KR20200020961A - 바이오매스 재료의 가공처리 - Google Patents

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아이치로 요시다
제니퍼 문 이 펑
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Abstract

효소를 유도하는 방법, 그리고 셀룰로스 및 리그노셀룰로스를 효소로 처리하는 방법이 제공된다.

Description

바이오매스 재료의 가공처리{PROCESSING OF BIOMASS MATERIALS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 미국 가특허출원 제61/579,550호 및 제61/579,562호(둘 모두 출원일: 2011년 12월 22일)의 이득을 주장한다. 상기 출원의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
기술 분야
본 발명은 바이오매스 재료의 가공처리에 유용한 제조 효소에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 셀룰라제 효소 또는 기타 효소 유형을 생산하는 것에 관한 것이다.
석유에 대한 수요가 증가함에 따라서, 바이오연료 및 생화학물질을 제조하기 위한 재생가능한 공급원료의 관심도 높아진다. 이러한 제조 공정을 위한 공급원료로서의 리그노셀룰로스 바이오매스의 이용은 1970년대 이래로 연구되어 왔다. 리그노셀룰로스 바이오매스는 풍부하고 재생가능하며 국내에서 생산되기 때문에 매력적이고, 식품 산업 용도와 경쟁하지 않는다.
두서너 가지 예를 들면, 농산물 잔류물(agricultural residue), 목재 바이오매스, 도시 폐기물, 오일시드(oilseed)/케이크 및 해초를 포함하는, 많은 잠재적인 리그노셀룰로스 공급원료가 오늘날 이용가능하다. 현재, 이들 재료는 동물 사료, 퇴비 재료로서 이용되거나, 열병합 설비에서 연소되거나, 혹은 매립된다.
리그노셀룰로스 바이오매스는, 식물 셀 벽이 강고하고 컴팩트한 구조를 지니므로 분해에 대해서 저항성(즉, 난분해성; recalcitrant)이다. 이 구조는 리그닌에 의해 둘러싸여 헤미셀룰로스 매트릭스 내에 매립된 결정성 셀룰로스 원섬유를 포함한다. 이 컴팩트한 매트릭스는 효소 및 기타 화학적, 생화학적 및 생물학적 처리과정에 의해 접근하기 어렵다. 셀룰로스 바이오매스 재료(예컨대, 실질적으로 모든 리그닌이 제거된 바이오매스 재료)는 효소 및 다른 전환 과정에 더 접근가능할 수 있으나, 그렇기는 하지만, 천연 유래 셀룰로스 재료는 종종 가수분해 효소와 접촉될 때 (이론적 수율에 비해서) 낮은 수율을 지닌다. 리그노셀룰로스 바이오매스는 효소 공격에 훨씬 더 난분해성이다. 또한, 각 유형의 리그노셀룰로스 바이오매스는 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 리그닌의 그 자체의 특이적인 조성을 지닌다.
리그노셀룰로스 바이오매스로부터 구조적 탄수화물을 추출하기 위하여 많은 방법이 시도되어 왔지만, 이들은 너무 값비싸거나, 너무 낮은 수율을 생산하거나, 얻어지는 생성물 중 바람직한 화학물질을 남기거나, 또는 간단히 당을 분해시킨다.
재생가능한 바이오매스 공급원으로부터의 당류는 석유 및 기타 화석 공급원료를 대체, 보충 혹은 치환함으로써 화학적 및 연료 산업의 토대로 될 수 있었다. 그러나, 이들 단당류를 허용가능한 순도와 가격으로 양산에 이용가능하게 만들 기술을 개발할 것이 요구되고 있다.
본 명세서에서는, 인덕턴트(inductant)의 사용을 통해서, 미생물에 의해 1종 이상의 효소의 생산을 유도하는 방법이 제공된다.
일 양상에 있어서, 난분해성(recalcitrance)을 저감시키기 위하여 처리된 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스를 미생물과 배합하여, 상기 미생물에 의해 효소(들)의 생산을 허용하는 조건 하에 상기 미생물-바이오매스 배합물을 유지함으로써 상기 미생물에 의해 1종 이상의 효소의 생산을 유도하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 몇몇 구현예에서, 효소(들)는 다음에 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스를 당화시키는데 이용된다.
또한, 미생물에 의해 효소의 생산을 유도하는 방법이 제공되되, 여기서 상기 방법은 제1셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스를 제공하는 단계; 난분해성을 저감시키는 처리 방법으로 제1바이오매스를 처리함으로써 제1의 처리된 바이오매스를 생성하는 단계; 미생물을 제공하는 단계; 액체 배지(liquid medium)를 제공하는 단계; 제1의 처리된 바이오매스와 미생물과 액체 배지를 배합함으로써, 미생물-바이오매스 배합물을 생성하는 단계; 및 미생물에 의한 효소의 생산을 허용하는 조건 하에 미생물-바이오매스 배합물을 유지함으로써, 인덕턴트-효소 배합물을 생성하는 단계를 포함하고; 이에 의해서 미생물에 의한 효소의 생산을 유도한다.
또한, 본 명세서에서는 액체 배지, 난분해성을 저감시키도록 처리된 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스, 미생물, 및 미생물에 의해 생산된 1종 이상의 효소를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 명세서에서 제공되는 방법 혹은 조성물의 어느 것에 있어서, 바이오매스 재료(들)의 난분해성을 저감시키는 처리는 전자 충격(bombardment with electrons), 초음파처리, 산화, 열분해, 증기 폭발(steam explosion), 화학적 처리, 기계적 처리 및 동결 분쇄 중 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 상기 처리 방법은 전자 충격이다.
상기 방법 및 조성물은 또한 벌크 밀도(bulk density)를 저감시키고/시키거나 표면적을 증가시키기 위하여 제1 또는 제2셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스를 기계적으로 처리하는 단계를 포함한다. 바이오매스 재료(들)는 미생물 및 액체 배지와 배합되기 전에 분쇄될 수 있다. 분쇄는 건식 밀링(dry miling) 또는 습식 밀링(wet miling)일 수 있다. 바이오매스 재료는 약 30 내지 1400㎛의 입자 크기를 지닐 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 어느 것에 있어서, 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스의 어느 것이라도, 종이, 종이제품, 폐지, 제지용 펄프, 색소지, 적재지, 코팅지, 충전 종이, 잡지, 인쇄물, 프린터 용지, 다중코팅지, 명함 용지, 카드보드, 보드지, 목면, 목재, 파티클 보드, 산림 폐기물, 톱밥, 포플러 나무, 목재 칩, 목초, 지팽이풀, 억새, 코드 그래스(cord grass), 흰줄갈풀(reed canary grass), 곡물 잔류물, 왕겨, 귀리 껍질, 밀겨(wheat chaff), 보리 겨(barley hull), 농산물 폐기물, 사일리지, 카놀라짚, 밀짚, 보리짚, 귀리짚, 볏짚, 황마, 대마, 아마, 대나무, 사이잘, 마닐라삼, 옥수수 속대, 옥수수 대, 대두 여물, 옥수수 섬유, 알팔파, 건초, 코코넛 헤어, 당 가공처리 잔류물, 버개스(bagasse), 사탕무우, 용설란 버개스, 조류(algae), 해초, 거름, 하수, 기울, 농업용 및 공업용 폐기물, 아라카차, 메밀, 바나나, 보리, 카사바, 칡, 안데스괭이밥, 사고, 수수, 감자, 고구마, 타로, 얌, 콩, 잠두, 렌즈콩, 완두, 또는 이들의 임의의 혼합물일 수 있다. 대안적으로, 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스는 종래의 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스가 미생물의 효소에 의해 미생물로 이미 전환된 후에 잔존하고 있는 재료를 포함할 수 있다.
이들 방법 및 조성물에 있어서, 미생물은 진균(fungus), 박테리아 또는 효모 중 어느 하나일 수 있다. 미생물은 실제로 상이한 미생물의 집단일 수 있다. 미생물은 높은 수준의 셀룰라제를 생산하는 균주일 수 있고/있거나, 유전자 조작되어 있을 수 있다. 미생물은 트리코데마 리제이(Trichoderma reesei)일 수 있거나, 또는, 예를 들어 클로스트리듐 써모셀륨(Clostridium thermocellum)일 수 있다. 미생물은 RUT-NG14, PC3-7, QM9414 또는 RUT-C30 등과 같은 트리코데마 리제이(T. reesei) 균주일 수 있다.
이들 방법 및 조성물의 어느 것에 있어서도, 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스는 미생물이 유도기(lag phase)에 있는 시간에 미생물과 배합될 수 있다.
상기 방법 및 조성물은 또한 미생물-인덕턴트-효소 배합물로부터 액체의 전부 혹은 일부를 제거하여 효소 추출물을 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법 및 조성물은 또한 1종 이상의 효소를 농축시키는 단계 및/또는 1종 이상의 효소를 단리시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법 및 조성물은 또한 1종 이상의 당이 생산되도록, 제2셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스의 당화를 일으키는 단계를 포함할 수 있다. 1종 이상의 당이 단리 및/또는 농축될 수 있다.
본 발명은 이 발명의 내용 부분에 개시된 실시형태로 제한되지 않는 것임이 이해되어야 하고, 또한 특허청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 정신과 범위 내에 있는 변형도 커버하도록 의도된다.
효소를 유도하는 방법, 그리고 셀룰로스 및 리그노셀룰로스를 효소로 처리하는 방법이 제공된다.
이상의 설명은, 동일한 참조 부호가 상이한 도면들을 통해서 동일 부분을 지칭하고 있는 첨부 도면에 예시된 바와 같은 본 발명의 예시적인 실시형태의 이하의 더욱 특별한 설명으로부터 명백해질 것이다. 도면은 반드시 일정 척도로 되어 있을 필요는 없고, 대신에 본 발명의 실시형태들을 예시할 때 강조되어 있을 수 있다.
도 1은 셀룰로스의 글루코스로의 효소에 의한 가수분해를 예시한 다이어그램이다. 셀룰로스 기질(A)은 엔도셀룰라제(i)에 의해 셀룰로스(B)로 전환되고, 이 셀룰로스는 엑소셀룰라제(ii)에 의해 셀로바이오스(C)로 전환되며, 셀로바이오스는 셀로비아제(베타-글루코시다제)(iii)에 의해 글루코스(D)로 전환된다.
도 2는 바이오매스 공급원료를 1종 이상의 생성물로 전환하는 것을 예시한 흐름 다이어그램이다. 공급원료는 (예컨대, 그의 크기를 저감시키기 위하여) 물리적으로 전처리되고(200), 선택적으로 그의 난분해성을 저감시키기 위하여 처리되며(210), 당화되어 당 용액을 형성하고(220), 이 용액은 (예컨대, 파이프라인, 레일카에 의해) 제조 공장으로 수송되며(또는 당화가 도중에 수행된다면, 공급원료, 효소 및 물이 수송됨)(230), 당화된 공급원료는 목적으로 하는 생성물(예컨대, 알코올)을 생성하기 위하여 바이오-가공처리되고(240), 생성물은 최종 생성물을 생산하기 위하여 예컨대 증류에 의해 더욱 가공처리될 수 있다(250). 난분해성을 위한 처리는, 리그닌 함량(201)을 측정하고 공정 파라미터를 설정 혹은 조정함으로써 변경될 수 있다(205). 공급원료(220)를 당화시키는 것은 공급원료를 배지(medium) 및 효소(221)와 혼합함으로써 변경될 수 있다.
