道，以将原料/培养基递送到区室，而出口阀(8)可以取出排出的原料和/或丝状真菌生物垫。透气膜(2)可以由聚合物材料构成，例如聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚吡咯烷酮、聚(酰胺基胺)树枝状聚合物复合物、乙酸纤维素、丁二烯-丙烯腈、TeflonAF2400和尼龙。虽然透气膜(2)的孔径范围通常为0.05-1.5μm，例如0.2μm、0.45μm和1.0μm，但是膜(2)可以为无菌的布样材料的形式或纸样材料的形式。对于一些用途，膜的表面质地光滑，对于其他用途，表面质地粗糙。另外，用于气体扩散的路径可以从基本直接变化到遵循更曲折的路径。
在其他情况下，膜促进氧气的进入和真菌生长期间产生的其他气体的排出(图18)。在此情况下，密闭反应器(1)具有气体收集室(14)，其紧接在透气膜(2)的顶部(见图20)。气体收集室(14)可以由与用于反应器的壁/挡板(9)或底部(3)的材料相似的材料制成；即硬和软塑料两者，例如聚对苯二甲酸乙二酯、高密度聚乙烯、聚氯乙烯、聚乳酸、聚碳酸酯、丙烯酸、乙缩醛、尼龙、丙烯腈丁二烯苯乙烯、玻璃、金属如铝、钛、不锈钢等和/或它们的组合。或者，气体收集室由通道(15)构成，该通道(15)可以反映气密反应器(1)的通道(4)，或者包括多于一个的气密反应器通道(20)(见图21)。
在其他系统中，分开的透气膜用于气体的进入和外出。图22显示了此类系统。在此种情况下，两个不同的透气膜(2、50)进料到分开的气体收集通道(30、40)中，并存在于单个反应器通道(4)上。这种类型的系统允许不同的有用气体进入、外出和/或收集和/或分离。例如，一个膜可以针对氧气通过校准，而第二膜针对二氧化碳或氢气通过或其他相关的气体系统校准。
反应器(1)产生生物膜-生物垫，其充当食物来源，例如蛋白质来源和/或油来源。然而，生物膜-生物垫还可以充当皮革类似物、生物塑料、生物燃料前体的来源、生物燃料和/或它们的组合。在其他实施方案中，生物膜-生物垫用于产生有机产物，例如有机酸、抗生素、酶、激素、脂质、真菌毒素、维生素、色素和重组异源蛋白质。
公开的生物膜-生物垫反应器发酵技术实现在标准以及极端原料和培养基，例如人废物(尿液/粪便)上生长，并且无需分离或浓缩步骤而生产高度固结且有质地的产物。无需主动通气或搅拌实现相对较高的生物质生产速率(0.55g/L/h干生物质)和较高的培养密度(100-180g/L)。垂直、水平和/或在超过两个维度上按比例放大系统是简单的，并且不导致降低的生产率。生产的生物膜-生物垫通常厚0.2至2.5cm，干物质含量为10％至30％，并且可以容易用于任务关键需求，例如肉类备选、无数其他美味食品和建筑材料。
在公开的反应器系统中培养的真菌生物膜-生物垫描述为菌膜，其在许多方面类似于在表面上培养但在气-液界面处悬浮在液体培养物中的微生物生物膜。例如，已证明生物膜内的细菌细胞承受用次氯酸钠(漂白剂)和氢氧化钠的极端消毒处理(Corcoran，2013)。公开的反应器系统利用生物膜结构，能够在苛刻的人和工业废物以及副产物上生长，所述人和工业废物以及副产物可以是在极端条件下产生的，例如在太空任务中产生的那些或由自然灾害引起的其他苛刻条件产生的那些。
公开的反应器设计并入直接位于液体表面上或刚好悬浮在液体表面上方的透气膜。包囊的反应器设计允许与外部大气进行气体交换，但经过气密密封以防止污染物进入或气体/液体逸出。包囊的反应器设计还可以通过透气膜将消耗性气体与逸出气体分离。为实现这点，在一些情况下，使用具有相同或不同特性的阀和/或其他多孔膜在一种或多种原料和任选的液体培养基的各个方面之间形成不同的层。
已经使用多种透气膜材料证明了使用公开的反应器设计的快速生物膜-生物垫生长。图17显示了在反应器中培养的约7mm厚的生物垫，其中容器是覆盖有聚丙烯膜的培养皿，该膜直接置于原料/液体培养基表面上。最初的生物膜是通过直接附着于膜形成的，并随时间向下生长到液体培养基中(见图16)。到5天的生长期结束时，基本上所有的原料/液体培养基都被消耗掉，并且致密的生物质完全充满膜下的体积。
产生的生物垫仅温和粘附于膜，并且通过简单地将生物垫从膜上剥离而容易收获(见图17A-D)。用聚碳酸酯膜的其他实验产生相似的结果(数据未显示)。因此，总反应器体积可以有效地用于生产致密的、易于收获的生物质。
在公开的反应器中通常产生的生物膜-生物垫是固结的(110-180g/L)，并且取决于真菌和生长条件，表现出纤维质地。纤维性生物质的生产对于一些任务关键产品至关重要，例如需要质地以模拟肉的食品以及模拟皮革和木材的纤维性材料。生物质的固结性质还实现易于收获而无需浓缩步骤(例如，离心，过滤)。
在零重力中使用生物膜-生物垫反应器
控制公开的反应器中生物膜-生物垫的形成和生长的主要物理力是对膜的附着。不受理论的束缚，认为在公开的反应器中的生长将不受空间飞行期间经历的零重力条件的影响。重力驱动的定向生长或通过物理混合或流动控制的生长不是系统中的首要因素，如在重力环境中往往如此。先前在太空中进行的实验成功地证明了真菌的生长，欧洲航天局，第25-28号探险，太空中有色真菌的生长和生存(CFS-A)，为所公开的反应器系统将在空间环境中发挥功能提供了更多的信心。
为了太空任务和易于部署，可将冷冻干燥的接种物和支持在特定原料上生长的必要成分(若需要的话)预加载在反应器中。然后，宇航员和太空旅行者可以准备原料、接种物和任何培养基成分。温育时间取决于原料、微生物的菌株以及其他生长参数，例如pH、温度和含水量。温育条件是简单的，因为发酵是在静态条件下进行的，在该条件下仅允许反应器就地温育。可以通过简单打开反应器密封物(例如
Figure BDA0002293114410000271
型)并取出垫收获致密的固结生物垫。
实施例
实施例1：静态托盘反应器中菌株尖孢镰孢菌菌株MK7和其他真菌的生长。
在浅静态托盘反应器中培养丝状嗜酸尖孢镰孢菌菌株MK 7、灵芝(图1A)、糙皮侧耳(珍珠平菇，图1B：和蓝平菇，图1C)、绣球菌(花椰菜；图1D)、榆蘑(图1E)；大秃马勃(图1F)和Fusarium venenatum生物垫，如PCT/US2017/020050中所述。
实施例2.在每天更换的营养物培养基上尖孢镰孢菌MK7生物垫的生长(半静态条件)。
在21天中在每天更换的营养物培养基中培养约3cm厚的致密的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫。使用在12.7x 17.8cm
Figure BDA0002293114410000272
