CN113302284A - 生成菌丝体支架的方法和其应用 - Google Patents

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Abstract

描述了用于生成用于使用数个技术的菌丝体支架的数个方法。在一个实施方式中，使用用于基于细胞的肉类技术的浸泡生物反应器系统生成菌丝体支架。在另一实施方式中，制备用于生物医学应用的菌丝体支架。菌丝体支架可由液体培养基或固体底物生成。

Description

生成菌丝体支架的方法和其应用
本申请为非临时专利申请并且要求于2018年11月20日提交的临时专利申请62/769,789的权益。
本发明涉及生成菌丝体支架的方法。更具体地，本发明涉及生成生物相容的和生物可降解的菌丝体支架的方法。
背景技术
如已知的，丝状真菌包括称为菌丝的丝状细胞的交联网络，其经极化顶端延伸和分支形成(增加生长顶端的数量)而扩展，这等同于动物和植物中的细胞分裂。见，GriffinD，Timberlake W，Cheney J.，Regulation of macromolecular，colony development andspecific growth rate of Achlya bisexualis during balanced growth.Journal ofGeneral Microbiology 80，381-388.(1974)。菌丝顶端延伸可显示许多趋性(正趋性或负趋性)，包括向地性、自趋性和趋电性，其修饰足够影响真菌菌体(菌丝体)和子实体(蘑菇)中有意义的组织和形态学多样性。见，Moore，Fungal Morphogenesis.CambridgeUniversity Press.Cambridge，UK.(1998)。
丝状真菌由它们的表型可塑性限定并且可产生二级菌丝体，基于分化的“模糊逻辑”，作为分离的“子程序”的分化表达的功能而不是被限定的途径的功能(见，Moore，Tolerance of Imprecision in Fungal Morphogenesis.Proceedings of the FourthConference on the Genetics and Cellular Biology of Basidiomycetes，13-19)，二级菌丝体可表达各种程度的分化，从复杂的生殖结构(蘑菇)到完全未分化的营养菌丝体，表示细胞密度、分支/交联频率、细胞直径分布、细胞聚集、结构各向异性和体积分数不同的各种网络形态。
如2018年11月14日提交的USSN 16/190,585中描述的，一种已知的生长生物聚合物材料的方法采用将包括营养底物和真菌的生长培养基在放置在密闭温育腔室中的容器中温育，空气流过各容器，同时腔室保持湿度、温度、二氧化碳和氧的预定环境。
如USSN 16/519,384中描述的，如USSN 16/190,585中描述的一组生物聚合物材料，可被修饰以生成具有定制质地、风味和营养特征的材料，用于作为食品或组织支架。该方法涉及在生长和/或使用后处理期间来调节未分化的真菌材料的密度、形态和组成，以改善口感和/或对风味、脂肪、细胞培养物等的倾向。
在一个实施方式中，改变温育腔室中的生长条件，以产生像肉的有序对齐的大分子结构，其可接着用增味剂和其他添加剂，包括但不限于蛋白质、脂肪、风味剂、芳族化合物、血红素分子、微量营养物和着色剂改进。
如已知的，基于细胞的肉类技术一般采用灌注生物反应器系统，其由下述组成：悬浮反应器单元，用于牛肉肌细胞增殖、透析、氧合作用；泵，用于反应器单元和培养基进料之间的培养基循环；和支架生物反应器单元，用于产生聚集细胞团，使用或不使用聚集细胞团的机械驱动。WO2018011805A9(Nahmias)、JP6111510B1(Yi)和Byrd，Clean meat’s path toyour dinner plate，The Good Food Institute。Website Accessed 11/14/18，https://www.gfi.org/clean-meats-path-to-commerialization。
如也已知的，用于生物医学应用的组织培养和工程化聚焦损伤的器官的产生或修复通常要求在具有特别的机械、孔隙率、生物相容性和生物可降解性特点的支架上培养给定的细胞。
本发明的目的是利用丝状真菌的表型可塑性，以产生具有具体地靶向网络形态的真菌支架材料。
本发明的另一目的是产生菌丝体支架，用于在用于基于细胞的肉类技术的灌注生物反应器系统中实施。
本发明的另一目的是提供菌丝体支架，其提供优化的纤维性的复合基底，用于在悬浮培养或深层培养中哺乳动物细胞的粘附、增殖和聚集。
所描述的发明的目的是产生具有独特的制造可塑性的生物相容的和生物可降解的菌丝体支架，允许孔隙率和结构独特地为了生物医学应用而可调。
发明内容
简言之，本发明提供了生成菌丝体支架的方法，包括下述步骤：将丝状有机体接种至培养基，所述培养基含有用于有机体的培养和生长的营养物，和将接种的培养基在限定的环境中温育足够的时间，用于真菌学生物聚合物从培养基生长，而不在其中产生菌柄、菌盖或孢子。限定的环境通常为具有85°F至95°F的温度和3％至7％的二氧化碳含量的环境。方法的特征在于真菌为生物相容的物种并且作为一片独立的(self-contained)支架，例如，以坯料的形式，从培养基去除真菌学生物聚合物的生长。
其中描述的方法可用于修饰三维菌丝体基质，如“Mycological BiopolymersGrown in Void Space Tooling”(US 20150033620 A)中描述，以产生定制的、量产非动物支架，作为独立的(stand-alone)材料，或作为用于培养非丝状次级细胞类型的结构支架。
方法允许产生大的惰性组织坯料，其可被进一步修饰，以生成具有定制的质地、风味和营养特征的材料，用于生物医学应用或用作食品。方法涉及在生长和/或使用后处理期间来调节真菌菌丝基质的密度、形态和组成。
该一个实施方式涉及改变温育条件，以产生像肉的有序对齐的大分子结构，其可接着用增味剂和其他添加剂(包括，但不限于蛋白质、脂肪、风味剂、芳族化合物、血红素分子、微量营养物和着色剂)改进。
第二实施方式涉及在生长过程期间，通过液体沉积或固体沉积，或通过自然细胞吸收(生物吸附)(例如，增加生长培养基中的矿物质含量，以增加组织中的最终含量)，沉积增味剂和其他添加剂。
