KR102063658B1 - 미세조류의 무효소 당화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미세조류의 무효소 당화 방법에 관한 것으로, (a) 미세조류를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 미세조류에 산(acid) 및 마이크로파를 처리하는 단계;를 포함하는 당화 방법이 제공된다.

Description

미세조류의 무효소 당화 방법{A NON-ENZYMATIC METHOD OF SACCHARIFYING MICROALGAE}

본 발명은 공정 효율이 우수한 미세조류의 무효소 당화 방법에 관한 것이다.

오늘날 화석연료의 과도한 사용과 온실가스 배출로 석유고갈과 환경문제가 인류의 지속 성장을 위협할 수 있다는 위험요소로 대두되고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 화석연료 사용 대신 탄소 중립적이고 재사용이 가능한 대체연료인 신재생 에너지 개발의 필요성이 높아지고 있다.

신재생 에너지는 대표적으로 수력, 풍력, 태양력 그리고 바이오연료 등으로 나눌 수 있으며 바이오연료는 광합성으로 생산된 바이오매스의 지질 또는 세포벽 성분을 열화학적 분해, 물리적 추출, 발효를 통해 생산되는 재생가능 에너지로서 연소과정에서 생산되는 이산화탄소는 바이오매스의 성장 과정에서 탄소동화작용을 통해 재흡수되므로 탄소중립적인 에너지 원이다.

바이오연료는 대표적으로 바이오디젤과 바이오알코올로 분류할 수 있으며 기존 대형운송 수단의 연료인 디젤과 휘발류를 대체할 수 있는 대안으로 관심을 받고 있다.

바이오디젤과 바이오알코올은 대두, 유채, 옥수수 등으로부터 추출 및 발효를 통해 생산되며 이를 1세대 바이오매스라 칭하나 원료물질이 식량자원으로 사용되고 있어 바이오연료의 개발이 식량 부족문제를 일으킬 수 있다.

또한, 기후 여건에 따라 원료의 불안정한 수급문제가 발생하는 단점이 있어 비식용 바이오매스인 목질계와 해조류 바이오매스를 이용한 바이오연료 개발에 대한 관심이 증가되고 있다.

2세대 바이오매스인 목질계의 경우 수집에 어려움이 있고 단단한 세포벽의 파괴를 통한 바이오당 생산을 위해 높은 수준의 에너지를 투입해야 되는 단점이 있어 최근 들어 3세대 바이오매스인 해조류를 이용한 바이오 연료 생산이 주목받고 있다.

3세대 바이오매스인 해조류의 대부분은 식물플랑크톤으로 미세조류(microalgae)와 거대조류(macroalgae)로 분류되는데, 미세조류는 광합성을 통한 이산화탄소 고정 능력이 우수하다. 해조류는 육상식물인 대두에 비해 단위 면적당 지질 생산량이 50배 이상 높으며, 배양 조건에 따라 지질 축척율이 70%에 이르는 등 바이오디젤 생산의 우수한 후보로 각광받고 있다.

미세조류의 경우 리그닌 함량이 육상 목질계 바이오매스에 비해 현저히 낮아 전처리를 통한 리그닌 제거가 용이하고 셀룰로오스와 헤미셀룰오스의 화학적 분해도 상대적으로 쉬워 효소당화 공정 없이 전처리 만으로도 발효당 생산이 가능하다.

일반적으로 목질계 바이오매스에 적용되는 전처리에는 증기 폭쇄, 열수, 침지, 초임계, 초음파, 및 침출 등이 있으며 묽은 산을 이용한 전처리가 가장 널리 활용되고 있다.

바이오매스의 효율적 전처리에는 고온, 고압 공정 수행이 필수적이며 바이오매스 가열을 위해서 전도와 대류를 바탕으로 하는 기존 가열법이 보편적으로 이용되고 있지만, 목질계 바이오매스의 낮은 열전도율로 인해 외부로부터 효과적 열전달이 어려운 공정상의 한계점이 존재한다.

기존 공정의 단점을 극복하기 위해 유전체를 포함하는 물질의 전기장 내 분자 상호작용을 통해 전자기에너지를 열에너지로 변환하는 원리를 이용한 마이크로파 가열법이 활용되고 있다.

마이크로파는 극성 용매 분자에 분극화 현상을 발생시켜 높은 내부발열, 이온 교환 능력 및 분해 능력이 형성된다는 장점이 있어 기존 외부 가열법 대비 효율적인 가열방식으로 주목 받고 있다.