玻璃托盘中含有pH 3.0的7.5％甘油的无菌MK7-1液体培养基(在PCT/US2017/020050中描述)生成生物垫。为了开始实验，如先前在PCT/US2017/020050中所述，在指数增长后期，用5％(体积/体积)的尖孢镰孢菌菌株MK7培养物接种200mL的营养物培养基。将200mL接种的培养基添加到三个无菌托盘的每个，所述托盘以无菌粗尼龙网筛为衬里。将培养物在室温(约22℃)不受干扰地温育4天，以形成在液体表面处形成的初始生物垫层。生长4天后，使用尼龙网筛将生物垫轻轻地从托盘中提出，并以45度角倾斜，以使液体从垫中排出。使生物垫在该位置中排干，直到每五秒滴出少于1滴液体。约3分钟后，平均发生足够的排干。将在其筛中滴干的生物垫放在含有200mL新鲜MK7-甘油培养基(在PCT/US2017/020050中描述)的新鲜预先称重的12.7x 17.8cm
Figure BDA0002293114410000273
托盘中。重新称重带有生物垫的托盘。将生物垫移动到另一个含有新鲜培养基的托盘的过程约每天重复再进行17天。在第12天、第15天和第21天对生物垫之一进行取样，并测定这些生物垫的含水量。生物垫的平均含水量为17.3％(标准差＝0.7)，并且该值用于计算实验持续时间内干生物质产量。从第4天到第18天，干生物质产量呈线性(r2＝0.995)，此后生物质重量稳定在约2.5Kg干/m2(图1，相对于每m2标准化的y轴，生长通常在第0天和第4天之间呈指数)。在此线性增长时间段内的平均生长率为6.04g/m2/h。图2显示了使用此方法在总共生长21天后形成的约3cm厚的生物垫。
实施例3.在连续流动条件下生物垫的生长。
制作连续流生物反应器系统，以证明生物垫在流动液体培养基表面上的生长。系统由2.44m长的透明塑料覆盖板制成，具有一系列用作流动通道的波纹(图3)。每个通道的末端都用硅(100％硅树脂，DAP Products Inc.,Baltimore,MD)拦起，使液体能够保留在通道内。通过经由蠕动泵将液体培养基递送到通道的一端来促进通过通道的流动，液体通过通道底部的孔离开通道的另一端。整个塑料覆盖板系统以每1m运行1厘米上升的角度倾斜，以使约500mL的液体能够保留在每个通道中，并且恒定流是液体量和倾斜角度的函数。
将板系统进行消毒，并且用
Figure BDA0002293114410000281
样塑料膜包裹起来以使系统与周围的室环境隔离。以400mL/min的速率在塑料膜下泵送无菌空气，在系统上创建正压。为了在开始流动之前启动生物垫的形成，每个通道添加500mL体积的用期望丝状真菌接种的营养物培养基，并且允许在静止/静态条件下温育4天。4天后，蠕动泵以400mL/d的连续脉冲流递送以给生物膜“补料”(以2.016mL/min开启49分钟39秒；关闭5小时10分钟21秒)。进行两个独立的实验，每个实验使用两个分开的流动通道作为重复(图3)。
在营养物培养基上生长10天后(在静止/静态条件下4天，然后在连续流动下6天；图4)收获固结的生物垫。对于重复流动通道，所产生的生物质的平均干重为2.38g的平均值。在连续流动期期间(第4天到第10天)，生长中的生物垫从流动液体培养基中的C和N的平均除去速率分别为11.9和1.2mg/L/h。通过使用Costech总C和N分析仪(ECS 4010，CostechAnalytical Technologies，Valencia，CA)测量液体体积以及生物反应器系统的总C和N输入和输出来确定从液体培养基中的C和N除去速率。因此，连续流系统支持表面处的生物垫生长。实验还充当尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫生长的连续补料和固结生物垫生成的实验室规模演示。应当注意的是，用此种类型的系统可以实现其他原料、流速和所得的生长速率。例如，凭借pH 2.8的MK7-1培养基中的10％的甘油(PCT/US2017/020050中所述)，预期产率是每m2每天大于40克干生物质。
实施例4.尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫的半连续和连续生产。
在19天的时段内半连续培养并收获致密的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫。使用酸乳清作为原料/碳源产生生物垫，所述原料/碳源补充有1/2强度MK7-1培养基盐(在PCT/US2017/020050中描述)，调整至pH 4.0。为了启动实验，将200mL接种有指数生长期后期的尖孢镰孢菌菌株MK7菌株(5％体积/体积)的营养物培养基添加到经灭菌的12.7x 17.8cm
Figure BDA0002293114410000291
玻璃托盘中，所述托盘然后用
Figure BDA0002293114410000292
膜覆盖，并在室温温育。生长5天后，通过切割并取出5.9x 12.7cm的生物垫切片来取出来自托盘一端的1/3生物垫(图5A)。然后，将剩余的2/3生物垫物理移动到培养基的开放区域，该区域是通过取出生物垫的1/3部分创建的。如下转移生物垫：通过用无菌的带手套的指物理抓取它，并拉动生物垫，直到其接触托盘的末端以开放培养基，在托盘的另一端没有形成的生物垫(图5B)。定期重复以下过程：收获生物垫的最成熟部分的1/3部分，然后将剩余的2/3生物垫移到开放区域。每4天从托盘中无菌取出50mL培养基，并用50mL新鲜无菌培养基(具有1/2强度MK7-1的酸乳清)替换，以补充通过取出生物垫而从液体培养基中除去的营养物。在第5天到第19天之间，使用此方法的干生物质产量产生0.57g/天/托盘或25.2g/d/m2(图6)。因此，证明了半连续生产系统，由此以1.56cm/天的平均速率收获生物垫的最成熟端，并且在托盘另一端的培养基的开放区域开始新鲜的生物垫生长。
系统还适合于生物垫的连续收获和生长，由此通过附着于生物垫的成熟端的滚轮促进连续取出(图7)。滚轮缓慢转动并收获成熟的生物垫，同时在托盘的另一端创建用于新生物垫生长的开放培养基。滚轮以1.56cm/天的速率转动并收获生物垫，以重现上述的半连续系统。期望以通过生物垫除去营养物的速率来补充液体培养基中的营养物。
实施例5.膜包囊的生物反应器。
在液体生长培养基中培养致密的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫，该培养基包囊在没有气体顶部空间的生物反应器系统中。将无菌培养皿底部(直径55mm)用57mL接种有MK7-1的含有8％甘油的培养基(在PCT/US2017/020050中描述)填充至边缘。将聚丙烯和聚碳酸酯的透气/半透膜直接放在液体培养基的表面上，并用橡皮筋紧密密封。生长期开始时没有提供气体顶部空间。