第三实施方式涉及通过后处理，或改变温育条件而去除不需要的残留物(例如，臭气、影响储存稳定性的酶等)。
第四实施方式涉及调节温育、合成生物学和/或后处理条件，以产生质地上像动物肉的组织(例如，经温度和气流控制和/或机械、酶或化学改变组织的结构而增加对齐和减少生长密度)。
第五实施方式涉及使用该后者的组织(整体，或冲洗掉任何干扰残留物)作为三维基质，其中可支持和培养非真菌组织细胞，允许体外产生用于肉消耗，或生物医学应用的组织。使用生长条件、后加工或合成生物学可工程化该组织，以增加用于期望的细胞生长的倾向(例如，增加或减少孔隙率、增加或减少菌丝体直径、几丁质的脱乙酰作用、增强的细胞粘附位点，或通过生成更多限制营养物而改善产率等)。
结合所附附图，从下述详细描述中，本发明的这些和其他目的和优势将变得更显而易见，其中：
图1阐释了在生长期间包括分离菌丝的各向同性基质的营养菌丝体的显微照片；
图2阐释了按照本发明的具有增加的束厚度和增加的网络各向异性分数的修饰的各向同性基质的显微照片；
图3阐释了按照本发明的具有增加的束厚度和没有增加的网络各向异性分数的修饰的各向同性基质的显微照片；
图4阐释了按照本发明的具有表达的椭圆体形态的修饰的各向同性基质的显微照片；和
图5阐释了采用具有丝状支架托盘单元的肌细胞悬浮反应器单元的设备的流程图，所述丝状支架托盘单元用于将肌细胞附着至所述托盘单元中的菌丝支架。
实施例方法
用于产生复合细胞团块的静态深层-深层培养
1、将丝状有机体接种体引入含有液体培养基和用于培养给定丝状物种的营养的生物反应器容器中，所述液体培养基用适当的无菌制备，并且可含有或可不含有固体基底或表面，以支持丝状生长，产生第一接种培养基。适于硫磺菌属物种(Laetiporus spp.)的示例液体培养基将为具有2g/L蛋白胨的20g/L麦精。培养基可经0.2um过滤器而过滤器灭菌或在15psi下加压灭菌45分钟。
2、将第一接种培养基在被选择为影响具体的三维丝状网络形态的条件下温育。用于硫磺菌物种的一般示例将是在27℃下静态温育15天。如果固体基底或表面包括在容器中，则三维丝状网络将附接至表面来发育，如果没有，则丝状网络将在容器的体积内发育。适当的基底将具有>1um的孔径大小，使得菌丝可穿透所述基底。
3、在已经三维丝状网络发育结束之后，容器中的培养基用设计为使菌丝基质脱细胞的化学处理替换，保留真菌细胞的结构壁基质，同时去除潜在地干扰非丝状细胞生长的所有组分，产生脱细胞的丝状支架。采用的化学处理为在溶剂，特别是75％乙醇溶液中浸渍大于1小时的时间段。接着，用去离子水清洗溶剂和流出物。
4、在脱细胞之后，将脱细胞化学处理替换为用于培养非丝状有机体的给定细胞系的适当液体培养基，并且将非丝状有机体的接种体引入容器中，产生第二接种培养基。
5、将第二接种培养基在丝状支架中，在适于支持给定非丝状有机体的系的代谢和生长的条件(例如，用于培养肌细胞的典型的条件)下温育，使丝状支架的细胞间区域被占据并且附着至脱细胞的丝状细胞的表面。
6、一旦丝状支架的细胞间区域确定为由非丝状有机体充分占据，产生了复合细胞团块，从生物反应器容器提取复合细胞团块并且传送至后处理。
用于产生复合细胞团块的静态固态-深层(SSSS)培养
1、用适当的无菌和补充的营养制备固体底物，以支持给定丝状有机体的代谢和生长，将丝状有机体接种体引入至制备的底物，产生接种底物，并且将接种底物载入生物反应器容器中。用于硫磺菌属物种的示例底物将为补充20％麦麸的硬木屑，其在15psi下加压灭菌1小时。
2、将接种底物在具体地被选择为影响具体的三维丝状网络形态的表达的条件下温育，其发生在所述固体底物块的外部，产生凝聚性丝状网络，其可与所述固体底物块分开。这种温育条件描述在USSN 16/190,585中。
3、实施例001步骤3-6。
用于产生复合细胞团块的搅拌的深层-深层培养
1、将丝状有机体接种体引入含有用适当的无菌制备的液体培养基和用于培养给定丝状有机体的营养(根据实施例1)的生物反应器容器中，产生第一接种培养基。调节丝状有机体接种体的添加率，以靶向具体的所得丝状小球尺寸，其针对下游质地和支持生长的细胞粘附被优化，并且进行培养基制备和接种，以靶向150厘泊的最佳培养基粘度，用于维持丝状有机体培养的溶氧。
添加率的一般示例将为8％接种率(vol/vol细胞悬液接种体比液体培养基)，细胞悬液被制备为在OD590nm下至少75％的浊度。降低至实践的接种体比率为5x104细胞的等分试样，其再悬浮在25μL的新鲜的培养基中，并且接种在已经浸入培养基中的支架上，并且然后压缩以排出液体。
2、用被选择为影响具体的三维丝状小球形态的表达的条件和搅拌速度进行接种培养基的搅拌的温育。搅拌使得保持小球，而不是将垫破碎成小球。接种体为单片段，其进一步在搅拌温育条件下被小球化。
3、实施例001步骤3-6
用于产生成型的丝状结构的搅拌深层滴注培养
1、实施例003步骤1-2
2、通过在许多天的期间内无菌滴注施加，将接种的培养基施加至代表最终期望的产品的预成型的形状的表面，直到在形状的表面上长成良好形成的菌丝体片。
3、从形状表面提取菌丝体片，保留形状作为2-D壳或更厚的3-D组织垫。
用于产生复合细胞团块的丝状和非丝状有机体的深层共培养
1、其中培养基制备为适于培养丝状和非丝状有机体二者的实施例001和003，并且将各有机体的接种体同时引入至培养基。这种培养基可包括马铃薯葡萄糖培养基，其支持丝状真菌和单细胞细菌二者。
2、实施例001和003，其中用适于培养丝状和非丝状有机体的条件，例如，在27℃和37℃(适于哺乳动物组织培养和细菌的上阈值)之间的温度下进行温育。
控制形态的细胞结构的SSSS培养。
按照方法[002]。
步骤2之后，进行下述步骤：
1、水分、信号传导化合物比如激素、矿物质和其他分子直接以微米精度沉积在生长培养基的表面之上的网格(x,y)上。尽管该实施方式考虑使用打印头(很像3D打印机)，但是沉积方法可经喷雾、空气输送或允许材料精确沉积横跨平面生长部件的表面的任何其他方法。考虑增强生长、修饰生长并且延迟生长的分子。考虑在该阶段添加其他活细胞并且可提供进一步原位分子或信号传导合成(例如时间延迟分子合成后沉积)和/或嵌入到部件的生长中。