도 3은 제1바이오매스의 처리(300), 셀룰라제 생산 유기체의 첨가(310), 제2바이오매스의 첨가(320) 및 생성물(예컨대, 알코올(들), 순수한 당)을 제조하기 위하여 얻어진 당의 가공처리(330)를 예시한 흐름도이다. 제1의 처리된 바이오매스는 선택적으로 분할될 수 있고, 그 일부는 제2바이오매스로서 첨가된다(A).
도 4는 효소의 생산을 예시한 흐름도이다. 셀룰라제-생산 유기체는 성장 배지(400)에 첨가되고, 처리된 제1바이오매스(405)가 첨가되어(A) 혼합물(410)을 형성하고, 제2바이오매스(420)가 첨가되어, 얻어진 당은 가공처리되어 생성물(예컨대, 알코올(들), 순수한 당)(430)을 생산한다. 제1바이오매스(405)의 일부가 또한 제2바이오매스(420)에 첨가된다(B).
도 5는 SDS PAGE를 이용한 단백질 분석 결과를 도시한다.
본 명세서에는, 인덕턴트의 사용을 통해서, 미생물에 의해 1종 이상의 효소의 생산을 유도하는 방법이 제공된다. 인덕턴트는 난분해성을 저감시키도록 처리된 바이오매스(셀룰로스 또는 리그노셀룰로스)로부터 형성된다. 처리 방법은 바이오매스에 전자 충격, 초음파처리, 산화, 열분해, 증기 폭발, 화학적 처리, 기계적 처리 또는 동결 분쇄를 실시하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 이러한 방법에 의해 처리된 바이오매스는 배지(예컨대, 액체 배지)에서 미생물과 배합되어, 미생물에 의해 1종 이상의 효소를 생산하도록 유도시킨다.
일 양상에 있어서, 본 발명은 리그노셀룰로스 재료를 포함하는 유도제(inducer)를 미생물과 접촉시켜 효소를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다.
구체적으로, 본 명세서에 기재된 방법은, 이하에 더욱 상세히 논의되는 바와 같은 트리코데마 리제이(Trichoderma reesei) 진균에 의해 생산된 효소를 이용해서 셀룰로스 및/또는 리그노셀룰로스 재료를 당화시키는 단계를 포함한다.
일반적으로, 본 발명은 진균 및/또는 기타 생성물 등과 같은 중간생성물 및 생성물을 생산하기 위하여 바이오매스 재료(예컨대, 바이오매스 재료 또는 바이오매스-유래 재료)를 가공처리함에 있어서의 개선에 관한 것이다. 예를 들어, 이 방법은 당, 알코올(예컨대, 에탄올, 아이소뷰탄올 또는 n-뷰탄올), 당 알코올(예컨대, 에리트리톨), 또는 유기산을 생산하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 바이오매스 재료를 가공처리함에 있어서 유용한 효소의 제조에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 셀룰라제 효소 혹은 기타 효소 유형을 생산하는 것에 관한 것이다.
전형적인 바이오매스 자원은 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 리그닌에 부가하여 보다 적은 양의 단백질, 추출가능물 및 미네랄을 함유한다. 셀룰로스 및 헤미셀룰로스 분획에 포함된 복합 탄수화물은 당화에 의해 당, 예컨대, 발효가능한 당으로 전환될 수 있고, 이 당은 이어서 최종 생성물 혹은 중간생성물로서 이용될 수 있거나 또는 추가의 가공처리, 예컨대, 발효 혹은 수소화에 의해 다양한 생성물, 예컨대, 알코올 혹은 유기산으로 전환될 수 있다. 얻어지는 생성물은 이용되는 방법 혹은 미생물 및 바이오처리가 일어나는 조건에 따라 좌우된다.
일 실시형태에 있어서, 예를 들어, 본 발명은 효소의 생산을 유도하는 방법을 포함한다. 난분해성을 저감시키기 위하여 처리된 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스가 제공되고, 이어서 액체 배지 중에서 미생물과 배합된다. 얻어지는 미생물-바이오매스 배합물은 이어서 바이오매스를 분해가능한 효소의 생산 및 유기체의 성장을 허용하는 조건 하에 유지된다. 처리된 바이오매스는 미생물로 하여금 효소를 생산하도록 하는 인덕턴트로서 작용한다. 이 방법은 인덕턴트-효소 배합물을 생산한다.
임의의 이론에 의해 얽매이길 원치 않지만, 바이오매스의 난분해성을 저감시키는데 이용되는 처리는 효소 유도에 있어서 중요한 것으로 여겨진다. 본 발명자들은, 미생물이 처리된 바이오매스 재료로부터 당을 추출하는 것이 곤란하다고 생각했기 때문에, 낮은 수준의 처리가 낮은 수준의 효소 유도 또는 극히 긴 래그 시간(lag time)을 유발하는 것을 발견하였다. 마찬가지로, 매우 높은 수준의 처리는, 또한 처리된 바이오매스로부터 당의 비교적 용이한 추출이 다량의 효소를 생산하기 위하여 미생물에 대한 필요성을 줄일 가능성이 있기 때문에, 미생물로 하여금 낮은 수준의 효소의 생산을 유발시킬 수 있다.
관련된 관점에서, 난분해성 처리는 또한 재료를 멸균화시키는 역할을 한다. 바이오매스는, 그의 속성에 의해, 재료 자체 내에 종종 깊이 들어가 있는 오염 미생물을 포함한다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 효소 유도는 긴 발효(약하거나 그 이상까지)로 되는 경향이 있기 때문에, 멸균은 중요하다. 따라서, 가능한 한 고도로 멸균화하도록 재료를 처리하는 것이 유리할 것이다. 그러나, 이러한 높은 수준의 처리는, 높은 수준의 처리가 미생물에 의한 효소 생산을 경감시키기 때문에 역효과를 낳기 쉽다.
따라서, 본 명세서에 개시된 바와 같이, 주의해서 재료를 과잉처리(미생물이 대량의 효소를 생산하는 것을 실패하게 함)가 아니라 멸균하는 처리 수준의 균형을 맞추는 것이 크게 유리하다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "인덕턴트"라는 용어는, 효소를 생산하기 위하여 유기체와 조우하게 하는 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스를 의미한다. 일례는 난분해성을 저감시키기 위하여 처리가 실시된 바이오매스일 것이다. 처리된 바이오매스는 이어서 액체 배지 중에서 1종 이상의 미생물과 배합되고, 이어서 미생물이 1종 이상의 효소를 생산하는 것을 허용하는 조건 하에 유지됨으로써 효소 인덕턴트로서 이용된다.
인덕턴트-효소 배합물은 이어서 다른 바이오매스와 배합되어, 그것을 당화시키는데 이용될 수 있다.
경이롭게도, 바이오매스를 미생물에 접종시키기 전에 해당 바이오매스를 처리하는 것은 증가된 양의 효소가 미생물에 의해 생산되는 것을 발견하였다. 또한, 미처리된 바이오매스의 사용에 비해서 처리된 바이오매스 상에서 상이한 효소가 생산된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스는 광범위한 재료로부터 기원될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 바이오매스는 리그닌 잔재(lignin hull)일 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "리그닌 잔재"란, 바이오매스가 당화된 후 남아 있는 재료를 의미한다.
소정의 실시형태에 있어서, 본 발명은, 진균에 의해, 예컨대, 셀룰로스 분해 사상균의 균주 트리코데마 리제이(Trichoderma reesei)에 의해 생산된 효소를 이용해서 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 재료를 당화시키는 과정에 관한 것이다. 몇몇 구현예에서, 트리코데마 리제이(Trichoderma reesei)의 고수율 셀룰라제 돌연변이체, 예컨대, RUT-NG14, PC3-7, QM9414 및/또는 RUT-C30이 이용된다. 이러한 균주는, 예를 들어, 문헌["Selective Screening Methods for the Isolation of High Yielding Cellulase Mutants of Trichoderma reesei", Montenecourt, B.S. and Everleigh, D.E. Adv. Chem. Ser. 181, 289-301 (1979)]에 기재되어 있다. 이들 돌연변이체는 과생산성이고, 이화작용산물 억제 저항성이어서 높은 수율의 셀룰라제가 달성될 수 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 효소 생산은 당화될 리그노셀룰로스 재료의 일부의 존재 하에 수행된다. 리그노셀룰로스 재료는 셀룰라제 합성을 위한 유도제로서 효소 생산 과정에서 작용할 수 있고, 생산되는 셀룰라제 복합체는 특정 리그노셀룰로스 재료에 맞춤화된 활성을 지닌다. 몇몇 구현예에서, 리그노셀룰로스 재료의 난분해성은 이 재료를 유도제로서 이용하기 전에 저감된다. 이것은 리그노셀룰로스 재료 내의 셀룰로스를 진균에 대해서 더욱 용이하게 입수가능하게 만드는 것으로 여겨진다. 리그노셀룰로스 재료의 난분해성을 저감시키는 것은 또한 당화를 용이하게 한다.
몇몇 경우에, 리그노셀룰로스 재료의 난분해성을 저감시키는 것은 물리적 처리에 의해 리그노셀룰로스 재료를 처리하는 것을 포함한다. 물리적 처리는, 예를 들어, 방사선 조사, 예컨대, 전자 충격, 초음파처리, 열분해, 산화, 증기 폭발, 화학적 처리, 또는 이들 처리 중 임의의 것들의 조합일 수 있다. 처리는 또한, 본 명세서에 개시된 처리들 중 임의의 하나 이상을 포함하되, 이들은 단독으로 혹은 임의의 바람직한 조합으로 그리고 1회 혹은 다회로 적용될 수 있다.
효소 및 바이오매스-분해 유기체는, 바람직하게는, 예컨대, 바이오매스의 셀룰로스 및/또는 리그닌 부분을 파괴시키거나, 각종 셀룰로스분해 효소(셀룰라제), 리그닌분해효소 혹은 각종 소분자 바이오매스-분해 대사산물을 함유하거나 제조한다. 이들 효소는 바이오매스의 결정성 셀룰로스 또는 리그닌 부분을 분해시키기 위하여 상승작용적으로 작용하는 효소의 복합체일 수 있다. 셀룰로스분해 효소의 예로는 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제 및 셀로비아제(베타-글루코시다제)를 포함한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 예를 들어, 당화 동안, 셀룰로스 기질(A)은 랜덤한 개소에서 엔도글루카나제(i)에 의해 초기에 가수분해되어 올리고머성 중간생성물(예컨대, 셀룰로스)(B)을 생산한다. 이들 중간생성물은 이어서 셀룰로스 중합체의 말단으로부터 셀로바이오스를 생산하기 위하여 셀로바이오하이드롤라제 등과 같은 글루카나제(ii)를 외부 분열시키기 위한 기질이다. 셀로바이오스는 글루코스의 수-가용성 1,4-결합 이량체이다. 최종적으로 셀로비아제(iii)는 셀로바이오스(C)를 절단시켜 글루코스(D)를 수득한다. 따라서, 엔도글루카나제는 셀룰로스의 결정성 부분을 공격하여 엑소셀룰라제의 효율을 증대시켜 셀로바이오스를 생산하는데 특히 효과적이며, 이는 이어서 글루코스를 생산하기 위하여 셀로바이오스의 특이성을 필요로 한다. 그러므로, 셀룰로스 기질의 속성과 구조에 따라서, 3종의 상이한 효소의 양과 종류가 개질될 필요가 있을 수 있는 것은 명백하다.
