KR102550483B1

KR102550483B1 - 버섯 균사체 매트의 제조방법 및 이를 통해 제조된 버섯 균사체 매트

Info

Publication number: KR102550483B1
Application number: KR1020220073700A
Authority: KR
Inventors: 신현재; 최문희; 김다송; 정용현
Original assignee: 조선대학교산학협력단
Priority date: 2022-06-16
Filing date: 2022-06-16
Publication date: 2023-06-30

Abstract

본 발명은 버섯 균사체 매트를 단시간 내에 효과적으로 제조할 수 있는 방법 및 이를 통해 제조된 버섯 균사체 매트에 관한 것이다. 본 발명의 버섯 균사체 매트의 제조방법은 비교적 단순한 공정을 통해, 종래 기술 대비 균막 형성 시점(Initial day)을 10일 이상 단축시킬 수 있으며, 배양 30일 정도에 두께 1cm 이상의 버섯 균사체 매트를 형성시킬 수 있어, 장시간 요구되는 배양기간을 유의미하게 단축시키는 효과가 있다.

Description

버섯 균사체 매트의 제조방법 및 이를 통해 제조된 버섯 균사체 매트{Manufacturing method of mushroom mycelium mat and mushroom mycelium mat manufactured by the same}

본 발명은 버섯 균사체 매트를 단시간 내에 효과적으로 제조할 수 있는 방법 및 이를 통해 제조된 버섯 균사체 매트에 관한 것이다.

최근 전 세계적으로 동물인권, 환경보호에 대한 인식이 높아지며 동물성 제품을 대체하려는 움직임이 대두되고 있다.

그 중 가죽소재를 기존의 동물에서 수득하는 것이 아닌, 식물을 활용하여 제작하는 기술 연구가 활발히 진행되는 추세이다.

여기서 가죽소재란 동물의 피부를 벗겨내어 만든 광물화된 동물 섬유로서, 가죽소재 생산을 위하여 송아지, 양과 같은 동물이 끊임없이 도살되고 있으며, 동물 복지와 생명권 침해 등 비윤리적인 문제점이 있다. 뿐만 아니라, 가죽 산업을 위한 축산업에서 발생하는 분뇨와 가죽 제조 시 공장에서 사용되는 화학물질에 의한 환경오염을 야기할 수 있다. 따라서 이러한 오염을 감소시키고 동물의 복지를 향상시키기 위해 떠오른 소재가 바로 버섯 균사체 소재이다. 현재 미국의‘Ecovative design’사를 주축으로 하는 다양한 기업들이 버섯 균사체를 활용하여 가죽소재, 건축재, 동물성 고기 등 대체재에 관련된 연구를 진행하며 다양한 결과를 내놓는 추세이다. 그 예시로, 미국 친환경 기업‘Mycoworks’사는 명품 패션브랜드‘Hermes’와 협업하여 가죽소재를 활용한 패션상품을 개발하기도 하였다. 그러나 버섯 균사체를 가죽소재로 활용하기 위해 소요되는 배양기간이 길어 경제성과 효율성에 단점이 존재하기 때문에 품질이 좋은 버섯 균사체 소재를 단기간에 생산하고자 다양한 배양방법이 시도되고 있다.

종래 알려진 버섯 균사체 배양의 경우 폴리프로필렌 백(polypropylene bag)에 기질을 담아 1차적으로 균사체-기질 복합체를 배양시킨 뒤, 이를 분쇄하여 깊이가 얕은 배양용기에 담아 2차 배양 후 버섯 균사체 소재를 생산하고 있다. 그러나, 이러한 배양 방법은 1차 배양에서 18 ~ 21일이 소요되고, 2차 배양에서 30 ~ 31일이 소요되어, 결과적으로 48 ~ 60일 정도가 소요되는바, 버섯 균사체를 매트 형태로 배양함에 있어서 오랜 시간을 소요하는 단점이 있다.

이에, 본 발명자는 상기와 같이 장시간 요구되는 배양기간을 유의미하게 단축시킬 수 있는 새로운 버섯 균사체의 배양방법을 도출하고자 하였다. 그 결과, 배양 용기(box)에 톱밥과 미강이 혼합된 혼합배지를 채우고, 균사체 접종을 위한 다수의 접종구(hole)를 동일 간격으로 형성시킨 후, 버섯 균사체에 질소원이 강화된 액체배지를 혼합한 균액을 상기 접종구에 접종시켜 배양하는 경우, 균막 형성 시점(Initial day)이 종래 18 ~ 21일에서 8 ~ 9일로 단축되고(10일 이상 단축됨), 배양 30일 이후에 두께 1cm 이상의 버섯 균사체 매트를 형성할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2004-0012238호

따라서 본 발명의 목적은 버섯 균사체를 단시간에 효과적으로 배양할 수 있는 버섯 균사체 매트의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 방법으로 제조된 버섯 균사체 매트를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 a) 배양 용기에 톱밥과 미강이 혼합된 혼합배지를 채우는 단계; b) 혼합배지에 다수의 홀(hole)을 동일 간격으로 형성시키는 단계; c) 배양 용기를 밀봉하여 고온에서 멸균하는 단계; d) 버섯 균사체에 질소원이 강화된 액체배지를 혼합한 균액을 상기 다수의 홀(hole)에 접종하는 단계; 및 e) 암실에서 23℃ ~ 27℃ 온도 및 습도 80% ~ 90% 조건으로 배양하는 단계를 포함하는, 버섯 균사체 매트의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 a) 단계에서 톱밥과 미강은 8:2의 부피비로 혼합될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, a) 단계에서 혼합배지는 탄산칼슘(CaCO₃) 또는 n-아세틸 글루코사민을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 질소원이 강화된 액체배지는 펩톤, 덱스트로오스, 효모추출물, 맥아추출물 및 질산암모늄을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 버섯 균사체는 붉은덕다리버섯(Laetiporus sulphureus), 메꽃버섯부치(Microporus affinis), 영지버섯(Ganoderma lucidum), 치마버섯(Schizophyllum commune), 구름송편버섯(Trametes versicolor), 삼색도장버섯(Daedaleopsis tricolor), 잔나비걸상버섯(Elfvingia applanata), 참바늘버섯(Mycoleptodonoides aitchisonii), 소나무잔나비버섯(Fomitopsis pinicola), 흰주름버섯(Agaricus arvensis), 표고버섯(Lentinula edodes), 솔뿌리혹버섯(Wolfiporia extensa), 장수버섯(Fomitella fraxinea) 및 시루송편버섯(Trametes orientalis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 버섯 균사체일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 버섯 균사체 매트를 제공한다.