接种培养基并密封膜后，允许生物反应器在不受干扰的情况下静置直至收获。图8显示了尖孢镰孢菌菌株MK7的约5mm和约1mm厚的生物膜，它们分别在五天内直接在聚丙烯(图17A-C)和聚碳酸酯(图17D)膜下面生长。生物垫温和粘附于膜，并且通过简单地将生物垫从膜上剥离容易地收获(图17)。
实施例6：通过用UVB照射尖孢镰孢菌MK7生物垫产生色素和维生素D2
使用UVB光(290-320nm)触发由尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫的色素产生。用UVB光照射在7.5％甘油MK7-1培养基(在PCT/US2017/020050中描述)上在3天内产生的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫达4小时时间段。UVB光从放置在生物垫上方10cm的50W灯泡(SlimlineDesert 50 UVB T8荧光灯泡，46cm；Zilla，Franklin，WI)发出。照射0.5小时后视觉检测橙色色素沉着，并且照射4小时后是明显的(图9)。此外，尚未暴露于UVB光的生物垫具有小于50IU/100g生物垫的维生素D2含量，而在UVB光暴露约12小时后，维生素D2含量增加至约120万IU/100g生物垫。
实施例7：在甘油、淀粉和玉米浆的混合物上培养的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫
从甘油、淀粉、玉米浆和MK7-1盐(在PCT/US2017/020050中描述)的混合物在短短4天内生产尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫。甘油购自Duda Energy LLC(Decatur,AL；99.7％纯度；USP级；Lot#466135376340)；Argo Food Companies,Inc(Memphis,TN)生产的100％Argo玉米淀粉购自Bozeman,MT的Albertson超市，而玉米浆则购自Santa Cruz Biotechnology,Inc.(Dallas,TX；Lot#B0116)。生长培养基是7.5％甘油(重量/重量)、2.5％淀粉和2.5％玉米浆与MK7-1盐的混合物。通过添加适量的HCl将混合物调节至pH 3.3，并在合适的容器中煮沸15分钟。冷却至室温后，将混合物的pH重新调节至3.3，然后用如PCT/US2017/020050中制备的5％尖孢镰孢菌菌株MK7接种物(vol/vol)接种。将1.5L接种培养基的等分试样添加到三个经过消毒的0.25m2聚丙烯托盘中，放置在已完全用铝箔覆盖以创建黑暗条件的经过消毒的托盘架系统中，并在23°±1℃温育。在培养基表面生长的丝状真菌生物垫在4天后通过简单地将生物垫从托盘上提起而收获。
三个托盘中残留液体的平均最终pH为4.45(标准差＝0.14)。在随机位置从每个生物垫中切出三个56.7cm2的圆形部分并取出，并将这些部分在50℃干燥48小时以获得干重。平均生物质干重(标准差)为124.6g/0.25m2(43.4)或498.4g/m2(173.6)。湿生物垫的平均厚度为7.5mm，并且以干重计的平均密度为0.66g/cm3。
为了暴露生物垫细丝并通过场发射扫描电子显微术(FE-SEM)进行检查，通过用乙醇清洗来除去细丝之间的胞外聚合物物质(EPS)。为了实现这点，在收获前立即用剃须刀片切下1cm2的部分(1cm x 1cm)的生物垫，并将切下的部分如下进行乙醇清洗/脱水系列：在40mL乙醇混合物中序贯浸没样品达记录的时间：25％乙醇，75％去离子H2O达20分钟；50％乙醇，50％去离子H2O达20分钟；75％乙醇，25％去离子H2O达20分钟；95％乙醇，5％去离子H2O达20分钟；100％乙醇，0％去离子H2O达60分钟。再将100％乙醇处理重复2次，然后将样品存储在100％乙醇中。
为保留FE-SEM的生物垫的微观结构完整性，乙醇清洗/脱水继之以临界点干燥，其按照制造商的说明(Tousimis Samdri-795操作手册；Tousimis,Rockville,MD)，使用Tousimis Samdri-795临界点干燥机进行。临界点干燥后，将样品直接安装到铝制短管上或在安装前用剃须刀片切成<0.3mm厚的切片。然后，将样品用铱(20μm,EMITECH K575X,Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA)包被，并用JEOL 6100 FE-SEM用1keV的入射光束能量(JEOL USA,Inc.,Peabody,MA)进行检查。
FE-SEM成像揭示了交织的菌丝细丝的复杂网络(图10)，与如PCT/US2017/020050中报告的通过光学显微术对在甘油上培养的生物垫揭示的结构非常相似。观察到三个不同的层：(a)顶表面的气生菌丝层，(b)致密的底层，和(c)顶层和底层之间的过渡层。过渡层仅松散地附着于致密的底层，因此可以容易地将底层与其他生物垫分离。过渡层的细丝密度范围从比两层相遇区域的底层密度稍低到与生物垫顶部附近的气生菌丝相当的密度。
还通过按照以下所示的顺序和时间缓慢浸入以下溶液中制备切下的样品用于光学显微术：
二甲苯，3min；二甲苯，3min；100％乙醇，3min；100％乙醇，3min；95％乙醇，3min；95％乙醇，3min；70％乙醇，3min；去离子水，3min；苏木素1，1.5min；运行自来水漂洗，1min；澄清剂溶液，1min；运行自来水漂洗，1min；发蓝溶液，1min；运行自来水漂洗，1min；70％乙醇，30次浸入；95％乙醇，30次浸入；95％乙醇，30次浸入；100％乙醇，30次浸入；100％乙醇，30次浸入；100％乙醇，30次浸入；二甲苯，30次浸入；二甲苯，30次浸入；二甲苯，30次浸入；施加盖玻片。
上述程序继之以用光学显微镜(B400B,Amscope,Irvine,CA)以100倍放大倍数显现(图11)。
用剃须刀片从新鲜的生物垫切下约2cm2大小的生物垫切片，之后立即收获。然后将这些切片浸入50mL锥形底部离心管中的35mL去离子水中。将管超声处理(CP200TUltrasonic Cleaner,Crest Ultrasonics,Ewing,NJ)0、40、90或150秒，以将细丝分散到液体中并进行显微镜观察。将来自这些管的液体等分试样(约100uL)放在载玻片上，盖上盖玻片，然后用光学显微镜(B400B，Amscope，Irvine，CA)以100倍放大倍数观察。测量未破碎细丝的平均长度(标准差)，并且对于0、40、90和160秒的超声处理，测定分别为1.1(0.6)、1.2(0.4)、1.0(0.4)和1.2(0.2)mm。在每种处理中观察到的最大细丝长度分别为2.5、1.4、1.8和1.4mm。与平均长度小于0.02mm的浸没式摇瓶培养物中的尖孢镰孢菌菌株MK7的生长相比，这些细丝的长度明显更长。