본 명세서에 기재된 방법에서 생산되고 이용되는 효소는 진균에 의해, 예컨대, 진균의 하나 이상의 균주인 트리코데마 리제이(Trichoderma reesei)에 의해 생산될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 트리코데마 리제이(Trichoderma reesei)의 고수율 셀룰라제 돌연변이체, 예컨대, RUT-NG14, PC3-7, QM9414 및/또는 RUT-C30이 이용된다.
효소 생산은 당화될 공급원료의 일부의 존재 하에 수행됨으로써, 특정 공급원료에 맞춤화된 셀룰라제 복합체를 생산하는 것이 바람직하다. 공급원료는, 예컨대, 공급원료 중의 셀룰로스가 진균에 대해서 보다 용이하게 이용가능하게 되도록, 본 명세서에 기재된 난분해성-저감 방법 중 하나 이상을 이용해서, 그의 난분해성을 저감시키기 위하여 이러한 사용 전에 처리될 수 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 효소-유도 바이오매스는 전자 충격에 의해 처리될 수 있다. 바이오매스는, 예를 들어, 약 1 M㎭ 이하, 약 2 M㎭ 이하, 약 5, 약 10, 약 20, 약 50, 약 100 또는 약 150 M㎭ 이하의 총 선량에 의한 전자 충격에 의해 처리될 수 있다. 바람직하게는, 효소-유도 바이오매스는 약 0.1 M㎭ 내지 약 150 M㎭, 약 1 내지 약 100 M㎭, 바람직하게는 약 2 내지 약 50 M㎭, 또는 약 5 내지 약 40 M㎭의 총 선량에 의해 처리된다
이하에 더욱 논의되는 바와 같이, 일단 효소가 생산되면, 이 효소는, 효소를 생산하는데 이용되지 않았던 나머지 공급원료를 당화시키는데 이용된다. 공급원료를 목적으로 하는 생성물 또는 중간생성물로 전환하는 이 방법은 일반적으로 이 당화 단계에 부가해서 다른 단계를 포함한다.
예를 들어, 도 2를 참조하면, 알코올을 제조하는 방법은, 예를 들어, 선택적으로 공급원료를 기계적으로 처리하여, 예컨대, 이 처리 전 및/또는 후에, 그의 크기를 저감시키고(200), 선택적으로 공급원료를 다른 물리적 처리로 처리하여 그의 난분해성을 더욱 저감시키며(210), 이어서 효소 복합체를 이용해서 공급원료를 당화시켜 당 용액을 형성할 수 있다(220). 선택적으로, 상기 방법은 또한, 예컨대, 파이프라인, 레일카, 트럭 혹은 바지선에 의해, 용액(또는 당화가 도중에 수행된다면, 공급원료, 효소 및 물)을 제조 공장으로 수송하는 단계(230)를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 당화된 공급원료는 더욱 바이오처리(예컨대, 발효)되어, 목적으로 하는 생성물, 예컨대, 알코올을 생산한다(240). 이 얻어진 생성물은 몇몇 구현예에서 예컨대 증류에 의해 더욱 가공처리되어(250), 최종 생성물을 생산한다. 공급원료의 난분해성을 저감시키는 하나의 방법은 공급원료의 전자 충격에 의한 것이다. 필요한 경우, 공급원료의 리그닌 함량을 측정하는 단계(201) 및 이 측정에 의거해서 공정 파라미터를 조절하는 단계(205)는, 미국 특허 출원 공개 제2010/0203495 A1호(발명자: Medoff 및 Masterman, 공개일: 2010년 8월 12일)에 기재된 바와 같은 방법의 각종 단계에서 수행될 수 있으며, 이 문헌의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된다. 공급원료를 당화시키는 단계(220)는 공급원료를 배지 및 효소와 혼합함으로써(221) 변경될 수도 있다.
효소 복합체의 제조를 이하에 먼저 기술하고, 이어서 도 2를 참조하여 상기 논의된 방법의 단계들의 설명과, 이 과정에 이용되는 재료에 대해서 설명할 것이다.
다수의 상이한 조건이 테스트되었고, 그 결과는 다음과 같다. 일 실시형태에 있어서, 효소 유도 바이오매스는 옥수수 속대이다. 이 실시형태에 있어서, 바이오매스는 35 M㎭ 전자 빔에 의한 전자 충격에 의해 처리된다. 바람직하게는, 바이오매스는 10 내지 1400㎛, 바람직하게는 더 바람직하게는 200㎛ 이하, 가장 바람직하게는 50㎛ 이하의 입자크기로 분쇄된다. 처리된 바이오매스(습윤 형태 혹은 건조 형태)는 접종된 배지의 총량 약 25 내지 약 133 g/ℓ, 더 바람직하게는 100 g/ℓ 중에 첨가된다. 인덕턴트 바이오매스는 접종 후 3일까지 미생물의 성장에 있어서 어느 시점에서도 첨가될 수 있지만, 바람직하게는 접종 후 1 내지 3일에 첨가된다. 인덕턴트로서 첨가될 바이오매스의 총량은 한번에 모두 혹은 나누어서, 예를 들어, 2부분으로 혹은 5부분으로 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 옥수수 속대 바이오매스는 한번에 모두 첨가된다.
효소 유도 바이오매스는 미생물에 대해서 고체로서 혹은 슬러리로서 존재할 수 있다. 바람직하게는 슬러리로서 첨가된다.
효소 생산
셀룰라제를 생산하는 사상균 혹은 박테리아는, 전형적으로 셀룰라제의 생산을 위하여 유도제 및 탄소 공급원을 필요로 한다. 임의의 이론에 의해 얽매이는 일 없이, 이 개시내용의 효소는 그의 생산을 유도하는데 이용되는 기질의 당화에 특히 적합한 것으로 여겨진다.
리그노셀룰로스 재료는 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 리그닌의 상이한 조합을 포함한다. 셀룰로스는 상당한 코일링(coiling) 없이도 꽤 경직된 선형 구조를 형성하는 글루코스의 선형 중합체이다. 이 구조 및 수소 결합할 수 있는 하이드록실기의 성향으로 인해, 셀룰로스는 결정성 부분과 비결정성 부분을 함유한다. 결정성 부분은, 또한 예를 들어, 가닥들 사이의 수소 결합의 위치에 따라서 I(알파) 및 I(베타)로서 알려진 상이한 유형일 수 있다. 중합체 길이 자체는 변할 수 있어 셀룰로스의 형태에 대해서 더욱 다양성을 부여할 수 있다. 헤미셀룰로스는 자일란, 글루쿠로노자일란, 아라비노자일란 및 자일로글루칸 등과 같은 수개의 이종중합체 중의 어느 하나이다. 존재하는 주된 당 단량체는 자일로스이지만, 만노스, 갈락토스, 람노스, 아라비노스 및 글루코스 등과 같은 다른 단량체도 존재한다. 전형적으로 헤미셀룰로스는 셀룰로스보다 저분량을 지니는 분지된 구조를 형성한다. 따라서 헤미셀룰로스는 일반적으로 효소적 가수분해를 받기 쉬운 비정질 재료이다. 리그닌은 일반적으로 복합 고분자량 이종중합체이다. 모든 리그닌은 그들의 조성에 있어서 다양성을 보이지만, 이들은 페닐 프로펜 단위의 비정질 수지상 망상 중합체(amorphous dendritic network polymer)로서 기술되어 있다. 특정 바이오매스 중의 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 리그닌의 양은 바이오매스의 공급원에 좌우된다. 예를 들어, 목재 유래 바이오재료는 유형에 따라서 약 38 내지 49% 셀룰로스, 7 내지 26% 헤미셀룰로스 및 23 내지 34% 리그닌일 수 있다. 목초는 전형적으로 33 내지 38% 셀룰로스, 24 내지 32% 헤미셀룰로스 및 17 내지 22% 리그닌이다. 명백하게 리그노셀룰로스 바이오매스는 기질의 커다란 부류를 구성한다.
바이오매스 재료의 다양성은, 예를 들어, 중합체의 결정성과 분자량을 변화시킴으로써 전처리에 의해 더 증가될 수 있다.
셀룰라제 생산 유기체는, 바이오매스와 접촉된 경우, 글루코스 등과 같은, 유기체의 성장에 유리한 분자를 유리시키는 효소를 생산하는 경향이 있을 것이다. 이것은 위에서 기재된 바와 같은 효소 유도의 현상을 통해서 행해진다. 특정 바이오재료에서는 기질의 다양성이 있으므로, 다양한 셀룰라제, 예를 들어, 앞서 논의된 엔도글루카나제, 엑소글루카나제 및 셀로비아제가 있다. 유도제로서 특정 리그노셀룰로스 재료를 선택함으로써, 이들 효소의 상대적인 농도 및/또는 활성은, 얻어지는 효소 복합체가 유도제 혹은 유사한 재료로서 이용된 리그노셀룰로스 재료에 대해 효율적으로 작용하도록 조절될 수 있다. 예를 들어, 보다 많은 부분의 결정성 셀룰로스를 지니는 바이오재료는 아주 작은 결정성 셀룰로스를 지니는 바이오매스보다 더 효과적인 혹은 더 많은 양의 엔도글루카나제를 유도할 수 있다.
따라서, 셀룰라제의 최적의 형성 및 이용을 위한 많은 방법이 있을 수 있다. 이들 방법의 일부 상세가 도면을 참조하여 기술될 것이다.
예를 들어, 도 3을 참조하면, 제1바이오매스는, 예를 들어, 그의 난분해성을 저감시키기 위하여 선택적으로 전처리되고(300), 이어서 수성 배지 및 셀룰라제 생산 유기체와 혼합된다(310). 세포를 소정의 단계로 성장시키기에 적절한 시간이 경과되고 충분한 효소가 생산된 후, 제2바이오매스가 첨가된다(320). 제2 및 임의로 남아 있는 제1바이오매스에 대한 효소의 작용은 당의 혼합물을 생성하며, 이것은 유용한 생성물(예컨대, 알코올, 순수한 당)로 더욱 가공처리될 수 있다(330). 제1 및 제2바이오매스는 동일한 바이오매스 공급 재료의 일부일 수 있다. 예를 들어, 바이오매스의 일부는 셀룰라제 생산 유기체와 배합되고, 이어서 일단 효소의 일부가 생산되면 나중 단계에서 나머지 부분이 첨가된다(A). 선택적으로, 제1 및 제2바이오매스는 둘 모두 난분해성을 저감시키기 위하여 전처리될 수있다. 수성 배지는 이하에 논의될 것이다.
이제 도 4를 참조하면, 셀룰라제 생산 유기체(400)는 특정 성장 단계에 도달하는 시간 동안 성장 배지에서 성장될 수 있다. 예를 들어, 이 성장 기간은 소정 일수 혹은 심지어 수주의 기간에 걸쳐서 연장될 수 있었다. 전처리된 제1 바이오매스(405)는 이어서 효소 생산 세포(410)와 접촉될 수 있고(A), 따라서, 소정 시간 후, 효소가 생산된다. 효소 생산은 또한 연장된 시간 기간에 걸쳐서 일어날 수도 있다. 효소 함유 용액은 이어서 제2바이오매스와 배합된다(420). 제2 및 나머지 제1바이오매스에 대한 효소의 작용은 혼합된 당을 생산하고, 이들은 유용한 생성물로 더욱 가공처리될 수 있다(430). 제1 및 제2바이오매스는 동일한 바이오매스의 일부일 수 있거나, 또는 유사하지만 동일하지는 않은(예컨대, 전처리된 것과 전처리되지 않은) 재료(B)일 수 있었다.
