KR101339960B1

KR101339960B1 - 그물말 과 조류 당화액으로부터의 유기산 제조방법

Info

Publication number: KR101339960B1
Application number: KR1020120021023A
Authority: KR
Inventors: 김진석; 김진철; 김영운; 최경자; 이승환; 김슬기; 뉴엔마이꾸옹; 박명수
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2012-02-29
Filing date: 2012-02-29
Publication date: 2013-12-10
Also published as: KR20130099475A

Abstract

본 발명은 (a) 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류를 당화시켜 단당류를 포함하는 당화액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 당화액을 탄소원으로 이용하여 미생물을 배양하여 유기산을 제조하는 단계를 포함하는 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류로부터 유기산의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 그물말 과 조류로부터의 화학물질 생산은 옥수수, 밀과 같은 식용자원이 아닌 비식용자원인 조류(algae)를 활용하기 때문에 바이오매스의 산업적 수요가 높아졌을 때 식품 가격 폭등 및 윤리적 문제의 발생 소지가 없고, 안정적으로 자원의 지속적 공급이 가능한 장점이 있다. 본 발명에 따라 생산된 유기산은 바이오 기반의 생분해성 물질로서 바이오플라스틱 및 기타 화학제품의 원료물질로 제공되어 석유대체 화학물질 생산에 기여할 것이다. 특히 젖산 및 숙신산 등은 생분해성 고분자로 전환되어 바이오플라스틱 제조에 활용될 수 있기 때문에 석유계 유래의 난분해성 플라스틱 등을 대체시킬 수 있어 석유화학제품의 환경 및 인축독성 문제를 해결하는데 크게 기여할 것이다.

Description

그물말 과 조류 당화액으로부터의 유기산 제조방법{Methods for Producing Organic Acids from the Saccharified Solution of Hydrodictyaceae Algal Biomass}

본 발명은 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류 당화액으로부터의 유기산 제조방법에 관한 것이다.

석유자원의 고갈, 에너지 수요 증가, 지구온난화와 CO₂ 배출 문제, 환경규제 강화 등의 여러 문제에 직면한 상황에서 미래 환경과 자원고갈을 슬기롭게 대비하기 위해서는 필수적으로 식물자원(바이오매스)의 효율적 활용기술 개발이 필요하다. 이에 적합한 식물자원은 다음의 몇 가지 요인 즉, 1) 식량 및 사료 확보와의 충돌이 최소화 될 것, 2) 생장시 이산화탄소 저감 또는 환경오염 경감 능력이 상대적으로 우수할 것, 3) 생산성이 뛰어나거나 생산물의 산업적 가치가 높아 경제성이 높을 것 등이 필수적으로 구비되어야 한다고 본다. 상기 요인을 비교적 높게 만족시키는 식물은 제3세대 바이오매스라고도 일컫는 조류(algae)이다. 특히 조류 중에는 특정 성분이 고함량 존재하는 종들이 많고 리그닌이 거의 없기 때문에 섬유질계 바이오매스(리그닌 15-30% 함유)보다 값싼 공정개발이 가능하다. 그리고 폐이산화탄소 또는 각종 폐수를 활용하여 재배할 수도 있다. 따라서 이러한 긍정적 기능들을 최대한 활용하면 CO₂ 저감/환경정화/대체에너지 및 친환경 산업원료 생산의 다중효과를 창출할 수 있어 과학계에서는 이에 큰 기대를 가지고 있으며 최근 들어 많은 연구자들이 보다 이용가치가 높은 조류종의 발굴 및 개선, 조류 바이오매스의 생산 또는 이의 활용기술 개발에 많은 노력을 투입하고 있다.

조류(algae)의 산업적 응용은 유가 상승 경험 이전의 경우 건강식품 및 기능성의약품, 색소생산, 양식사료, 화장품 소재 등의 분야로(Karina., Comparative Biochemistry and Physiology, Part C 146:60-78(2007)) 제한되어 왔었으나 유가상승 경험 이후에는 대체에너지원 확보를 위한 미세조류 연구가 전 세계적으로 대단한 열풍으로 진행되고 있다. 주로 바이오디젤 생산기술 개발에 집중되고 있으며(Scott., Current Opinion in Biotechnology, 21:1-10(2010); Mata., Renewable and Sustainable Energy Reviews , 14:217232(2010)), 한편 미세조류 및 해양거대조류를 이용한 바이오에탄올 또는 바이오부탄올 등의 생산기술이 보고되고 있다(Ge., Renewable Energy. 36:84-89(2011); Harun., Renewable and Sustainable Energy Reviews, In press(2011); Adams., J. Appl . Phycol., 21:569574(2009); Lee., J. Korean Ind . Eng . Chem . 20(3):290-295(2009); Isa., Journal of the Japan Institute of Energy, 88:912-917(2009); Ueno., Journal of Fermentation and Bioengineering. 86(1):38-43(1998); Brennan과 Owende, Renew . Sustain . Energy Rev . 14:557577(2010); John., Bioresource Technology, 102:186-193(2011); Choi., Bioresource Technology 101:5330-5336(2010); 강., 대한민국특허 제10-0908425호, 2009; 김., 대한민국 공개특허번호 제10-2009-0025221호, 2009; 이., 대한민국 공개특허 제10-2010-0125104호, 2010; 장., 대한민국특허 제10-0919299호, 2009). 그러나 석유자원 고갈을 대비하여 조류 바이오매스를 화학산업의 원료물질 공급원(chemical feedstocks)으로서 활용하고자 하는 연구, 예를 들면, 바이오플라스틱과 같은 분야로의 활용에 대한 성과는 아직 보고된 바 없다.

바이오플라스틱 산업은 2008년 이후 환경규제 강화 및 친환경제품 선호도 증가에 따라 그 시장이 급속히 확대되고 있어, 현재 플라스틱 전체시장의 1%의 점유율을 가졌지만 환경규제가 강한 미국. 유럽, 일본을 중심으로 연간 13%의 성장률로 빠르게 증가하고 있는 상황이다(Nampoothiri., Bioresource Technology , 101:84938501(2010)). 따라서 현재 많은 연구자가 저비용으로 바이오플라스틱 원료물질을 생산하는 기술개발에 노력을 경주하고 있다. 바이오플라스틱 주요 원료물질로서는 유기산(젖산, 숙신산, 부틸산 등), 폴리하이드록시알카노에이트(Polyhydroxyalkanoates, PHAs), 전분 및 단백질과 같은 고분자 물질 등이 알려져 있는데 그 중에서 범용성과 경제성 측면에서 장점을 가지고 있는 유기산의 활용에 대한 기대를 크게 가지고 있다.

젖산은 식품첨가제(제빵산업의 유화제 및 다양한 가공식품에 있어서 산성제/조미료/pH 버퍼제 및 부패억제제로 사용됨), 화장품의 보습제, 여드름약, 연고 및 로션과 같은 의약품 제제시의 첨가제로 사용되고 있다. 최근에는 석유 대체 화학제품(생분해성 플라스틱용 PLA 폴리머, 에틸 락테이트와 같은 녹색 용제(green solvents) 및 산화 산업용 화학물질(oxygenated industrial chemicals) 생산을 위해 보다 활발히 응용되고 있다(Reddy, Biotechnology Advances 26: 2234 (2008)).

숙신산(Bio-succinic acid)은 1,4-부탄다이올, 테트라하이드로퓨란, 감마 부티로락톤, 2-피롤리돈, NMP(N-Methyl Pyrolidone), 폴리부틸린 석시네이트(Polybutylene succincate; PBS) 제조의 플랫폼 화학물질로 사용 가능하기 때문에 그동안 석유로부터 생산된 무수말레인산, 프탈레이트계 가소제 및 부탄 기원의 폴리머 등을 대체할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 또한 석시네이트 에스테르는 디젤 연료에 첨가하여 미세입자 방출저감에 응용될 수 있다. 따라서 접착제, 윤활제, 계면활성제, 첨가제, 바이오플라스틱 및 기타 의약품 제조에 있어서 친환경 중간물질로 숙신산의 수요가 증가될 전망이다.

바이오매스 기원의 유기산 혼합물(아세트산+부틸산+프로피온산)은 생물학적 또는 화학적 공정을 통해 혼합알코올로 제조될 수 있다. 또한 정제하여 분리된 유기산은 여러 화학물질 합성의 원료 화합물로 활용된다. 한편 유기산 혼합물은 그 자체로 정밀화학물질 또는 바이오플라스틱 생산의 발효 공정에 있어서(예를 들면, 폴리하이드록시알카노에이트 생산) 기질로도 사용된다.

그러나 지금까지 산업화 수준에서의 바이오매스 기원 유기산, 특히 젖산 및 숙신산 생산 사례를 보면, 이들의 생산 원료가 주로 옥수수, 밀, 고구마 및 감자 등으로서 식품 및 사료등과 경쟁하기 때문에 앞으로는 이들과 경쟁이 적은 비식용자원(목질계 및 조류 등)으로부터 원료의 대체 확보가 요구되고 있다. 그런데 이 경우 해결해야할 가장 큰 도전 중의 하나는 당화물 생산비용의 절감이다. 식용자원과는 달리 비식용자원의 경우 전처리, 당화가 보다 어렵고 고농도 당용액 또는 발효억제물질 함유량이 낮은 당용액을 제조하기 위해서는 추가 공정이 요구되기 때문이다. 그리고 자원의 종류마다 화학적 조성 및 물리적 구조에 차이가 있기 때문에 각각의 종에 최적화된 당용액 생산 방법이 개발되어야 하는 바, 보다 온화한 조건에서 당화될 수 있는 종을 선발, 사용하는 것이 당화물 생산비용 절감에 있어서 매우 중요한 요소가 된다. 한편 발효의 경우도 균주에 따라 여러 당을 모두 소화하는 계통이 있기는 하지만 대부분 몇 가지 당(글루코오스, 프락토오스 및 포도당 등)을 우선적으로 선호함에 따라 이들 탄수화물이 상대적으로 높게 생산될 수 있는 자원을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서 비식용 자원 중에서 발효에 유용한 당이 많이 함유되어 있는 것을 골라 저비용/친환경적으로 당화물을 제조한 다음, 이를 발효 기질로서 사용하여 보다 경제적으로 유기산을 생산하는 것이 본 산업 분야에서 지속적으로 추구해야 할 과제 중의 하나이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 상술한 종래기술의 문제점 및 당업계의 기술적 요구를 달성하기 위하여, 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 그 활용에 대해 아직 보고된 바 없는 탄수화물 고함유 조류 바이오매스인 그물말 과 조류의 당화액으로부터 유기산을 저비용으로 제조할 수 있는 방법을 개발하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 그물말 과(Family Hydrodictyaceae)조류의 당화액으로부터 유기산의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 의해 제조된 유기산을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류로부터 유기산의 제조방법을 제공한다:

(a) 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류를 당화시켜 단당류를 포함하는 당화액을 수득하는 단계; 및

(b) 상기 당화액을 탄소원으로 이용하여 미생물을 배양하여 유기산을 제조하는 단계.