본 발명자들은 미세조류를 이용한 바이오당 생산에 있어 리그닌을 선택적으로 분리하고 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스의 결정성을 효과적으로 감소시키기 위한 마이크로파 처리 공정 도입으로 효소 당화 공정이 생략되고 바이오당 생산능이 증진 된 마이크로파 전처리 공정을 제안하고자 하였다.

본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 효소 당화 공정을 배제함으로써 공정이 단순화되고 생산성이 증대된 미세조류의 전처리 및 당화 공정을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 미세조류를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 미세조류에 산(acid) 및 마이크로파를 처리하는 단계;를 포함하는 미세조류의 무효소 당화 방법이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 미세조류는 스파이로자이라(Spirogyra), 클로렐라(Chlorella), 세네데스무스(Scenedesmus), 클로로컴(Chloroccum), 두날리엘라(Dunaliella), 유글레나(Euglena), 포르피리디움(Porphyridium), 프림네시움(Prymnesium), 및 테트라셀미스(Tetraselmis)로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 마이크로파의 출력은 550 내지 750W일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 산은 황산, 염산, 질산, 아세트산, 포름산 및 인산으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 산의 농도는 0.25 내지 0.75 mol일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 처리시간은 60 내지 180초일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 마이크로파의 출력은 702W, 상기 산은 0.48mol의 황산, 상기 처리시간은 108초일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 방법으로 수득한 단당체에 발효 균주를 접종하는 단계;를 포함하는 바이오 에탄올의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 일 측면에 따른 당화 방법은 효소당화 없이 전처리 공정만을 이용하여 생산된 육탄당과 오탄당을 사용하기 때문에 공정이 단순화되고 투입되는 에너지 비용이 현저히 감소될 수 있다.

구체적으로 종래의 발효 공정은 '전처리→당화→멸균→바이오당→균주 접종→발효→유용물질 생산'의 7단계 공정으로 수행되나, 본 발명의 무효소 당화공정은 '전처리→바이오당→균주 접종→발효→유용물질 생산'의 5단계 공정으로 단순화될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 마이크로파 전처리 조건이 미세조류 잔류고체, 글루코오스, 자일로오스 생산에 미치는 영향을 분석한 것이다.
도 2는 미세조류 전처리 조건이 고체잔류량에 미치는 영향을 분석한 것이다.
도 3은 마이크로파 전처리가 육탄당(글루코오스) 생산에 미치는 영향을 분석한 것이다.
도 4는 마이크로파 전처리가 오탄당(자일로오스) 생산에 미치는 영향을 분석한 것이다.
도 5는 산처리에 따른 발효 미생물 저해물질의 생성을 정량한 결과이다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.

이하, 본 발명의 실시예를 상세히 기술하나, 하기 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 아니함은 자명하다.

본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 미세조류를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 미세조류에 산(acid) 및 마이크로파를 처리하는 단계;를 포함하는 미세조류의 무효소 당화 방법이 제공된다.

기존 목질계 또는 식물 세포를 이용한 발효당 생산은 세포벽 구성 물질(셀룰로오스, 헤미셀룰로오스)을 물리화학적으로 부분 파괴하는 전처리 단계 및 부분 파괴된 세포벽의 단당화 단계로서 효소 반응 단계가 필수적으로 요구되었다.

본 발명의 무효소 당화 방법은 리그닌 함량이 낮아 세포벽 강건도가 낮은 미세조류의 특징을 고려하여 물리화학적 전처리 만으로 세포벽을 분해하는 단당화할 수 있다.

기존 공정은 목질계로부터 바이오당 생산공정은 전처리와 당화 공정이 필수적이며 고가의 효소를 사용함에 따라 효소당화 공정이 바이오에탄올 또는 바이오플라스틱 생산가의 15 내지 20%를 차지하였으나, 본 발명에 따른 공정을 적용함으로써 효소비용 감소 및 공정 단순화에 의해 바이오에탄올 및 바이오플라스틱 생산 원가를 현저히 저감할 수 있다.

또한, 마이크로파를 이용한 내부 발열 전처리 공정을 통해 저온에서 짧은 시간 처리함으로써 에너지 비용을 절감시킬 수 있고, 고온에서 발효당의 과분해로 인한 발효 부산물(푸르푸랄, HMF 등)의 생성을 최소화할 수 있다.

상기 “미세조류(microalgae)”는 물, 이산화탄소 및 햇빛을 이용하여 광합성으로 성장하는 단세포성 생물로서, 식물 플랑크톤이라고도 불린다. 상기 미세조류는 배양하거나 수확한 것일 수 있다. 상기 배양된 미세조류는 배양액을 포함할 수 있고, 수확된 미세조류는 미세조류의 서식지에 따라 해수 또는 담수를 함께 포함할 수 있다.