도 4에서 상기 논의된 방법에 부가해서, 셀룰라제 생산 유기체(400)는 선택적으로 제1의 전처리된 바이오매스와 배합되기(410) 전에 수확될 수 있다. 수확은 용액 및 성장 배지 성분의 일부 혹은 거의 완전한 제거를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 원심분리에 의해 수집되고 나서 물 혹은 다른 용액으로 세척될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 효소(들)는 생산된 후(410), (예컨대, 도 4의 단계 (410)과 (420) 사이에서) 농축될 수 있다. 농축은 크로마토그래피, 원심분리, 여과, 투석, 추출, 용매의 증발, 분무 건조 및 고체 담지체 상에의 흡수를 포함하는 임의의 유용한 방법에 의해서 행해질 수 있다. 농축된 효소는 소정 시간 동안 저장되고 나서, 제2바이오매스의 첨가(420) 및 유용한 생성물의 생산(430)에 의해 이용될 수 있다.
상기 기재된 방법에서 이용되는 수성 배지는 첨가된 효모 추출물, 옥수수 침지액, 펩톤, 아미노산, 암모늄염, 인산염, 칼슘염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염, 망간염, 아연염, 코발트염을 함유할 수 있다. 이들 성분 이외에도, 성장 배지는 전형적으로 탄소 공급원으로서 0 내지 10% 글루코스(예컨대, 1 내지 5% 글루코스)를 함유한다. 부가적으로 유도제 배지는 앞서 논의된 바이오매스에 부가해서, 기타 유도제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 공지된 유도체는 락톤, 순수한 셀룰로스 및 소포로스(sophorose)이다. 유용한 생성물의 바람직한 생산을 최적화하기 위하여 가공처리 동안 각종 성분이 첨가되고, 제거될 수 있다.
효소 생산을 유도하기 위하여 전형적으로 이용되는 바이오매스의 농도는 0.1중량% 이상 내지 50중량% 이하, 0.5중량% 이상 내지 25중량% 이하, 1중량% 이상 15중량% 이하, 1중량% 이상 10중량% 이하이다.
상기 기재된 방법들의 어느 것도, 회분식(batch) 유가식(fed-batch) 또는 연속 공정으로서 수행될 수 있다. 상기 방법들은, 예를 들어, 적어도 50리터, 바람직하게는 적어도 100리터, 더 바람직하게는 적어도 500리터, 더욱더 바람직하게는 적어도 1,000리터, 특히 적어도 5,000리터, 100,000리터 혹은 500,000리터의 배양 배지를 가진 특별히 산업적 규모 생산을 위하여 유용하다. 상기 방법들은 혐기성 혹은 호기성으로 수행될 수 있다. 몇몇 효소는 침지 배양에 의해 그리고 몇몇은 표면 배양에 의해 생산된다.
상기 기재된 방법의 어느 것에 있어서도, 효소는 제조되고 저장될 수 있고, 이어서 후일에 및/또는 상이한 장소에서 당화시키기 위하여 이용될 수 있다.
위에 기재된 방법의 어느 것이라도 교반 하에 수행될 수 있다. 몇몇 경우에, 교반은, 미국 특허 출원 공개 제2010/0297705 A1호(발명자: Medoff 및 Masterman, 공개일: 2010년 11월 25일), 미국 특허 출원 공개 제2012/0091035 A1호(발명자: Medoff 및 Masterman, 공개일: 2012년 4월 19일) 및 미국 특허 출원 공개 제2012/0100572 A1호(발명자: Medoff 및 Masterman, 공개일: 2012년 4월 26일)에 기재된 바와 같은 제트 혼합을 이용해서 수행될 수 있으며, 이들 문헌의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
효소 생산 유기체의 성장을 위한 온도는 유기체 성장을 증대시키기 위하여 채택된다. 예를 들어, 트리코데마 리제이(Trichoderma reesei)를 위하여, 최적 온도는 일반적으로 20 내지 40℃(예컨대, 30℃)이다. 효소 생산을 위한 온도는 처리과정의 그 일부를 위하여 최적화되어 있다. 예를 들어, 트리코데마 리제이(Trichoderma reesei)를 위하여, 효소 생산을 위한 최적 온도는 20 내지 40℃(예컨대, 27℃)이다.
공급원료, 바이오매스 재료 및/또는 유도제
효소 생산용의 유도제일 수도 있는 공급원료는, 바람직하게는 리그노셀룰로스 재료이지만, 본 명세서에 기재된 방법은 또한 셀룰로스 재료, 예컨대, 종이, 종이제품, 제지용 펄프, 목면, 및 이들의 임의의 혼합물, 및 기타 유형의 바이오매스와 함께 이용될 수도 있다. 본 명세서에 기재된 방법은 리그노셀룰로스 재료에 특히 유용한데, 그 이유는, 이들 방법이 경제적으로 실행가능한 방식으로 이러한 재료를 생성물 및 중간생성물로 가공처리할 수 있기 때문이다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "바이오매스 재료"란 용어는 리그노셀룰로스, 셀룰로스, 전분 및 미생물 재료를 포함한다.
바람직하게는 효소-유도 바이오매스 재료는, 농산물 폐기물, 예컨대, 옥수수 속대, 더욱 바람직하게는 옥수수 대이다. 가장 바람직하게는, 효소-유도 바이오매스 재료는 목초를 포함한다.
리그노셀룰로스 재료는, 목재, 파티클 보드, 산림 폐기물(예컨대, 톱밥, 포플러 나무, 목재 칩), 목초(예컨대, 지팽이풀, 억새, 코드 그래스, 흰줄갈풀), 곡물 잔류물(예컨대, 왕겨, 귀리 껍질, 밀겨(wheat chaff), 보리 겨(barley hull)), 농산물 폐기물(예컨대, 사일리지, 카놀라짚, 밀짚, 보리짚, 귀리짚, 볏짚, 황마, 대마, 아마, 대나무, 사이잘, 마닐라삼, 옥수수 속대, 옥수수 대, 대두 여물, 옥수수 섬유, 알팔파, 건초, 코코넛 헤어), 당 가공처리 잔류물(예컨대, 버개스, 사탕무우박, 용설란 버개스), 조류, 해초, 거름, 하수, 및 이들의 임의의 혼합물을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
몇몇 경우에, 리그노셀룰로스 재료는 옥수수 속대를 포함한다. 분쇄 혹은 햄머밀링된 옥수수 속대는 방사선 조사를 위하여 비교적 균일한 두께의 층으로 확산될 수 있고, 조사 후에는 추가의 가공처리를 위하여 배지에 분산되기 용이하다. 수확 및 수집을 용이하게 하기 위하여, 몇몇 경우에는, 옥수수대, 옥수수 알, 또한 몇몇 경우에는 심지어 식물의 뿌리계를 포함하여 옥수수의 전체 식물이 이용된다.
유리하게는, 에탄올 생산을 위하여, (질소 공급원, 예컨대, 요소 또는 암모니아 이외의) 어떠한 추가적인 영양물질도 충분한 양의 옥수수 속대를 포함하는 옥수수 속대 또는 셀룰로스 혹은 리그노셀룰로스 재료의 발효 동안 요구되지 않는다.
옥수수 속대는, 분쇄 전후에, 또한 반송되고 분산되기 더욱 용이하며, 건초 및 목초 등과 같은 기타 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 재료보다 공기 중에서 폭발성 혼합물을 형성하는 경향이 더 적어진다.
셀룰로스 재료는, 예를 들어, 종이, 종이제품, 폐지, 제지용 펄프, 색소지, 적재지, 코팅지, 충전 종이, 잡지, 인쇄물(예컨대, 서적, 카탈로그, 매뉴얼, 라벨, 캘린더, 그리팅 카드, 브로셔, 안내서, 신문 인쇄용지), 프린터 용지, 다중코팅지, 명함 용지, 카드보드, 보드지, 목면과 같은 높은 α-셀룰로스 함량을 지니는 재료, 및 이들의 임의의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 종이 제품은 미국 특허 출원 제13/396,365호("Magazine Feedstocks", Medoff 등, 출원일: 2012년 2월 14일)에 기재된 바와 같으며, 이 문헌의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
셀룰로스 재료는 또한 탈-리그닌화된 리그노셀룰로스 재료를 포함할 수 있다.
전분 재료는, 전분 자체, 예컨대, 옥수수 전분, 밀 전분, 감자 전분 또는 쌀 전분, 전분의 유도체, 또는 전분, 예컨대, 식용 식품 제품 혹은 작물 등을 포함하는 재료를 포함한다. 예를 들어, 전분 재료는 아라카차, 메밀, 바나나, 보리, 카사바, 칡, 안데스괭이밥, 사고, 수수, 보통 가정용 감자, 고구마, 타로, 얌, 또는 1종 이상의 콩, 예컨대, 잠두, 렌즈콩 혹은 완두일 수 있다. 2종 이상의 전분 재료의 배합물도 또한 전분 재료이다. 전분, 셀룰로스 및 또는 리그노셀룰로스 재료의 혼합물도 이용될 수 있다. 예를 들어, 바이오매스는 식물 전체, 식물의 일부 혹은 식물의 상이한 부분들, 예컨대, 밀 식물, 목면 식물, 벼 식물 혹은 나무일 수 있다. 전분 재료는 본 명세서에 기재된 방법들의 어느 것에 의해서도 처리될 수 있다.
미생물 재료는, 탄수화물의 공급원(예컨대, 셀룰로스)을 제공하는 것이 가능하거나 이들을 함유하는 임의의 천연 유래 혹은 유전자 변형된 미생물 혹은 유기체, 예를 들어, 원생생물, 예컨대, 동물 원생생물(예컨대, 편모충류, 아메바류, 섬모류 및 포자충류 등의 원생동물) 및 식물 원생생물(예컨대, 알베오레이트(alveolate), 클로라라크니오식물(chlorarachniophyte), 크립토모나드(cryptomonad), 유글레나류(euglenid), 회조류(glaucophyte), 착편모조(haptophyte), 홍조류(red algae), 부등편모조류(stramenopiles) 및 녹색식물(viridaeplantae) 등의 조류)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 다른 예로는 해초, 플랑크톤(예컨대, 매크로플랑크톤, 메조플랑크톤, 마이크로플랑크톤, 나노플랑크톤, 피코플랑크톤 및 펨토플랑크톤), 식물플랑크톤, 박테리아(예컨대, 그람 양성균, 그람 음성균 및 극한성 생물), 효모 및/또는 이들의 혼합물을 포함한다. 몇몇 경우에, 미생물 바이오매스는 천연 공급원, 예컨대, 해양, 호수, 수역, 예컨대, 염수 혹은 담수로부터, 혹은 육지 상에서 얻어질 수 있다. 대안적으로 혹은 부가적으로, 미생물 바이오매스는 배양 시스템, 예컨대, 대규모 건식 및 습식 배양 및 발효 시스템으로부터 얻어질 수 있다.