본 발명의 버섯 균사체 매트의 제조방법은 비교적 단순한 공정을 통해, 종래 기술 대비 균막 형성 시점(Initial day)을 10일 이상 단축시킬 수 있으며, 배양 30일 정도에 두께 1cm 이상의 버섯 균사체 매트를 형성시킬 수 있어, 장시간 요구되는 배양기간을 유의미하게 단축시키는 효과가 있다.

도 1은 기균사(aerial hyphae), 생물막 균사(biofilm hyphae) 및 침투성 균사(penetrative hyphae)로 이루어진 균사체의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 2a는 종래 버섯 균사체 배양방법을 개괄적으로 나타낸 모식도이며, 2b는 본 발명의 버섯 균사체 배양방법을 개괄적으로 나타낸 모식도이다.
도 3은 시루송편버섯 (ToM) 균사체의 성장 기간에 따른 균사체 무게를 측정한 결과이다.
도 4는 시루송편버섯 (ToM) 균사체를 12종의 배지에 접종한 후 6일차되는 시점에서 배양 온도(23℃, 25℃, 27℃)에 따른 방사형 성장(radial growth)을 측정한 결과이다.
도 5는 시루송편버섯 (ToM) 균사체를 12종의 배지에 접종한 후 배양 온도(23℃, 25℃, 27℃)에 따른 성장을 관찰한 사진이다.
도 6은 본 발명의 버섯 균사체 배양방법(Hole box cultivation)을 통해 시루송편버섯 (ToM) 균사체를 배양함에 있어서, 균사체와 함께 접종되는 액체배지의 종류별(YMB, mYMB3, mYMB6) 시간 경과에 따른 균사체 배양 및 성장 양상을 관찰한 사진이다.
도 7은 본 발명의 버섯 균사체 배양방법(Hole box cultivation)을 통해 시루송편버섯 (ToM) 균사체를 배양함에 있어서, CaCO₃ 또는 N-아세틸 글루코사민을 포함하는 톱밥배지에서 성장한 ToM의 균사체 매트 표면을 나타낸 사진이다(A: CaCO₃, B: N-아세틸 글루코사민).
도 8은 본 발명의 버섯 균사체 배양방법(Hole box cultivation)으로 배양이 완료된 후 채취한 버섯 균사체 매트의 샘플을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 버섯 균사체 배양방법(Hole box cultivation)을 통해 시루송편버섯 (ToM) 균사체를 배양함에 있어서, 다양한 농도(0.5%, 10.%, 1.5%)의 CaCO₃ 또는 N-아세틸 글루코사민을 포함하는 톱밥배지에서 성장한 ToM의 균사체 매트의 인장강도를 측정한 것이다.
도 10은 본 발명의 버섯 균사체 배양방법(Hole box cultivation)을 통해 시루송편버섯 (ToM) 균사체를 배양함에 있어서, 다양한 농도(0.5%, 10.%, 1.5%)의 CaCO₃ 또는 N-아세틸 글루코사민을 포함하는 톱밥배지에서 성장한 ToM의 균사체 매트의 연신율을 측정한 것이다.
도 11은 본 발명의 버섯 균사체 배양방법(Hole box cultivation)을 통해 시루송편버섯 (ToM) 균사체를 배양함에 있어서, 다양한 농도(0.5%, 1.0%, 1.5%)의 CaCO₃ 또는 N-아세틸 글루코사민을 포함하는 톱밥배지에서 성장한 ToM의 균사체 매트의 밀도를 측정한 것이다.

본 발명은 버섯 균사체 매트를 단시간 내에 효과적으로 제조할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명에서 ‘버섯 균사체(mycelium)’란 버섯이 생존하기 위해 영양을 흡수하는 기관을 의미한다. 버섯류는 영양기관인 균사체(菌絲體)와 번식기관인 포자를 지닌 자실체(子實體)로 되어 있는데, 균사체는 일반 식물 기준으로 뿌리/줄기/잎에 해당하며, 자실체는 꽃에 해당한다.

버섯 균사체의 세포벽은 키틴(chitin)과 β-1,3 글루칸(β-1,3 glucan)의 미세섬유들이 직조된 멤브레인 위에 다당류(α-1,3-글루칸) 및 당단백질(주로 mannan 혹은 galactomannoproteins)들이 비정질 겔형 매트릭스가 연결되어있는 구조를 가지고 있다. 키틴과 β-1,3 글루칸은 세포벽의 구조를 유지하는 요소 성분으로 특히, 키틴은 균사섬유의 기계적인 강성에 있어 매우 중요한 성분이다.

생장 중인 버섯 균사는 양분 지양성을 가지며, 끝단을 팽창하면서 영양분을 섭취, 생장한다. 균사의 팽창 후에는 세포벽에서 선단이 형성되어 분지가 발생할 수 있으며, 연속적이고 특징적인 방사형태로 뻗어나간다. 이러한 분지는 여러 방향으로 신장하여 균사간의 수많은 융합이 발생한다. 균사 간의 융합은 재료적 측면에서는 균일성을 가지고 있으며, 기계적 측면에서는 균사의 미세그물망 형성으로 기계적 강성이 높아진다. 버섯 균사체는 균사가 얽혀 망상층을 형성하고 있으며, 동물가죽의 진피층과 유사한 미세구조를 가지고 있다. 하지만 균사의 밀도가 높지 않아 내구성과 강도가 약하다.