상기 미세조류는 육상식물을 제외한 모든 광합성 생물의 통칭으로 분류학적 용어는 아니며, 매우 다양한 분류군을 지칭하는 일반 용어이다. 이들 중 현미경으로 관찰할 수 있는 단세포성 조류를 미세조류라 하며 대부분의 식물성 플랑크톤이 이에 속한다.

상기 미세조류는 지구상에서 전체 광합성의 90%를 담당하는 것으로 추정되고 있으며, 지구 생태계의 1차 생산자로 매우 중요한 위치를 점하고 있다.

상기 미세조류는 물, 햇빛 및 CO₂ 등을 공급해주면 무제한 증식(배양)이 가능하다. 미세조류는 주로 광합성을 통해 세포 성장과 번식을 행하는 식물군 또는 넓은 의미로 일부는 세균으로 분류되고 있으며, 그 종류나 수에 있어서는 매우 다양하고 많다.

일반적으로, 상기 미세조류는 지상 식물보다 훨씬 빨리 성장하고 생균체 생산성이 높은 점, 담수나 해수는 물론이고 빛 에너지를 확보할 수 있는 자연 환경에서는 쉽게 생육된다는 점, 다양한 조류에서 단백질, 지질, 당질 및 색소와 같은 산업적으로 흥미가 있는 생물 고분자 물질은 물론이고 특정의 생리 기능을 갖는 물질을 고농도로 생산할 수 있다는 점에서 중요한 생물 산업 소재로서 활용가능성이 우수하다.

상기 미세조류로부터 지질을 추출한 후, 부산물로 발생하는 유기물인 미세조류는 소량의 잔류 지질을 포함하고 있으며 회분을 제외한 세포벽 성분이 주를 이루고 있어 목질계 바이오매스와 구조적으로 유사한 특징을 가진다.

일반적으로 구조가 강건한 목질계 바이오매스로부터 바이오당 생산을 위해서는 외부 리그닌을 제거하고 셀룰로오스의 강건한 구조와 헤미셀룰로오스를 일부 파괴하는 물리, 화학적 전처리 과정이 필수적이다.

목질계 바이오매스의 경우 전처리에 의해 리그닌이 일부 제거되고 부분적 파괴가 이루어진 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스를 단당으로 분해하는 공정인 효소 당화 공정을 통해 바이오당이 생산될 수 있다.

반면, 미세조류의 경우 리그닌 함량이 육상 목질계 바이오매스에 비해 현저히 낮아 구조의 강건함이 약해 전처리를 통한 리그닌의 제거가 용이하고 셀룰로오스와 헤미셀룰오스의 화학적 분해도 상대적으로 쉬워 효소당화 공정 없이 전처리 만으로도 발효당 생산이 가능할 수 있다.

상기 미세조류는 이산화탄소를 기질로 하여 유기물을 합성하는 통상의 미세조류라면 특별히 제한되지 않으나, 예컨대 스파이로자이라(Spirogyra), 클로렐라(Chlorella), 세네데스무스(Scenedesmus), 클로로컴(Chloroccum), 두날리엘라(Dunaliella), 유글레나(Euglena), 포르피리디움(Porphyridium), 프림네시움(Prymnesium), 및 테트라셀미스(Tetraselmis)로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있다.

상기 “당화”는 셀룰로스 성분이 글루코스로 전환되는 과정을 의미하며, 미세조류 유래 발효당은 글루코오스와 자일로오스를 포함하므로 유기산, 알코올, 아미노산 등의 제조에 사용될 수 있다.

상기 “발효당”은 통상의 발효 과정을 거쳐 알코올, 젖산 등으로 변환될 수 있는 당류를 지칭하며, 예컨대, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등이 이에 해당한다.

통상적으로, 바이오매스를 이용한 발효 공정은 효소처리에 의한 당화 공정이 적용되었으나, 본 발명은 무효소 당화공정으로서 마이크로파를 처리 공정을 도입함으로써 설비 비용이 획기적으로 절감될 수 있으며 공정이 단순화되어 생산성이 현저히 증대될 수 있다.

상기 마이크로파는 통상적으로 300 MHz 내지 300 GHz의 주파수 범위대를 가지는 전자파를 의미한다. 상기 마이크로파는 물이나 식품에 흡수되는 성질을 가지며, 흡수된 마이크로파는 열로 변환되므로 처리 대상 온도를 효과적으로 상승시킬 수 있다.