바이오매스 재료는 또한 기울, 및 재료의 유사한 공급원을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 셀룰로스, 전분 및 리그노셀룰로스 공급원료 재료 등과 같은 바이오매스 재료는, 야생형 변종에 관하여 변형된 형질전환 미생물 및 식물로부터 얻어질 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 식물에서 목적으로 하는 특성을 얻기 위하여 선택 및 번식의 반복 단계를 통해서 이루어질 수 있다. 또한, 식물은 야생형 변종에 관하여 제거, 변형, 침묵 및/또는 부가된 유전자 재료를 지닐 수 있다. 예를 들어, 유전자 변형된 식물은 재조합 DNA 방법에 의해 생산될 수 있되, 여기서, 유전자 변형은 부모 변종으로부터의 특정 유전자를 도입하거나 변형시키는 것 또는 예를 들어 상이한 종의 식물 및/또는 박테리아로부터 식물에 특정 유전자 혹은 유전자들이 도입되는 형질전환 번식을 이용하는 것을 포함한다. 유전자 변종을 작성하는 다른 방법은 새로운 대립유전자가 내생 유전자로부터 인공적으로 작성되는 돌연변이 번식을 통하는 것이다. 인공 유전자는, 예를 들어, 화학적 돌연변이 유발원(예컨대, 알킬화제, 에폭사이드, 알칼로이드, 퍼옥사이드, 폼알데하이드를 이용해서), 방사선 조사(예컨대, X-선, 감마선, 중성자, 베타 입자, 알파 입자, 양자, 중양자, UV 방사선) 및 온도 충격 혹은 기타 외부 응력 및 후속의 선택 수법으로 식물 혹은 종자를 처리하는 것을 포함하는 각종 방법에 의해서 작성될 수 있다. 변형된 유전자를 제공하는 기타 방법은, 오류 발생이 쉬운 PCR 및 DNA 셔블링에 이어서, 목적으로 하는 변형된 DNA를 목적으로 하는 식물 혹은 종자에 삽입을 통하는 것이다. 종자 혹은 식물에서의 바람직한 유전자 변이를 도입하는 방법으로는, 예를 들어, 보균동물, 바이오리스틱스(biolistics), 인산칼슘 침강, 전기 영동, 유전자 스플라이싱, 유전자 침묵, 리포펙틴, 마이크로주입 및 바이러스 전달체의 이용을 포함한다. 부가적인 유전자 변형 재료는, 미국 특허 출원 제13/396,369호(출원일: 2012년 2월 14일)에 기재되어 있으며, 이 문헌의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에 기재된 방법들 중 어느 것이라도 본 명세서에 기재된 임의의 바이오매스 재료의 혼합물로 실시될 수 있다.
바이오매스 -- 기계적 준비
공급원료의 기계적 처리는, 예를 들어, 절삭, 밀링, 예컨대, 해머밀링, 습식 밀링, 분쇄, 가압, 전단 혹은 저미기(chopping)를 포함할 수있다. 초기의 기계적 처리는, 몇몇 구현예에서, 공급원료의 크기를 저감시키는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 느슨한 공급원료(예컨대, 재생지 혹은 지팽이풀)는 초기에 절삭, 전단 및/또는 세단(shredding)에 의해 준비된다.
가공처리 동안 초기에 및/또는 말기에 수행될 수 있는 크기 저감에 부가해서, 기계적 처리는 또한 물리적 처리 동안 바이오매스 재료를 "개방"(opening up), "응력 부여"(stressing), 파괴 및 파쇄하여, 사슬 절단되고/되거나 결정 구조가 파괴되기 더욱 쉬운 재료의 셀룰로스로 만드는 데 유리할 수 있다.
바이오매스 재료를 기계적으로 처리하는 방법으로는, 예를 들어, 밀링 혹은 분쇄를 포함한다. 밀링은, 예를 들어, 해머 밀, 볼 밀, 콜로이드 밀, 코니컬 혹은 콘 밀, 디스크 밀, 에지 밀, 윌리 밀(Wiley mill) 또는 제분용 밀을 이용해서 수행될 수 있다. 분쇄는 예를 들어, 절삭/충격식 그라인더를 이용해서 수행될 수 있다. 그라인더의 구체적인 예로는 스톤 그라인더, 핀 그라인더, 커피 그라인더 혹은 버 그라인더(burr grinder)를 포함한다. 분쇄 혹은 밀링은, 예를 들어, 핀 밀의 경우에서처럼, 예를 들어, 핀 혹은 기타 요소를 왕복이동시킴으로써 제공될 수 있다. 기타 기계적 처리 방법은 기계적 째기(mechanical ripping), 찢기(tearing), 또는 섬유에 압력을 가하는 다른 방법 및 공기 마찰 밀링을 포함한다. 적절한 기계적 처리는 이전의 가공처리 단계들에 의해 초기화된 재료의 내부 구조의 파괴를 계속하는 기타 임의의 수법을 더 포함한다.
이용될 수 있는 기계적 처리 및 기계적으로 처리된 공급원료의 특징은, 미국 특허 출원 제13/276,192호(출원일: 2011년 10월 18일, 공개일: 2012년 4월 26일, 미국 특허 출원 공개 번호 제2012/0100577 A1호)에 더욱 상세히 기술되어 있으며, 이 문헌의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
바이오매스 처리 -- 전자 충격
몇몇 경우에, 공급원료는 그의 구조를 변형시킴으로써 그의 난분해성을 저감시키기 위하여 전자 충격으로 처리될 수 있다. 이러한 처리는, 예를 들어, 공급원료의 평균 분자량의 저감, 공급원료의 결정질 구조의 변화 및/또는 공급원료의 표면적 및/또는 다공도의 증가를 가능하게 할 수 있다.
전자 빔을 통한 전자 충격이 일반적으로 바람직한데, 그 이유는 비교적 저전압/고전력 전자빔 장치의 사용이 값비싼 콘크리트 돔 형상 차폐를 위한 필요를 제거하고, 따라서 그러한 장치는 "자체-차폐되어", 안전한 효율적인 공정을 제공하기 때문이다. "자체-차폐된" 장치들은 차폐(예컨대, 금속 판 차폐)를 포함하는 한편, 이들은 콘크리트 돔형상 구조의 구축을 필요로 하지 않아, 자본적 지출을 크게 저감시켜, 종종 기존의 제조 설비를 값비싼 개조 없이 사용할 수 있게 한다. 전자 빔 가속기는, 예를 들어, IBA(Ion Beam Applications, 벨기에 루방-라-뇌브), 티탄 코포레이션(Titan Corporation)(미국 캘리포니아주의 샌디에이고시에 소재) 및 NHV 코포레이션(Nippon High Voltage, 일본)으로부터 입수가능하다.
전자 충격은 10 MeV 이하, 예컨대, 7 MeV 이하, 5 MeV 이하 또는 2 MeV 이하, 예컨대, 약 0.5 내지 1.5 MeV, 약 0.8 내지 1.8 MeV, 약 0.7 내지 1 MeV 또는 약 1 내지 3 MeV의 공칭 에너지를 지니는 전자 빔 장치를 이용해서 수행될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 공칭 에너지는 약 500 내지 800 keV이다.
전자 빔은 비교적 높은 총 빔 파워(즉, 전력)(모든 가속된 헤드의 조합된 빔 파워, 또는 다수의 가속기가 이용된다면 모든 가속기 및 모든 헤드), 예컨대, 적어도 25 kW, 예컨대, 적어도 30, 40, 50, 60, 65, 70, 80, 100, 125 또는 150 kW를 지닐 수 있다. 몇몇 경우에, 파워는 500 kW, 750 kW 또는 심지어 1000 kW 이상으로 더 높다. 몇몇 경우에, 전자 빔은 1200 kW 이상의 빔 파워를 지닌다.
이 높은 총 빔 파워는 통상 다수의 가속 헤드를 이용함으로써 달성된다. 예를 들어, 전자 빔 장치는 2개, 4개 혹은 그 이상의 가속 헤드를 포함할 수 있다. 다수의 헤드(각각은 비교적 낮은 빔 파워를 지님)의 이용은, 재료 내에서의 과도한 온도 상승을 방지함으로써, 재료의 연소를 방지하고, 또한 재료의 층의 두께를 통해서 선량의 균일성을 증가시킨다.
몇몇 구현예에 있어서, 전자 충격 동안 재료를 냉각시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 재료는 예를 들어 스크류 압출기 혹은 기타 압출 장비에 의해서 반송되면서 냉각될 수 있다.
난분해성-저감 과정에 의해 요구되는 에너지를 저감시키기 위하여, 재료를 가능한 한 신속하게 처리하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 처리는 초당 약 0.25 M㎭ 이상, 예컨대, 초당 약 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 5, 7, 10, 12, 15 이상, 또는 심지어 약 20 M㎭ 이상, 예컨대, 초당 약 0.25 내지 2 M㎭의 선량률에서 수행되는 것이 바람직하다. 보다 높은 선량률은, 일반적으로 보다 높은 선 속도를 요구하여, 재료의 열 분해를 회피한다. 일 구현예에서, (예컨대, 0.5 g/㎤의 벌크 밀도를 지니는 옥수수 속대 재료를 분쇄할 때) 가속기는 3 MeV, 50 mAmp 빔 전류에 대해서 설정되고, 선 속도는 약 20㎜의 샘플 두께에 대해서 24 피트/분이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 전자 충격은 재료가 적어도 0.5 M㎭, 예컨대, 적어도 5, 10, 20, 30 또는 적어도 40 M㎭의 총 선량을 입수할 때까지 수행된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 처리는 재료가 약 0.5 M㎭ 내지 약 150 M㎭, 약 1 M㎭ 내지 약 100 M㎭, 약 2 M㎭ 내지 약 75 M㎭, 10 M㎭ 내지 약 50 M㎭, 예컨대, 약 5 M㎭ 내지 약 50 M㎭, 약 20 M㎭ 내지 약 40 M㎭, 약 10 M㎭ 내지 약 35 M㎭, 또는 약 25 M㎭ 내지 약 30 M㎭의 선량을 입수할 때까지 수행된다. 몇몇 구현예에 있어서, 25 내지 35 M㎭의 총 선량이 바람직한데, 이상적으로는 각 패스(pass)가 약 1초 동안 적용되되 2초에 걸쳐서 적용되며, 예컨대, 5 M㎭/패스로 적용된다. 7 내지 8 M㎭/패스 이상의 선량을 적용하면, 몇몇 경우에 공급원료 재료의 열분해를 초래할 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이 다수의 헤드를 이용해서, 재료는 다회의 패스로, 예를 들어, 수초의 냉각에 의해 분리된 10 내지 20 M㎭/패스, 예컨대, 12 내지 18 M㎭/패스의 2회 패스에서, 또는 7 내지 12 M㎭/패스, 예컨대, 9 내지 11 M㎭/패스에서 3회 패스로 처리될 수 있다. 위에서 논의된 바와 같이, 1회의 높은 선량보다 오히려 수회의 비교적 낮은 선량으로 재료를 처리하는 것은, 재료의 과열을 방지하는 경향이 있고 또한 재료의 두께를 통한 선량 균일성을 증가시킨다. 몇몇 구현예에 있어서, 재료는 각 패스 동안 혹은 후에 교반되거나 혹은 다르게는 혼합되고, 이어서 그 다음 패스 전에 재차 균일한 층 내로 평활화되어, 처리 균일성을 더욱 향상시킨다.
몇몇 실시형태에 있어서, 전자는, 예를 들어, 빛의 속도의 75퍼센트 이상, 예컨대, 빛의 속도의 85, 90, 95 또는 99 퍼센트 이상으로 가속된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 임의의 가공처리는 획득된 대로 건조 상태이거나, 또는 예컨대, 열 및/또는 감압을 이용해서, 건조되어 있는 리그노셀룰로스 재료에 대해서 수행된다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 셀룰로스 및/또는 리그노셀룰로스 재료는, 25℃ 및 50퍼센트 상대 습도에서 측정된, 약 5중량% 이하의 수분 보유량을 지닌다.