균사는 크게 기균사(aerial hyphae), 생물막 균사(biofilm hyphae) 및 침투성 균사(penetrative hyphae) 3가지로 분류될 수 있다(도 1 참조). 기균사(aerial hyphae)는 균사체 증식에 필요한 산소와 이산화탄소를 교환하는 역할을 하며, 생물막 균사(biofilm hyphae)는 기균사와 침투성 균사 사이에 위치하며, 밀도가 높은 매트 형태를 나타낸다. 생물막 균사(biofilm hyphae)는 배지에서의 수분 이탈을 방지하고, 다른 균의 침입을 방지하며, 균사 생장을 위한 수분을 저장한다. 생물막(biofilm)의 두께와 밀도가 높아질수록, 배지 부분에서의 영양 전달(mass transfer)이 어려워져, 생물막(biofilm)과 기균사(aerial hyphae)의 성장은 멈추게 된다. 한편, 침투성 균사(penetrative hyphae)는 배지 내 영양분을 분해하기 위한 효소를 분비하고 분해된 영양분을 섭취하는 역할을 한다.

본 발명자는 생물막 균사(biofilm hyphae)가 두껍게 생장하면 버섯 균사체의 밀도와 기계적 물성이 증가하므로 가죽화소재로서 활용이 가능할 것으로 판단하였다.

본 발명에서 ‘버섯 균사체’란 기균사(aerial hyphae), 생물막 균사(biofilm hyphae) 및 침투성 균사(penetrative hyphae) 중, 좁게는 생물막 균사를 의미하며, 넓게는 기균사 및 생물막 균사를 포함하는 개념이다.

본 발명에서는 버섯 균사체의 기균사(aerial hyphae) 및 생물막 균사(biofilm hyphae)가 성장하여 밀도가 높은 매트(mat)의 형태를 보이는 것을 ‘버섯 균사체 매트’라 명명하였다.

본 발명의 버섯 균사체 매트의 제조방법은, a) 배양 용기에 톱밥과 미강이 혼합된 혼합배지를 채우는 단계; b) 혼합배지에 다수의 홀(hole)을 동일 간격으로 형성시키는 단계; c) 배양 용기를 밀봉하여 고온에서 멸균하는 단계; d) 버섯 균사체에 질소원이 강화된 액체배지를 혼합한 균액을 상기 다수의 홀(hole)에 접종하는 단계; 및 e) 암실에서 23℃ ~ 27℃ 온도 및 습도 80% ~ 90% 조건으로 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 a) 단계는 배양 용기에 균사체의 먹이원이 되는 배양기질을 채우는 단계로서, 자세하게는 상부가 개방되어있는 박스(box) 형태의 배양 용기에 톱밥과 미강이 8:2의 부피비로 혼합된 혼합배지를 채우는 단계이다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 a) 단계에서 혼합배지는 탄산칼슘(CaCO₃) 또는 n-아세틸 글루코사민을 추가로 포함할 수 있다.

상기 혼합배지에 첨가되는 탄산칼슘(CaCO₃) 또는 n-아세틸 글루코사민의 함량은 혼합배지 100중량%를 기준으로 각각 0.5 내지 1.5중량%일 수 있다.

본 발명의 상기 b) 단계는 혼합배지에 다수의 홀(hole)을 동일 간격으로 형성시키는 단계로서, 자세하게는 혼합배지에 균사체 접종을 위한 접종구(hole)를 동일한 간격으로 뚫는 단계이다. 본 발명의 하기 실시예에서는 9개의 접종구(hole)를 형성시켰다.

본 발명의 상기 c) 단계는 배양 용기를 밀봉하여 고온에서 멸균하는 단계로서, 자세하게는 상기 a) 및 b) 단계를 거쳐 다수의 홀(hole)이 형성된 혼합배지를 포함하는 배양 용기를 필터가 부착된 뚜껑을 사용하여 밀봉하고 121℃에서 60분간 멸균하는 단계이다.

본 발명의 d) 단계는 버섯 균사체에 액체배지를 혼합한 균액을 상기 다수의 홀(hole)에 접종하는 단계로서, 자세하게는 버섯 균사체 1 g 당 질소원이 강화된 액체배지 15 mL를 혼합하여 균액으로 제조하고, 이렇게 제조된 균액을 상기 b) 단계에서 형성된 다수의 홀(hole)에 접종하는 단계이다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 질소원이 강화된 액체배지는 펩톤(peptone), 덱스트로오스(dextrose), 효모추출물(yeast extract), 맥아추출물(malt extract) 및 질산암모늄(ammonium nitrate)을 포함할 수 있다.

본 발명의 e) 단계는 버섯 균사체를 배양하는 단계로서, 자세하게는 상기 d) 단계를 거쳐 버섯 균사체를 접종한 혼합배지를 암실에서 23℃ ~ 27℃ 온도 및 습도 80% ~ 90% 조건으로 배양하는 단계이다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 버섯 균사체는 붉은덕다리버섯(Laetiporus sulphureus), 메꽃버섯부치(Microporus affinis), 영지버섯(Ganoderma lucidum), 치마버섯(Schizophyllum commune), 구름송편버섯(Trametes versicolor), 삼색도장버섯(Daedaleopsis tricolor), 잔나비걸상버섯(Elfvingia applanata), 참바늘버섯(Mycoleptodonoides aitchisonii), 소나무잔나비버섯(Fomitopsis pinicola), 흰주름버섯(Agaricus arvensis), 표고버섯(Lentinula edodes), 솔뿌리혹버섯(Wolfiporia extensa), 장수버섯(Fomitella fraxinea) 및 시루송편버섯(Trametes orientalis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 버섯 균사체일 수 있으며, 바람직하게는 시루송편버섯(Trametes orientalis)일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 버섯 균사체는 시루송편버섯(Trametes orientalis)에 200 Gy의 감마선을 24시간 조사하여 수득된 돌연변이 균주일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 a) 내지 e) 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 버섯 균사체 매트를 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 재료 및 방법

<1-1> 사용 균주

본 실험에 사용된 균주는 시루송편버섯 (Trametes orientalis (Yasuda) Imazeki), T05321)으로 ㈜ 마이셀에서 분양받아 사용하였다. 분양 받은 균주는 균사의 활력을 회복시키기 위하여 PDA (Potato Dextrose Agar)배지에 계대배양을 3회 진행하였고, 저온 보관고 (4℃)에 보관하며 사용하였다.