본 발명자들은 상술한 종래기술의 문제점 및 당업계의 기술적 요구를 달성하기 위하여, 예의연구 노력하였다. 그 결과, 그 활용에 대해 아직 보고된 바 없는 탄수화물 고함유 조류 바이오매스인 그물말 과 조류의 당화액으로부터 유기산을 저비용으로 제조할 수 있는 방법을 개발하였다.

그물말 과 조류 바이오매스(biomass)로부터 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하기 위한 본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 그물말 과( Family Hydrodictyaceae ) 조류로부터의 당화액 수득

우선, 그물말 과 조류를 당화시켜 단당류를 포함하는 당화액을 수득한다.

본 발명에서 바이오매스로 이용되는 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류는 당업계에 공지된 다양한 그물말 과 조류를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 이용 가능한 그물말 과 조류는 히드로딕티온 속(Hydrodictyon sp.), 훈장말 속(Pediastrum sp.), 소라스트럼 속(Sorastrum sp.), 유아스트롭시스 속(Euastropsis sp.), 페르난디넬라 속(Fernandinella sp.), 라쿠나스트럼 속(Lacunastrum sp.), 모나크티누스 속(Monactinus sp.), 파라독시아 속(Paradoxia sp.), 파라페디아스트럼 속(Parapediastrum sp .), 슈도페디아스트럼 속(Pseudopediastrum sp .), 스패라스트럼 속(Sphaerastrum sp .), 스타우리디움 속(Stauridium sp .) 및 테트라페디아 속(Tetrapedia sp .)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용 가능한 그물말 과 조류는 히드로딕티온 속(Hydrodictyon sp .), 훈장말 속(Pediastrum sp.) 및 소라스트럼 속(Sorastrum sp.)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 조류이고, 가장 바람직하게는 히드로딕티온 속(Hydrodictyon sp .)이다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명에는 담수 녹조류 중 그물말 과 조류를 선택되며, 이는 탄수화물 함량이 50-70 중량%까지 되며, 특히 주요 단당류로서 글루코오스와 만노오스를 포함하고, 효소 당화 시 글루코오스 함량이 바이오매스 중량대비 30-60 중량%까지 생산될 수 있는 탄수화물 고함유 바이오매스이다.

본 발명에서 이용되는 그물말 과 조류는 시료의 수집/선별 시 단순히 건지개로만 이용해도 될 정도로 용이하여 원심분리 또는 여과과정을 거쳐 수집해야만 하는 다른 미세조류의 공정에 비해 저에너지/저비용으로 시료를 공급받을 수 있으며, 세척, 탈수, 건조 및 분말화 등의 작업도 매우 간편한 장점을 가진다. 또한, 그물말 과 조류는 리그닌이 없고 탄수화물이 보통 50-70 중량% 차지하고 있으며, 특히 발효에 가장 많이 활용되는 육탄당(글루코오스+만노오스) 함량 비율이 90 중량% 이상 차지함으로써 기타 조류 종들에 비해 매우 유리한 장점이 있다.

한편, 본 발명에 있어서, 그물말 과 조류는 생체; 건조체; 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올로 침출 여과 후 남은 잔사물; 유기물 정제 장치를 이용하여 물, 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올 또는 이들의 연속 용매로 추출 후 남은 잔사물; 및 유기용매를 이용하여 지질성분을 추출하고 남은 잔사물로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.

보다 상세하게는, 본 발명에 적용되는 그물말 과 조류는, 야외에서 직접 수집하거나, 배양과정을 통해서 얻어진 생체 또는 건조체를 고운 입자로 마쇄하여 이용할 수 있으며, 시료에 따라서는 마쇄 없이 직접 당화에 적용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적용되는 그물말 과 조류의 시료는 당화공정에 투입 전, 부가가치를 높이면서 고품질의 당화액을 제조하기 위하여 다음과 같이 별도의 추출과정을 거칠 수 있다. 상기 용어 “고품질”이란 당화액 내에 6탄당(글루코오스, 만노오스 등) 함량이 높고 발효에 저해역할을 하는 억제물질의 함량이 낮아서 발효에 적합하도록 제조된 상태를 말한다.

이를 위해 본 발명에서는 (i) 수집된 그물말 과의 생체 및 건조체 조류를 70-100%의 메탄올 또는 에탄올로 추출한 다음, 추출 후 남은 잔사(고형분)를 고농도의 단당류의 제조에 이용하거나, (ii) 또한 생체 또는 건조체의 그물말 과의 조류를 속슬렛 장치를 이용하여 물 또는 물과 에탄올로 연속하여 추출한 다음, 추출 후 남은 잔사를 단당류의 제조에 사용하거나, 또는 (iii) 생체 또는 건조체의 그물말 과(Family Hydrodictyaceae)의 조류를 유기용매(예컨대, 클로로포름＋메탄올)를 가지고 지질성분을 추출한 다음, 추출 후 남은 잔사를 고농도의 단당류의 제조에 사용할 수도 있다.

단계 (a)의 그물말 과 조류는 바람직하게는 고형분 함량이 1-30 중량%이다.

단계 (a)에서 당화액 수득을 위한 그물말 과 조류의 시료 공급은 초기에 모두 공급하거나 또는 분할하여 공급할 수 있으며, 최종 공급된 고형분 함량은, 바람직하게는, 배양액 무게대비 1-30 중량%까지 투입할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)의 당화액 수득은 가수분해 촉매, 다당류 분해효소 또는 가수분해 촉매 및 다당류 분해효소를 이용하여 실시할 수 있다.

상기 가수분해 촉매는 당업계에 공지된 다양한 가수분해 촉매를 포함하고, 바람직하게는, 황산, 염산, 브롬산, 질산, 아세트산, 과염소산, 인산, 파라-톨루엔설폰산(p-toluene sulfonic acid, PTSA) 및 고체산(예컨대, 구연산, 옥살산, 각종 아미노산, 말레산, 프탈산, 푸마르산 및 설파민산)으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 산 촉매 또는 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼슘 및 암모니아 수용액으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 알칼리 촉매를 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 가수분해 촉매를 이용한 당화액의 수득은, 20-200℃의 온도에서 0.5-6시간 동안 1차 가수분해 및 2차 가수분해시킴으로써 실시한다. 예를 들어, 30℃의 온도에서 1시간 동안 1차 가수분해 후, 121℃에서 1시간동안 2차 가수분해시킴으로써 실시한다.

또한, 본 발명에 있어서 당화액의 제조에 이용되는 다당류 분해효소는 당업계에 공지된 다양한 다당류 분해효소를 포함하고, 바람직하게는, 셀룰라아제, β-글루코시다아제, β-아가라제, β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, 라미나린나아제, α-D-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, 수크라아제, 말타아제, 이소말타아제, 락타아제, 드리할라제 및 울바나아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 분해효소를 포함한다.

다당류 분해효소의 공급은 그물말 과 조류의 시료 공급 직후에 필요량 모두를 공급할 수 있으나 조건에 따라 분할하여 투입할 수 있다.

다당류 분해효소 공급 후의 온도조절은 효소 투입시기와 효소 반응 최적조건에 따라 달라질 수 있으며, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 20-60℃에서 0.5-5일 동안 반응시킨다.

또한, 상기 다당류 분해효소를 이용한 당화액 수득과정은, 품질이 우수한 고농도 당화액을 제조하기 위해 효소 반응 시 완충액 염 농도가 최소화되도록 당화를 실시하며, 바람직하게는, 증류수 또는 0.01 mM 내지 1.0 M 범위의 완충액에서 당화를 실시한다.

한편 가수분해 촉매 또는 다당류 분해효소를 이용한 당화액의 수득 과정은, 발효억제물질 생성을 최소화 하도록 실시하는 것이 바람직하다. 일반적으로 당화효율을 높이기 위해 바이오매스를 고온/고압처리 하거나, 산 가수분해 처리를 하게 되는데 이 작업과정에서 당이 화학적 전환을 일으켜 하이드록시메틸풀푸랄(Hydroxymethylfurfural, HMF) 및 풀푸랄(Furfural)이 생성되고, 이는 발효 균주의 강력한 저해제로 작용하기 때문에 바람직하지 않다. 따라서, 이러한 발효억제물질이 생성되는 것을 가능한 억제되는 조건 하에서 반응을 진행하여야 한다. 예컨대, 가수분해를 이용한 화학적 가수분해의 경우는 발효 억제물질 생성을 최소화하기 위해서 낮은 반응온도와 반응시간을 설정하는 것이 바람직하다.

하이드록시메틸풀푸랄은 C₆H₆O₃, 융점 31.5℃의 결정으로, 물, 알코올 등의 유기용매에 쉽게 용해되며, 공기, 빛에 의해 자동 산화되어 착색이 일어나기 쉽다. 신선식품(fresh foods)에는 거의 함유되어 있지 않으나, 당-함유 식품을 건조, 가열, 장기보관 중에 자연적으로 생긴다. 옥수수 등의 당류를 약산성하에 가열함으로써 공업적으로 얻어지고, 의약, 농약의 중간체 합성에 이용되고 있다. 시험관 연구 및 쥐실험에서 하이드록시메틸풀푸랄은 독성 및 발암 가능성이 제기되고 있지만, 아직은 인간에 있어 하이드록시메틸풀푸랄의 섭취와 질병간의 관계에 대해서 알려진 것은 없다.