2、沉积的速度可校准为匹配有机体在y方向上的生长速度。理想地，在另外的向上组织扩展之前，可处理部件的整个表面(例如，在一个菌丝长度的细胞分裂之前，可发生整个表面处理)。沉积的速度也可以随意地是缓慢的，以便在整个生长循环期间，仅仅允许传递一次。基于期望的最终特征分辨率，选择沉积速度，并且沉积速度将通常位于这些两个极端之间。
3、在z轴中的菌丝生长(以微米或菌丝长度测量)的每个循环n期间，打印头经过x,y网格中部件的表面。每个x,y细胞接收精确剂量的影响组织形态和代谢的液体。影响的组织形态和代谢包括，但不限于菌丝分支速度、细胞壁厚度、产生的菌丝组织的类型、在菌丝生长期间分泌的蛋白质和化合物的类型，以及菌丝延伸的方向。网格间隔可选择为最小，以匹配一个菌丝单位(例如，微米乘以微米的细胞尺寸)或向上至相对大的分割(例如，1mm x1mm分辨率)。基于生长组织要求的精度选择分辨率。精细特征，例如用于毛细血管的支架，可要求非常高水平的分辨率，其中体特征(在结构元件中产生更高密度组织的区)可要求相对低分辨率的沉积控制。
4、重复步骤3，直到整个期望的图案(x,y,z封套)压印在生长组织上或直到组织达到其最大菌丝延伸极限。
5、x,y轴的使用是用于描述打印过程并且该实施方式考虑打印头将以直线方式从(0,0)原点移动至(x,y)。
6、从反应器提取组织，并且可进一步后处理或原样使用。潜在的应用包括菌丝组织的图案化，以匹配用于细胞支架的现有器官类型(例如，肺、肝、肾等)，和菌丝组织的图案化，以产生预定的大几何结构(例如，具有根据图1的低密度菌丝体的区域的蜂巢图案，和根据图3的高密度的菌丝体的更厚的六边形壁)。该方法的原理是选择性控制菌丝体生长的区域，以横跨表面以预测的方式呈现不同的密度。
生物体
1、实施例001-005，其中丝状有机体为担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)、接合菌门(Zygomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)或球囊菌门(Glomeromycota)的腐生真菌。
2、实施例001-005，其中丝状有机体为产生单系菌丝、二系菌丝或三系菌丝菌丝体的真菌。而且，可使用起初作为个体酵母细胞存在并且接着诱导而成为丝状的二态生物体，其示例为出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)。
3、实施例001-005，其中真菌为可食用物种的一种并且通常认为对于人类消费是安全的。
4、实施例001-005，其中丝状有机体为产生一个或多个细胞结构的真菌，一个或多个细胞结构例如生殖菌丝、联络菌丝、珊瑚状联络菌丝、骨架菌丝、拟薄壁组织、假果、中间胚芽生殖细胞、向顶性胚芽生殖细胞、细胞膨胀、末端分生孢子产生、中间分生孢子产生、无性孢子形成(oidiation)、节孢子形成、基质、子囊壳、分生细胞、分生孢子、假根或根状菌索。
5、实施例001-005，其中丝状有机体为下述属的真菌：侧耳属、灵芝、多孔菌属、树花菌属、香菇属、香菇、栓菌属、猴头菌、田头菇菌、松蕈属、落叶松蕈、球盖菇属、裂褶菌属、硫磺菌、香蘑属、菌寄生属、纤孔菌属、密孔菌属、层孔菌属、拟层孔菌属、拟迷孔菌属、桦剥孔菌属、皮孔菌属、针层孔菌属、暗孔菌属、绣球菌属、干酪菌属、落叶松层孔菌(Laricifomes)、扇菇属、根霉菌属、白腐菌属、毛平革菌属、叉丝孔菌属、拟蜡菌属、环柄菇属、韧革菌属、木霉属、炭角菌属、虫草属、刺革菌属、玉蕈属、火菇属、鬼伞菌属(Coprinopsis)、鬼伞菌属(Coprinus)、羊肚菌属、杯伞菌属、角孔菌属、小包脚菇属、银耳属、秃马勃属或牛舌菌属。
6、实施例001-005，其中非丝状有机体为脊索动物有机体的细胞，并且可为哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。
7、实施例001-005，其中非丝状有机体为植物细胞。
8、实施例001-005，其中非丝状有机体为非脊索动物并且可为软体动物或节肢动物细胞。
9、实施例001-005，其中非丝状有机体为肌细胞、神经元、神经胶质细胞、肺细胞、成纤维细胞、软骨细胞、内皮细胞、骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞或干细胞。
10、实施例001-005，其中非丝状有机体为细菌、酵母、藻类、丝状真菌、核酸类生命形式(病毒、噬菌体)或支原体。
11、实施例001-005，其中非丝状有机体为珊瑚或壳结构的细胞。
培养范例变型
下面的任何可用于实施例001-005：
1、实施例001、002和003，其中第一和第二接种培养基的温育都以单个批次出现，其中所有的培养基组分在温育阶段耗尽，而不进一步调节。
2、001和003(第一接种培养基和第二接种培养基二者)和002(第二接种培养基)的实施例，其中温育使用补料分批范例进行，其中基于给定营养物浓度的设定的阈值条件的主动或定期监测，营养物(碳、氮、矿物质以及pH调节)周期性地进料至接种的培养基，按比例去除消耗的培养基。
3、001和003(第一接种培养基和第二接种培养基二者)和002(第二接种培养基)的实施例，其中使用连续进料范例进行温育，其中基于给定营养物浓度的设定条件的连续监测，连续调节营养物(碳、氮、矿物质和pH)。
4、实施例002，其中丝状有机体的固态培养出现在托盘容器中，在提供控制气体交换和含量、相对湿度和温度的二级容器中温育。在该范例中，三维向外颗粒丝状基质从来自托盘的固体底物的顶部表面延伸。
5、实施例002，其中丝状有机体的固态培养出现在主动充气的填充床生物反应器容器中，其中输入空气被调节至特定的CO2、湿度和温度并且穿过固体底物基质。
在该范例中，容器中保留了空隙空间，其中发展三维向外颗粒丝状基质。
6、实施例002，其中在脱细胞之前，将三维丝状基质与固体底物基质分开。
7、实施例002，其中在脱细胞之前，三维丝状基质未与固体底物基质分开，并且在培养结束时将复合细胞团块与固体底物基质分开。
8、实施例001、003和005，其中丝状和非丝状有机体在分开的容器(分别为A和B)中平行培养，并且其中非丝状细胞从容器A传至容器B，通过容器B的丝状有机体网络过滤，将非丝状细胞沉积遍及丝状细胞网络。完全穿过容器B的非丝状细胞被回收并且传回至容器A或容器B。从容器A至容器B的非丝状细胞的流动可为周期性的或连续的，并且可在丝状有机体网络在容器B中发育期间或丝状有机体网络在容器B中发育之后进行。