<1-2> 균주 감마선 변이

균막 형성을 위한 우량균주를 확보하기 위하여, 시루송편버섯 균사체를 한국원자력연구원 첨단방사선연구소의 Co-60 저준위 감마선 조사장치 (MDS Nordion, Canada)를 이용하여 200 Gy의 Co-60 저준위 감마선을 24시간동안 처리하였다. 감마선 조사가 끝난 균주는 백금이를 이용하여 무작위로 채취한 후 PDB(Potato Dextrose Broth) 배지에 접종하고, 3일간 항온배양기 (25℃, 암조건)를 이용하여 배양하였다. 배양이 완료된 후 균질기를 이용하여 10,000 rpm으로 60초간 분쇄하고 손상된 균사의 회복을 위해 항온배양기 (25℃, 암조건)에서 24시간 정치배양하였다. 이후 PDA 배지에 10 mL씩 도말하고 항온배양기 (25℃, 암조건)를 이용하여 배양 및 활성화된 콜로니(colony)를 채취하였다. 채취된 균주는 모균주와의 대치배양을 통해 독립성을 검정하여 시루송편버섯 돌연변이 균주 (Trametes orientalis mutation, 이하 ‘ToM’라 약칭함)를 획득하였다.

<1-3> 최적 배양조건 확립

[균주 생장]

ToM 균주의 생장을 파악하기 위해 yeast malt extract broth (YMB; yeast extract 3g/L, malt extract 3 g/L, peptone 5 g/L, dextrose 10 g/L) 배지를 삼각플라스크에 200 mL씩 제조 후, 플라스크 입구를 sili stopper로 봉하여 121℃에서 20분간 멸균 후 냉각하였다 (Antinori, M.E., et al. 2021). 접종할 균사체는 3000 rpm에서 20분간 원심분리 후 상등액을 제거한 균사체를 활용하였으며, 배지가 담긴 8개의 플라스크에 ToM 균사체 5 g씩 접종하고 24시간 간격으로 8일 동안 균사체의 무게를 측정하였다.

[최적 고체배지 규명]

ToM 균주의 최적 고체배지 선정을 위하여 버섯 균사체의 성장에 중요한 영양원인 질소원을 YMA 배지에 강화시켜 고효율의 성장효과를 확인하였다 (Choi, D. B., et. al. 2007; Mikiashvili, N., et. al. 2005; Ma, Y., et. al. 2014; Ribeiro, B., et. al. 2008). 기본배지로 사용한 YMA의 조성 (yeast extract 3 g/L; malt extract 3 g/L; peptone 5g/L; dextrose 10 g/L; agar 15 g/L)에 복합질소원 (yeast extract, malt extract) 및 무기질소원 (ammonium nitrate, sodium nitrate, ammonium chloride)의 함량을 조절하여 총 12종의 배지를 제작 후 실험에 활용하였다 (하기 표 1 참조).

ToM 균주의 배양을 위한 질소 농축 배지의 조성 (단위: g/L)

배지	펩톤	덱스트로스	효모 추출물	맥아 추출물	질산 암모늄	질산 나트륨	염화 암모늄
YMA	5.0	10.0	3.0	3.0	-	-	-
mYMA1	5.0	10.0	3.0	10.0	-	-	-
mYMA2	5.0	10.0	10.0	3.0	-	-	-
mYMA3	5.0	10.0	3.0	30.0	-	-	-
mYMA4	5.0	10.0	30.0	3.0	-	-	-
mYMA5	5.0	10.0	30.0	30.0	-	-	-
mYMA6	5.0	10.0	3.0	3.0	3.0	-	-
mYMA7	5.0	10.0	3.0	3.0	30.0	-	-
mYMA8	5.0	10.0	3.0	3.0	-	3.0	-
mYMA9	5.0	10.0	3.0	3.0	-	30.0	-
mYMA10	5.0	10.0	3.0	3.0	-	-	3.0
mYMA11	5.0	10.0	3.0	3.0	-	-	30.0

[최적 온도 규명]

ToM 균주의 최적 배양온도를 규명하기 위해 화염멸균된 cork-borer (No 5.)를 사용하여 YMA 배지에 배양된 ToM 균주의 균사체 block을 채취하여, YMA ~ mYMA11 의 12종 배지 중앙에 접종하였다. 이후, 23℃, 25℃, 27℃ 온도로 설정된 항온배양기에서 4일간 배양하여 배양된 균사체 지름을 측정하였고, 각 실험당 3번씩 반복 실험하였다.

<1-4> 배양 방법

[1차 봉지배양 (Polypropylene bag cultivation) 후 2차 박스배양 (Box cultivation)]

참나무 톱밥과 미강을 8:2의 부피비로 혼합한 후 배지 수분을 55%로 조절하였다. 내열성 P.P (polypropylene) 필름으로 제작된 봉지에 1,000 g씩 배지를 채워 고압멸균기로 121℃, 60분간 멸균하였으며, 배지 온도를 20℃까지 냉각시켰다. 이후 YMB 배지에서 14일간 배양한 ToM 균사체를 균질기로 5000 rpm에서 20초간 잘게 분쇄하여 제작된 균액 50 mL를 톱밥배지에 접종하였고 암실, 27℃, 습도 80% ~ 90% 조건에서 18일간 배양하였다. 1차 배양이 완료된 후, 배지를 클린벤치에서 잘게 분쇄하여 121℃에서 60분간 멸균된 배양용기 (155 × 155 × 87 mm, HPL822D, LOCK & LOCK, Korea)에 채웠으며, 지름 1 cm의 구멍을 6개 내어 필터를 부착한 뚜껑으로 밀봉하였다. 이를 1차 배양과 동일한 조건에서 30일간 2차 배양하여 균막 형성을 관찰하였다 (도 2a 참조).