实施例8：使用在甘油、淀粉和玉米浆的混合物上培养的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫生产鸡块
使用如上所述生产的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫来产生鸡块。将湿的生物垫在97℃的锅蒸锅中蒸0.5小时，冷却至室温，并用作生产鸡块的基础。将蒸过的湿生物垫(200g)切成小于0.5mm长的碎片，并用4％(重量/重量；8g)鸡基础和4％蛋清蛋白(8g)同质化，所得混合物包含超过90％的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫。将此生物垫混合物的部分(约30g)形成块形状，并在锅蒸锅中蒸煮。通过在蛋清上包被，然后与粘附于表面的面包屑混合，然后油炸，以使制成的块成为面包。制备的块表现出鸡肉样质地(图13A)，并散发出典型的鸡肉香气。由5个人进行的味觉测试认为，就口味和质地而言，块紧密模拟含有实际鸡肉的鸡块。
实施例9：尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫提取物的生产。
从尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫中产生高浓缩且粘合的提取物。如前所述，将培养4至16天后收获的生物垫冲洗和蒸煮，在多孔的塑料网上滴干5分钟，然后置于塑料袋中并密封。在将剩余培养基液体的pH调节至pH 4-6后将密封袋在-20℃或-80℃冷冻24小时，之后60℃培养箱中在原始密封袋中温育48小时。热处理后，将生物垫压过孔径<1.5mm的滤器，并收集所得液体。将收集的液体在无反应性的容器中煮沸10分钟，然后在60℃干燥直至水分含有约6-8％，形成粘的糊状提取物。提取物的营养价值类似于经蒸煮的生物垫的营养价值和由经蒸煮的生物垫制成的粉状物。
实施例10.从在酸乳清上培养的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫生产酸奶。
直接使用尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫生产酸奶。在托盘上在作为希腊酸奶生产副产物生成的酸性乳清原料/碳源上培养生物垫，在6天后收获，并在收获后20分钟内蒸煮。将200g冷却的，湿的生物质与600g饮用质量的自来水混合在一起，制成乳状的悬浮液，称为“MK7液体分散体”。MK7液体分散体单独或与牛奶组合用作成分以产生酸奶。
制备了三种混合物，它们含有不同比率的MK7液体分散体与全脂奶：1)25％MK7液体分散体:75％全脂奶，2)50％MK7液体分散体:50％全脂奶，和3)100％MK7液体分散体。通过将每种混合物加热至83℃，并在恒定搅拌的情况下于该温度保持14分钟，将混合物用于制备三批酸奶。允许混合物冷却至43℃，然后添加活酸奶培养物作为接种物。将所得混合物在酸奶机(YM80型；EuroCuisine,Los Angeles,CA)中于44℃温育8小时。所有所得混合物均具有酸奶的外观和质地(图14)，以及与典型酸奶相似的气味和味道。
实施例11：在甘油上蘑菇生物垫的生长。
使用甘油作为主要碳源(原料)，在短短10天内生产出由Baby Bella Brown褐菇(双孢子蘑菇)和白蘑菇(White Mushrooms)构成的生物质生物垫。这些常见的食用蘑菇购自Bozeman,MT的Albertson超市，并于4℃贮存。用于培养蘑菇的培养基由1L的7.5％甘油与MK7-1盐组成(在PCT/US2017/020050中描述)，其煮沸10分钟，然后冷却至室温(约23℃)。将混合物的pH调节至2.7，并将200mL的经pH调节的混合物倒入两个无菌的12.7x 17.8cm
Figure BDA0002293114410000341
托盘中。接种物由5g混合的、经表面灭菌的褐菇或白菇组成，将其添加到每个托盘的培养基中。蘑菇接种物如下制备：1)将10g湿的褐菇或白菇添加到200mL的5％漂白剂溶液，并将悬浮液搅拌2分钟以对蘑菇进行表面消毒，2)然后通过转移到200mL无菌甘油/MK7-1盐培养基(在PCT/US2017/020050中描述)并搅拌2分钟将蘑菇冲洗，3)将经表面消毒的蘑菇在通过用70％乙醇漂洗消毒的咖啡研磨机中混合30秒，4)通过用经研磨的生物质重复步骤1和2再次对经研磨的蘑菇生物质(<5mm长的聚集体)进行表面灭菌，5)将5克经研磨的蘑菇生物质添加到
Figure BDA0002293114410000342
托盘中的液体培养基中(添加蘑菇后，最终pH＝4.0-4.1)，并且6)将托盘覆盖，并允许在黑暗中于室温(22±2℃)温育。
温育3天后，观察到生物垫在培养基表面上形成，并且生长10天后收获固结的生物垫。褐菇的生物垫覆盖托盘中液体培养基的整个表面，而白菇的生物垫生长以五个浮动生物垫岛覆盖约1/2液体培养基。褐菇的生物垫平均厚度为1.5mm，并且白菇的生物垫平均厚度为1.7mm。生物质生物垫在50℃干燥48小时，并且对于褐菇和白菇每个托盘产生的干重分别为1.14g和2.12g。干生物质生物垫的干重密度分别为褐菇和白菇的0.033和0.111g/cm3。
显微镜图像揭示了生物垫的菌丝体性质。褐菇和白菇生物垫的平均菌丝厚度分别为25.2μm(标准差＝6.2)和18.7μm(4.0)。
使用生产的褐菇生物垫产生鸡块。将生物垫在97℃蒸煮0.5小时，冷却至室温，并用作生产鸡块的基础。将经蒸煮的湿生物质(2.5g)与3％(重量/重量；75mg)Better ThanBouillon鸡基础(Southeastern Mills,Inc.Rome,GA)和3％蛋清蛋白(Eggwhite Protein)(75mg；Now Foods,Bloomingdale,IL)混合，然后用剃须刀片切成少于2mm长的碎片。将混合物形成块，并蒸煮0.5小时。制备的块提供了典型的鸡肉香气，带有轻微的蘑菇香气。在品尝时，块具有鸡肉风味至中性风味。
实施例12.在麦芽和甘油培养基上蘑菇生物垫的生长。
使用麦芽提取物培养基001、甘油培养基002、Hansen培养基、MK7-SF培养基、麦芽提取物+NH4NO3培养基003(表3)，在短短5天内生产生物质生物垫，其包括大秃马勃、刺芹侧耳(珍珠平菇)、糙皮侧耳columbinus变种(蓝平菇)、榆蘑、绣球菌(花椰菜)和灵芝。所有最终培养基均包含0.01％的氯霉素。