전자 충격은 셀룰로스 및/또는 리그노셀룰로스 재료가 공기, 산소-풍부 공기, 또는 심지어 산소 자체에 노출되거나, 또는 질소, 아르곤 혹은 헬륨 등과 같은 불활성 기체에 의해 블랭킷된 상태에서 적용될 수 있다. 최대 산화가 요망될 경우, 공기 혹은 산소 등과 같은 산화 환경이 활용되고, 빔 공급원으로부터의 거리는, 반응 가스 형성, 예컨대, 오존 및/또는 질소의 산화물을 최대화하기 위하여 최적화되어 있다.
바이오매스 처리 -- 초음파처리, 열분해, 산화, 증기 폭발
필요한 경우, 하나 이상의 초음파처리, 열분해, 산화적 혹은 증기 폭발 공정이 바이오매스 재료의 난분해성을 더욱 저감시키기 위하여 기타 처리에 부가해서 혹은 이 대신에 이용될 수 있다. 이들 공정은 미국 특허 제7,932,065호(Medoff)에 상세히 기재되어 있으며, 이 문헌의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
처리된 바이오매스 재료의 용도
바이오매스 재료(예컨대, 식물 바이오매스, 동물 바이오매스, 종이 및 도시 폐 바이오매스)가 유기산, 유기산의 염, 무수물, 유기산의 에스터 및 연료, 예컨대, 내연기관용의 연료 혹은 연료 전지용의 공급원료 등과 같은 유용한 중간생성물 및 생성물을 생산하기 위한 공급원료로서 이용될 수 있다. 용이하게 입수가능한 공급원료 셀룰로스 및/또는 리그노셀룰로스 재료로서 이용될 수 있는 시스템 및 방법이 본 명세서에 기재되어 있지만, 예컨대, 도시 폐 스트림 및 폐지 스트림, 예컨대, 신문지, 크래프트지, 골판지 혹은 이들의 혼합물을 포함하는 스트림을 처리하는데 어려울 수 있다.
공급원료를 용이하게 가공처리될 수 있는 형태로 전환시키기 위하여, 공급원료 내 글루칸- 또는 자일란-함유 셀룰로스는, 당화제, 예컨대, 효소 혹은 산에 의해 저분자량 탄수화물, 예컨대, 당으로 가수분해될 수 있으며, 이 과정은 당화라 지칭된다. 저분자량 탄수화물은 이어서 예를 들어 기존의 제조 공장, 예컨대, 단세포 단백질 공장, 효소 제조 공장, 혹은 연료 공장, 예컨대, 에탄올 제조 설비에서 이용될 수 있다.
공급원료는, 예컨대, 용매 중, 예컨대, 수성 용액 중에서 효소와 재료를 배합함으로써, 효소를 이용해서 가수분해될 수 있다. 효소는 본 명세서에 기재된 방법에 따라서 제조ㄷ/유도될 수 있다.
구체적으로, 효소는 바이오매스(예컨대, 바이오매스의 셀룰로스 및/또는 리그닌 부분)을 파괴시키거나, 또는 각종 셀룰로스분해 효소(셀룰라제), 리그닌분해효소 혹은 각종 소분자 바이오매스-분해 대사산물을 함유하거나 제조하는, 유기체에 의해 공급될 수 있다. 이들 효소는 바이오매스의 결정성 셀룰로스 또는 리그닌 부분을 분해시키기 위하여 상승작용적으로 작용하는 효소의 복합체일 수 있다. 셀룰로스분해 효소의 예로는 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제 및 셀로비아제(베타-글루코시다제)를 포함한다.
당화 동안, 셀룰로스 기질은 올리고머성 중간생성물을 생성하는 랜덤한 개소에서 엔도글루카나제에 의해 초기에 가수분해될 수 있다. 이들 중간생성물은 이어서 셀룰로스 중합체의 말단으로부터 셀로바이오스를 생산하기 위하여 셀로바이오하이드롤라제 등과 같은 글루카나제를 외부 분열시키기 위한 기질이다. 셀로바이오스는 글루코스의 수-가용성 1,4-결합 이량체이다. 최종적으로, 셀로비아제는 셀로바이오스를 분할시켜 글루코스를 수득한다. 이 과정의 효율(예컨대, 가수분해 시간 및/또는 가수분해 완성도)은 셀룰로스 재료의 난분해성에 좌우된다.
중간생성물 및 생성물
본 명세서에 기재된 방법을 이용해서, 바이오매스 재료가 에너지, 연료, 식품 및 물질 등과 같은 하나 이상의 생성물로 전환될 수 있다. 생성물의 구체적인 예로는, 수소, 당(예컨대, 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 만노스, 갈락토스, 프럭토스, 이당류, 올리고당 및 다당류), 알코올(예컨대, 1가 알코올 혹은 2가 알코올, 예컨대, 에탄올, n-프로판올, 아이소뷰탄올, sec-뷰탄올, tert-뷰탄올 또는 n-뷰탄올), 수화된 혹은 함수 알코올(예컨대, 10%, 20%, 30% 이상 혹은 심지어 40% 이상의 물을 함유함), 바이오디젤, 유기산, 탄화수소(예컨대, 메탄, 에탄, 프로판, 아이소뷰텐, 펜탄, n-헥산, 바이오디젤, 바이오-가솔린 및 이들의 혼합물), 공동-생성물(예컨대, 단백질, 예컨대, 셀룰로스 분해 단백질(효소) 또는 단세포 단백질), 및 임의의 조합 혹은 상대적인 농도에서, 그리고 선택적으로 임의의 첨가제(예컨대, 연료 첨가제)와의 조합에서의 이들의 임의의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 기타 예로는, 카복실산, 카복실산의 염, 카복실산과 카복실산의 염과 카복실산의 에스터의 혼합물(예컨대, 메틸, 에틸 및 n-프로필 에스터), 케톤(예컨대, 아세톤), 알데하이드(예컨대, 아세트알데하이드), 알파 및 베타 불포화 산(예컨대, 아크릴산) 및 올레핀(예컨대, 에틸렌)을 포함한다. 기타 알코올 및 알코올 유도체로는 프로판올, 프로필렌 글라이콜, 1,4-뷰탄다이올, 1,3-프로판다이올, 당 알코올 및 폴리올(예컨대, 글라이콜, 글라이세롤, 에리트리톨, 트레이톨, 아라비톨, 자일리톨, 리비톨, 만니톨, 솔비톨, 갈락티톨, 이디톨, 이노시톨, 볼레미톨, 아이소말트, 말티톨, 락티톨, 말토트라이이톨, 말토테트라이톨 및 폴리글라이시톨 및 기타 폴리올), 그리고 이들 알코올의 어느 하나의 메틸 혹은 에틸 에스터를 포함한다. 기타 생성물로는, 메틸 아크릴레이트, 메틸메타크릴레이트, 락트산, 시트르산, 폼산, 아세트산, 프로피온산, 뷰티르산, 숙신산, 발레르산, 카프로산, 3-하이드록시프로피온산, 팔미트산, 스테아르산, 옥살산, 말론산, 글루타르산, 올레산, 리놀레산, 글라이콜산, 감마-하이드록사뷰티르산 및 이들의 혼합물, 이들 산의 어느 것인가의 염, 이들 산의 어느 하나와 그들의 각각의 염의 혼합물을 포함한다.
상기 생성물의 서로 간의 및/또는 상기 생성물의 다른 생성물과의 임의의 조합(여기서 다른 생성물은 본 명세서 혹은 다른 곳에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있음)은, 함께 포장되어 생성물로서 판매될 수 있다. 이 생성물은 조합, 예컨대, 혼합되거나, 배합되거나 공용해될 수 있거나, 또는 단순히 포장되어 함께 판매될 수 있다.
본 명세서에 기재된 생성물의 어느 하나 혹은 생성물의 조합은 생성물을 판매하기 전에, 예컨대, 정제 혹은 단리 혹은 심지어 포장 후에, 위생처리 혹은 멸균화하여, 생성물(들)에 존재할 수 있는 하나 이상의 잠재적으로 바람직하지 않은 오염물을 중화시킬 수 있다. 이러한 위생처리는 전자 충격에 의해, 예를 들어, 약 20 M㎭ 이하, 예컨대, 약 0.1 내지 15 M㎭, 약 0.5 내지 7 M㎭, 또는 약 1 내지 3 M㎭의 선량에서 행해질 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법은 공장의 다른 부분에서 이용되거나(공동-발전) 오픈 마켓에서 판매되도록 스팀 및 전기를 발생하는데 유용한 각종 부산물 스트림을 생산할 수 있다. 예를 들어, 부산물 스트림의 연소로부터 발생된 스팀은 증류 과정에서 이용될 수 있다. 다른 예로서, 부산물 스트림의 연소로부터 발생된 전기는 전처리에서 이용되는 전자빔 발전기를 통전시키는데 이용될 수 있다.
스팀 및 전기를 발생시키는데 이용되는 부산물은 이 과정 전체를 통해서 다수의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 폐수의 혐기성 소화는 매탄 중 높은 바이오가스 및 소량의 폐 바이오매스(슬러지)를 생산할 수 있다. 다른 예로서, 당화후 및/또는 증류후 고체(예컨대, 전처리 및 예비 과정으로부터 남아 있는 비전환된 리그닌, 셀룰로스 및 헤미셀룰로스)가 사용, 예컨대 연료로서 연소될 수 있다.
얻어지는 많은 생성물, 예컨대, 에탄올 또는 n-뷰탄올은, 동력 차량, 트럭, 트랙터, 배 혹은 트레인용의 연료로서, 예컨대, 내연 연료로서 혹은 연료 전지 공급원료로서 활용될 수 있다. 얻어진 많은 생성물은 또한 항공기, 예컨대, 제트 엔진을 지니는 비행기 혹은 헬리콥터를 통전시키는 데 활용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 생성물은, 예컨대, 종래의 스팀 발전 공장에서 혹은 연료 전지 공장에서 전력 발전을 위하여 활용될 수 있다.
식품 및 약제학적 생성물을 포함하는 기타 중간생성물 및 생성물은 미국 특허 출원 공개 제2010/0124583 A1호(공개일: 2010년 5월 20일, Medoff)에 기재되어 있으며, 이 문헌의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
당화
난분해성 저감된 공급원료는, 일반적으로 해당 재료와 효소를 유체 배지, 예를 들어, 수성 용액 중에서 배합함으로써, 위에서 논의된 효소에 의해 처리된다. 몇몇 경우에, 공급원료는 미국 특허 출원 공개 제2012/0100577 A1호(Medoff 및 Masterman, 공개일; 2012년 4월 26일)에 기재된 바와 같이 당화 전에 온수에서 비등되거나, 적셔지거나 혹은 조리되며, 이 문헌의 전체 내용은 본 명세서에 포함된다.
당화 공정은 제조 공장 내의 탱크(예컨대, 적어도 4000, 40,000 혹은 500,000ℓ의 체적을 지니는 탱크)에서 부분적으로 혹은 완전히 수행될 수 있고/있거나, 수송 중에, 예컨대, 레일 카 내, 탱커 트럭 내, 또는 초대형 유조선이나 선박의 선창 내에서 부분적으로 혹은 완전히 수행될 수 있다. 완전한 당화를 위해 필요한 시간은 이용된 공급원료와 효소 그리고 처리 조건에 좌우될 것이다. 당화가 제어된 조건 하에 제조 공장에서 수행된다면, 셀룰로스는 약 12 내지 96시간에 글루코스로 실질적으로 완전히 전환될 수 있다. 당화가 수송 중에 부분적으로 혹은 완전히 수행된다면, 당화는 더 오랜 시간이 걸릴 수 있다.