[Hole 박스 배양 (Hole box cultivation)]

참나무 톱밥과 미강을 8:2의 부피비로 혼합한 후 배지 수분을 55%로 조절하여 배양용기 (155 × 155 × 87 mm, HPL822D, LOCK & LOCK, Korea)에 300 g씩 채웠다. 톱밥배지에 접종을 위한 9개의 접종구를 동일한 간격으로 뚫고, 필터가 부착된 뚜껑을 사용하여 밀봉했으며, 121℃에서 60분간 멸균 후 냉각하였다. YMA 배지에서 14일간 성장한 ToM 균사체를 5000 rpm에서 20초간 균질기로 잘게 분쇄하였으며, 3000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 상등액을 제거하여 균사체를 수거하였다. 톱밥배지의 각 접종구에는 수거된 균사체 1 g당 질소원 강화된 최적 액체배지 15 mL를 혼합한 균액을 접종하였다. 암실에서 27℃, 습도 80 ~ 90%, 조건으로 30일간 배양하여 균막 형성을 관찰하였다 (도 2b 참조).

참고로, 상기 질소원 강화된 최적 액체배지는 표 1에서 mYMB3 또는 mYMB6 조성의 배지로, 고체배지 제작 시 첨가되는 한천(agar)을 제외한 형태의 액체배지를 의미한다.

[균사체 매트 강화 조건 연구]

균사체 매트의 강성을 강화시키고 생장을 촉진시키기 위해 세포벽 강화에 도움을 주는 Ca 이온이 함유된 CaCO₃와, 균사체의 구성성분인 N-아세틸 글루코사민(N-acetyl glucosamine)을 일정 비율 (0.5, 1.0, 1.5중량%)로 톱밥배지에 첨가하였다. 미리 준비된 배양용기 (155 × 155 × 87 mm, HPL822D, LOCK & LOCK, Korea)에 톱밥배지를 300 g씩 채운 후 9개의 접종구를 뚫었으며, 필터가 부착된 뚜껑으로 밀봉하여 고압멸균기에서 121℃, 60분간 멸균 및 냉각하였다. 액체배지에서 성장한 ToM 균사체는 5000 rpm에서 20초간 균질기로 잘게 분쇄하였고, 3000 rpm에서 20분간 원심분리를 진행한 후 상등액을 제거하여 균사체를 수거하였다. 상기 액체배지는 YMB, mYMB3, mYMB6 조성의 액체배지 중 1개일 수 있다. 톱밥배지의 각 접종구에는 수거된 균사체 1 g당 새로 제작한 질소원 강화 최적 액체배지 15 mL가 혼합된 균액을 접종하였다. 암실에서 27℃, 습도 80% ~ 90%, 조건으로 30일간 배양하여 균막의 형성을 관찰하였다.

<1-5> 강화 균사체 매트 배양 및 물리적 특성

배양 용기의 배지 표면에서 균막이 형성되는 시점을 initial day로 표시하였다. 또한 용기에 접종 30일 후 균사체 매트를 수거하여 무게 (weight), 인장강도 (tensile strength), 신장률 (elongation rate), 밀도 (density)를 측정하였다. 균사체 매트의 무게는 잔여 톱밥을 모두 제거한 순수한 균사체 매트만을 활용하여 측정되었으며, 인장강도 및 신장률은 55 × 20 mm 균사체 매트 샘플을 UTM (AGS-X, Shimadzu, Japan)기기를 이용하여 인장속도 100±20 mm/min조건에서 측정하였다. 밀도는 gas pycnometer (Ultrapyc 5000 Foam, Anton Paar, Austria)를 사용하여 3.0 psi, 20℃조건에서 측정하였다.

2. 결과

<2-1> 최적 배양조건 확립

ToM 균주의 생장은 배양 1일차에서 3일차까지 완만한 상승을 하고, 3일차 이후부터 성장률이 상승하기 시작하였다. 또한 7일차 이후부터는 성장률이 서서히 감소하는 추세를 보였다 (도 3 참조). 결과적으로 5 g의 균사체는 YMB배지에서 8일간 1.009 g 성장하였다.

한편, 3가지 온도 조건(23℃, 25℃, 27℃) 및 12종의 배지에서 ToM 균사체의 4일차 방사형 성장(radial growth)을 비교한 결과, 모든 배지는 23℃에서 저조한 성장을 보였고, 27℃에서 우수한 성장을 보였다 (표 2, 도 4 & 5 참조). YMA 배지는 28.67 ± 0.41 mm의 성장률을 보였고, 군집형태는 적당한 밀도 (dense)로 퍼져나가는 점을 관찰하였다. 가장 높은 방사형 성장(radial growth)을 나타낸 실험군은 27℃에서 맥아추출물(malt extract)이 30 g/L 함유된 mYMA3 배지로 배양된 ToM 균사체가 35.75 ± 0.52 mm의 성장률을 나타내었으며, 균사체가 배지 표면에서 성장할 뿐만 아니라 균사끼리 촘촘하게 얽혀 기균사 (aerial hyphae)를 높게 형성하는 고밀도 (highly dense)의 성장 형태를 보였다. 또한, 질산암모늄(ammonium nitrate)이 3 g/L함유된 mYMA6 배지는 27℃에서 35.17 ± 0.68 mm의 성장률과 고밀도의 성장형태를 보이는 것을 확인하였다.