상기 마이크로파의 처리에 의해 발생한 열에 의해 미세조류의 리그닌 성분은 효과적으로 제거될 수 있다. 이 때, 상기 마이크로파의 출력은 550 내지 750W일 수 있다.

상기 마이크로파의 출력이 550W 미만이면 공정 효율이 과도하게 저하될 수 있고, 750W 초과이면 고열로 인해 유기성분이 파괴될 수 있다.

특히, 본 발명의 당화 방법은 마이크로파와 함께 산처리 공정을 결합함으로써 미세조류로부터 효과적으로 발효당을 생성할 수 있다.

상기 산은 황산, 염산, 질산, 아세트산, 포름산 및 인산으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 상기 산의 농도는 0.25 내지 0.75 mol일 수 있다.

상기 산의 농도가 0.25 mol 미만이면 공정 효율이 낮아 생산성이 저하될 수 있고, 0.75 mol 초과이면 산성 특성으로 인해 유기성분이 변형될 수 있다.

상기 처리시간은 60 내지 180초일 수 있다. 상기 처리시간이 60초 미만이면 리그닌 성분이 완전히 제거되지 않아 생산성이 저하될 수 있고, 180초 초과이면 공정 효율이 감소할 수 있다.

구체적으로 상기 마이크로파의 출력은 702W, 상기 산은 0.48mol의 황산, 상기 처리시간은 108초일 수 있으며, 본 조건에서 공정 효율이 극대화될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 방법으로 수득한 단당체에 발효 균주를 접종하는 단계;를 포함하는 바이오 에탄올의 제조방법이 제공된다.

상기 “발효”는 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정을 지칭하는 것으로, 상기 발효를 통해 각종 산물이 생성될 수 있다.

예컨대, 포도당에 효모와 같은 특정 균주는 유기물인 포도당을 분해할 수 있다. 이 경우, 산소를 공급하지 않으면 효모는 포도당을 완전히 분해시키지 못하고 에탄올을 생성할 수 있다.

상기 발효 균주는 배치, 공급-배치 또는 연속 발효 조건 하에서 배양될 수 있다.

이 때, 고전적인 배치 발효 방법은 폐쇄적인 시스템을 사용할 수 있고, 상기 배양 매질은 발효가 실행되기 전에 제조되며, 상기 매질에 유기체를 접종하고, 상기 매질에 어떠한 성분의 첨가도 없이 발효가 일어날 수 있다. 특정한 경우에서, 성장 매질의 상기 탄소원 내용물이 아닌, 상기 pH 및 산소 함량은 배치 방법 동안 변화될 수 있다. 배치 시스템의 상기 대사물 및 세포 바이오매스는 끊임없이 발효가 정지될 때까지 변화할 수 있다. 배치 시스템에서, 세포는 정지된 지체 상에서 고도성장 로그 상에 걸쳐 진척하고, 성장율이 감소되거나 멈춘 최종적으로 정지 상에 이를 수 있다. 일반적인 기간에서, 로그 상의 상기 세포는 대부분의 단백질을 만들 수 있다.

표준 배치 시스템의 변형은 "공급-배치 발효" 시스템이다. 상기 시스템에서, 영양(예를 들면, 탄소원, 질소원, O₂, 및 통상적으로, 다른 영양)은 이들의 배양물의 농도가 한계치 미만으로 떨어질 때 첨가될 수 있다. 공급-배치 시스템은 이화 생성물 억제가 세포의 대사를 억제하고, 매질이 매질 내에서 영양소를 제한된 양으로 갖는 것이 바람직할 때 유용할 수 있다, 공급-배치 시스템에서의 실제 영양 농도의 측정은 pH, 용존 산소 및 CO₂와 같은 폐기가스의 부분압과 같은 측정 가능한 인자의 변화에 기초하여 예측될 수 있다. 배치 및 공급-배치 발효는 일반적인 시스템으로서 당업계에 널리 알려져 있다.

계속적 발효는 정의된 배양 매질이 계속해서 생반응기(bioreactor)에 첨가되고, 조건화된 매질의 동일한 양이 과정 동안 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 계속적 발효는 일반적으로 세포가 처음에는 로그상 성장에 있는 일정한 고 밀도의 배양물을 유지할 수 있다. 계속적 발효는 세포 성장 또는 마지막 생성물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 임의의 수의 인자의 조작이 가능할 수 있다.