일반적으로, 탱크 내용물은 당화 동안, 예를 들어, 국제 출원 제PCT/US2010/035331호(출원일: 2010년 5월 18일, 제WO 2010/135380호로 영어로 공개되고 미국을 지정함)에 기재된 바와 같은 제트 혼합을 이용해서 혼합되는 것이 바람직하며, 이 문헌의 전체 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
계면활성제의 첨가는 당화의 속도를 증대시킬 수 있다. 계면활성제의 예로는, 비이온성 계면활성제, 예컨대, 트윈(Tween)(등록상표) 20 혹은 트윈(Tween)(등록상표) 80, 폴리에틸렌 글라이콜 계면활성제, 이온성 계면활성제, 또는 양성 계면활성제를 포함한다.
일반적으로 당화로부터 얻어지는 당 용액의 농도는 비교적 높은 것, 예컨대, 40중량% 이상, 또는 50, 60, 70, 80, 90 중량% 이상 또는 심지어 95중량% 이상인 것이 일반적으로 바람직하다. 물은, 당 용액의 농도를 증가시키기 위하여, 예컨대, 증발에 의해 제거될 수 있다. 이것은 출하될 부피를 감소시키며, 또한 용액 중의 미생물 증식을 억제한다.
대안적으로, 보다 낮은 농도의 당 용액이 이용될 수 있으며, 이 경우, 항균제 첨가제, 예컨대, 광범위 항생제를 낮은 농도, 예컨대, 50 내지 150 ppm으로 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 기타 적절한 항생제로는 암포테리신 B, 암피실린, 클로르암페니콜, 시프로플록사신, 겐타마이신, 하이그로마이신 B, 카나마이신, 네오마이신, 페니실린, 퓨로마이신, 스트렙토마이신을 포함한다. 항생제는 수송 및 저장 동안 미생물의 성장을 저해할 것이며, 적절한 농도, 예컨대, 15 내지 1000 중량ppm, 예컨대, 25 내지 500 중량ppm, 또는 50 내지 150 중량ppm에서 이용될 수 있다. 필요한 경우, 항생제는 당 농도가 비교적 높더라도 포함될 수 있다. 대안적으로, 보존성의 항균제와 함께 다른 첨가제가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 향균제 첨가제(들)은 식품-등급이다.
효소와 함께 바이오매스 재료에 첨가되는 물의 양을 제한함으로써 비교적 고농도의 용액이 얻어질 수 있다. 농도는 예컨대 얼마나 많은 당화가 일어나는지를 제어함으로써 제어될 수 있다. 예를 들어, 농도는 용액에 더 많은 바이오매스 재료를 첨가함으로써 증가될 수 있다. 용액 내에서 생성되고 있는 당을 유지하기 위하여, 계면활성제, 예컨대, 위에서 논의된 것들 중 하나가 첨가될 수 있다. 용해도는 용액의 온도를 증가시킴으로써 또한 증가될 수 있다. 예를 들어, 용액은 40 내지 50℃, 60 내지 80℃ 혹은 심지어 그 이상의 온도에서 유지될 수 있다.
당화제
적절한 셀룰로스분해 효소는 바실루스(Bacillus), 코프리누스(Coprinus), 마이셀리오프토라(Myceliophthora), 세팔로스포륨(Cephalosporium), 사이탈리듐(Scytalidium), 페니실륨(Penicillium), 아스페르길루스(Aspergillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 후미콜라(Humicola), 푸사리움(Fusarium), 티엘라비아(Thielavia), 아크레모늄(Acremonium), 크리소스포륨(Chrysosporium) 및 트리코데마(Trichoderma) 속으로부터의 셀룰라제를 포함하며, 특히 아스페르길루스(Aspergillus)(예컨대, EP 공개 제0 458 162호), 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens)(사이탈리듐 써모필룸(Scytalidium thermophilum)으로서 재분류됨, 예컨대, 미국 특허 제4,435,307호 참조), 코프리너스 시네레우스(Coprinus cinereus), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 마이셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila), 메리필루스 기간테우스(Meripilus giganteus), 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 아크레모늄 종(Acremonium sp.)(아크레모늄 페르시시넘(A. persicinum), 아크레모늄 아크레모늄(A. acremonium), 아크레모늄 브라키페늄(A. brachypenium), 아크레모늄 디클로모스포룸(A. dichromosporum), 아크레모늄 오브클라바툼(A. obclavatum), 아크레모늄 핀커토니애(A. pinkertoniae), 아크레모늄 로세오그리세움(A. roseogriseum), 아크레모늄 인콜로라툼(A. incoloratum) 및 아크레모늄 푸라툼(A. furatum)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아님) 종으로부터 선택된 균주에 의해 생산된 것들을 포함한다. 바람직한 균주로는, 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) DSM 1800, 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) DSM 2672, 마이셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila) CBS 117.65, 세팔로스포륨종(Cephalosporium sp.) RYM-202, 아크레모늄종(Acremonium sp.) CBS 478.94, 아크레모늄종(Acremonium sp.) CBS 265.95, 아크레모늄 페르시시넘(Acremonium persicinum) CBS 169.65, 아크레모늄 아크레모늄(Acremonium acremonium) AHU 9519, 세팔로스포륨종(Cephalosporium sp.) CBS 535.71, 아크레모늄 브라키페늄(Acremonium brachypenium) CBS 866.73, 아크레모늄 디클로모스포룸(Acremonium dichromosporum) CBS 683.73, 아크레모늄 오브클라바툼(Acremonium obclavatum) CBS 311.74, 아크레모늄 핀커토니애(Acremonium pinkertoniae) CBS 157.70, 아크레모늄 로세오그리세움(Acremonium roseogriseum) CBS 134.56, 아크레모늄 인콜로라툼(Acremonium incoloratum) CBS 146.62, 및 아크레모늄 푸라툼(Acremonium furatum) CBS 299.70H를 포함한다. 셀룰로스분해 효소는 또한 크리소스포륨(Chrysosporium), 바람직하게는, 크리소스포륨 룩노웬스(Chrysosporium lucknowense)로부터 얻어질 수 있다. 이용될 수 있는 부가적인 균주로는 트리코데마(Trichoderma)(특히 트리코데르마 비리데(T. viride), 트리코데마 리제이(T. reesei) 및 트리코데마 코닌기(T. koningii)), 호알칼리성 바실러스(alkalophilic Bacillus))(예를 들어, 미국 특허 제3,844,890호 및 EP 공보 제0 458 162호 참조) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)(예컨대, EP 공보 제0 458 162호 참조)를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
바이오매스 재료를 당화시켜 당을 생산하는데 이용될 수 있는 많은 미생물은 또한 이들 당을 발효시켜 유용한 생성물로 전환시키는데도 이용될 수 있다.
당
본 명세서에 기재된 방법에 있어서, 예를 들어, 당화 후에, 당(예컨대, 글루코스 및 자일로스)이 단리될 수 있다. 예를 들어 당은 석출, 결정화, 크로마토그래피(예컨대, 시뮬레이션화된 이동상 크로마토그래피, 고압 크로마토그래피), 원심분리, 추출, 당업계에 공지된 기타 임의의 단리 방법, 그리고 이들의 조합에 의해 단리될 수 있다.
수소화 및 기타 화학적 변형
본 명세서에 기재된 방법은 수소화를 포함할 수 있다. 예를 들어 글루코스 및 자일로스는 각각 솔비톨 및 자일리톨로 수소화될 수 있다. 수소화는 고압(예컨대, 10 내지 12000 psi) 하에서 H2와 조합하여 촉매(예컨대, Pt/감마-Al2O3, Ru/C, 라니 니켈(Raney nickel), 또는 당업계에 공지된 기타 촉매)의 사용에 의해 달성될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법으로부터 생성물의 화학적 변형의 기타 유형, 예를 들어, 유기 당 유래 생성물(예컨대, 푸르푸랄 및 푸루푸랄-유래 생성물)이 이용될 수 있다. 당 유래 생성물의 화학적 변형은 미국 특허 가출원 제61/667,481호(출원일: 2012년 7월 3일)에 기재되어 있으며, 이 문헌의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
발효
당화에 의해 생산된 당은 최종 생성물로서 단리될 수 있거나, 또는 기타 생성물, 예컨대, 알코올, 당 알코올, 예를 들어, 에리트리톨, 또는 유기산, 예컨대 락트산, 글루탐산 혹은 시트르산 또는 아미노산을 생산하기 위하여 발효될 수 있다.
예를 들어, 효모 및 지모모나스(Zymononas) 박테리아는 당(들)의 알코올(들)로의 전환 혹은 발효에 이용될 수 있다. 기타 미생물은 이하에 논의된다. 발효를 위한 최적 pH는 약 pH 4 내지 7이다. 예를 들어, 효모를 위한 최적 pH는 약 pH 4 내지 5인 반면, 지모모나스를 위한 최적 pH는 약 pH 5 내지 6이다. 전형적인 발효 시간은 약 24 내지 168시간(예컨대, 24 내지 96시간)이고 이때의 온도 범위는 20℃ 내지 40℃(예컨대, 26℃ 내지 40℃)이지만, 호열성 미생물은 보다 높은 온도를 선호한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 예컨대, 혐기성 유기체가 사용될 경우, 발효의 적어도 일부는 산소의 부재, 예컨대, N2, Ar, He, CO2 또는 이들의 혼합물 등과 같은 불활성 기체의 블랭킷 하에 수행된다. 부가적으로, 상기 혼합물은 발효의 일부 혹은 전부 동안 탱크를 통해 흐르는 불활성 가스의 일정한 퍼지(purge)를 지닐 수 있다. 몇몇 경우에, 혐기성 조건은 발효 동안 이산화탄소 생산에 의해 달성되거나 유지될 수 있고, 부가적인 불활성 가스가 필요로 되지 않는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 발효공정의 전부 혹은 일부는 저분자량 당이 생성물(예컨대, 에탄올)로 완전히 전환되기 전에 중단될 수 있다. 중간생성물인 발효 산물은 고농도의 당과 탄수화물을 포함한다. 당과 탄수화물은 이하에 논의된 바와 같이 단리될 수 있다. 이들 중간생성물인 발효 산물은 인간 혹은 동물 소비를 위한 식품의 제조에 이용될 수 있다. 부가적으로 혹은 대안적으로, 중간생성물인 발효 산물은 밀가루 유사 물질을 생산하기 위하여 스테인레스강제 실험실 밀로 미립자 크기로 분쇄될 수 있다.
제트 혼합은 발효 동안 이용될 수 있고, 몇몇 경우에 당화와 발효는 동일 탱크에서 수행된다.
미생물에 대한 영양물질, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2012/0052536호(출원일: 2011년 7월 15일)에 기재된 식품-기반 영양물질 패키지가 당화 및/또는 발효 동안 첨가될 수 있으며, 이 문헌의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
"발효"는 미국 가출원 제61/579,559호(출원일: 2012년 12월 22일) 및 미국 가출원 제61/579,576호(출원일: 2012년 12월 22일)에 개시된 방법 및 생성물을 포함하며, 이들 두 문헌의 내용은 참조로 그들의 전문이 본 명세서에 포함된다.