9、实施例001-005，其中丝状有机体支架完全或选择性地充满二级生物相容的材料，比如琼脂糖或明胶凝胶。这些凝胶不提供固有的脉管系统或结构，但是的确为表面积和孔隙率提供另一控制杠杆，用作二级交联剂，在丝状支架中选择性辅助调节弹性模量，辅助启动/引导粘附细胞的细胞分化，以及潜在地增强水吸收和保留。
10、实施例001-005，其中丝状有机体支架完全或选择性吸收用于非丝状有机体的生长因子。生长因子可灌注在丝状支架中(自然扩散)，封装在时间释放装置中，或通过使用合成生物学，以组成型或通过可诱导的DNA控制序列和机制(即，临时、热、可用性反馈环等)表达所述化合物。
11、实施例001，其中丝状有机体支架发育附着至，或以其他方式附着至固体载体，所述固体载体通过三维丝状支架的一个或多个面连接至机械驱动装置。在实施例001，步骤4-6期间，丝状有机体支架在非丝状有机体增殖期间，在丝状支架中机械致动，刺激分化和增殖。
调节培养条件以影响不同的三维真菌支架形态
1、实施例001-005，其中丝状有机体为腐生真菌，例如硫磺菌属物种。在有利于产生包括分离菌丝的各向同性基质的营养菌丝体的条件下选择和培养硫磺菌属物种(图001)。对于硫磺菌属物种，实施例将是在27℃下经培养基和实施例001-005中描述的范例温育15天。
2、1的各向同性的基质可被修饰，以表达趋电性和菌丝聚集，增加平均束厚度，具有(图002)，或不具有(图003)增加的网络各向异性分数，以及通过如下的任何组合表达椭圆体形态(图004)：增加温育温度，例如至37℃，增加CO2含量，例如至大于2％，添加挥发性有机化合物或诱变物，例如萜，减少气体交换率，增加淀粉或其他简单的碳水化合物的补充，增加脂肪酸的补充，调节氮补充，例如，通过补充蛋白胨，或补充表面活性剂(比如，吐温80)。
3、1的各向同性基质可通过如下的任何组合减少网络交联(分支、融合和菌丝纠缠的组合效果)和/或细胞体积密度：增加温育温度，增加CO2含量，添加挥发性有机化合物或诱变物，减少气体交换率，减少淀粉或其他简单的碳水化合物，脂肪酸或氮补充，修饰钙的补充，或补充表面活性剂。
4、1的各向同性基质可通过如下的任何组合增加网络交联和/或细胞体积密度：减少温育温度；减少CO2含量，例如，减少至17℃-22℃；增加气体交换率，例如，增加气体交换率使得CO2保持在大气水平；增加淀粉或其他简单的碳水化合物补充；补充难分解的碳水化合物，比如纤维素；和修饰钙的补充。
肌细胞在丝状真菌支架上的增殖作为肉类替代品
1、根据实施例001-005和008-009，其中丝状有机体为根据实施例007的可食用真菌物种，比如硫磺菌属物种。
2、根据实施例001-005和008-009，其中非丝状有机体为牛科动物、禽类(比如，鸡肉)或鱼细胞系的脊索动物肌细胞。
通过调节丝状支架小球尺寸产生修饰质地的碎肉类产品
1、实施例003的工艺，其中丝状有机体为可食用真菌物种(比如硫磺菌属物种)，其产生有软毛的小球形态，并且非丝状有机体为母牛(牛肉)肌细胞。
2、实施例003，其中调节硫磺菌属物种进入培养基的接种率，以靶向所得复合组织块的具体质地质量。例如，为了靶向粗糙质地，将减少接种率，产生更大的小球尺寸，并且最终产生更大的牛肉肌细胞小球。例如，实施例3的添加率(8％v/v)可减少至2％，或可选地可将75％的浊度接种体稀释。
可选地，为了产生精细质地，将增加接种率，产生更小的小球尺寸，和最终更小的牛肉肌细胞小球。例如，实施例3的添加率(8％v/v)可增加至16％，或可选地可将75％浊度接种体浓缩至更高的细胞密度。
3、所得硫磺菌-牛肉肌细胞复合组织块应用为碎牛肉替代品，具有“研磨”，或根据1和2的组织小球尺寸决定的质地。
4、步骤1-3，用根据实施例007，步骤5-7的可选的肌细胞系。
实施例011，另外的丝状有机体再生长至具体的几何体
1、实施例011，只是在培养牛肉肌细胞之前真菌支架未脱细胞，因此保持了真菌支架部分的活力。
2、在提取真菌-牛肉肌细胞复合团块之后，将块投入具有限定几何学例如肉饼的模具中。
3、将模制的真菌-牛肉肌细胞复合团块在适于真菌部分继续生长的条件下温育，导致分开的小球通过丝状延伸结合在一起，成为给定几何学的凝聚性块。最终的真菌-牛肉肌细胞形式用作食物产品。
替代蛋白质基质的产生
1、实施例002，其中丝状有机体为可食用的物种，比如硫磺菌属，在步骤2之后从反应器或固体状态底物无菌提取菌丝支架，并且进一步修饰或不进一步修饰，而用作食物产品。
替代蛋白质基质的修饰
1、实施例010-013，其中通过浸渍在水中，改变培养基营养，例如，补充糖和/或环境条件，例如，使温度增加至37℃，而迫使收获的组织表达过量的胞外-粘液。
2、实施例010-013，其中在活支架中诱导自溶，以产生更柔软的质地。例如，温度诱导的自溶可通过在温育循环(2-48小时)结束时，使温育温度增加至40℃短的时间段来诱导。
3、实施例010-013，其中另外的酶(例如，壳质酶、转谷氨酰胺酶、蛋白酶、葡聚糖酶等)施加至提取支架，或表达(经合成生物学)，以修饰结构的质地。
4、实施例010-013，其中在支架上将产生感兴趣的酶的第二有机体共培养，以产生支架质地和结构的体内修饰。例如，产生蛋白酶、葡聚糖酶和壳质酶的真菌寄生物，比如木霉属物种或毛霉菌属物种，可用作第二有机体。
5、实施例010-013，其中收获的组织在加热或不加热的情况下经受腐蚀性化合物(例如，1M HCl，0.8M乙酸[白醋]等)，以改变所得结构的质地或孔隙率。
6、实施例010-013，其中收获的组织在加热或不加热的情况下经受强碱，以从几丁质去除乙酰基，和/或改变支架的质地或孔隙率。用于几丁质提取的方法的实施例描述在http://www.iglobaljournal.com/wp-content/uploads/2015/07/6.-Krishnaveni-Ragunathan-IGJPS-2015.pdf中。
7、实施例010-013，其中收获的组织经受已知的用于几丁质的溶剂(例如，CaCl2饱和的甲醇、离子液体等)，以改变质地或修饰孔隙率。
8、实施例010-013，其中收获的组织经受机械降解，以改变组织的自然质地、孔隙率或密度(例如，穿孔、切割、滚压、挤压等)。