풀푸랄은 분자식 C₂H₂O₂ _,비점 161.8℃의 무색 액체로, 알데히드와 유사한 향기를 갖는다. 공기, 빛에 의해 자동산화되어 착색이 일어나기 쉽고, 공업적으로는 곡류의 당을 산과 가열함으로써 얻고 수지의 원료, 용제로서 사용된다. 또한 식품에 있어서 단당, 올리고당, 다당류의 가열에 의해 생성하는 휘발성 카보닐 화합물의 주성분이며, 식품의 처리, 가공 또는 저장 중 생기는 품질저하에 의한 성분변화의 지표의 하나로서 하이드록시메틸풀푸랄과 동시에 취급된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a)에 따라 수득한 당화액은 하이드록시메틸풀푸랄, 풀푸랄 또는 이들의 혼합물이 0.07 중량% 이하(바람직하게는, 5% 글루코오스 기준으로), 보다 바람직하게는 0.00001-0.07 중량%이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)의 당화액은 고농도 당농축액을 제조하기 위해서, 1차적으로 당화한 용액을 2회 이상 원심분리를 하거나 여과과정을 통해 모은 다음, 이어 감압건조 또는 막투과증발법 등을 더 진행하여 농축하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 단계 (a)를 통해 수득되는 단당류는 당업계에 공지된 다양한 단당류를 포함하며, 바람직하게는, 갈락토오스, 갈락토오스 유도체(갈락튜론산 등), 3,6-안하이드로갈락토오스, 크실로오스, 글루코오스, 람노오스, 크실로오스 및 만노오스로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 단당류이며, 보다 바람직하게는, 글루코오스, 만노오스 또는 이들의 혼합 단당류이다.

단계 (b): 미생물을 배양한 유기산의 제조

이어, 단계 (a)에서 수득한 당화액을 탄소원으로 이용하여 미생물을 배양하고 유기산을 제조한다.

본 발명에서 이용되는 미생물은 유기산을 대사산물로 생성하는 어떠한 미생물도 포함한다.

본 발명의 방법이 유기산 중에서 젖산을 생산하기 위하여 실시하는 경우에는 당업계에 공지된 다양한 젖산균이 이용되며, 바람직하게는 본 발명에서 이용되는 젖산균은 락토바실러스 속[Lactobacillus sp., 예컨대 Lactobacillus amylophilus GV6, Lactobacillus paracasei LAB3510(KCTC 3510), Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LAB104(KCTC 11883BP), 형질전환된 락토바틸러스 코로니포미스 토르퀀스(Lactobacillus coroniformis subsp. torquens(KCTC 3535)], 엑티노바실러스 속(Actinobacillus sp.), 비피도박테리엄 속(Bifidobacterium sp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.). 엔테로코커스 속(Enterococcus sp.), 락토코커스 속(Lactococcus sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 페디오코쿠스 속(Pediococcus sp.), 에로코쿠스 속(Aerococcus sp.), 카노박테리엄 속(Carnobacterium sp.), 오에노코커스 속(Oenococcus sp.), 테트라제노코커스 속(Tetragenococcus sp.), 바고코쿠스 속(Vagococcus sp .), 와이셀라 속(Weisella sp.), 라이족토니아 속(Rhizoctonia sp., 예컨대 R. oryzae), 리조푸스 속(Rhizopus sp., 예컨대 R. arrhizus), 맨하이미아 속(Mannheimia sp.), 애내로비오스피릴럼 속(Anaerobiospirillum sp.), 클로스트리디움 속 (Clostridium sp.) 및 아세토박테르 속(Acetobacter sp.)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물이고 보다 바람직하게는, 락토바실러스 속 또는 엑티노바실러스 속 미생물이고, 보다 더 바람직하게는 락토바실러스 파라카세이 LAB3510(Lactobacillus paracasei LAB3510(KCTC 3510)), 락토바틸러스 파라카세이 스페이시즈 톨레란스 LAB104(Lactobacillus paracaseisubsp. tolerans LAB104) 또는 형질전환된 락토바틸러스 코리니포미스 토르퀀스(Lactobacillus coryniformis subsp. torquens(KCTC 3535))이다. 젖산 발효의 경우엔 사용하는 균주에 따라 특정 form을 생산할 수 있으며 대부분 L-isomer가 생산된다. 그러나 형질전환된 락토바틸러스 코로니포미스 토르퀀스(Lactobacillus coryniformis subsp. torquens(KCTC 3535))는 D-isomer를 생산하는 특징을 가진다.

본 발명의 방법이 유기산 중에서 숙신산을 생산하기 위하여 실시하는 경우에는 당업계에 공지된 다양한 숙신산-생성 균이 이용되며, 바람직하게는 본 발명에서 이용되는 숙신산-생성 균은 엑티노바실러스 속(Actinobacillus sp., 예컨대 Actinobacillus succinogenes), 숙신상-생성 재조합 대장균(Escherichia coli) 및 맨하이미아 속(예컨대, Mannheimia succiniciproducens, 바람직하게는 Lee 등, Appl . Microbiol . Biotechnol . 79:1122(2008))에 기재된 재조합 Mannheimia succiniciproducens)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물이고, 보다 바람직하게는 엑티노바실러스 숙시노제네시스(Actinobacillus succinogenes)이다.

한편, 아세트산, 부틸산 및 프로피온산의 혼합 유기산을 생성하고자 하는 경우, 단계 (b)에서 사용되는 미생물은 하수처리장 슬러지에서 채취한 혼합 균주로서, 바실러스(Bacillus sp.), 클로스트리디움(Clostridium sp.) 및 아세토박테르(Acetobacter sp.) 균주들이 포함된 혼합물이다.

단계 (b)에서 미생물의 배양은 단계 (a)에서 수득한 당화액을 이용하여 당업계에 공지된 통상적인 배양 방법에 따라 실시할 수 있다(Kubitschek, H. E., Introduction to Research with Continuous Cultures. Englewood Cliffs, N.J.:Prentice-Hall, Inc., 1970; Mandelstam, J., et al., Biochemistry of Bacterial Growth, 3rd ed. Oxford:Blackwell, 1982; Meynell, G.G., et al., Theory and Practice in Experimental Bacteriology, 2nd ed. Cambridge: Cambridge University Press, 1970; Gerhardt, P., ed., Manual of Methods for General Bacteriology, Washington: Am. Soc. Microbiol, 1981). 배양 과정에서 탄소원으로서의 당화액 이외에 질소원을 포함할 수 있으며, 예컨대 효모 추출액 및 펩톤을 포함할 수 있다.

본 발명의 단계 (b)는 상기 미생물의 배양 배지에 탄소원으로써 상기 단계 (a)의 결과물을 첨가하여 유기산을 제조한다.

바람직하게는, 본 발명에 의해 제조되는 유기산은 젖산, 숙신산, 아세트산, 프로피온산 및 부틸산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유기산이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 방법에 의해 제조된 유기산을 제공한다.

본 발명의 유기산은 식품, 화장품 및 의약품의 첨가제, 석유 대체 화학제품(예컨대, 생분해성 플라스틱용 폴리머 및 그린 용제), 바이오디젤, 바이오에탄올 및 바이오부탄올 등의 생산에 적용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 미생물을 이용하여 젖산 또는 숙신산을 제조 할 수 있으며, 하수처리장에서 수집한 슬러지의 균주혼합물을 이용하여 아세트산, 부틸산 및 프로피온산이 포함된 혼합 유기산을 제조할 수 있다. 이러한 혼합 유기산은 추가 공정을 통해 혼합 알코올로 제조 될 수 있으며, 정제를 통해 원료 화합물로 활용할 수 있다. 한편, 혼합 유기산 자체로 정밀화학물질 또는 바이오플라스틱 생산의 발효공정에 있어서 기질로 사용할 수 있다. 본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 그물말 과 조류로부터의 화학물질 생산은 옥수수, 밀과 같은 식용자원이 아닌 비식용자원인 조류(algae)를 활용하기 때문에 바이오매스의 산업적 수요가 높아졌을 때 식품 가격 폭등 및 윤리적 문제의 발생 소지가 없고, 안정적으로 자원의 지속적 공급이 가능한 장점이 있다.

(b) 또한, 본 발명에 따른 그물말 과 조류는 생화학적/화학적 당화가 매우 용이한 특징을 가져 수집 후 생체를 직접 사용할 수 있고, 건조체를 이용할 때에도 특별한 전처리 없이도 높은 당화율을 나타내며, 이는 보다 저비용으로 당화할 수 있는 경제성 뿐 아니라 당화공정시 환경오염물질 배출가능성도 낮아 향후 산업바이오화학제품 생산으로의 크게 기여할 것이다.

(c) 따라서 본 발명에 따라 생산된 유기산은 바이오 기반의 생분해성 물질로서 바이오플라스틱 및 기타 화학제품의 원료물질로 제공되어 석유대체 화학물질 생산에 기여할 것이다. 특히 젖산 및 숙신산 등은 생분해성 고분자로 전환되어 바이오플라스틱 제조에 활용될 수 있기 때문에 석유계 유래의 난분해성 플라스틱 등을 대체시킬 수 있어 석유화학제품의 환경 및 인축독성 문제를 해결하는데 크게 기여할 것이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

도 1은 본 발명에 따른 그물말 과 조류를 이용한 고농도의 단당류를 수득하고 이의 당화액으로부터 유기산을 생산하는 방법에 대한 공정을 모식화을 나타낸다.
도 2는 고농도 그물말 고형분의 2차 가수분해 시 글루코즈 생성량 및 기대치을 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 그물말 당화액을 탄소원으로 배양배지에 첨가하여 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) LA104 및 락토바실러스 파라카세이 3510 균주의 젖산 생산 능력을 조사한 결과이다.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1: 그물말의 탄수화물 함량 분석

사전 실험결과, 수집된 담수조류 중 그물말 과의 대표적인 히드로딕티온 속(Hydrodictyon sp.) 그물말에 대하여 총탄수화물의 상대적 함량 비율을 조사해 볼 때, 생육단계 및 배양 환경에 따라 다소 변화가 있지만 대략 건물중을 기준하여 50-65% 이었다. 그물말 건조시료를 속슬렛 추출시 물 추출성분(water-extractive) 무게는 29.5%, 물 추출성분 제거 후 남은 고형분(WEFS)은 건조시료 전체 무게의 70.5%를 차지하였다. 상기 시료에 대해 고압멸균기를 이용하여 1차 및 2차 가수분해를 실시한 다음 얻어진 가수분해물을 가스 크로마토그래피로 정성분석한 결과, 그물말 시료의 주요 당성분은 글루코오스 및 만노오스인 것을 확인할 수 있었다. 즉 총탄수화물이 64.6%이었던 그물말 시료를 가지고 효소가수분해를 통해 얻어진 글루코오스 및 만노오스의 함량은 건조된 바이오매스 100 g 당 46.82±0.46 g 및 10.56±0.48 g로서 효소가수분해에 의한 육탄당(glucose＋mannose) 수득율은 총탄수화물 기준 88.8%, 바이오매스 건물중 기준 57.4%였다. 이는 미세조류로부터의 당생성율에 있어서 현재까지 보고된 결과들 중에서 매우 높은 수준이다. 그리고 이들의 결과는 대부분의 상업용 발효균주는 오탄당보다 육탄당을 잘 이용하며 육탄당 중에서도 글루코오스가 다량 함유된 시료를 가장 선호하기 때문에, 그물말 시료가 발효용, 바이오리파이너리 또는 바이오에너지용 바이오매스로서 매우 우수한 품질의 재료가 될 수 있음을 의미한다.