예컨대, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소는 고정된 속도로, 모든 다른 파라미터는 적당하게 유지될 수 있다. 다른 시스템에서, 많은 성장에 영향을 주는 인자는 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도가 일정하게 유지되는 동안, 계속해서 변화할 수 있다. 계속적 시스템은 일정한 상태의 성장 조건을 유지하려고 한다. 따라서, 매질이 빠져나가는 것에 의한 세포 손실은 발효에서의 세포 성장 속도에 대항하여 균형이 맞을 수 있다. 생성물 형성의 속도를 최대화하는 기술뿐만 아니라, 계속적 발효 과정 동안 영양소 및 성장인자를 유지하는 방법은 당업계에 알려져 있다.

생성물인 에탄올은 공지의 방법을 통해 회수될 수 있다. 예컨대, 상기 자일리톨과 에탄올은 염석법, 재결정법, 유기 용매 추출법, 에스테르화 증류법, 크로마토그래피 및 전기투석법 등에 의해 회수될 수 있다.

이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

실험예 1 : 미세조류 선정

바이오당 생산을 위해서는 탄수화물의 고분자인 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스의 함량이 높은 미세조류의 선정하는 것이 중요하다.

이를 위해 문헌조사를 통해 탄수화물 함량이 높은 22종의 미세조류를 우선 선정하였으며, 문헌상의 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스 고함량 균주를 중심으로 10종의 균주를 선정하여 주요 탄수화물인 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스 함량분석을 위해 고체분석을 수행하였다(표 1).

실험예 2 : 미세조류 선정

미세조류에 포함된 리그노셀룰로오스 함량은 미국 신재생에너지연구소(NREL;National Renewable Energy Laboratory)에서 제공한 분석 방법(NREL Laboratory Analytical Procedures)에 따라 분석하였다.

전처리 조건에 따른 당화율 분석은 마이크로파를 이용한 전처리 후 당화액의 상층을 채취하였다. 0.2 μm 주사기 필터로 여과한 당화액을 HPLC(Waters 1525, Waters Co., USA)로 분석하였다.

HPLC 구동에 사용된 이동상은 0.05 mM의 황산용액을 사용하였고 0.6 mL/min의 유속으로 운전하였다.

사용된 검출기로는 RI detector Refractive Index (Waters 410, Waters Co., USA)를 사용하였고, 검출기 온도는 60℃로 설정하였다.

주요 바이오매스의 고체성분인 글루코오스, 자일로오스, 등의 당과 당화액 내의 당분석은 Aminex HPX-87H Column (Bio-Red Inc., USA)을 사용하였고 컬럼의 온도는 60℃로 설정하였다.

실험예 3 : 마이크로파 전처리 방법

마이크로파를 이용한 전처리를 위해 시료와 용매를 1:10의 고액비로 혼합하여 고압용기인 pressure vessel(XF100, Anton-Paar, Austria)에 넣고 밀폐하여 마이크로파 장치인 Anton Paar microwave(Multiwave 3000, Anton Paar, Austria)에서 출력과 시간을 조절하면서 마이크로파 추출을 진행하였다.

추출 후, 상온에서 냉각시켜 전처리액을 원심분리 후 상등액을 회수하여 칼슘카보네이트(CaCo₃)로 중화시켜 사용하였다.

실험예 4 : 마이크로파 전처리 조건 최적화

미세조류 세포벽으로부터 분리 된 바이오당인 글루코오스와 자일로오스 생산을 최대로 하는 최적추출조건을 설정하기 위해 통계학적 최적화를 이용하였다.

중심합성법(central composite design, CCD)을 이용하여 추출조건에 대한 실험을 진행하였다.

Design Expert 8.0(Stat-Ease, Inc., USA)을 통해 전처리 공정에서 중요한 변수로 확인된 마이크로파 출력(200~600 W, X₁), 추출시간(20~80 sec., X₂), 황산농도(0~1 mol, X₃)를 -1.68, -1.0, 0, 1.0, +1.68로 표준화된 중심합성계획에 중심 3반복 실험을 포함한 17개 조건에서 전처리 실험을 실시하였다.

3개의 독립변수에 의해 영향을 받는 종속변수(Y)를 잔류 고체 비율, 오탄당(글루코오스)과 육탄당(자일로오스) 당화율로 설정하여 회귀분석을 통해 전처리 조건 최적화를 진행하였다(X₁ = 마이크로파 출력, X₂ = 추출시간, X₃ = 황산농도).

실험예 5 : 당화율 분석

당화율의 경우 기존의 연구과 같이 바이오매스에 존재하는 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스의 절대량을 단당으로 환산하였다.

바이오매스의 단당 절대량 대비 전처리를 통해 단당화 되어 당화액에 존재하는 단당의 양의 비율을 하기 식을 이용하여 계산하여 당수율을 산출하였다.