9、实施例010-013，其中通过营养学、合成生物学，或环境条件过表达可食用物种中的自然风味化合物(例如，侧耳属(Pleurotus)中的苯甲醛、乳牛肝菌属(Suillus)中的苯乙醛、栓菌属(Trametes)中的茴香醛等)。
10、实施例010-013，其中在所得基质上培养另一有机体，其中所述有机体产生期望的增味剂化合物(例如，来自乳酸菌的二乙酰基[黄油]、来自谷氨酸棒杆菌的吡嗪[烤味]和谷氨酸盐[肉味]等)。
11、实施例010-013，其中将商业上可得的增味剂、脂肪、色素、血红素、增稠剂、甜料、酸等注入组织支架，以产生食物产品。
12、实施例010-013，其中在生长期间将化合物添加至组织或培养基，以改变终端产品的风味、质地或颜色(例如，在培养基中添加谷氨酸，用雾化器(misters)将着色剂雾化，将自然风味提取物雾化，将毛喉素添加至培养基，以诱导菌丝分支和改变最终质地等)。
13、实施例010-013，其中用维生素和矿物质强化所得组织，以改善营养价值，和/或复制肉的营养价值。
14、实施例010-013，其中生长培养基为修改的，以改变组织的最终营养特征(例如，添加氨基酸，以增加脂肪酸浓度，矿物质雾化或添加，维生素补充、蛋白质等)。
15、实施例010-013，其中根据实施例007和009，通过选择真菌物种或产生趋电性和菌丝聚集的培养条件，菌丝支架被赋予限定的颗粒。
16、实施例010-013，其中根据实施例007和009，通过选择真菌物种或产生中间和/或末端分生孢子的培养条件，菌丝支架被赋予更易碎和脆弱的质地。
17、实施例010-013，其中根据实施例007和009，通过选择真菌物种或产生分生孢子的培养条件，菌丝支架被赋予更易碎和脆弱的质地。
18、实施例010-013，其中根据实施例007和009，通过选择具有单系菌丝、二系菌丝或以其他方式不含或骨架菌丝的菌丝形态的真菌物种，菌丝支架被赋予更易碎的质地。
19、实施例010-013，其中根据实施例007和009，通过选择真菌物种或产生各向同性的菌丝形态的培养条件，菌丝支架被赋予均匀质地。
20、实施例010-013，其中根据实施例007和009，通过选择具有三系菌丝、二系菌丝或以其他方式包括结构或骨架菌丝的菌丝形态的真菌物种，菌丝支架被赋予坚韧或难咀嚼的质地。
21、实施例010-013，其中根据实施例007和009，通过选择真菌物种或产生胚芽生殖或拟薄壁组织的培养条件，菌丝支架被赋予减少的凝聚性和/或凝聚性块。
22、实施例010-013，其中根据实施例007和009，通过修饰培养条件，以增加菌丝分支、融合和/或纠缠，菌丝支架被赋予更大的密度。可选地，根据实施例007和009，通过修饰培养条件，以减少菌丝分支、融合和/或纠缠，菌丝支架可被赋予减少的密度。
实施方式：牛肉
根据方法9和10，其中丝状支架为在其中描述的条件下生长的硫磺菌属的腐生真菌，其中二级非丝状有机体包括牛属(Bos)的成肌细胞，产生三维可食用真菌支架，吸收了繁殖牛肉细胞，以用作食物产品。
实施方式：海产食品
根据方法005，其中丝状支架为在其中描述的条件下生长的根霉属(Rhizopus)的腐生真菌，其中非丝状有机体为软体动物门(Mollusca)的成肌细胞，产生三维可食用真菌支架，吸收了繁殖软体动物肉细胞，以用作食物产品或结构材料。
实施方式：中性替代蛋白质
根据方法013，其中提取猴头菌属(Herecium)的营养菌丝的固体坯料而不用任何的非丝状生物体接种。该支架根据014后处理，施加来自木瓜提取物的壳质酶，以改善质地，接着在1摩尔乙酸中加热，以进一步修饰质地。所得组织接着灌输植物脂肪，在自溶酵母、烟熏风味剂、番茄提取物、香料中浸泡，并且用矿物质和维生素强化。然后，将组织烹饪直到酥脆，以产生非动物咸肉样产品。
实施方式：调味的替代蛋白质
根据方法002，其中在培养基中添加谷氨酸盐使火菇属(Flammulina)的营养菌丝的固体坯料生长，以赋予鲜味和基本的膳食矿物质并且增强所得组织。在初始生长之后，丝状支架接着接种乳酸菌或酵母，以原位产生二乙酰，产生黄油样风味和香味。接着收获组织，灌输植物脂肪和蛋白质，并且烹饪。产生具有天然增味剂和肉样质地和特性的食品物品。
实施方式：肺
根据方法006，其中丝状支架为在其中描述的条件下生长的灵芝属(Ganoderma)的腐生真菌并且二级非丝状有机体为细支气管上皮细胞。丝状支架在009中描述的条件下生长，其中选择聚集向电性生长，以模拟肺泡的血管性质，允许二级细胞形成结构化的三维组织团块。
实施方式：脑，使用根状菌索以支持轴突生长
根据方法002和006，其中丝状支架为在其中描述的条件下生长的松蕈属(Armillaria)的腐生真菌，选择生长参数，以表现根状菌索生长，高度各向异性、向电性、带状形态。这些带样结构接着接种二级非丝状有机体，比如哺乳动物神经干细胞，以支持沿着天然结构化的支架的轴突样细胞生长。
实施方式：美容涂抹器
根据方法003，其中硫磺菌属的营养菌丝的固体坯料在白天/黑夜光循环和增加空气交换下温育，其引起菌丝支架的外源色素沉着的表达。该支架接着根据014后处理，浸渍有益的脂肪酸，比如月桂酸，以改善施加平滑度和泡沫刚性，产生化妆品涂抹器样泡沫，具有可施加至皮肤的天然产生的色素。
实施方式：一次性油漆刷
根据方法013，其中提取灵芝属的营养菌丝的固体坯料，而没有任何接种非丝状生物体，并且根据014后处理，10％过氧化氢浸泡，以使组织剥落并且增加孔隙率/吸收容量，产生生物可降解的泡沫坯料，其可用于替代传统的聚合泡沫刷子。
实施方式：传感
根据方法002，其中丝状支架为在其中描述的条件下生长的根霉菌属的腐生真菌，其中二级非丝状有机体包括电活细菌，比如希瓦氏菌属(Shewanella)，并且电线连接至集电器和伏特计，用于监测下水道、径流和/或污染物的水污染。
实施方式：废水处理
根据方法002，其中丝状支架为在其中描述的条件下生长的灵芝属的腐生真菌，其中二级非丝状有机体包括用于氧产生的蓝藻细菌的混合培养物和用于有机处理的β-变形菌纲(Betaproteobacteria)，产生生物可降解的盒，其可现场使用和/或产生，用于公共厕所、赈灾等的处理。
实施方式：抗生素海绵
根据方法002，其中支架包括在其中描述的条件下(有或没有抗生素)生长的栓菌属的腐生真菌(有或没有药物抗性)，其中面板接着被灭菌并且吸收抗生素，或者接种并且用产生抗生素的有机体温育，接着灭菌和包装。该生物可降解的3-D支架可接着调节尺寸并且用于植入，用于腔创伤的内部抗生素处理，或用作生物可降解的临时创伤敷料，用于创伤或赈灾。