따라서 그물말 시료로부터 발효용 당용액을 생산하고 이를 유기산(젖산, 숙신산 등) 생성균주의 기질로 공급하여 바이오화학제품 생산의 원료물질이 되는 유기산을 보다 경제적으로 생산하는 제반 기술을 확립하는 것은 산업적으로 매우 중요한 일이 된다.

실시예 2: 저농도 그물말 고형분에서의 산 가수분해에 따른 그물말로부터의 글루코오스 생산

그물말의 산가수분해에 따른 글루코오스 생성정도를 알아보기 위하여 실험하였다.

식물재료는 45℃에서 1일 건조된 그물말 시료를 분말화 하여 1-2 ㎜ 체에 통과하였다. 물 추출성분이 제거된 고형분(Water-extractive free solid; WEFS)과 물 및 에탄올 추출성분이 제거된 고형분 시료는(Water & ethanol-extractive free solid; EFS) 시료는 다음과 같이 제조하였다: 물 추출성분이 제거된 고형분(WEFS) 제조의 경우, 2 g의 건조 분말시료를 심블(thimble, 28×100 ㎜)에 넣고 190 ㎖의 물을 이용하여 250℃에서 약 8시간 추출한 다음, 잔사를 취하여 45℃에 1일 동안 건조시켜 조제하였다. 물 및 에탄올 추출성분이 제거된 고형분(EFS) 제조의 경우는 2 g의 건조 분말시료를 심블(thimble, 28×100 ㎜)에 넣고 190 ㎖의 물을 이용하여 250℃에서 약 8시간 추출한 후, 이를 다시 190 ㎖ 에탄올로 150℃에서 3-4시간 추출한 후, 잔사를 취하여 45℃에 1일 동안 건조시켜 조제하였다.

산 가수분해는 상기와 같이 준비된 건조분말시료(분말, WEFS 및 EFS) 0.3 g을 취한 다음 72% 황산 3 ㎖를 넣고, 30℃ 항온기에 1시간 두었다가(1차 가수분해, 5-10분 마다 교반), 이후 증류수를 가하여 1-4%로 희석한 다음 마개를 한 후, 위 아래로 흔들어 혼합시켜 121℃에서 1시간 가수분해하였다(2차 가수분해). 그 후 가수분해물을 탄산칼슘(calcium carbonate)으로 중화하였다.

중화된 그물말 가수분해물을 막여과 및 원심분리한 후, 고성능 액체크로마토그래피 분석(디텍터 : 코로나디텍터, Corona detector)을 실시하였다. 글루코오스 정량을 위해서 글루코오스 표준곡선과 동일조건에서의 글루코오스 손실률(loss factor)을 구하여 환산해 주었다.

상기 시료에 대해 산 가수분해 후 생성된 글루코오스 함량을 분석한 결과, 하기 표 1에서 확인할 수 있듯이 속슬렛 추출을 하지 않은 시료는 건조물 100 g당 38.22 g의 글루코오스를 생성하였고, 물 추출성분이 제거된 고형분(WEFS), 물 및 에탄올 추출성분이 제거된 고형분(EFS)은 각각 56.35 g 및 53.72 g의 글루코오스 생성량을 나타내었다.

추출 후 남은 잔사(WEFS 및 EFS)가 무처리의 경우 보다 글루코오스의 함량 높은데, 이는 추출물이 제거된 상태에서 셀룰로오스 성분을 가진 조직이 상대적으로 높게 포함되었기 때문이다(표 1).

그물말 고형분 종류	산가수분해후 글루코오스 함량 (g/100 g 건조 그물말 분말시료)
무처리	38.22± 1.87
WEFS	56.35± 4.78
EFS	53.72± 2.46

한편, 바이오매스 기원 당용액으로부터 화학제품 원료물질을 생산하기 위해서는 고농도 당용액을 제조하여 생물학적 전환을 위한 발효용 기질로서 제공하여야 한다. 이때 중요하게 고려되어야 할 사항은 발효에 유용한 당이 가능한 한 최대로 많이 함유되면서 발효균주의 생육을 저해하는 물질이 최소화되어야 한다. 그런데 일반적으로 당화효율을 높이기 위해 바이오매스를 고온/고압처리 하거나, 산 가수분해 처리를 하게 되는데 이 작업과정에서 당이 화학적 전환을 일으켜 하이드록시메틸풀푸랄(Hydroxymethylfurfural, HMF) 및 풀푸랄(furfural)이 생성되고, 이는 발효균주의 강력한 저해제로 보고되고 있다.

따라서 산 가수분해하는 과정에서 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄이 어느 정도 생성되는지를 알아보고 발효균주의 억제여부를 예측해 보고자 실험하였다.

발효억제물질의 분석은 고성능 액체크로마토그래피(Waters, 미국)로 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄을 정량하였다. 컬럼은 Comosil 5C18-MS-II(4×150 ㎜)을 사용하였고, 이동상은 100% 증류수(펌프 A)와 100% 메탄올(펌프 B)로 시간별 구배를 두었으며, 유량은 0.6 ㎖/min, 측정 파장은 280 ㎚이었다.

그 결과, 물 및 에탄올 추출 후 남은 잔사 시료(EFS)를 고압멸균기에서 산 가수분해 한 경우, 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄 생성량이 각각 건조물 1 g당 3.8 ㎎ 및 3.3 ㎎으로서 하이드록시메틸풀푸랄이 풀푸랄보다 약간 높게 생성됨을 확인할 수 있었다. 이를 근간으로 그물말 건조시료로부터 산 가수분해를 통해 5% 글루코오스 함량의 당농축액을 제조했을 때 포함될 수 있는 퓨란 유도체 총량은 약 0.07%가 되는 것으로 추측할 수 있었고, 이는 보고된 문헌을 통해서 볼 때((Almeida. Appl . Microbiol . Biotechnol, 82:625-638(2009)) 발효균주를 심하게 억제하지는 않을 것으로 판단되었다.

실시예 3: 효소가수분해를 통한 당화액 제조

그물말 시료에 대해 고형분 함량에 따른 당화 및 글루코오스 생성 패턴을 파악하여 여러 농도의 당화액을 제조하기 위하여 실험하였다.

식물재료는 온실에서 배양한 그물말을 수확하여 탈수시킨 다음 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다(HR-d23 및 HR-d31). 본 시료는 글루코오스 함량이 각각 35% 및 45% 내외 함유되는 것으로 조사되었다.

250 ㎖ 삼각 플라스크에 상기 건조시료를 고형분 함량이 2-10%(w/v) 되도록 넣고 0.05 M 시트레이트 완충액(pH 4.8) 23.9 ㎖ 및 1% NaN₃ 1.1 ㎖를 가한 다음, 120℃에서 20분 고압살균하였다.

무균상에서 효소용액을 고형분 함량에 비례하여 가하였는바, 사용된 효소량은 E1＋E2를 건조물 1 g당 0.2＋0.04 ㎖ 수준이었다. 이때 사용된 효소는 셀룰라아제(Celluclast Conc BG, Novozymes사 제품, 5배 희석하여 사용, 하기 ‘E1’으로 표시) 및 β-글루코시다아제(Sigma C6105, 하기 ‘E2’로 표시)이다. 이후 50℃, 170 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 시키고, 당화액내의 글루코오스 생성정도를 생화학 분석기(YSI Incorporated, YSI 2700 SELECT)로 분석 및 정량하였다. 아울러 동일 시료에 대해 환원당 함량을 보고된 방법에(T. Matrai et al. Inter. J. Food. Microbiol. 61:187-191, 2000) 따라 분석하였다.

그 결과, 그물말 건조시료의 고형분의 함량이 6% 될 때 까지는 어떠한 장애 없이 2% 고형분 함량에서와 비슷한 글루코오스 생성량을 나타내었지만 8-10% 고형분 함량에서는 이보다 약간 낮은 당화율을 나타내었다(표 2 및 표 3). 그러나 2% 고형분 처리구의 87-93% 정도는 글루코오스가 생산되었기 때문에 산업공정상의 경제적 측면으로 볼 때에 큰 차이가 없을 것으로 판단되었다. 결국 HR-d23 및 HR-d31의 10%(w/v) 고형분 함량 시료를 가지고 효소가수분해 할 때, 농축과정 없이도 각각 3.3 및 4.0% 내외의 글루코오스 당용액(환원당 기준으로 볼 때는 4.4 및 5.1% 당용액)을 생산할 수 있었다(표 2 및 표 3). 이는 목질계 바이오매스로부터 얻어지는 1차 당화액의 당농도가 보통 1-2%인 것에 비해 훨씬 효율이 높은 생산성을 보인다. 표 2는 그물말 시료로부터 효소가수분해를 통해 얻어진 글루코오스 함량을 나타낸 것이고, 표 3은 그물말 시료로부터 효소가수분해를 통해 얻어진 환원당 함량을 나타낸 표이다.