잔류고체비(solid residue)는 마이크로파 전처리 수행 후, 잔류 된 고체의 무게를 전처리 이전의 시료의 무게비로 나누어 그 비율로 나타냈다.

육탄당 당수율 환산계수 0.9는 셀룰로오스 구성시 글루코오스 1단위에 물분자 1단위가 결합되어 있으므로 셀룰로오스가 글루코오스로 전환 시 물분자가 셀룰로오스 고분자에서 빠져나가므로 당수율 계산에서 물분자는 제외하여 계산하였고 오탄당 당수율 환산계수인 0.88은 헤미셀룰로오스 1단위 당 물분자 1개가 결합된 결정형 구조를 기반으로 산출하였다.

[식1]

육탄당 당수율(%) = [(추출 된 당의 무게 (g))/(셀룰로오스의 무게 (g) × 0.90] × 100

[식2]

오탄당 당수율(%) = [(추출 된 당의 무게 (g))/(셀룰로오스의 무게 (g)) × 0.88] × 100

[식3]

잔류고체비(%) = [(전처리 이전 고체무게 (g))/(전처리 이후 고체 (g)) × 무게] × 100

실시예 1 : 미세조류 성분분석 결과

미세조류의 구성성분은 10.7%의 셀룰로오스, 5.5%의 헤미셀룰로오스와 0-2%의 리그닌으로 구성되어 있었으며 회분이 23.0%를 차지하는 것으로 분석되었다.

일반적으로 목질계 리그노셀룰로오스의 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스는 효소적 또는 화학적 분해에 의해 각각 글루코오스와 자일로오스 등의 바이오당으로 전환될 수 있으나 리그닌에 의해 둘러싸여 있어 바이오당 생산을 방해 받는다.

목질계 바이오매스로부터 바이오당 생산을 위해서는 리그닌을 제거하여 효소의 접근성을 향상시키는 동시에 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스를 부분적으로 분해시켜 당화를 용이하게 하는 전처리 과정이 필수적이다.

미세조류의 경우 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스 함량이 각각 10.7%와 5.5%로 목질계 대비 1/2 내지 1/3 수준으로 확인되었다.

미세조류의 경우 목질계와 달리 리그닌 함량이 매우 낮아 리그닌 제거를 위한 전처리 공정이 필요 없거나 전처리 만으로 바이오당을 생산할 수 있는 장점을 가진다.

리그닌 부재로 인한 당화의 용이성으로 인해 바이오당 생산 공정의 주요 공정인 전처리-당화 공정의 단순화가 가능하여 전처리 만으로 바이오당을 생산하는 무효소 당화공정 구성이 가능할 수 있다.

실시예 2 : 미세조류 선정

실험에 사용한 미세조류는 한국해양과학기술원에서 분양 받아 사용했으며 광반응기에서 배양 후 원심분리로 세포를 회수하여 -50℃의 냉동고에 보관하면서 이용하였다.

바이오당 생산에 적합한 탄수화물 함량이 높은 미세조류 선정을 위해 미세조류 성분 분석을 진행하였다.

실험에 사용된 미세조류의 구성성분은 9-47% 셀룰로오스(글루칸), 5-14% 헤미셀룰로오스(자일란)으로 구성되어 있었으며 리그닌이 3%이하로 포함되어 있다.

리그노셀룰로오스 이외에 회분의 함량이 10-30%로 매우 높은 것을 확인할 수 있었는데 회분의 대부분은 칼슘으로 미세조류를 포함한 해조류가 광합성에 필요한 탄소를 탄산칼슘형태로 저장함에 기인한다고 알려져 있다.

바이오당 생산 최적화를 위해 미세조류의 지질 이외의 성분에 대한 문헌조사를 통해 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스 함량이 높고 리그닌 함량이 낮은 후보 미세조류 1차 선정하였다.

또한 리그노셀룰로오스 성분분석 기반 선정을 위해 셀룰로오스, 헤미세룰로오스과 리그닌을 표준 분석법을 적용하여 성분을 분석하여 세포벽 주요 3 성분을 측정하여 오탄당과 육탄당의 함량이 높고 리그닌 함량이 상대적으로 적어 바이오당 생산 잠재력이 높은 Scenedesmus sp .를 바이오당 생산용 미세조류로 최종 선정하였다.

실시예 3 : 마이크로파를 이용한 무효소 당화공정

마이크로파를 이용한 미세조류로부터 바이오당 생산 최대화를 위한 전처리 조건 도출을 위해 황산을 이용한 약산 전처리에 영향을 미치는 주요변수를 최적화하였다.