表3.添加到去离子水或饮用质量的自来水以制备营养物培养基的成分。
Figure BDA0002293114410000351
Figure BDA0002293114410000352
Figure BDA0002293114410000353
Figure BDA0002293114410000361
Figure BDA0002293114410000362
Figure BDA0002293114410000371
Figure BDA0002293114410000372
使用表3中的上述配方，根据期望培养基的体积，通过将规定的成分混合到特定体积的水中，在2升
Figure BDA0002293114410000373
瓶或8升不锈钢锅中制备培养基。将成分添加到水中，期间用搅拌棒或汤匙连续搅拌液体。在添加下一个组分之前，将培养基的每种组分彻底混合到液体中，将MK7-SF培养基的pH值调节到5.0，并对该溶液进行高压灭菌。其他所有pH值源自简单地混合成分。将培养基和容器在20psi和121℃下高压灭菌至少20分钟。液体的渗透压使用Advanced Instruments,Inc.渗透计3250型(Two Technology Way,Norwood,MA)测量。
高压灭菌后，使培养基冷却至室温，并用表4所示的蘑菇物种接种各个容器。
表4。蘑菇孢子(10cc注射器)购自MycoDirect(12172Route 47,Ste 199 Huntley,Il 60142)，并于8/2/2018收到。榆蘑孢子购自Everything Mushrooms(1004 Sevier AveKnoxville,TN 37920)，并且于8/3/2018收到。
批次 公司生产日期
蓝平菇 3-P7 2-2018
珍珠平菇 9P8 12-2017
大秃马勃 N/A 3-2018
花椰菜蘑菇 N/A 4-2018
榆蘑(1cc干的) N/A 10-2017
使用无菌技术应用以下方法进行生长培养基的接种。这些实验中的所有无菌工作均在II级生物安全柜中进行。使用孢子注射器直接在之前高压灭菌的12.7x 17.8cm
Figure BDA0002293114410000381
玻璃托盘中接种约75mL生长培养基。这通过将液体培养基无菌转移到高压灭菌的
Figure BDA0002293114410000382
托盘中并用2cc孢子注射器中的悬浮液接种来完成。托盘用无菌铝箔覆盖，然后轻轻旋转以混合接种的培养基。
通过高压灭菌MEA无菌制备麦芽提取物琼脂(MEA；表5)板，允许冷却至50℃，并将约25mL倒入100x 15mm无菌培养皿中。
表5.用于制备麦芽提取物琼脂的成分
Figure BDA0002293114410000383
通过将来自孢子注射器内包含的悬浮液的1cc液体等分取样到板上来接种MEA板。然后将琼脂板用
Figure BDA0002293114410000384
密封，并在室温下放入干净的深色抽屉中。
在菌丝体覆盖了MEA板的整个表面后，将它们用于在2L带挡板的摇瓶中接种1.5L培养基。用无菌剃刀刀片从板中切下具有菌丝体的琼脂培养基的约2cm2部分，并用无菌剃刀刀片切成约2mm2的部分，然后将其加入到含有1.5L麦芽提取物001培养基的两个烧瓶中。将培养基在室温(23±1℃)下温育3天，用手间歇摇动(用手将烧瓶剧烈摇动1分钟，每天最少摇动5次)。
然后，将摇瓶中的培养物用作6L麦芽提取物培养基001和6L麦芽提取物+NH4NO3003培养基的接种物。用15％(vol:vol)接种培养物接种培养基，并充分混合。将2升接种的培养基倒入三个0.25m2塑料托盘的每个中，所述托盘放置在托盘架中。将架用
Figure BDA0002293114410000391
包裹，并允许温育6天。相对致密的生物垫在4天内覆盖整个表面，并且在6天后收获生物垫。
通过将生物垫从托盘中提起并用手轻轻挤压收获来自12.7x 17.8cm
Figure BDA0002293114410000392
玻璃托盘和0.25m2塑料托盘的生物垫。在设置在厨房烤箱燃烧器上的锅蒸锅中，将部分生物垫(3-50g)在沸水(水面以上约5cm)上蒸煮20分钟。蒸煮后，允许生物质冷却至室温，并且立即在
Figure BDA0002293114410000393
袋中装袋，并送至Eurofins(Des Moines,IA)进行蛋白质分析(燃烧法测定N，测试代码QD252)。
表6.来自在各种类型的培养基中托盘中的一系列大秃马勃生长的结果
Figure BDA0002293114410000401
实施例13.尖孢镰孢菌菌株MK7鸡块
鸡肉风味的尖孢镰孢菌菌株MK7是许多食谱的基本成分，包括带或不带面包屑的鸡块、亚洲菜鸡肉或其他鸡肉菜作为鸡肉替代品。从不同的原料/碳源生产的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫导致鸡肉风味略有不同。甘油鸡肉更甜，而酸性乳清鸡肉往往更酸一点。
食物加工量和所使用的刀片(即锋利的金属刀片、钝的金属刀片、塑料刀片)导致不同的鸡块质地。此外，可以从极其多种生物质大小产生可接受的鸡块。也就是说，可以用刀切割生物质，进行轻度食品加工或高度食物加工，并且仍然导致可接受的鸡肉类似物。
使用尖孢镰孢菌菌株MK7:鸡汤:粘合剂(binder)的50–20:1:1比率，具有或没有约66.6％尖孢镰孢菌菌株MK7:脂肪比率。合适的脂肪包括鸭脂肪、椰子油和可可脂。混合后，将混合物蒸煮约30分钟以固化粘合剂；但是，一些粘合剂可能需要更多或更少的时间。然后可以添加额外的面包屑，并且所得到的块如此类食品典型的那样加工。
实施例14：早餐香肠和/或热狗和/或汉堡
根据需要将适当的香料混合物添加至大小减小的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫，以形成期望的风味，其可以介于10重量％香料混合物对尖孢镰孢菌菌株MK7的量直至20％之间，通常比率为10尖孢镰孢菌菌株MK7:1香料混合物，具有或没有其他成分，例如洋葱、粘合剂和脂肪如可可脂。然后将混合物油炸以除去适量的水分。然后，在成型为期望形状并烹调之前，可以添加其他成分，例如蒸谷麦(bulgur)、蔬菜汤、土豆等。
实施例15：冰淇淋和慕斯