고형분 함량	HR d23		HR d31
고형분 함량	D-글루코오스 (g/L)	D-글루코오스 (g/100g DM)	D-글루코오스 (g/L)	D-글루코오스 (g/100g DM)
2%,	7.04±0.05	35.38±0.26	8.78±0.12	44.12±0.61
4%	14.06±0.08	35.49±0.21	17.04±0.08	43.00±0.19
6%	21.07±0.35	35.63±0.59	24.40±1.22	41.24±2.07
8%	26.04±0.52	33.17±0.66	30.38±0.47	38.70±0.60
10%	32.98±0.65	33.77±0.66	40.18±0.05	41.14±0.05

고형분 함량	HR d23		HR d31
고형분 함량	환원당 (g/L)	환원당 (g/100g DM)	환원당 (g/L)	환원당 (g/100g DM)
2%,	9.07±0.46	45.59±2.33	11.25±0.29	56.50±1.45
4%	17.28±0.69	43.62±1.75	22.28±1.30	56.24±3.28
6%	26.03±1.38	44.00±2.34	33.05±1.08	55.88±1.83
8%	35.64±0.05	45.41±0.07	42.73±3.91	54.44±4.98
10%	43.66±1.81	44.71±1.86	51.41±1.92	52.64±1.97

아울러 실시예 2에서와 같은 방법으로 상기 효소가수분해 한 그물말 시료를 가지고 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄이 어느 정도 생성되는지를 알아보고 발효균주의 억제여부를 예측해 보고자하였다.

고형물 함량이 2-10%(w/v)이 되도록 하여 효소당화시킨 시료의 퓨란 유도체를 분석한 결과, 하기 표 4에서도 확인할 수 있듯이, 하이드록시메틸풀푸랄은 미량 검출되었으나 풀푸랄은 검출되지 않았다.

상기의 결과를 바탕으로 그물말 건조시료로부터 10% 글루코오스 함량의 당농축액을 제조했을 때 포함될 수 있는 하이드록시메틸풀푸랄의 농도가 15-28.3 ppm(0.12-0.23 mM)임을 확인할 수 있었다(표 4). 보고에 의하면 하이드록시메틸풀푸랄의 경우 대장균(Escherichia coli, E. coli)에 대해 0.265% 농도에서 50% 생육을 저해하고, 기타 균주에 대해서 0.1-0.5%에서 저해하는 것으로 보고된 바(Almeida. Appl . Microbiol . Biotechnol, 82:625-638(2009)), 이에 준하면 본 그물말 유래 당용액(10% 글루코오스 함량)은 하이드록시메틸풀푸랄의 생육저해활성 농도 보다 50배 이상 낮게 함유되어 있기 때문에 발효균주를 전혀 저해하지 않음을 예측할 수 있었다. 표 4의 고형분 함량은 효소가수분해가 48시간동안 50℃, 150 rpm 회전배양조건에서 진행되었으며, ND는 ‘Not Determined'를 의미한다.

고형분 함량 (w/v)	함량(㎎/L)		생성량 (㎎/g 건조 그물말 분말시료)		푸랄데하이드 (mg/g DM)
고형분 함량 (w/v)	하이드록시 메틸풀푸랄	풀푸랄	하이드록시 메틸풀푸랄	풀푸랄	푸랄데하이드 (mg/g DM)
2%	3.8± 0.26	ND² ⁾	0.205±0.014	ND	0.205
6%	11.2± 0.46	ND	0.209±0.008	ND	0.209
7%	14.5± 1.57	ND	0.233±0.025	ND	0.233
8%	12.4± 0.13	ND	0.175±0.002	ND	0.175
9%	12.7± 0.10	ND	0.161±0.001	ND	0.161
10%	13.9± 0.13	ND	0.159±0.001	ND	0.159

실시예 4: 고농도 그물말 고형분에 따른 당화액 제조

당함량이 높으면서 발효억제물질이 낮은 소위 “고품질 당용액”을 경제적으로 얻기 위해서는 우선 고농도 고형분함량을 가지고 당화할 수 있어야 하며 이후 당화율이 높으면서 당화시간이 짧은 공정을 개발하는 것이 필요하다. 그런데 일반적으로 고농도 고형분 함량에서의 가수분해는 여러 원인에 의해 당화율이 감소된다. 본 실시예에서는 열(heat) 및 효소가수분해를 겸용함으로서 그물말 시료 고농도 함량을 가지고 보다 효율적으로 당화액을 생산하는 방법을 개발하고자 실험하였다.

125 ㎖ 삼각 플라스크에 상기 건조시료 5 g 및 20 ㎖ 증류수에 넣어 25%(w/v) 고형분 함량이 되도록 한 다음 121℃에서 20분 고압살균하였다. 그 후 NaN₃가 포함된 0.1M 시트레이트 버퍼(1% NaN₃ 8.4 ㎖ 및 버퍼 91.6 ㎖, pH 4.8) 23.88 ㎖를 주입한 다음, 1M HCl 용액을 가하여 pH를 4.8-5.0으로 조정해 주었다. 효소는 셀룰라아제(Celluclast Conc BG, Novozymes사 제품, 5배 희석하여 사용, 하기 ‘E1’으로 표시) 및 β-글루코시다아제(Sigma C6105, 하기 ‘E2’로 표시)를 사용하였다. 무균상에서 이들 시료에 여러 농도의 효소용액 E1＋E2(5:1)를 가하였는바, 사용된 효소량은(E1+E2) 건조물 1 g당 0.02-0.2＋0.004-0.04 ㎖ 수준이었다. 이후 50℃, 170 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해하고, 당화액내의 글루코오스 생성정도를 생화학 분석기(YSI Incorporated, YSI 2700 SELECT)로 분석 및 정량하였다. 아울러 동일 시료에 대해 환원당 함량을 보고된 방법에(T. Matrai et al. Inter. J. Food. Microbiol. 61:187-191(2000)) 따라 분석하였다.

그 결과, 공급된 효소량이 그물말 건조시료 g당 0.12 ㎖ 미만으로 낮을 때는 당생성정도도 낮고 생성속도도 늦어 2일간 당화를 하여야 했으나 효소량이 0.12 ㎖ 이상일 때는 당화가 24시간 반응으로 거의 종료되었고 효소량이 0.24 ㎖ 처리된 것과 당농도의 차이가 없었다. 즉 본 방법을 통해서도 농축과정 없이 HR-d23 및 HR-d31 시료를 가지고 각각 3.1 및 4.2% 내외의 글루코오스 당용액(환원당 기준으로 볼 때는 3.8 및 5.0% 당용액)을 생산할 수 있었다(표 5). 그리고 효소량을 초기 결정농도의 절반으로 감소시켜도 당화에는 큰 지장이 없었으며, 보다 고농도의 고형분함량을(25% S/L) 한꺼번에 고압멸균 할 수 있어 보다 경제적인 당화공정을 수립할 수 있을 것이다. 표 5는 고농도 그물말 시료로부터(25% 고형분) 여러 농도의 가수분해효소 처리를 통해 얻어진 글루코오스 및 환원당 함량 변화를 보여준다. HAI는 접종 후 시간(Hour after incubation)을 나타낸다.

HR 샘플	E1+E2 첨가량(㎖/g DM)	글루코오스(g/100g DM)		환원당(g/100g DM)
HR 샘플	E1+E2 첨가량(㎖/g DM)	24 HAI	48 HAI	24 HAI	48 HAI
HR-d23	0.024	18.53±0.13	21.42±0.38	19.11	24.55
	0.06	24.85±0.29	28.36±0.26	25.98	30.24
	0.12	26.85±0.26	30.67±0.45	31.73	34.22
	0.18	31.24±0.16	31.93±0.36	35.81	37.32
	0.24	30.51±0.03	31.62±0.16	37.24	38.06
HR-d31	0.024	29.14±0.50	33.36±0.19	29.01	37.69
	0.06	35.83±0.06	40.84±0.28	37.64	44.40
	0.12	41.89±0.63	42.56±0.32	45.89	50.57
	0.18	42.89±0.29	38.95±0.19	47.00	49.49
	0.24	40.10±0.06	39.69±0.96	49.77	50.91

실시예 5: 고농도 그물말 고형분에서의 산가수분해를 통한 당용액 제조

바이오매스 가수분해 방법 중에서 효소가수분해는 산가수분해에 비해 비용이 높은 것으로 알려지고 있다. 본 실시예에서는 산가수분해만을 통해 그물말 시료를 효율적으로 가수분해 할 수 있는 보다 효율적인 방법 및 최적조건을 알아보기 위해 실험하였다.

온실조건에서 재배하여 수확한 HR을 건조시켜 분말로 만든 다음 이를 실험재료로 사용하였다(HR-d13). 산 가수분해를 위해 사용된 산은 황산 및 염산이며 가수분해 방법 및 조건(고형분 함량, 산농도, 온도 및 시간 등)은 결과에 제시될 것이다. 산가수분해 효과를 알기 위해서 가수분해물 내의 글루코오스, 환원당, 하이드록시메틸풀푸랄(HMF) 및 풀푸랄 함량을 실시예 2 및 실시예 3에서와 같은 방법으로 조사하였다.

사전 실험에서 실용적으로 의미가 있는 고형분 함량(2% w/v 이상)에서의 산 농도별 및 반응온도별 산가수분해 효과를 실험하였다. 그 결과, 2% 산농도에서 120℃, 1시간 반응의 경우 가장 바람직하였다. 따라서 그물말(HR d13) 2-8% 고형분 함량에서 2% 황산으로 산가수분해(1차 가수분해)를 실시하였다. 그 결과 표 6에서와 같이 고형분 함량 증가에 따른 글루코오스 생성량에는 큰 차이가 없었으나 4% 고형분 함량에서의 글루코오스 생성량이 27.4 g/100g DW로 가장 높은 경향을 나타내었다. 그러나 본 방법에 의해서는 효소당화 방법(고형분 함량이 2% 및 8% S/L 이었을 때 생성된 글루코오스 함량이 각각 40.8±2.52 및 37.47±0.31 g/100g DM 이었음)보다 상당히 낮은 결과를 보여주어 산가수분해 자체만으로는 당화율이 효소당화의 73% 정도에 그치는 경향이었다.