实施方式：吸收/分散
1、根据方法002，随后吸收用于医学处理的期望的抗生素
2、组织接着通过冷压缩变得平坦，以形成基本上2-D形状
3、使变平的组织干燥，以保持组织质量
4、灌输的2-D组织用于小空间插入。
5、在小插入空间之外的空间中的扩展受到如由晶格记忆赋予的具体设计的影响，其中2-D平坦的薄片可穿过小孔/切口、再水化并且扩展至初始形态，以填充大大难以接近的空间
6、扩展的组织实现作为内部扩散支架的作用，用于内部外科手术的抗生素
实施方式：用于损伤树枝的生物可降解的创伤敷料
1、按照方法002
2、通过施加热使得所得组织极其惰性
3、对组织灌输对受伤的树物种特异性的抗真菌和抗生素处理
4、组织施加至创伤表面不定量的时间，直到组织垫劣化或被长满
实施方式：具有半导体特性的可植入真菌支架
1、实施例001步骤1-2，实施例002步骤1-2，或实施例003步骤1-2，其中丝状有机体为裂褶菌(Schizophyllum commune)或羊肚菌属(Morchella)物种，并且为产生靛蓝的菌株。
2、以0.1-1％(质量/体积)的比率将MgSO4，7H2O补充至实施例001-003的培养基中。
3、在适于支持选择的真菌菌株代谢和生长的环境条件下进行温育，期间发生外源靛蓝的生物合成，导致在真菌菌丝的外部上的靛蓝沉积。在该情况下，可通过根据步骤2的MgSO4，7H2O补充比率修饰靛蓝生物合成和外源沉积的程度。
4、分开具有菌丝细胞的外源靛蓝或黑色素涂层的所得三维菌丝支架，用于下游用作可植入的、生物相容的半导体材料。
5、将步骤4的半导体菌丝支架向前传送至实施例001-005步骤3。
实施方式：实施例028，其中外源靛蓝沉积在二级表面上
1、实施例028步骤1-3，其中另外的细胞类型或材料与产生靛蓝的真菌菌株共同占据培养基。
2、步骤1，其中另外的细胞类型为实施例001-005的非丝状物种。
3、步骤1，其中共同占据培养基的另外的材料为有机底物。
4、步骤1，其中共同占据培养基的另外的材料为无机底物。
实施方式：在浸泡反应器系统中实施静态深层丝状真菌支架反应器单元，以产生替代肉类产品
按照方法[001]。
在步骤1期间，选择的真菌为一种可食用的物种，例如硫磺菌属物种，具体地，硫磺菌(Laetiporus sulphureus)，其被接种至含有包括玉米浆固体(corn steep solid)、葡萄糖、磷酸钾、硫酸镁的培养基的容器中，并且将pH调节至5.5至6.5之间。设计容器，比如允许培养基流过容器，并且实施为浸泡生物反应器系统中的支架托盘单元，其中用于牛肉肌细胞的悬浮生物反应器直接进料至其中培养丝状真菌的支架托盘单元。在支架托盘容器体积的中心，沿着支架托盘容器的长度，容器进一步含有分散器和扩散器。
在步骤2期间，在静态条件下进行接种硫磺菌属物种的培养基的温育而没有来自牛肉肌细胞悬浮反应器单元的流，通过经分散器和扩散器进料的过滤的空气保持溶氧水平，允许在支架托盘容器中发育连续菌丝网络，其进一步生长至分散器和扩散器中，将连续菌丝网络锚定在适当位置。可作为分批、补料分批或连续进料工艺进行支架托盘生物反应器操作。在该阶段期间，可根据方法[009]修改溶氧水平、光暴露、温度和培养基组分。
按照步骤3。
在步骤4期间，脱细胞化学替换为含有用于牛肉肌细胞的生长因子的胎牛血清，并且启动从悬浮生物反应器单元至丝状真菌支架托盘反应器单元的牛肉肌细胞的流。培养基可进一步补充聚乳酸、聚己酸内酯或聚乙醇酸，以有助于牛肉肌细胞粘附至脱细胞的丝状真菌细胞(菌丝)。
参考图005，在步骤5和6期间，用丝状支架托盘单元(3)和肌细胞悬浮反应器单元(1)之间用胎牛血清和悬浮牛肉肌细胞(6，7)的连续的或定期流进行温育，在此期间，肌细胞(2)附着至支架托盘反应器单元(3)中锚定至分散器和扩散器(4)的菌丝支架(5)，并且复制，在丝状网络的菌丝体积间产生肌细胞的聚集，产生菌丝和肌细胞的复合细胞团块。接着提取该复合细胞团块用于后加工为替代肉。
实施方式：在浸泡反应器系统中实施静态固态-深层丝状真菌支架反应器单元，以产生替代肉类产品
按照方法[002]。
在步骤1期间，用玉米秸、淀粉、谷类颗粒制备固体底物，并且接种可食用真菌物种，比如硫磺菌物种，具体地，硫磺菌。将制备的底物填入I型托盘生物反应器系统，比如Mitchell等(Eds)Solid-State Fermentation Bioreactors，Springer-Verlag BerlinHeidelberg(2010)中描述的，并且载入控制温度、光、二氧化碳、氧、相对湿度和气相淀积的温育容器中。
在步骤2期间，温育条件保持在5％的二氧化碳和接近100％的相对湿度。另外，在该阶段可按照方法[006]，以实现具体的异质形态。从接种的底物开发负向地性向外颗粒真菌菌丝基质，其在生长期间根据方法[009]经调制光、氧、二氧化碳、相对湿度或气相淀积速度而被进一步修饰。向外颗粒菌丝基质发育成连续团块，将其从固体底物分开，用于后加工。
按照方法[001]步骤3。
将脱细胞的菌丝支架转移至浸泡生物反应器系统中的支架托盘容器。按照实施方式030的步骤4-6。
实施方式：在浸泡生物反应器系统中实施丝状真菌基质和牛肉肌细胞的深层共培养，用于产生替代肉类产品
根据方法[004]的修改进行方法[001]。
在方法[001]步骤1期间，制备培养基并且接种在根据实施方式030实施在浸泡生物反应器中的托盘容器反应器中。
在方法[001]步骤2期间，根据实施方式030进行支架托盘容器中硫磺菌属物种的温育，直到硫磺菌属物种的丝状生长已经建立并且已经锚定在分散器和扩散器中。
根据方法[005]步骤1，通过在支架托盘容器中发育真菌支架，根据实施方式030启动来自牛肉肌细胞悬浮反应器的流。在该点，培养基包括支持硫磺菌属物种和牛肉肌细胞的二者增殖的营养物，并且可包括玉米粉固体、葡萄糖、磷酸钾、硫酸镁、胎牛血清、牛肉肌细胞生长因子、聚乳酸、聚己酸内酯或聚乙醇酸，并且将pH调节至5至7之间。根据方法[004]步骤2，糙皮侧耳(P.ostreatus)和牛肉肌细胞平行发育，根据实施方式030步骤5和6产生复合细胞团块。
实施方式：使用灌输组织，以产生晶体结构沉积
1、按照方法[002]，以产生菌丝体组织薄片。