产生约1:3尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫:水的比率，其具有含有小于900微米的平均细丝长度的粒径。将此混合物逐渐加热直到不再有真菌味，然后与腰果以约4:1比率使用，任选地与适量的黄原胶和/或调味品一起使用，以生成混合物，该混合物可以任选加热，然后冷却以形成慕斯。对于冷冻点心，然后将混合物放入冰淇淋搅拌器中，并且搅拌后冷冻形成不可融化的冷冻点心(图14)。
实施例16：从松露生物垫生产松露油。
可以从如上所述培养的松露(块菌)生物垫制备油提取物。在一种情况下，使用麦芽提取物、葡萄糖和蛋白胨作为主要碳源(原料)，在短短7天中在托盘中培养松露生物垫。食用松露蘑菇购自Amazon Marketplace的IGB Trading LLC，并在4℃贮存。通过将约3mm3的松露部分(用无菌剃刀刀片切割)放在麦芽提取物琼脂+0.01％氯霉素(用于抑制细菌生长)上从购买的松露中制备块菌真菌的纯培养物。如下制备麦芽提取物琼脂：在1L去离子水中混合20g麦芽提取物、20g葡萄糖、1g蛋白胨和20g琼脂，然后高压灭菌30分钟，并且冷却至50℃，然后添加0.01％氯霉素。然后将无菌混合物倒入9cm直径的培养皿中，并且允许冷却并固化。
观察到真菌在3天后在托盘上生长。生长4天后，用无菌微生物环挑选菌丝，并在新的一组麦芽提取物琼脂+氯霉素板上划线。允许真菌在所述板上生长5天，然后用微生物环挑出菌丝，并用于通过DNA测序确认培养物纯度。通过提取和纯化DNA(FastDNA Spin Kit，MP Biomedicals)并测序宏基因组的ITS区域，然后使用Blast(NCBI数据库)对该序列进行系统发育分类来完成确认。
通过在1L去离子水中混合20g麦芽提取物、20g葡萄糖和1g蛋白胨来制备麦芽提取物肉汤并灭菌。也使用用微生物环得到的菌丝刮物在用无菌纱布材料加帽的无菌带挡板摇瓶中接种50mL无菌麦芽提取物肉汤。使用无菌纱布，因为它允许气体进出摇瓶的交换。然后，将摇瓶以185rpm旋转5天。然后，使用旋转培养物在无菌的12.7x 17.8cm
Figure BDA0002293114410000421
玻璃托盘中接种350mL的无菌麦芽提取物肉汤。此培养基的接种物密度为7.5％接种物至92.5％肉汤。在托盘中生长7天后，通过从液体培养基中提起生物垫来收获表面上形成的丝状生物垫。将收获的生物垫在40℃干燥48小时。尽管可以使用其他提取方法，但可以通过机械压榨或使用己烷的溶剂提取法从这些收获的生物垫中提取脂质/油。也可以使用Yuval将发送的另一种提取方法。
实施例17：MK7面粉。
使用如上所述生产的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫来创建在粒度和粒度分布上与标准烘焙面粉相似的干粉末。在这里，在97℃的锅蒸锅中将湿的生物垫蒸煮0.5小时，冷却至室温，并在Cuisinart脱水器(DHR-20型)中脱水2–8小时，平均脱水时间为4小时。脱水时间是加载到脱水器中的生物质数量、影响脱水器中的空气流动的脱水器中生物垫的分布和生物垫的含水量(平均含水量约为75％)和室温的函数。脱水后的含水量在4％至14％之间变化，脱水后的平均含水量低于12％。使用咖啡研磨机(KRUPS，电咖啡和香料研磨机，不锈钢刀片F2034251)将脱水的生物质减小大小，直至将其细磨。经研磨的生物垫面粉的平均粒径为75微米至120微米。小分数的较大颗粒(约5wt％)具有大于180微米的粒径。小分数的较小颗粒(约5wt％)具有小于75微米的粒度。所述较小的颗粒的大小使得较小的颗粒能够长时间段保持在空气中传播。通过在具有180μm、120μm和75μm开口的筛中提起100克大小减小的生物垫样品测定粒径。由于较高的含水量可以导致干燥且磨碎的生物质团集，优选低于6％的脱水后和大小减小后的含水量。
然后，使用生物垫面粉作为其他标准面粉(King Arthur面粉、Bob’s Red磨面粉(Mill Flour)和Bob’s Red磨小麦面粉)的添加，并制备多种烘焙食品。以5wt％、10wt％、20wt％和30wt％加载生物垫面粉，对最终烘焙的良好味道、发面(rising)、质地、外观或气味没有有害影响。展示的产品包括面包(7种谷物，white&wheat)、糕点(Pate a Choux)、饼干、意大利面和饺子。所得产品在味道测试中表现良好，并且品尝产品的人均无法检测到MK7面粉的纳入。
实施例18：MK7填充剂
使用如上所述生产的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫创建生物质颗粒，所述颗粒作为填充剂用作肉类和鱼类的添加(即，通过将MK7添加到其他出口食品增加总食品量)。将湿的生物垫在锅蒸锅中于97℃蒸煮0.5小时，冷却至室温。对生物垫进行大小减小(即，用刀切碎或在食品加工器中进行食品加工)至期望的粒度分布。然后，将大小减小的生物质添加到不同的食品中，以增加肉(在肉填充剂的情况下)或鱼(在鱼填充剂的情况下)的量。作为肉填充剂的一个例子，向牛肉汉堡肉添加大小减小的生物质的10％、20％、30％、40％和50％添加。以许多不同的大小分布评估生物质的大小减小。较小的粒度往往产生较稠密且较为乳脂状的质地。较大的颗粒往往产生更具质地、更具口感并且在吞咽前需要更多咀嚼的产品。然后，对有填充剂的肉加工成就像未添加生物质一样。在牛肉汉堡填充的情况下，可以任选地添加香料或粘合剂，并将有填充剂的肉形成肉饼或肉丸，并烹调脂质将肉烹调至消费者期望的温度。烹调方法包括炉顶、烤箱、油炸和烤架。味道测试显示了在所有加载水平和添加的生物质的所有大小分布下产生可接受的食品。也在类似的加载水平尝试鸡肉和猪肉填充，具有类似的烹调和品尝结果。
还以10％、20％、30％和40％加载演示鱼填充剂。通过添加多种不同大小分布的经加工的MK7产生鱼片和鱼丸，所述大小分布范围为小颗粒(小于1.0mm)至大颗粒(大于2mm)，对味道、颜色、气味或全部饮食体验没有有害影响。在小粒径添加的情况下，所得食品具有较为乳脂状的质地。在大粒径添加的情况下，所得食品具有较硬的质地，其以在吞咽之前需要更多咀嚼的较大颗粒为特征。味道测试显示了在所有测试的加载和大小分布水平下生产可接受的食品。
实施例19：MK7肉干