본 실험에서는 질소원 강화로 사용한 질소원 중 질산암모늄(ammonium nitrate) 성분이 ToM 균사체 매트 형성에 도움을 주는 것을 확인하였다. 그러나 무기 질소원이 고농도 (30 g/L ammonium nitrate, sodium nitrate, ammonium chloride)로 첨가된 배지에서는 균사체의 성장이 거의 나타나지 않았다. 이는 복합질소원과는 다르게 무기질소원이 고농도로 배지에 함유될 시, 균사 생장이 억제되는 것을 시사한다. 결과적으로 ToM 균사체의 생장을 유의미하게 촉진시킬 수 있는 조건은 mYMA3 (malt extract 30 g/L) 또는 mYMB6 (ammonium nitrate 3 g/L)이며, 최적 배양온도는 27℃임을 확인하였다.

온도에 따른 질소 농축 배지에서 ToM 균사체의 특성

배지	온도	방사형 성장 (mm in 4d)	균사 특징
YMA	23℃	19.92 ± 0.38	Dense
	25℃	23.42 ± 0.38
	27℃	28.67 ± 0.41
mYMA1	23℃	20.75 ± 0.27	Highly dense
	25℃	27.33 ± 0.41
	27℃	30.17 ± 0.26
mYMA2	23℃	20.00 ± 0.45	Dense
	25℃	26.25 ± 0.27
	27℃	30.42 ± 0.66
mYMA3	23℃	25.17 ± 0.52	Highly dense
	25℃	28.58 ± 0.38
	27℃	35.75 ± 0.52
mYMA4	23℃	23.42 ± 0.58	Dense
	25℃	27.58 ± 0.49
	27℃	32.17 ± 0.26
mYMA5	23℃	23.50 ± 0.63	Dense
	25℃	27.92 ± 0.20
	27℃	34.92 ± 0.49
mYMA6	23℃	23.25 ± 0.42	Highly dense
	25℃	26.33 ± 0.52
	27℃	35.17 ± 0.68
mYMA7	23℃	Not determined	Low dense
	25℃	Not determined
	27℃	7.08 ± 0.49
mYMA8	23℃	25.25 ± 0.42	Highly dense
	25℃	27.69 ± 0.69
	27℃	33.42 ± 0.66
mYMA9	23℃	Not determined	Low dense
	25℃	Not determined
	27℃	Not determined
mYMA10	23℃	25.33 ± 0.61	Highly dense
	25℃	27.50 ± 0.77
	27℃	31.17 ± 0.61
mYMA11	23℃	Not determined	Low dense
	25℃	Not determined
	27℃	8.08 ± 0.38

<2-2> 배양 방법에 따른 균사체 매트 특성

[1차 배양 후 2차 배양, Hole 박스배양 방식에서의 균사체 매트 특성 비교]

P.P 봉지에 접종하여 진행한 ToM 균주의 1차 배양은 18~21일이 소요되었다. 1차 배양이 종료된 균사체-톱밥 복합체는 단단하게 결합되었으며, 이를 배양용기에 분쇄하여 배양하는 과정에서 배지 표면의 균막은 2차 배양 이후 3일이 지난 시점에서 형성되었다. 균사체 매트를 생산하는 2차 배양은 총 30일~40일이 소요되었다. 결과적으로 P.P 봉지 1차 배양 후 배양 용기에 2차 배양을 진행하는 방식은 48일~60일 정도가 소요되는 것을 확인하였다. 이러한 배양 방식은 상당히 오랜 시간을 소요하는 단점이 있다.

종래 연구를 참고하여 배양용 톱밥배지를 용기에 채우고 균사체를 접종할 구멍을 여러 개 뚫은 후, 동일한 양의 균액을 접종하여 최적 조건에서 배양시키는 본 실험은 배지의 모든 곳에서 균사체가 최대한 동일하게 성장하고 기존의 방식보다 더욱 빠르게 매트를 생산하는데 목표를 두었다. 또한, P.P 봉지에 접종하는 균액 50 mL의 원심분리 및 상등액을 제거할 시, 균사체 2.240±0.051 g이 함유되어 있는 것을 확인하였고, hole 박스배양의 균사 접종 농도를 늘리기 위해 균액을 원심분리하여 상등액 제거 후 각 접종구에 균사체 1 g당 새로 제작한 액체배지 15 mL씩 총 9 g의 균사체를 접종하였다.

그 결과, 톱밥배지에 YMB 배지 균액을 접종한 실험군은 10.50±0.55일차에 균막이 형성되었으며, mYMB3과 mYMB6 배지 균액은 각각 8.67±0.52, 8.83±0.41일차에 균막이 형성되는 것을 관찰하였다(도 6 참조).

또한 두 방법에서 생산된 매트의 무게와 색상은 거의 동일하였으며, hole 박스배양 방식은 기존에 사용된 방식과 비교하여 단축된 기간에 비슷한 품질의 균사체 매트 생산이 가능한 것을 확인하였다(표 3 참조).

배양 방법에 따른 균사체매트 성장 비교

배양 방법	질소원 강화된 액체배지	균막 형성 시점 (Initial day)	중량(g)	성장률
P.P 봉지(1차) + 박스 배양(2차)	YMB	21.67 ± 0.82	30.36 ± 1.01	+
	mYMB3	18.83 ± 0.75	31.76 ± 0.63	++
	mYMB6	19.00 ± 0.63	31.59 ± 0.76	++
홀(hole) 박스 배양	YMB	10.50 ± 0.55	30.78 ± 0.59	++
	mYMB3	8.67 ± 0.52	32.08 ± 1.33	+++
	mYMB6	8.83 ± 0.41	31.64 ± 1.26	+++

[균사체 매트 강화 박스 배양]

0.5%, 1.0%, 1.5% 비율로 CaCO₃와 n-아세틸 글루코사민을 첨가한 톱밥배지에 mYMB3, mYMB6 배지와 혼합한 균액이 접종된 실험군 모두 빠른 성장을 보였다. CaCO₃를 첨가한 톱밥배지는 배지 표면에 균막을 형성하는 균막 형성 시점(initial day)이 6일, n-아세틸 글루코사민을 첨가한 배지는 7일로 균사 성장이 조금 더 촉진되었음을 확인하였다. 또한 모든 실험군은 30일의 배양 후, 두께 1 cm 이상의 균사체 매트를 채취할 수 있었다.