HR d13, 고형분 함량 (w/v %)	글루코오스 (g/100g DM)
2%	27.00±0.74
4%	27.44±0.16
6%	26.40±0.98
8%	26.30±2.02

이를 개선하기 위해 2차 가수분해를 검토하였다. 즉 여러 무게의 그물말 건조시료에 72% 황산 1 ㎖을 넣고 30℃에서 1시간동안 1차 가수분해 한 후, 24 ㎖ 증류수를 가한 다음 120℃에서 1시간 반응하였다. 그 결과 기대치에는 미치지 못하지만 4% 고형분 함량까지는 글루코오스 생성량이 29.3 g/100g DM 이상으로서 1단계 가수분해에 비해 당화가 더 잘 이루어졌다(도 2).

상기 2차 가수분해를 보다 최적화시키기 위하여 그물말 고형분 함량을 4% (w/v)로 고정시키고 1단계 가수분해시의 산처리 부피 및 온도를 조정하였다. 그 결과 1차 가수분해 시 HR 건조중:72% 황산의 비를 1 g : 1.5 ㎖로 하여 60℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 증류수 23.5 ㎖를 가한 후 4% 고형분 함량에서 120℃ 1시간 가수분해하면 가장 바람직한 결과를 얻게 되었다(표 7). 이 경우 1.1-2.2%의 글루코오스 및 1.8-2.9%의 환원당 함량을 가진 당용액을 얻을 수 있었고, HR 건물중 기준으로 볼 때 30-35%가 글루코오스로, 50-54%가 환원당으로 전환될 수 있는 조건이었으며(고형분 함량을 낮추어 최적 조건에서 산가수분해 했을때의 85-90% 수준임), 이 때 생성되는 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄 함량은 227.5 ㎎/L 및 40 ㎎/L 이하 수준이었다(표 7). 한편 HR-d13의 효소당화의 경우, 고형분 함량이 2% 및 8% S/L 이었을 때 생성된 글루코오스 함량이 각각 40.8±2.52 및 37.47±0.31 g/100g DM 이었는데 결국 4% 고형분 함량에서 당화시킬 경우(2차 가수분해 기준), 산가수분해만을 통해서도 글루코오스를 효소당화의 90-95%까지 수득할 수 있기 때문에 본 공정은 저비용 당화액 조제에 충분히 적용될 수 있을 것으로 보여졌다.

1차 산가수분해 시 온도	글루코오스 (g/100g DM)	환원당 (g/100g DM)	하이드록시메틸풀푸랄 (㎎/L)	풀푸랄 (㎎/L)
30℃	32.91±0.57	49.13±0.35	167.25±11.67	28.00±2.83
60℃	35.11±0.51	53.80±0.94	227.50±1.41	40.00±0.00
90℃	12.88±1.39	22.81±2.04	83.25±10.25	7.50±1.41
120℃	2.84±0.45	1.10±0.04	0.00±0.00	0.00±0.00

실시예 6: 고농도 그물말 고형분에서의 혼합가수분해를 통한 당용액 제조

당함량이 높으면서 발효억제물질이 낮은 소위 “고품질 당용액”을 경제적으로 얻기 위해서는 우선 고농도 고형분함량을 가지고 당화할 수 있어야 하며 이후 당화율이 높으면서 당화시간이 짧은 공정을 개발하는 것이 필요하다. 그런데 일반적으로 고농도 고형분 함량에서의 가수분해는 여러 원인에 의해 당화율이 감소된다. 본 실시예에서는 산(acid) 및 효소가수분해를 겸용함으로서 그물말 시료 고농도 함량을 가지고 보다 효율적으로 당화액을 생산하는 방법을 개발하고자 실험하였다.

식물재료는 온실에서 배양한 그물말을 수확하여 탈수시킨 다음 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 2일 동안 건조시킨 후 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다(HR-d23). 본 시료는 글루코오스 함량이 35% 내외 함유되는 것으로 조사되었다.

125 ㎖ 삼각 플라스크에 상기 건조시료 5 g을 2% 염산 20 ㎖에 넣어 25%(w/v) 고형분 함량이 되도록 한 다음 121℃에서 20분 고압살균하였다. 그 후 NaN₃가 포함된 0.1M 시트레이트 버퍼(1% NaN₃ 8.4 ㎖ + 버퍼 91.6 ㎖, pH 4.8) 23.88 ㎖를 주입한 다음, 10N NaOH 용액을 가하여 pH를 4.8-5.0으로 조정해 주었다. 효소가수분해를 위해 사용된 효소는 셀룰라아제(Celluclast Conc BG, Novozymes사 제품, 5배 희석하여 사용, 하기 ‘E1’으로 표시) 및 β-글루코시다아제(Sigma C6105, 하기 ‘E2’로 표시)이다. 무균상에서 시료에 여러 농도의 효소용액 E1＋E2(5:1)를 가하였는바, 사용된 효소량은(E1+E2) 건조물 1 g당 0.02-0.2(E1)＋0.004-0.04(E2) ㎖ 수준이었다. 이후 50℃, 170 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 시키고, 당화액내의 글루코오스 생성정도를 생화학 분석기(YSI Incorporated, YSI 2700 SELECT)로 분석 및 정량하였다. 아울러 동일 시료에 대해 환원당 함량, 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄 함량을 실시예 2 및 실시예 3에서와 같은 방법으로 조사하였다.

그 결과 24시간 반응까지는 증류수보다 약산처리 이후 효소처리한 샘플에서 글루코오스의 생성량이 높게 나타났다. 그러나 48시간 반응의 경우는 E1+E2 효소처리량이 g 건물중당 0.06 ㎖ 이하에서만 대조구(증류수 처리)보다 약산처리에서 글루코오스 생성량이 높게 나타났고 효소처리량 0.12 ㎖ 이상에서는 두 처리 간에 차이가 없었다(표 8). 이는 약산처리로 인해 보다 적은 효소량으로 보다 빨리 당화시킬 수 있음을 나타낸다. 특히 약산처리된 시료의 당화는 효소 첨가량에 관계없이 24시간이면 당화가 거의 종료되는 특징을 보였다(표 8). 그리고 24시간 반응한 당화액내의 글루코오스 및 환원당 농도는 각각 3.4-3.6% 및 5.2-5.4%로, 효소가수분해만을 실시했던 것과 비교하여 유사하거나 오히려 높은 결과를 보여주었다(표 9). 그런데 HR-d23보다 탄수화물함량이 높은 시료(예, HR-d31)를 가지고 당화시킬 경우는 이보다 더 높은 당농도의 당화액을 얻을 수 있을 것이다.

한편 당화액내의 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄 농도를 조사하였다. 효소처리량에 상관없이 하이드록시메틸풀푸랄 농도는 0.016-0.018% 정도였고, 풀푸랄 함량은 이보다 훨씬 낮은 0.0015-0.0022%를 나타내었다(표 10). 이는 2차 산 가수분해에서 HMF가 0.022% 이었던 것보다 낮은 수치이며(실시예 5) 보고에 의하면 하이드록시메틸풀푸랄의 경우 대장균(Escherichia coli, E. coli)에 대해 0.265% 농도에서 50% 생육을 저해하고, 기타 균주에 대해서 0.1-0.5%에서 저해하는 것으로 보고된 바(Almeida. Appl . Microbiol . Biotechnol, 82:625-638(2009)), 이에 준하면 본 방법의 그물말 유래 당용액은 하이드록시메틸풀푸랄의 생육저해활성 농도 보다 50배 이상 낮게 함유되어 있기 때문에 발효균주를 저해하지 않을 가능성이 매우 높음을 예측할 수 있었다.

따라서 약산과 효소가수분해를 겸용하는 본 방법은 25% 고형분 함량 조건에서 당화수득율의 감소 없이 보다 빠르게 시료를 당화시키면서 고품질의 당화액을 얻을 수 있는 유용한 방법임을 확인할 수 있었다.

HR 샘플	E1+E2 첨가량 (㎖/g DM)	글루코오스 (접종 후 24시간, g/100g DM)		글루코오스(접종 후 48시간, g/100g DM)
HR 샘플	E1+E2 첨가량 (㎖/g DM)	증류수내 고압멸균	2% HCl내 고압멸균	증류수내 고압멸균	2% HCl내 고압멸균
HR-d23	0.024	18.53±0.13	28.44±0.71	21.42±0.38	27.30±0.51
	0.06	24.85±0.29	31.79±0.32	28.36±0.26	30.13±0.30
	0.12	26.85±0.26	34.04±0.24	30.67±0.45	31.44±0.37
	0.18	31.24±0.16	34.84±0.45	31.93±0.36	31.25±0.13
	0.24	30.51±0.03	36.42±0.26	31.62±0.16	31.85±0.43

HR 샘플	E1+E2 첨가량 (㎖/g DM)	환원당(접종 후 24시간)
HR 샘플	E1+E2 첨가량 (㎖/g DM)	g/L	(g/100g DM)
HR-d23	0.024	50.86±2.81	45.67±2.52
	0.06	56.41±0.53	50.86±0.48
	0.12	57.58±0.30	52.26±0.27
	0.18	58.69±0.61	53.62±0.55
	0.24	58.83±0.47	54.10±0.44

HR 샘플	E1+E2 첨가량 (㎖/g DM)	HMF(접종 후 24시간)		풀푸랄(접종 후 48시간)
HR 샘플	E1+E2 첨가량 (㎖/g DM)	g/L	(g/100g DM)	g/L	(g/100g DM)
HR-d23	0.024	0.173±0.006	0.155±0.006	0.024±0.005	0.022±0.004
	0.06	0.183±0.016	0.165±0.014	0.018±0.002	0.016±0.002
	0.12	0.171±0.014	0.155±0.013	0.016±0.001	0.015±0.001
	0.18	0.171±0.010	0.156±0.009	0.017±0.000	0.015±0.000
	0.24	0.165±0.006	0.151±0.006	0.017±0.000	0.015±0.000

실시예 7: 다른 형태의 그물말 고형물로부터 당농축액 생산

바이오매스 기원 당용액으로부터 화학제품 원료물질을 생산하기 위해서는 고농도 당용액을 제조하여 생물학적 전환용 기질로서 제공하여야 한다.