2、将组织薄板压平并且疏散来自细胞间孔的残留的水分
3、接着使组织经受高度矿化液体并且使得吸收所述液体至完全饱和
4、使组织在指定为矿物质沉积区的位置沉积
5、使组织在环境中干燥并且作为之前保持在细胞间孔空间的矿化残留的延时释放起作用
实施方式：脉管系统的产生
根据实施方式030进行方法[001]，其中丝状有机体为高卢蜜环菌(Armillariagallica)的根状菌索菌株，并且非丝状有机体包括内皮细胞、肌细胞和成纤维细胞的任何组合。
在步骤1和2期间，高卢蜜环菌填充支架托盘生物反应器单元的体积，根状菌索的基质的直径的范围为<1mm至5mm。
在步骤4-6期间，内皮细胞、肌细胞和/或成纤维细胞附着至根状菌索并且沿着根状菌索的表面繁殖，形成凝聚性外细胞层或套筒。
在后加工期间，通过化学裂解或机械分开的任何组合，将内皮细胞、肌细胞和/或成纤维细胞的套筒与下面的高卢蜜环菌根状菌索分离。
实施方式：生长工具
实施例001-005，其中丝状支架生长成预定的形状，比如小的手动工具(锤子)。将支架与粘附和沉积聚合物、金属、角蛋白、方解石或蜘蛛丝至支架基质上的非丝状细胞(即，酵母、细菌等)共培养，因此提供增强的机械强度，和结构稳定性。可通过菌株工程化增强化合物的合成和沉积。
实施方式：哺乳动物肉的替代(酵母)
实施例001-005，其中丝状支架与允许粘附至脱细胞的或完整的细胞支架的酵母细胞共培养。酵母将以共培养或独立地(发酵罐B，图5)培养，并且用作哺乳动物细胞的替代，以避免用昂贵的牛血清的细胞培养，和表面附着要求。
1、酵母或丝状有机体可被基因工程化，以增强对支架(即，几丁质、疏水蛋白结合基序)的结合亲和力。
2、酵母可被工程化，以表达肉类风味和特性(即血红素、脂肪、色素)。，这些化合物的表达可为组成型，遍及培养/组装，或在细胞组装过程中以期望的时间被诱导，用于优化表达和影响。
实施方式：工程化的真菌可食用肉
实施例001-005，其中丝状支架有机体为基因工程化的，以具有天然肉风味、颜色、质地和气味(即，血红素、脂肪、颜料)的期望特点。
有机体可如何被基因工程化的实施例包括上调现有基因以增强真菌组织中谷氨酸组成的方法，以提供更加鲜美风味特征，或为色素沉着途径进行相同的操作，比如黑色素诱导。进一步，有机体可被工程化，以“敲除”或消除导致菌丝体分化成蘑菇的具体基因，因此修改或限制质地改变。最后，有机体可被工程化，以为来自另一有机体的分子，比如血红素引入启动子和基因盒。
实施方式：治疗性递送
实施例001-005，其中丝状支架有机体和/或共培养的非丝状细胞用于递送治疗剂至植入的组织(即皮肤、皮下、肌内等)。在该实施方式中，通过非丝状细胞产生治疗剂并且封装在丝状支架中。治疗剂的释放可与支架和周围组织之间的浓度差相关(例如，费克或非费克扩散)。治疗剂也可随着支架劣化或并入所述组织中而释放至周围组织。
1、丝状有机体可被基因工程化，以表达或具有用于递送治疗剂的细胞表面结合/释放亲和性。
2、非丝状生物体可被基因工程化，以表达或具有用于递送治疗剂的结合/释放亲和性。
3、可通过组成型化合物合成，或临时碱降解释放特征(治疗剂结合亲和力)而释放治疗剂
4、两种(1-2)细胞可被工程化，以检测植入的组织或细胞外基质中的治疗剂的效价，因此调节治疗剂的合成或释放。
实施方式：自保护支架(感知-应答)
实施例001-005，其中丝状支架有机体和/或共培养的非丝状细胞被基因编程，以感知微生物污染物和病原体(大肠杆菌、葡萄球菌)。
在该实施方式中，非丝状菌株(即，细菌、酵母)被基因工程化，以含有整合至基因组中的多种传感器，其对与微生物污染物，比如表示人健康威胁的细菌和真菌相关的信号，或对丝状支架基质的结构完整性有害的信号做出应答。多种传感器和特异性将通过经遗传逻辑门整合这些传感器而实现，以便积极地鉴定菌株。
工程化的非丝状生物体将与支架共培养并且保持为活细胞，以提供针对感染的主动免疫性。这些共培养菌株将与其他指示剂一起对与污染物相关的特别的模式群体分子做出应答，并且使用分类器电路，以选择正确的抗生素/抗真菌来产生。
1、食品安全性-使食物能够鉴定病原性微生物(即，大肠杆菌、沙门氏菌、梭菌属(Clostridium)等)的存在，和通过表达和分泌物种特异性的抗生素启动应答，以抑制或杀死所述污染物。
2、植入-使活细胞支架基质能够感知疑似微生物污染物(即，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等)的存在并且启动应答，以在外科植入之前和之后抑制或杀死入侵微生物。
实施方式：活支架功用
实施例001-005和[007]生物体，使丝状和非丝状细胞能够表达限制性的营养物需要，用于成功的培养和外科植入支架活力。
1、定位共培养微生物组中作为自然生长促进生物的微生物并且靶向富集。
2、基因工程化[007]微生物，以在培养/支架组装过程中促进增强的系统广泛生长，
3、基因工程[007]微生物，一旦作为医学装置植入，以支持支架健康和可持续性。
实施方式：组织生成/支架去除
实施例001-005，其中丝状支架有机体用于支持共培养的细胞(即，成肌细胞)的粘附和分化，以确立有功能的组织形式，即，医学装置、食物等。
1、在组织(即，医学植入、食物)预期可用的寿命整个期间，支架保持为形成的组织的一部分，并且继续提供结构支持或促进附着的细胞的活力和/或生长。
2、从最终组织形式“去除”支架。使用酶、化合物、pH、热化学应用等，使丝状支架体外或原位降解。
3、可在形成最终组织的期间(即，在发酵罐中)，通过从外部来源进料至反应器，或从共培养的细胞(粘附的或游离漂浮的)表达所述降解试剂，引入降解支架的酶、化合物、小分子或其他底物。
4、也可通过在二级反应器中的微生物产生降解试剂。可分离和纯化试剂，或在细胞悬液中使用，接着转移至最终组织，以去除或降解丝状支架基质，留下“纯组织”即，成肌细胞等。
因此，本发明提供了生成菌丝体支架的方法，其利用丝状真菌的表型可塑性，以产生具有具体靶向的网络形态的真菌支架材料。
本发明也提供了用于在浸泡生物反应器系统中实施的菌丝体支架，用于基于细胞的肉类技术。
本发明也提供了菌丝体支架，其提供优化的纤维状的复合基底，用于悬液或深层培养中哺乳动物细胞的粘附、增殖和集聚。
本发明也提供了产生生物相容的和生物可降解的菌丝体支架的方法，所述菌丝体支架具有独特的制造可塑性，允许孔隙率和结构独特地可调节用于生物医学应用。