마이크로파 추출에 있어 주요변수와 실험구간 설정은 기존 본 실험실의 예비 실험결과를 통해 선정하였으며 공정조건 최적화에서 종속변수인 잔류고체량과 바이오당(오탄당, 육탄당) 생산에 미치는 독립변수인 마이크로파 출력(A), 추출시간(B) 및 황산농도(C)의 영향을 평가하였다.

종속변수에 미치는 각 독립변수들의 영향을 시각화 했을 때 고체잔류량은 출력과 시간에 따라 비례하여 감소하지만 황산의 농도변화에 따른 고체잔류량은 큰 변화가 없는 것으로 나타났다(도 1).

상기 결과는 출력과 시간이 리그노셀룰로오스 성분의 제거에 보다 효과적임을 시사한다.

육탄당(글루코오스)과 오탄당(자일로오스) 당화의 경우 출력과 시간에 따라 당화율이 비례하여 증가하는 경향을 보이며 출력이 시간에 비해 더 큰 영향이 있었다.

상기 결과는 산을 이용한 전처리에 있어 바이오매스의 주요성분인 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스와 리그닌의 가수분해로 육탄당, 오탄당과 폴리페놀로 분해되어 액체상으로 이동함에 따라 바이오매스의 질량이 감소한 것을 의미한다.

마이크로파와 추출시간 증가에 따라 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스의 분해 증가에 따라 단당화가 가속되어 고체 잔류량이 감소하였으며, 이는 전처리 조건이 고온이고 시간이 길어짐에 따라 저분자화 진행 속도가 증가되며 이에 따라 잔류 고체량이 감소한다는 일반적인 보고 내용과 일치한다.

실시예 4 : 미세조류 고체잔류량 평가

리그노셀룰로오스의 전처리는 세포벽의 주성분인 리그닌을 제거하고 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스를 내부 결합을 일부 파괴하여 바이오당 생산 효율을 증대시킴에 목적이 있다.

따라서 리그노셀룰로오스의 주요 3성분의 제거 정도를 확인하기 위해서 마이크로파 전처리 이후 잔류하는 고체량을 측정할 필요가 있다.

미세조류의 마이크로파 추출에 있어 황산농도를 0.5 mol로 고정하여 마이크로파 전처리를 진행하였을 때 잔류고체량에 미치는 마이크로파 출력과 추출시간의 영향을 보여준다(도 2).

잔류고체량은 마이크로파의 출력 낮고 추출시간이 짧을 때 감소폭이 크지 않았으나 출력과 추출시간이 증가함에 따라 고체잔류량이 급속히 감소하여 542 W 및 182초 이상 조건에서 잔류하는 고체가 최소화되었다.

상기 결과는 미세조류 고체성분인 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스가 높은 출력과 긴 전처리 조건에서 빠르게 분해되어 전처리액으로 이동되어 잔류 고체가 잔존하지 않은 것을 의미한다.

고체잔류량 변화에 황산농도가 미치는 영향을 평가하였을 때, 황산농도는 출력과 시간과 상호작용에 있어서도 고체잔류량 감소에 큰 영향이 없는 것으로 나타났다.

상기 결과는 미세조류의 탈지과정에서 황산과 유기용매를 이용한 추출이 선행되어 전처리 과정에서 첨가한 황산에 의한 세포벽 분해 효과가 크지 않음을 시사한다.

실시예 5 : 오탄당 및 육탄당 생산량 평가

마이크로파 출력과 추출시간 변화에 따른 육탄당과 오탄당의 생산을 평가하였다.

육탄당 생산에 있어 출력과 추출시간의 증가에 따라 급격하게 증가하여 최대 당화율인 94.1%에 도달하였다(도 3).

상기 결과는 셀룰로오스 분해를 통한 글루코오스 생산에서 대부분의 셀룰로오스가 과분해 없이 글루코오스로 전환됨을 의미한다.

셀룰로오스 분해를 통한 육탄당 생산에 있어 마이크로파와 전처리 시간의 증가에 따른 상승효과가 크며 효과적인 당화를 위해서는 두 변수의 동시 증가가 필요한 것으로 분석되었다.

오탄당 당화에 있어서도 육탄당과 유사한 결과를 보였는데 출력과 추출시간이 증가함에 따라 오탄당 당화율이 빠르게 증가하여 최대 당화율인 75.6%에 도달하였다(도 4).

상기 결과는 마이크로파를 이용한 바이오당 산당화에 있어 출력과 추출시간이 충분치 않을 때 바이오매스에 전달된 에너지의 총량이 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스의 β-1,4 결합 분해에 충분하지 못하며, 마이크로파 출력과 시간의 증가에 따라 세포벽의 리그노셀룰로오스 내부의 분자운동의 증가에 따라 열 발생량이 증가하여 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스의 가수분해가 가속화 되었음을 시사한다.