이를 위해서는 유용한 당이 가능한 최대로 많이 함유되면서 화학적 간섭 또는 생육억제물질이 최소화되도록 조제하는 기술이 확보되어야 한다. 본 실시예에서는 몇 가지 처리된 그물말 시료를 가지고 당화 및 농축과정을 통해 고농도 당용액을 제조하는 방법을 실험하고자 하였다.

식물재료는 온실에서 배양한 그물말을 수확하여 탈수시킨 다음 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후, 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다(HR-d2 및 HR-d16).

당농축액 제조는 그물말 건조시료, 물 추출물이 제거된 잔사(WEFS) 및 물/에탄올 추출물이 제거된 잔사(EFS)를 가지고 제조하였다. 물 및 에탄올로의 추출은 실시예 2에서와 같았다.

상기와 같이 조제된 건조분말시료(분말, WEFS 및 EFS)를 가지고 당화액을 제조하기 위해서는 건조시료(6 g)를 500 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 0.05 M 시트레이트 완충용액(pH 4.8) 100 ㎖을 가한 다음, 120℃에서 20분 고압살균 하였다. 사용된 효소는 셀룰라아제(Celluclast Conc. BG., Novozymes사 제품, 5qo 희석하여 사용, 하기 ‘E1’으로 표시) 및 β-글루코시다아제(Sigma C6105, 하기 ‘E2’로 표시)이다. 무균상에서 여과멸균된 당화효소 E1＋E2 용액을 각각 건조물 1 g 당 0.2+0.04 ㎖ 양으로 가한 후 50℃, 170 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 하였다.

당화가 끝난 시료는 원심분리를(8000 rpm, 20분) 통해 1차 상등액을 취하고, 이어 멸균수를 넣고 부유시킨 다음 동일한 조건으로 원심분리하여 2차 상등액을 취하였다. 1차 및 2차 상등액을 수집하여 혼합한 다음 적당량의 알코올을 가하면서 감압건조기로 물 및 용매를 건조시켰다. 당농축액 내의 글루코오스 함량은 시료를 증류수에 희석하여 생화학 분석기(YSI 2710)로 분석 및 정량하였다.

그 결과, HR-d16 건조시료의 양을 6%(w/v)로 하여 당화시킨 다음 이로부터 당농축액을 제조할 경우, 120 g의 건조 HR에서 약 133.8 g의 당농축액을 얻을 수 있었다. 이에 동일 무게의 멸균수와 혼합하여 글루코오스 함량이 15.6%인 당농축액을 제조할 수 있었다. 한편 WEFS 및 EFS 48 g을 동일한 방법으로 조제하였을 때 약 40g 내외의 당농축액을 얻을 수 있었고 이를 동일 무게의 멸균수와 혼합하여 얻어진 당용액(약 70 ㎖)의 글루코오스 함량은 각각 15.8 및 18% 정도였다(표 11). 이는 WEFS 및 EFS를 이용했을 때 직접 분말화한 건조시료보다 약간 더 높은 고농도 당용액을 제조할 수 있음을 시사해 주지만 물/에탄올 추출 경비 등을 고려하면 그 효과가 낮을 수 있지만 물/에탄올 추출물이 어떤 용도가 있을 경우엔 본 방법도 매우 유용하리라 여겨진다. 한편 물/에탄올 추출물 제거 없이 직접 분말화한 그물말과 시료를 가지고 당용액을 조제하여도, 적어도 글루코오스 함량이 10% 이상이 되면서 발효에 직접 적용할 수 있는 정도의 용액을 손쉽게 확보할 수 있음을 확인할 수 있었다.

HR 샘플	건조중량	최종 당 농도 (HRSC)¹⁾	HRSC로 동일양의 증류수 첨가 (HRSCM)	HRSCM의 글루코오스 함량
HR-d16	120g	133.8g	220 ㎖	15.6%
WEFS(HR-d2)	48g	40g	70 ㎖	15.8%
EFS(HR-d2)	48g	39g	70 ㎖	17.8%

한편 대량의 당화액 생산을 가정해서 보다 효율적으로 당농축액을 얻고자 1차적으로 당화액내의 물을 여과하는 방안을 검토하였다. 즉, HR-d23 건조시료 6 g을 500 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 50 mM 시트레이트 버퍼(pH 4.8) 100 ㎖을 가한 다음, 120℃에서 20분 동안 고압살균하고, 상기와 같은 방법으로 당화를 실시한 후 원심분리를 통해 당화액을 수득하였다. 수회 실험을 통해 모은 당화액(MFHS 라고 명명함) 10.6 L를 4“ PVDF 중공사 모듈을 통해 여과하여 일부 물을 제거시킨 것을 위에서와 같이 적당량의 알코올을 가하면서 감압건조기로 물 및 용매를 건조시켰다.

그 결과 초기 당화액(글루코오스 함량 1.14%)을 중공사 모듈로 여과했을 때의 글루코오스 함량은 2.14%로서 약 2배로 농축되었고 여과된 용액 내의 당함량은 거의 무시할 정도였다. MFHS 1차 농축액 2,500 ㎖만을 취하여 감압건조기를 사용하여 추가 농축한 결과, 완전 농축시 128.5 g 얻어졌으며 여기에 동일 무게의 멸균수를 넣어 섞어준 다음(총 257.0 g) 발효용 당용액을 조제하였는 바(MFHS 2차 농축액), 이때의 글루코오스 함량은 13.5±1.6%(w/w) 이었다. 따라서 본 방법을 통해 대량의 당화액을 적어도 글루코오스 함량이 10% 이상이 되면서 발효에 직접 적용할 수 있는 정도의 당농축액을 보다 빠르게 확보할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 8: 그물말 조류로부터 글루코오스 고함유 당용액 HRHS -3 및 HRHS -7 조제

온실에서 배양된 그물말 과 조류 건조분말시료(HR-d7)를 가지고 보다 높은 용량과 낮은 완충용액강도(buffer strength) 하에서 당화액을 제조하기 위해서 건조시료(40 g)를 2000 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 0.1 mM 시트레이트 완충용액(pH 4.8) 500 ㎖를 가한 다음, 120℃에서 30분 고압살균 하였다. 사용된 효소는 셀룰라아제(Celluclast 1.5 L, Novozymes사 제품, 하기 ‘E1’으로 표시), β-글루코시다아제(Sigma C6105, 하기 ‘E2’로 표시), α-아밀라아제(Sigma A8220, 하기 ‘E3’로 표시) 및 아밀로글루코시다아제(Sigma A7095, 하기 ‘E4’로 표시)이다. 무균상에서 여과멸균된 당화효소 E1＋E2＋E3＋E4 용액을 각각 건조물 1 g 당 0.2, 0.04, 0.2 및 0.2 ㎖양으로 가한 후 50℃, 170 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 시켰다.

당화가 끝난 시료는 원심분리를(8000 rpm, 40분) 통해 1차 상등액을 취하고, 이어 멸균수를 넣고 부유시킨 다음 동일한 조건으로 원심분리하여 2차 상등액을 취하였다. 1차 및 2차 상등액을 모아 혼합한 다음 적당량의 알코올을 가하면서 감압건조기로 물 및 용매를 건조하였다. 당농축액 내의 글루코오스 함량은 시료를 증류수에 희석하여 생화학 분석기(YSI 2710)로 분석 및 정량하였다.

그 결과, HRHS7의 경우 총 120 g의 건조 그물말에서 약 250 g의 당농축액을 수득할 수 있었고, 대략의 글루코오스 함량은 13.9% 정도였다.

실시예 9: 락토바실러스 파라카세이 ( Lactobacillus paracasei ) LA104 균주를 이용한 여러 가지 그물말 당화액으로부터의 젖산 생산

HRHS7 당화액 공급을 통한 LA 생산

HR-d7 시료를 10% 고형분 함량 조건에서 효소가수분해하여 당화액을 얻은 다음 이를 농축시켜 글루코오스 함량이 약 13.9%인 고농도 HR 당용액(HRHS7)을 제조하였다.

HRHS7을 LA 생산 배지(22 g 효모추출물, 5 g 펩톤, 0.2 g MgSO₄, 1.5 g KH₂PO₄, 1.5 g K₂HPO₄, 1.5 g 아세트산나트륨, 0.005 g MnSO₄, 1 g 트윈(tween) 80 및 50 g CaCO₃를 1 L증류수에 첨가)로 초기 글루코오스 함량이 48.4 g/L되도록 희석하고 L. paracasei LA104 및 L. paracasei #3510 균주를 공급하여 37℃, 200 rpm, 36시간 배양하였다. 그 결과 36시간 배양에서 남아있는 글루코오스는 없었으며 각각 52.7 및 51.3 g/L의 젖산이 생산되었다(도 3).

MFHS 2차 당농축액 공급을 통한 LA 생산

실시예 7에서 생산된 MFHS 2차 당농축액(MFHS B)을 LA 생산 배지(10 g 효모추출물, 5 g 펩톤, 0.2 g MgSO₄, 1.5 g KH₂PO₄, 1.5 g K₂HPO₄, 1.5 g 아세트산나트륨, 0.005 g MnSO₄, 1 g 트윈 80 및 50 g CaCO₃를 1 L 증류수에 첨가)로 초기 글루코오스 함량이 114 g/L 이하가 되도록 희석하여 50 ㎖ 삼각플라스크에 27 ㎖ 분주하고 사전에 준비해둔 L. paracasei LA104 균주를 3 ㎖ 공급하여 비닐 혐기성 챔버(Vinyl Anaerobic Chambers, COY Laboratory Products INC, 미국)에서 37℃, 220 rpm, 72시간 배양하였다.

그 결과, 72시간 배양에서 남아있는 글루코오스는 거의 없었으며 초기 환원당 기준으로 150, 125 및 100 g/L의 MFHS 용액을 공급했을 때 각각 생성된 총 젖산 함량은 111.2, 95.3 및 49.0 g/L로서 매우 양호하였다. 소모된 환원당으로부터 젖산 생성 수율을 환산해 볼 때, MFHS B150의 경우 91.36%로서 매우 높은 결과를 보여주었다( 표 12).