Claims (20)

1.一种生成菌丝体支架的方法，其包括下述步骤：将丝状有机体接种至培养基中，所述培养基含有用于所述有机体的培养和生长的营养物，和在限定的环境中将所接种的培养基温育足够的时间用于从所述培养基生长真菌学生物聚合物的生长，而不在其中产生菌柄、菌盖或孢子，特征在于真菌为生物相容的物种和作为一件独立支架从所述培养基去除真菌学生物聚合物的生长。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述真菌为丝状有机体并且进一步的特征在于下述步骤：将非丝状有机体引入所述培养基中，用于所述丝状有机体和所述非丝状有机体温育和共培养成所述支架。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述非丝状有机体为牛科动物、禽类和鱼细胞系中的一种的脊索动物肌细胞。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述丝状有机体为硫磺菌属(Laetiporus)物种并且所述非丝状有机体为牛科动物的脊索动物肌细胞。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述丝状有机体为根霉菌属(Rhizopus)的腐生真菌并且所述非丝状有机体为软体动物门(Mollusca)的成肌细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，进一步的特征在于：使所述真菌学生物聚合物生长脱细胞，以形成脱细胞的丝状支架，其后添加液体培养基，用于选择的非丝状有机体的细胞系的培养；将非丝状有机体接种至所述液体培养基中，并且使所接种的液体培养基温育足够的时间，用于所述非丝状有机体生长成细胞化的丝状支架，以形成复合细胞团块。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基为生物反应器容器中的液体培养基并且进一步的特征在于：以靶向具体所得丝状小球尺寸的接种率温育所接种的培养基，所述具体所得丝状小球尺寸为下游质地和支持生长的细胞粘附而被优化；将所接种的液体培养基的粘度保持在足够将溶氧保持在用于丝状有机体培养成丝状网络的程度；并且以足够影响从所述丝状网络表达具体的三维丝状小球形态的程度搅拌所接种的培养基。
8.根据权利要求7所述的方法，进一步的特征在于下述的步骤：以逐滴方式将所接种的培养基施加至预成型的元件的表面足够的时间，用于在所述表面上形成菌丝体薄片，然后作为一件独立支架从所述元件去除所述菌丝体薄板。
9.根据权利要求7所述的方法，进一步的特征在于下述的步骤：将非丝状有机体引入至所述生物反应器容器中的所述液体培养基中，用于所述丝状有机体和所述非丝状有机体的温育和共培养。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述丝状有机体为可食用真菌，其产生有软毛的小球形态并且所述非丝状有机体为牛肌细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述丝状有机体为硫磺菌属物种并且以靶向所得丝状小球形态的具体质地质量的比率接种至所述液体培养基，其中降低所述比率实现更大的小球尺寸并且增加所述比率实现更小的小球尺寸。
12.根据权利要求7所述的方法，进一步的特征在于以下步骤：在用于培养其中的所述牛肌细胞的搅拌步骤之前，将接种非丝状牛肌细胞的第二液体培养基添加至所述容器中，和在搅拌以形成复合细胞团块的步骤之前，将所接种的第二培养基温育足够的时间，用于所述牛肌细胞生长至所述丝状网络中。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基在生物反应器容器中并且进一步的特征在于：将所述容器中的所述培养基温育足够的时间和在足够影响所述培养基外部的具体三维丝状网络形态的表达的条件下温育；和在所述丝状网络形态的表达期间，将至少一层选择的材料沉积在所述丝状网络形态上，以赋予所述丝状网络形态预定的特征，然后作为一件独立支架去除所述丝状网络形态。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述选择的材料为激素和矿物质的一种。
15.根据权利要求13所述的方法，进一步的特征在于：在从所述容器去除之后，用预定的形状将所述丝状网络形态图案化。
16.根据权利要求1所述的方法，进一步的特征在于：将二级生物相容的材料引入所述支架，以赋予所述支架期望的特征。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述二级生物相容的材料为琼脂糖和明胶的一种，以提供二级交联剂。
18.根据权利要求16所述的方法，进一步包括下述步骤：
将来自木瓜提取物的壳质酶施加至所述支架，以改善质地，
其后在1摩尔乙酸中加热所述支架，以进一步修饰质地，
其后用植物脂肪灌输所述支架，
在自溶酵母、烟熏风味剂、番茄提取物和香料中浸泡所述支架，
用矿物质和维生素强化所浸泡的支架，和
烹饪所强化的支架直到酥脆，以产生非动物咸肉样产品。
19.根据权利要求1所述的方法，进一步的特征在于下述步骤：使所述真菌学生物聚合物在支架托盘单元中生长；将空气递送至所述托盘单元，用于其中所述真菌学生物聚合物的生长；其后使所述真菌学生物聚合物脱细胞，以在所述支架托盘单元中形成脱细胞的丝状支架；将含有生长因子的胎牛血清的流引入所述丝状支架中；其后将牛肉肌细胞的流递送至所述脱细胞的丝状支架，用于附着至所述丝状支架和在所述丝状支架中形成菌丝和肌细胞的复合团块；和将所述团块加工为替代肉类产品。
20.一种用于生成替代肉类产品的设备，其包括：
支架托盘单元，用于容纳接种丝状有机体的培养基并且用于从中生长连续菌丝网络；
所述支架托盘单元中的分散器，用于将空气递送至所述托盘单元并且用于在其中生长菌丝网络；
连接至所述支架托盘单元中所述分散器的扩散器，用于将空气扩散在所述托盘单元上并且用于在其中生长菌丝网络；和
肌细胞悬浮反应器单元，用于牛肉肌细胞与所述支架托盘单元交流，以将牛肉肌细胞的流递送至所述支架托盘单元的菌丝网络中。
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