使用如上所述生产的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫来创建真菌肉干(mycojerky)，在外观和味道上类似于肉干(例如牛肉干、水牛肉干、猪肉干、鸡肉干、火鸡肉干等)。将湿的生物垫在锅蒸锅中于97℃蒸煮0.5小时，冷却至室温。对生物垫进行大小减小到与通常在肉干产品中发现的大小一致的大小。在一些情况下，对大小减小的生物垫块针对风味进行调味，并在Cuisinart脱水器(DHR-20型)中脱水20-200分钟，平均脱水时间为40-120分钟。脱水时间是以下项的函数：加载到脱水器中的生物质的量、影响脱水器中的空气流动的脱水器中生物垫的分布、生物垫的含水量(平均含水量为约75％)、室温和最终产品中期望的含水量。取决于期望的产品特性，脱水后的含水量在8％至12％之间变化。在一些情况下，在脱水前对生物质进行穿孔产生产品，该产品更容易撕成小块，从而易于食用。通过使用叉、刀或嫩化器(tenderizer)工具对生物质进行穿孔，这既对生物质进行了穿孔，又破坏了细丝网络，从而使其更容易撕裂。评估了极其多种香料混合物(即Cajun、奶酪、大豆、醋、药草、酸奶油和洋葱、烟熏液、严格素食肉香料(vegan meat flavor)等)。在脱水前和脱水后均评估香料混合物。与脱水后处理的样品相比，在脱水前添加香料的那些样品提供更多的味道并更好地附着于生物质。所得的肉干在味觉测试中均表现良好。
实施例20：真菌片(Myco-chips)
如上所述生产的尖孢镰孢菌菌株MK7生物垫用于薄片，外观和味道类似于薯片或玉米片。将湿的生物垫在锅蒸锅中于97℃蒸煮0.5小时，冷却至室温。对生物垫进行大小减小到与片产品中通常发现的大小一致的大小，并且经高度加工成糊状物并形成片样的几何形状。然后将真菌片放入热油的煎锅中(温度约等于380°F)，直到变成棕色。烹调时间随生物质的几何形状而变化，但烹调非常快，通常不到15秒。生产的油炸片证明是非常可口的，并且能够根据油炸前添加到生物质或涂覆到生物质上的香料而提供极其多种味道体验。
实施例21：气密密封的生物反应器：生物垫
使用
Figure BDA0002293114410000441
玻璃托盘12.7x 17.8cm以及100x 15mm培养皿作为基本托盘。对玻璃托盘加载200mL原料，其与液态营养物培养基(若需要的话)和接种物混合。托盘用透气膜覆盖并密封，该透气膜用集成的橡胶垫圈附着于塑料框。密封系统在膜和玻璃托盘之间提供了有效的无菌密封，并使得易于组装以及打开/关闭反应器以用于采样和收获目的。
使用具有不同厚度、孔径和质地(表面粗糙度)的一套不同的透气膜材料作为气液界面的材料。最初，使用八(8)种聚合材料，包括聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚吡咯烷酮、聚(酰胺基胺)树枝状聚合物复合物和乙酸纤维素(例如SpecialtySilicone Products,Inc.Corporate Technology Park,NY；Thermo-Fisher,Waltham,MA； Merck Millapore,Burlington,MA)。对材料使用三种孔径(0.2、0.45、1.0μm)，除了气体直接扩散通过聚合物本身同时排除微生物以外，它们还有助于气体转移。另外，使用具有不同粗糙表面质地和曲折路径的无菌布状材料进行气体扩散。大量此类材料可购自其他公司来源，包括3M、Solvay、Ube Industry和Saint-Gobain。
为了分析和确定用于不同环境和任务条件的参数，托盘反应器装有传感器，以监测温度、溶解氧和pH值，作为跨越托盘的深度的函数。传感器和穿过膜进入反应器的导线的端口用硅树脂、环氧树脂和/或粘合剂密封，取决于膜材料。集成到膜中的隔片用作样品端口，用于收集液体样品，以通过GC-MS、ICP-MS、IC和总C/N进行分析。标准以及微电极用于以规则的时间间隔(例如6、12、24、36、48小时)实时测量穿过透气膜和生物垫内的pH和电子受体通量(O2)。通量信息对于使实时代谢需求与膜气体渗透性以及最佳生长和原料转化所需的电子供体(有机物)和营养物(无机物)浓度和分布的变化相匹配是至关重要的。
实施例22：未仪器化的反应器
未仪器化的反应器用于生长研究，该生长研究用真菌菌株尖孢镰孢菌MK7作为模型丝状生物进行。MK7菌株是一种极端的真菌，其已经显示在极其多种原料上茁壮生长，包括人废物、食品废物、蓝细菌和藻类生物质以及木质纤维素材料。还已经显示了MK7菌株对高尿素水平(至少26g/L)以及高溶解有机碳和渗透压(300g/L甘油)具有耐受性。
测试的原料包括：1)替代人尿液作为氮的主要来源；2)替代食物废物(狗粮)作为主要碳源；3)植物材料(木质纤维素)作为额外的碳源。对所有原料广泛分析有机和无机成分、pH值和生物需氧量。使用NASA科学家或其他参与研究任务废物的科学家推荐的培养基成分制备替代人尿液。
通过进行比较性生物膜-生物垫生长研究来测量不同的透气膜的效率，其中将不同膜密封到含有各种原料和MK7接种物的托盘和培养皿的表面上。膜与液相直接接触，并且是气体/蒸气外部环境与生物膜-生物垫/液体培养基之间气体交换的唯一途径。对反应器进行破坏性采样以测量随时间的生长(生物质干重，生物垫厚度)。将生长速率与没有膜的对照托盘进行比较。测试了由原料和膜组合组成的因素实验设计，以提供原料和膜的最佳匹配。还评估了其他变量，包括初始原料的pH值和无机营养物添加。此外，实验跟踪了作为时间函数的来自原料的活细菌细胞计数，以量化与生物垫生长相关的消毒动力学。
实施例23：
使用表现最好的膜/原料组合进行其他实验。首先，通过无生命实验对通过选定透气膜的气体通量进行定量和建模。从反应器外部的蒸气相到液相的O2通量使用初始斜率方法，并使用溶解氧探针和最初是缺氧的培养基进行测量。从二氧化碳饱和液相到蒸气相的二氧化碳通量也使用初始斜率法，并通过总无机碳分析并且用pH探针(碳酸的测量)进行测量。溶解的无机碳相最初为0％、0.5％和5％的二氧化碳。将数据整合到移动前沿真菌生长模型中，以开发更准确的参数。
然后，将观察到的表现最好的膜/原料组合用于真菌生长模型辅助的详细生物优化实验。使用玻璃托盘和培养皿两者。较小的培养皿促进密集的破坏性采样，用于随时间对生物质和液体分析。鉴定下述条件的创建，其中将几乎所有添加的碳和营养物以最少的废物转化为生物质。这里，通过测量每个电子供体产生的生物质和每电子受体产率产生的生物质来评估碳和电子通量以及反应器条件。使用商业服务(例如，Microanalysis Inc.，Wilmington DE)测量生物质的元素组成，以完成质量平衡。感兴趣的参数包括液相的体积和可用原料和营养物(碳底物、氮源、无机营养物、氧气)的浓度。所得数据用于真菌垫生长的移动前沿数学模型，该模型促进定量比较和生长条件的最终优化。

Claims (37)

1.包含食用丝状真菌颗粒的食用丝状真菌的配制剂，其中所述食用丝状真菌颗粒包含未破碎的丝状真菌丝、破碎的丝状真菌丝或它们的组合，其中所述食用真菌颗粒是从食用丝状真菌生物垫分离的。
2.权利要求1的配制剂，其中所述丝状真菌是尖孢镰孢菌菌株MK7(ATCC保藏号PTA-10698)。
3.权利要求1的配制剂，其中所述丝状真菌是Fusarium venenatum。