시료	멸균 전		멸균 후		젖산 생성 (g/L)	잔존 글루코오스 함량 (g/L)	잔존 환원당 함량 (g/L)	수율 (%)¹⁾
시료	초기 글루코오스 함량(g/L)	초기 환원당 함량 (g/L)	초기 글루코오스 함량(g/L)	초기 환원당 함량 (g/L)	젖산 생성 (g/L)	잔존 글루코오스 함량 (g/L)	잔존 환원당 함량 (g/L)	수율 (%)¹⁾
MFHS B150	114.00	150.00	94.58	148.27	111.21	0.60	26.51	91.36
MFHS B125	95.00	125.00	63.98	127.86	95.13	0.68	17.97	86.57
MFHS B100	76.00	100.00	58.50	106.79	79.03	0.75	14.20	85.35

상기 표 12의 수율은 100×[젖산/(멸균 후 초기 환원당-잔존 환원당)]의 공식으로 산출한다.

실시예 10: 엑티노바실러스 숙시노제네시스 ( Actinobacillus succinogenes )균주를 이용한 조류 당화액으로부터의 숙신산 생산

숙신산(Succinic acid; SA)은 말레인 무수물(Maleic anhydride), 부탄다이올(Butanediol), 테트라히드로퓨란(Tetra hydro furan) 및 PBS(Poly Butylene Succinate)와 같은 여러 가지 화학제품 생산의 중간체 원료 합성에 많이 활용되고 있다. 현재 숙신산은 석유로부터 화학합성을 통해 대부분 생산하지만 향후 석유가 고갈되기 시작하거나 바이오화학제품의 수요가 증가되면 바이오매스로부터 숙신산을 생산하여야만 할 것이다. 그리고 현재 소규모로 생산되고 있는 바이오-숙신산은 밀 및 옥수수 전분 기원의 글루코오스 발효로부터 모두 생산된다. 그런데 인구가 증가되고 바이오매스 수요가 증가되면 특히 화학제품 원료로서의 숙신산은 농산물과 경합되지 않는 바이오매스로 대체하여 생산하는 것이 농산물 가격 안정 차원에서 매우 필요하다. 따라서 본 실시예에서는 생산과 활용 측면에서 농산물과의 경합이 거의 없는 조류 바이오매스인 그물말(HR) 시료를 가지고 숙신산을 생산하는 공정을 개발하기 위하여 실험하였다.

숙신산 생산균주로서 엑티노바실러스 숙시노제네시스(Actinobacillus succinogenes)를 이용하였고, 숙신산 생성 배지에 실시예 8에서 조제된 당농축액을 여러 농도로 희석 공급한 후 121℃에서 15분 멸균한 다음 교반상태로 37℃, 혐기조건에서 4일 동안 배양하면서 경시적으로 당소모량과 숙신산 생성량을 HPLC로 분석하였다. 숙신산 생성 배지의 조성은 50 ㎖ 배지 조제 시 효모추출물 0.5g, 박토트립톤 0.3g , Na₂HPO₄ 0.0545g, NaH₂PO₄ 0.0475g, NaCl 0.05g, MgCl₂ 0.01g, 1000× 비타민 0.05 ㎖ 및 MgCO₃는 당농도의 80% 량을 공급하여 pH 6.5-6.7가 되도록 조제하였다.

그 결과 HRHS3 당화액을 공급하여 숙신산을 생산할 경우 글루코오스 기준 0.85%의 HRHS3를 공급할 경우는 숙신산으로의 전환율이 96.2%였고, 글루코오스 기준 1.25% HRHS3 공급에서는 당의 87.8%가 숙신산으로 전환되어 10 g/L 내외의 숙신산이 생성되었다(표 13). 본 실험 결과는 순수한 글루코오스를 기질로 공급할 경우에 비해 생산성이 떨어지는 경향이지만 보다 최적화 과정을 통해서 숙신산 생성을 높일 수 있을 것이다.

반응시간	HRHS3 (12.5 g/L)		HRHS3 (8.5 g/L)
반응시간	글루코오스	숙신산	글루코오스	숙신산
0	12.4	0	8.5	0
24	4.18	10.35	2.11	6.34
48	1.15	10.82	2.0	5.94
72	1.03	10.98	2.0	6.01
120	0.85	10.41	2.1	5.86
전환율 (%)	87.84		96.16

실시예 11: 여러 균주 혼합물을 이용한 그물말 조류 당화액으로부터의 혼합유기산의 제조

본 실시예에서는 그물말 조류 당화액을 여러 종류의 균주가 혼합된 균주혼합물에 공급하여 혐기조건에서 혼합유기산(아세트산+부틸산+프로피온산)을 생산하는 방법을 실험하였다.

실시예 3에서와 같은 방법으로 HR-d23 시료 2% 고형분 함량으로부터 조제된 당화액(글루코오스 기준 0.6-0.7% 당용액)으로 실험하였다. 사용된 기본배지의 조성은 1L당 NH₄HCO₃ 20 g, KH₂PO₄ 10 g, MgSO₄-7H₂O 1 g, NaCl 0.1 g, MoNa₂O₄ 0.105 g, CaCl₂ 0.1 g, MnSO₄ 0.13 g 및 FeCl₂ 0.04 g 이다. 혐기성 배양에 사용된 균주혼합물[바실러스(Bacillus sp.), 클로스트리디움(Clostridium sp.), 아세토박테르(Acetobacter sp.), 푸로피오노박테리움(Propionobacterium sp.), 기타 등을 포함하는 혼합 균주]은 하수처리장에서 수집한 슬러지를 배양하여 사용하였다. 슬러지 배양은 상기 기본배지의 5배 희석액에 조류분말 또는 효모추출물 등이 2-4% 포함된 용액을 1-2일마다 교체해 주면서 배양함으로서 균주활성을 유지하였다.

유기산 발효를 위해서는 250 ㎖의 삼각플라스크에 증류수 또는 당화액 80 ㎖를 넣은 후 기본배지 10 ㎖를 넣고 슬러지 접종균 10 ㎖ 넣어 혼합한 후 질소가스를 이용하여 혐기성 상태를 만든 다음 37℃ 150 rpm에서 2일 동안 배양하였다. 생성된 유기산을 분석하기 위해서는 발효액 1 ㎖를 취해 8,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 채취한 후 0.45 ㎛의 멤브레인 필터로 여과하여 HPLC 분석을 실시하였다. 분석을 위한 컬럼은 aminex HPX-87H ion-exchange(Bio-Rad, 미국) 컬럼을 사용하였으며, 이동상으로는 0.004 N 황산용액이었다.

그 결과, 반응 개시 후 1일째에 가장 높은 함량을 나타내었으며 이 때 생성된 혼합유기산의 농도는 1.1-1.6 g/L 이었으며 부틸산 < 프로피온산 < 아세트산 순으로 그 함량이 높은 경향이었다(표 14). 발효조건의 최적화 통해서 유기산의 생산성을 보다 높일 수 있을 것이다.

시료	발효후 생성된 유기산 함량 (g/L)
시료	아세트산 (A)	프로피온산(P)	부틸산 (B)	기타	A+P+B
HR - S1	1.30	0.45	0.15	-	1.90
HR - S2	0.95	0.34	0.16	-	1.45

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류로부터 유기산의 제조방법:
(a) 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류를 당화시켜 단당류를 포함하는 당화액을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 당화액을 탄소원으로 이용하여 미생물을 배양하여 유기산을 제조하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 그물말 과 조류는 히드로딕티온 속(Hydrodictyon sp .), 훈장말 속(Pediastrum sp.) 및 소라스트럼 속(Sorastrum sp.)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 조류인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 (ⅰ) 가수분해 촉매, (ⅱ) 다당류 분해효소 또는 (ⅲ) 가수분해 촉매 및 다당류 분해효소를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 3 항에 있어서, 상기 가수분해 촉매는 (i) 황산, 염산, 브롬산, 질산, 아세트산, 포름산, 과염소산, 인산, 파라-톨루엔설폰산(p-toluenesulfonic acid, PTSA) 및 고체산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 산 촉매 또는 (ii) 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼슘 및 암모니아 수용액으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 알칼리 촉매이고, 상기 가수분해 촉매를 이용하여 20-200℃의 온도에서 1-6시간 동안 1차 가수분해 후, 20-200℃의 온도에서 1-6시간 동안 2차 가수분해 하여 실시하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 3 항에 있어서, 상기 다당류 분해효소는 셀룰라아제, β-글루코시다아제, β-아가라제, β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, 라미나린나아제, α-D-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, 수크라아제, 말타아제, 이소말타아제 및 락타아제로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 분해효소이고 상기 다당류 분해효소를 이용하여 증류수 또는 0.01 mM-1.0 M 범위의 완충액에서 20-60℃, 0.5-5일 반응시켜 실시하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 가수분해촉매를 이용하여 20-200℃의 온도에서 1-6시간 동안 1차 가수분해 후, 다당류 분해효소를 이용하여 증류수 또는 0.01 mM-1.0 M 범위의 완충액에서 20-60℃, 0.5-5일 반응시켜 실시하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 당화액은 하이드록시메틸풀푸랄(Hydroxymethylfurfural, HMF), 풀푸랄(furfural) 또는 이들의 혼합물이 0.07 중량% 이하인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 미생물은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 엑티노바실러스 속(Actinobacillus sp.), 비피도박테리엄 속(Bifidobacterium sp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.). 엔테로코커스 속(Enterococcus sp.), 락토코커스 속(Lactococcus sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 페디오코쿠스 속(Pediococcus sp.), 에로코쿠스 속(Aerococcus sp.), 카노박테리엄 속(Carnobacterium sp.), 오에노코커스 속(Oenococcus sp.), 테트라제노코커스 속(Tetragenococcus sp.), 바고코쿠스 속(Vagococcus sp .), 와이셀라 속(Weisella sp.), 라이족토니아 속(Rhizoctonia sp.), 리조푸스 속(Rhizopus sp.), 맨하이미아 속(Mannheimia sp.), 애내로비오스피릴럼 속(Anaerobiospirillum sp.), 클로스트리디움 속 (Clostridium sp.), 푸로피오노박테리움 속(Propionobacterium sp.) 및 아세토박테르 속(Acetobacter sp.)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 유기산은 젖산, 숙신산, 아세트산, 프로피온산 및 부틸산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유기산인 것을 특징으로 하는 방법.
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