CaCO₃를 첨가한 배지는 n-아세틸 글루코사민을 첨가한 배지보다 더 빠른 성장을 보였으며, CaCO₃의 농도가 증가할수록 mYMB6 균액을 접종한 실험군은 매트의 무게가 증가하였고, mYMB3 균액을 접종한 실험군은 매트의 무게가 감소하는 양상을 보였다. 또한, mYMB3 균액이 접종된 실험군은 초기 성장이 빠른 장점이 있으나 갈변현상의 발생도 증가하는 단점을 보였다. 결과적으로 CaCO₃ 1.5% 배지에 mYMB6을 접종한 실험군이 우수하였다 (표 4 참조).

본 실험에서 n-아세틸 글루코사민이 첨가된 배지는 함량이 높아질수록 매트의 무게는 감소하는 결과를 나타내었다. 또한 n-아세틸 글루코사민이 첨가된 배지는 갈변현상이 빈번하게 발생하여 균사체 매트의 품질이 감소하였다 (도 7 참조).

CaCO₃ 및 N-아세틸 글루코사민을 함유한 배지에서 균사체 매트의 특성

첨가물질	농도	배지	균막 형성 시점 (Initial day)	균사체 매트 무게 (g)
CaCO₃	0.5%	mYMB3	6	42.63 ± 1.13
	0.5%	mYMB6	6	32.42 ± 1.10
	1.0%	mYMB3	6	38.00 ± 0.92
	1.0%	mYMB6	6	43.27 ± 0.79
	1.5%	mYMB3	6	31.37 ± 1.20
	1.5%	mYMB6	6	52.18 ± 1.21
N-아세틸 글루코사민	0.5%	mYMB3	7	43.72 ± 2.06
	0.5%	mYMB6	7	47.96 ± 1.14
	1.0%	mYMB3	7	42.03 ± 1.03
	1.0%	mYMB6	7	40.83 ± 1.17
	1.5%	mYMB3	7	38.51 ± 0.60
	1.5%	mYMB6	7	41.16 ± 0.40

[강화 균사체 매트 물리적 특성]

가. 인장강도 측정

각 실험군의 UTM 측정 결과, CaCO₃가 첨가된 톱밥배지에서 생산한 매트의 인장강도가 비교적 높은 것을 확인하였다. CaCO₃가 첨가된 톱밥배지에서 mYMB3 균액으로 생산된 매트의 인장강도는 CaCO₃의 함량 0.5%에서 1.961±0.467 (N/mm²), 함량 1.0%에서 1.932±0.443 (N/mm²), 함량 1.5%에서 1.832±0.211 (N/mm²)의 수치를 보이며 감소하였고, mYMB6 균액으로 생산된 매트의 인장강도는 CaCO₃의 함량 0.5%에서 1.310±0.154 (N/mm²), 함량 1.0%에서 1.284±0.175 (N/mm²), 함량 1.5%에서 1.134±0.238 (N/mm²)의 수치를 보이며 감소하였다. 따라서 CaCO₃ 함량이 높아질수록 인장강도는 감소하는 경향을 보였다. n-아세틸 글루코사민이 첨가된 톱밥배지에서 mYMB3 균액으로 생산된 매트의 인장강도는 n-아세틸 글루코사민의 함량 0.5%에서 1.129±0.079 (N/mm²), 함량 1.0%에서 0.921±0.088 (N/mm²), 함량 1.5%에서 1.149±0.184 (N/mm²)의 수치를 보이며 함량 0.5% 및 1.5%에서의 인장강도는 유사하고, 1.0% 함량에서만 인장강도가 감소하는 것을 확인하였다. mYMB6 균액으로 생산된 매트의 인장강도는 n-아세틸 글루코사민의 함량 0.5%에서 0.759±0.045 (N/mm²), 함량 1.0%에서 0.460±0.059 (N/mm²), 함량 1.5%에서 0.729±0.085 (N/mm²)의 수치를 보이며 mYMB3의 결과와 유사하게 함량 0.5% 및 1.5%에서의 인장강도는 큰 차이를 보이지 않았으며, 함량 1.0%에서만 인장강도가 감소하였다 (도 9 참조). 무처리군의 인장강도 0.487±0.042 (N/mm²)와 비교하여 전반적으로 균사체 매트의 인장강도가 상승하였다.

나. 연신율 측정

각 실험군의 CaCO₃가 첨가된 톱밥배지에서 mYMB3 균액으로 생산된 매트의 연신율은 CaCO₃의 함량이 0.5%에서 11.536±1.681(%), 함량 1.0%에서 12.958±2.144(%)의 수치를 보이며 증가하였으나 함량 1.5%에서 8.669±0.159(%)의 수치를 보이며 감소하였다. mYMB6 균액으로 생산된 매트의 연신율은 배지 CaCO3의 함량 0.5%에서 9.341±1.644(%), 함량 1.0%에서 13.103±0.829(%), 함량 1.5%에서 14.764±1.339(%)의 수치를 보이며 CaCO₃ 함량이 증가할수록 연신율도 증가하였다. n-아세틸 글루코사민이 첨가된 톱밥배지에서 mYMB3 균액으로 생산한 매트는 n-아세틸 글루코사민의 함량 0.5%에서 12.169±3.269(%), 함량 1.0%에서 10.391±2.994(%), 함량 1.5%에서 12.364±1.868(%)의 수치를 보이며 n-아세틸 글루코사민 함량이 증가함에 따라 연신율이 증가하지는 않았고, 1.0% 함량에서 낮은 연신율을 나타내었다. mYMB6 균액으로 생산한 매트는 n-아세틸 글루코사민의 함량 0.5%에서 11.597±1.591(%), 함량 1.0%에서 13.469±2.582(%), 함량 1.5%에서 14.697±3.958(%)의 수치를 보이며 n-아세틸 글루코사민의 함량이 증가함에 따라 연신율이 증가하는 양상을 보였다. 또한, 모든 실험군은 무처리군의 연신율 5.447±0.270(%)의 수치보다 높은 수치를 보이는 것을 확인하였다 (도 10 참조). 균사체 매트 생산 이후 물리·화학적인 처리로 인장강도 및 연신율을 증가시킨 연구사례가 있으며, 추후 고온압축, 가소화 (plasticization) 또는 가교화 (cross-linking)등의 처리 방법을 통해 매트의 기계적 특성 강화가 가능하다.