4.权利要求1的配制剂，其中所述丝状真菌选自下组：双孢子蘑菇(Agaricusbisporus)(褐菇和白菇)、美味牛肝菌(Boletus edulis)(牛肝菌)、鸡油菌(Cantarelluscibarius)(黄菇)、大秃马勃(Calvatia gigantea)(giant puffball)、Cyclocybeaegerita(velvet piopinni)、灵芝(Ganoderma lucidum)(Reishi)、多叶奇果菌(Grifolafrondosa)(椎茸)、羊肚菌属(Morchella)物种(羊肚菌)、真姬菇(Hypsizygustessellatus)(蟹味菇(clamshell))、榆蘑(Hypsizygus ulmarius)(elm oyster)、硫磺菌属(Laetiporus)物种(硫磺菌)、埃杜拉香菇(Lentinula edodes)(香菇)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)(trumpet royale)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)(珍珠平菇和蓝平菇)、滑菇(Pholiotami crospora)(森林滑菇)、绣球菌(Sparassis crispa)(花椰菜)和块菌属(Tuber)物种(松露)。
5.权利要求1的配制剂，其中所述配制剂是液体。
6.权利要求1的配制剂，其中所述配制剂是固体。
7.权利要求1的配制剂，其中所述配制剂是糊剂、粉状物、充气物质或硬质物质。
8.食品，其包含权利要求1的食用丝状真菌配制剂。
9.根据权利要求8的食品，其中所述丝状真菌是尖孢镰孢菌菌株MK7(ATCC登录保藏号PTA-10698)。
10.根据权利要求8的食品，其中所述丝状真菌是Fusarium venenatum。
11.根据权利要求8的食品，其中所述丝状真菌选自下组：双孢子蘑菇(褐菇和白菇)、美味牛肝菌(牛肝菌)、鸡油菌(黄菇)、大秃马勃、Cyclocyb eaegerita(velvet piopinni)、灵芝、多叶奇果菌(椎茸)、羊肚菌属物种(羊肚菌)、真姬菇(蟹味菇)、榆蘑、硫磺菌属物种(硫磺菌)、埃杜拉香菇(香菇)、刺芹侧耳(trumpet royale)、糙皮侧耳(珍珠平菇和蓝平菇)、滑菇(森林滑菇)、绣球菌(花椰菜)和块菌属物种(松露)。
12.根据权利要求8的食品，其是肉替代品、肉填充剂、面包、生面团、糕饼、饺子、肉干、零食、饮料、酸奶或点心。
13.根据权利要求12的食品，其中所述肉替代品模拟汉堡、香肠、热狗、鸡块或鱼片的质地。
14.根据权利要求12的食品，其中所述点心是慕斯、布丁、冷冻点心或冰淇淋类似物。
15.根据权利要求12的食品，其中所述点心是甜食或糖果。
16.制备食品的方法，其包括使权利要求1的配制剂与一种或多种其他成分接触。
17.制备权利要求1的食用丝状真菌配制剂的方法，其包括
(a)用食用丝状真菌的小分生孢子，孢子或菌丝体接种含有碳源的液体生长培养基；
(b)在室温温育接种的生长培养基；
(c)通过在接种的生长培养基上进行表面发酵来培养粘合丝状真菌生物垫；
(d)收集所述粘合丝状真菌生物垫；并且
(e)减小所述丝状真菌生物垫的大小以产生至少两种食用丝状真菌颗粒。
18.根据权利要求17的方法，其中收获所述粘合丝状真菌生物垫连续发生。
19.根据权利要求17的方法，其进一步包括在所述温育步骤期间偶尔或连续替换所述液体生长培养基。
20.根据权利要求17的方法，其中所述碳源是甘油、淀粉、玉米浆、酸乳清、乳清、甜乳清、氢化淀粉水解产物、淀粉衍生物、小麦浆，工业用液、食品精炼产品/废物流或它们的组合。
21.制备权利要求4的配制剂的方法，其包括
(a)对所述丝状真菌的子实体进行表面消毒；
(b)减小经灭菌的所述丝状真菌的子实体的大小；
(c)对经研磨的所述丝状真菌的子实体进行表面消毒；
(d)任选地重复步骤(b)和(c)；
(e)用经灭菌的经研磨的所述丝状真菌的子实体接种含有碳源的液体生长培养基；
(f)在室温温育接种的生长培养基；
(g)培养粘合丝状真菌生物垫；
(h)收获所述粘合丝状真菌生物垫；并且
(i)减小所述丝状真菌生物垫的大小以产生至少两种食用丝状真菌颗粒。
22.权利要求21的方法，其中大小减小的丝状真菌生物垫包含小于5mm长的菌丝聚集体。
23.权利要求21的方法，其中所述接种的生长培养基具有约4.0-4.1的pH。
24.权利要求21的方法，其中所述碳源包括甘油。
25.权利要求21的方法，其中所述温育期是10-20天。
26.自含式无菌密封生物反应器系统，其包括容器、原料、真菌接种物、至少一个透气膜、密封件和任选地液体营养物培养基。
27.根据权利要求26的自含式生物反应器系统，其中所述容器包含多个生长区室。
28.根据权利要求26的自含式生物反应器系统，其中所述至少一个透气膜针对特定气体校准。
29.根据权利要求26的自含式生物反应器系统，其中所述至少一个透气膜是聚合物材料。
30.根据权利要求26的自含式生物反应器系统，其中所述透气膜选自下组：聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚吡咯烷酮、聚(酰胺基胺)树枝状聚合物复合物和乙酸纤维素。
31.根据权利要求26的自含式生物反应器系统，其中所述原料是天然存在的或合成的尿液、食物废物、工业废物和副产物、农业废物和副产物、甘油、淀粉、淀粉衍生物、小麦浆、植物材料、藻类、蓝细菌、食品加工废物和副产物、植物材料的水解产物、废油和副产物、工业用液、食品精炼产品/废物流和/或它们的组合。
32.根据权利要求26的自含式生物反应器系统，其中所述真菌接种物包含子囊菌或担子菌真菌，和/或它们的组合。
33.根据权利要求32的自含式生物反应器系统，其中所述真菌接种物包括子囊真菌。
34.根据权利要求31的自含式生物反应器系统，其中所述真菌接种物包括担子菌真菌。
35.根据权利要求31的自含式生物反应器系统，其中所述子囊真菌选自下组：尖孢镰孢菌菌株MK7、Fusarium venenatum、燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)、酿酒酵母、粗糙链孢霉和/或它们的组合。
36.根据权利要求26的自含式生物反应器系统，其中所述容器具有歧管设计和/或挡板系统。
37.根据权利要求26的自含式生物反应器系统，其中所述容器由一种或多种消耗性原料制成。
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