즉, 미세조류의 마이크로파를 이용한 당화에 있어 산당화 만으로도 육탄당 94.1%, 오탄당 75.6%의 높은 당화율을 얻을 수 있어 무효소 당화 공정의 구성이 가능하다.

최적화 결과, 글루코오스와 헤미셀룰로오스 단당화 최적조건은 마이크로파 출력 702W, 추출시간 108초, 황산 0.48 mol이었으며 셀룰로오스 당화율 94.1%, 헤미셀룰로오스 75.6%가 산출되었다.

상기 결과는 기존 목질계의 전처리와 당화를 거쳐 생산되는 단당의 당화율에 비해 상대적으로 높은 당화율이며 미세조류로부터 마이크로파를 이용한 전처리가 낮은 온도와 짧은 전처리 시간 적용이 가능하여 기존 전처리 대비 효과적인 공정임을 의미한다.

실시예 6 : 발효 저해물질 생산량 평가

발효 미생물 저해물질인 푸르푸랄과 하이드록시메틸푸르푸랄의 정량을 위한 HPLC 결과에 따르면 황산 첨가가 없을 경우 푸르푸랄과 하이드록시메틸푸르푸랄의 생산이 없었으나, 1.0 mol 첨가에 따라 하이드록시메틸푸르푸랄 0.42 g/L 확인되어 0.8 mol 이상의 황산 농도에서 글루코오스가 하이드록시메틸푸르푸랄로 미량 분해되었다.

하지만 푸르푸랄의 생산은 확인되지 않았는데 이는 자일로스로부터 생산된 푸르푸랄이 분해과정을 거쳐 유기산(말릭산, 개미산 등)등으로 분해되는 과정을 거쳤기 때문으로 분석된다.

목질계 바이오매스를 이용한 바이오당 생산에 있어 약산 전처리 조건에 따른 글루코오스와 자일로오스의 과분해물 생산에 대한 많은 연구가 진행되었고 연구결과에 따르면 산농도가 증가할수록 바이오당 생산이 증가하나 일정수준(>1 mol)이상에서 재차 감소하였다(도 5).

글루코오스와 자일로오스는 산성조건에서 열 안정성이 약해져 과분해되며 자일로스의 과분해물인 푸르푸랄의 안정성이 하이드록시메틸푸르푸랄에 비해 더 낮아 과분해물이 바이오당 생산 수율을 감소시키는 동시에 발효 수율이 저하될 수 있다.

하지만 일반적으로 대장균과 효모 균주에 있어서 두가지 부산물의 농도가 1 g/L 이하에서는 미생물 발효 성장저해가 없으므로, 본 부산물은 미생물 성장 저해가 없는 수준으로 평가할 수 있다.

실시예 7 : 전처리 공정 효율 비교 평가

기존 전처리 공정인 약산, 침출, 암모니아가스 폭쇄, 암모니아 침출, 염기침지법과 마이크로파 전처리의 추출시간을 비교했을 때 마이크로파 전처리는 120°C 이하의 온도에서 2분 이하의 전처리가 진행되므로 기존 전처리에 비해 공정 시간이 획기적으로 감소되었다(표 2).

구분	온도(°C)	반응시간(min)	화학물질	농도
Microwave	120	2	Sulfuric acid	0.5-2%
Dilute acid	160	20	Sulfuric acid	0.49%
Flow through	200	24	-	0
Partial flow	200	24	-	0
Controlled Ph	190	15	-	0
AFEX	90	5	Ammonia	100%
ARP	170	10	Ammonia	15%
Lime	55	4 주	lime	8%

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

1. (a) 미세조류로서 세네데스무스(Scenedesmus)를 제공하는 단계; 및
   (b) 상기 미세조류에 황산, 염산, 질산, 아세트산, 포름산 및 인산으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 산(acid) 및 마이크로파를 90 내지 120초 동안 처리하는 단계;를 포함하고,
   상기 산의 농도는 0.25 내지 0.75 mol이며, 상기 마이크로파의 출력은 550 내지 750W인 미세조류의 무효소 당화 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제1항에 있어서,
   상기 마이크로파의 출력은 702W, 상기 산은 0.48mol의 황산, 상기 처리하는 단계의 처리시간은 108초인 미세조류의 무효소 당화 방법.
8. 제1항 또는 제7항의 방법으로 수득한 단당체에 발효 균주를 접종하는 단계;를 포함하는 바이오 에탄올의 제조방법.

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