다. 밀도 측정

각 실험군의 밀도 측정 결과, 무첨가군 (control)의 밀도 1.329 ± 0.055 g/cm³과 비교하여 CaCO₃ 및 n-아세틸 글루코사민이 함유된 톱밥배지 균사체 매트의 밀도는 무처리군 1.329±0.055 (g/cm³)와 비교하여 전반적으로 상승하였다. CaCO₃가 첨가된 톱밥배지에서 mYMB3 균액으로 생산된 매트의 밀도는 CaCO₃의 함량 0.5%에서 1.418±0.041 (g/cm³), 함량 1.0%에서 1.451±0.070 (g/cm³), 함량 1.5%에서 1.538±0.204 (g/cm³)의 수치를 보이며 증가하였다. mYMB6 균액으로 생산된 매트의 밀도는 CaCO₃의 함량 0.5%에서 2.003±0.302 (g/cm³), 함량 1.0%에서 1.502±0.113(g/cm³), 함량 1.5%에서 1.492±0.049 (g/cm³)의 수치를 보이며 감소하였다. n-아세틸 글루코사민이 첨가된 톱밥배지에서 mYMB3 균액으로 생산한 매트는 n-아세틸 글루코사민의 함량 0.5%에서 1.456±0.108 (g/cm³), 함량 1.0%에서 1.356±0.063 (g/cm³), 함량 1.5%에서 1.701±0.265 (g/cm³)의 수치를 보이며 1.0% 함량에서 밀도가 감소하였다가 1.5% 함량에서 증가하는 결과를 나타내었다. mYMB6 균액으로 생산한 매트는 n-아세틸 글루코사민의 함량 0.5%에서 1.467±0.105 (g/cm³), 함량 1.0%에서 1.396±0.049 (g/cm³), 함량 1.5%에서 1.571±0.095 (g/cm³)의 수치를 보이며 mYMB3의 결과와 유사하게 1.0% 함량에서 밀도가 감소하였다가 1.5% 함량에서 증가하는 결과를 나타내었다. 가장 높은 밀도를 보인 실험군은 CaCO₃ 함량이 0.5%인 배지에서 생산된 균사체 매트였으며, 2.003 ± 0.302 g/cm³의 수치를 나타내었다 (도 11 참조).

n-아세틸 글루코사민이 첨가된 톱밥배지에서 생산되는 균사체 매트는 배양 도중 부분적인 갈변현상이 빈번하게 발생함에 따라 부위별로 기계적인 특성이 상이할 가능성이 높아 균일한 품질의 균사체 매트 생산에는 적합하지 않다고 판단되었다. 결과적으로 순수한 균사체 매트의 인장강도, 연신율은 CaCO₃가 첨가된 톱밥배지에서 비교적 높고, 갈변현상의 발생이 적어 배양과정에서의 오염이 일어나지 않는 것을 전제로 하여 CaCO₃ 1.5% 함량의 톱밥배지에 mYMB6 균액을 접종시키는 방법이 가장 균일한 품질의 균사체 매트 생산이 가능하다고 판단되었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

a) 배양 용기에 톱밥과 미강이 혼합된 혼합배지를 채우는 단계;
b) 혼합배지에 다수의 홀(hole)을 동일 간격으로 형성시키는 단계;
c) 배양 용기를 밀봉하여 고온에서 멸균하는 단계;
d) 버섯 균사체에 질소원이 강화된 액체배지를 혼합한 균액을 상기 다수의 홀(hole)에 접종하는 단계; 및
e) 암실에서 23℃ ~ 27℃ 온도 및 습도 80% ~ 90% 조건으로 배양하는 단계를 포함하는, 버섯 균사체 매트의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 a) 단계에서 톱밥과 미강은 8:2의 부피비로 혼합된 것을 특징으로 하는, 버섯 균사체 매트의 제조방법.
제1항에 있어서,
a) 단계에서 혼합배지는 탄산칼슘(CaCO₃) 또는 n-아세틸 글루코사민을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 버섯 균사체 매트의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 질소원이 강화된 액체배지는 펩톤, 덱스트로오스, 효모추출물, 맥아추출물 및 질산암모늄을 포함하는 것을 특징으로 하는, 버섯 균사체 매트의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 버섯 균사체는 붉은덕다리버섯(Laetiporus sulphureus), 메꽃버섯부치(Microporus affinis), 영지버섯(Ganoderma lucidum), 치마버섯(Schizophyllum commune), 구름송편버섯(Trametes versicolor), 삼색도장버섯(Daedaleopsis tricolor), 잔나비걸상버섯(Elfvingia applanata), 참바늘버섯(Mycoleptodonoides aitchisonii), 소나무잔나비버섯(Fomitopsis pinicola), 흰주름버섯(Agaricus arvensis), 표고버섯(Lentinula edodes), 솔뿌리혹버섯(Wolfiporia extensa), 장수버섯(Fomitella fraxinea) 및 시루송편버섯(Trametes orientalis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 버섯 균사체인 것을 특징으로 하는, 버섯 균사체 매트의 제조방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 버섯 균사체 매트.