국제 특허 출원 제PCT/US2007/074028호(출원일: 2007년 7월 20일, WO 2008/011598로서 공개되었고, 미국을 지정함)에 기재된 바와 같은 이동식 발효기가 이용될 수 있다. 마찬가지로, 당화 장비는 이동식일 수 있다. 또, 당화 및/또는 발효는 수송 동안 부분적으로 전체적으로 수행될 수 있다.
발효제
발효에 이용되는 미생물(들)은 천연 유래 미생물 및/또는 공학적으로 조작된 미생물일 수 있다. 예를 들어, 미생물은 박테리아(예컨대, 셀룰로스 분해 박테리아를 포함하지만, 이로써 제한되는 것은 아님), 균류(예컨대, 효모를 포함하지만, 이로써 제한되는 것은 아님), 식물, 원생생물, 예컨대, 원생동물문 혹은 균류-유사 원생생물(예컨대, 점균류를 포함하지만, 이로써 제한되는 것은 아님), 또는 조류일 수 있다. 유기체가 거부반응을 일으키지 않을 경우, 유기체의 혼합물이 이용될 수 있다.
적절한 발효 미생물은, 예컨대, 글루코스, 프럭토스, 자일로스, 아라비노스, 만노스, 갈락토스, 올리고당 혹은 다당류 등의 탄수화물을 발효 생성물로 전환시키는 능력을 지닌다. 발효 미생물로는, 사카로마이세스종(Saccharomyces spp)의 속(genus)(사카로마이세스 세레비시아(S. cerevisiae)(빵 효모), 사카로마이세스 디스타티쿠스(S. distaticus), 사카로마이세스 우바룸(S. uvarum)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아님), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)속(클루이베로마이세스 마르시아누스(K. marxianus), 클루이베로마이세스 프라길리스(K. fragilis) 을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아님), 칸디다(Candida)속(칸디다 슈도트로피칼리스(C. pseudotropicalis) 및 칸디다 브라시카에(C. brassicae)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아님), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis)(칸디다 쉐하타에(Candida shehatae)와 관련됨), 클라비스포라(Clavispora)속(클라비스포라 루시타니에(C. lusitaniae) 및 클라비스포라 오푼티애(C. opuntiae) 를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아님), 파키솔렌(Pachysolen)속(파키솔렌 탄노필루스(P. tannophilus)을 포함하지만, 이로써 제한되는 것은 아님), 브레탄노마이세스(Bretannomyces)속(브레탄노마이세스 클라우세니이(B. clausenii)(Philippidis, G. P., 1996, Celluose bioconversion technology, Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C.E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212)를 포함하지만, 이로써 제한되는 것은 아님)의 균주들을 포함한다. 기타 적절한 미생물로는, 예를 들어, 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 클로스트리듐 종(클로스트리듐 써모셀륨(C. thermocellum)(Philippidis, 1996, 전술함), 클로스트리듐 사카로뷰틸아세토니쿰(C. saccharobutylacetonicum), 클로스트리듐 사카로뷰틸리쿰(C. saccharobutylicum), 클로스트리듐 푸니세움(C. Puniceum), 클로스트리듐 베이전키이(C. beijernckii), 클로스트리듐 아세토뷰틸리쿰(C. acetobutylicum)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아님), 모닐리엘라 폴리니스(Moniliella pollinis), 모닐리엘라 메가실리엔시스(Moniliella megachiliensis), 락토바실러스 종(Lactobacillus spp.), 야로위아 리포리타카(Yarrowia lipolytica), 유레오바시디움 종(Aureobasidium sp.), 트리코스포로노이데스 종(Trichosporonoides sp.), 트리고놉시스 바리아빌리스(Trigonopsis variabilis), 트리코스포론 종(Trichosporon sp.), 모닐리엘라아세토아부탄스 종(Moniliellaacetoabutans sp.), 티풀라 바리아빌리스(Typhula variabilis), 칸디다 마그놀리애(Candida magnoliae), 우스틸라기노마이세테스 종(Ustilaginomycetes sp.), 슈도지마 츠쿠바엔시스(Pseudozyma tsukubaensis)의 균주, 지고사카로마이에스(Zygosaccharomyces), 데바리오마이세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula) 및 피키아(Pichia) 속의 효모 종, 및 데마토이드속 토룰라(Torula)의 진균을 포함한다.
예를 들어, 클로스트리듐 종은, 에탄올, 뷰탄올, 뷰티르산, 아세트산 및 아세톤을 생산하는데 이용될 수 있다. 락토바실러스 종(Lactobacillus spp.)은 락트산을 생산하는데 이용될 수 있다.
이러한 많은 미생물 균주는, 두서너 가지 예를 들면, ATCC(American Type Culture Collection, 미국 버지니아주의 머내서스시에 소재), NRRL(Agricultural Research Service Culture Collection, 미국 일리노이주의 피오리아시에 소재) 또는 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, 독일의 브라운슈바이크에 소재) 등과 같이, 상업적으로 혹은 기탁소를 통해서 공개적으로 입수가능하다.
시판의 효모로는, 예를 들어, 래드 스타(Red Star)(등록상표)/라사프레 에탄올 레드(Lesaffre Ethanol Red)(미국 Red Star/Lesaffre사로부터 입수가능), 팔리(FALI)(등록상표)(미국 Burns Philip Food Inc.의 분사인 Fleischmann's Yeast사로부터 입수가능), 수퍼스타트(SUPERSTART)(등록상표)(Alltech사(이제는 Lalemand)로부터 입수가능), 거트 스트란드(GERT STRAND)(등록상표)(스웨덴의 Gert Strand AB사로부터 입수가능) 및 페르몰(FERMOL)(등록상표)(DSM Specialties사로부터 입수가능)을 포함한다.
바이오매스 재료를 당화시켜 당을 생산하는데 이용될 수 있는 미생물은 또한 이들 당을 발효시켜 유용한 생성물로 전환시키는데 이용될 수 있다.
증류
발효 후, 얻어지는 유체는, 예를 들어, "비어탑"(beer column)을 이용해서 증류되어 대부분의 물과 잔류 고체로부터 에탄올과 기타 알코올을 분리할 수 있다. 비어탑을 나온 증기는 예컨대 35중량% 에탄올일 수 있고 정류탑으로 공급될 수 있다. 정류탑으로부터 거의 공비(azeotropic)(92.5%) 에탄올과 물의 혼합물은 기상 분자체를 이용해서 순수한(99.5%) 에탄올로 정제될 수 있다. 비어탑 바닥부분은 3-작용 증발기의 제1작용부에 보내질 수 있다. 정류탑 환류 응축기는 이 제1작용부를 위해 열을 제공할 수 있다. 제1작용 후, 고체는 원심기를 이용해서 분리되고 회전 건조기에서 건조될 수 있다. 원심기 유출물의 일부(25%)는 발효로 재순환될 수 있고, 나머지는 제2 및 제3증발기 작용부로 보내질 수 있다. 대부분의 증발기 응축물은 작은 부분이 폐수 처리로 분리되어 낮은 비등 화합물의 구축을 방지하면서 상당히 깨끗한 응축물로서 상기 처리로 되돌아갈 수 있다.
본 명세서의 실시예 이외 혹은 달리 명확하게 특정되지 않는 한, 본 명세서의 이하의 부분 및 첨부된 특허청구범위에서, 수치 범위, 양, 값 및 퍼센트, 예컨대, 재료, 원소 함량, 시간 및 반응 온도, 양들의 비 및 기타에 대한 것들의 모두는, 용어 "약"이 그 값, 양 혹은 범위에 명확하게 표시되어 있지 않을 수도 있더라도 마치 단어 "약"으로 시작되는 것처럼 읽혀질 수 있다. 따라서, 상반되게 표시되지 않는 한, 이하의 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 기술된 수치 파라미터는 본 발명에 의해 얻고자 추구되는 목적으로 하는 특성에 따라서 변할 수 있는 근사치이다. 적어도 또한 특허청구범위의 범주에 대한 등가물의 원칙의 적용을 제한하는 시도로서가 아니라, 각 수치 파라미터는 보고된 유효숫자의 숫자를 감안하여 그리고 통상의 반올림 수법을 적용함으로써 적어도 해석될 필요가 있다.
본 발명의 광범위한 범위를 기술하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에서 기술하고 있는 수치는 가능한 한 정확하게 보고되어 있다. 그러나, 어떠한 수치도 반드시 각각의 테스트 측정에 기반하여 발견되는 표준 편차에 기인하는 오차를 고유하게 포함한다. 또한, 수치 범위가 본 명세서에 기술되어 있을 경우, 이들 범위는 인용된 범위의 종말점을 포함한다(즉, 종말점이 이용될 수 있다). 중량 퍼센트가 본 명세서에서 이용된 경우, 그 보고된 수치는 전체 중량에 대한 것이다.
또한, 본 명세서에서 인용된 어떠한 수치 범위도 그 안에 포괄되는 모든 하위 범위를 포함하도록 의도된 것임이 이해되어야 한다. 예를 들어, "1 내지 10"의 범위는 인용된 최소값 1과 인용된 최대값 10 사이(이들을 포함함)의, 즉, 1과 동등 혹은 그보다 큰 최소값과 10과 동등 혹은 그보다 작은 최대값을 지니는 모든 하위 범위를 포함하도록 의도된다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "하나", "한가지" 혹은 "일" 등과 같은 단수 표현은 달리 표시되지 않는 한 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 포함하도록 의도된다.
실시예
재료 및 방법
이하의 절차 및 재료가 이하의 실시예에서 사용되었다.
세포 수탁: 이하의 트리코데마 리제이(Trichiderma reesei) 균주는 ATCC 66589, PC3-7; ATCC 56765, RUT-C30; ATCC 56767, NG-14; ATCC 26921, QM 9414로 수탁되었다.
각 세포는 25℃에서 감자 덱스트로스(PD) 배지에서 재수화되고 전파되었다.
매스터 세포 뱅크의 생산을 위하여, 각 균주는 멸균수 0.5㎖ 중에서 하룻밤 재수화되었다. 세포를 전파시키기 위하여, 재수화된 세포 40㎕를 이용해서 감자 덱스트로스 한천(PDA) 고체 배지에 접종시켰다. 재수화된 세포는 또한 PD 액체 배지 50㎖에 접종하고, 25℃ 및 200rpm에서 배양하였다. PDA 배지 중 2주 배양 후, 멸균 NaCl(9g/ℓ), 20% 글라이세롤 용액 중에 재현탁시키고, 세포 뱅크로서 이용하기 위하여 -80℃ 냉동고에 보존하였다.
단백질 측정 및 셀룰라제 검정(assay): 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준으로서 이용해서 브래드포드법(Bradford method)에 의해 측정하였다.
여과지 검정(Filter paper assay: FPU), 셀로비아제 활성 및 CMC 활성은 IUPAC법(T.K. Ghose, Pure Appl. Chem. 59:257-68, 1987)을 이용해서 수행하였다.
반응 생성물(글루코스)은 YSI 7100 멀티파라미터 바이오분석 시스템(Multiparameter Bioanalytical System)(YSI 라이프 사이언스사(YSI Life Sciences), 미국 오하이오주의 옐로 스프링스시에 소재) 또는 HPLC 상에서 분석하였다.
배지: 배지는 옥수수 침지액(2 g/ℓ), 황산암모늄(1.4 g/ℓ), 수산화칼륨(0.8 g/ℓ), 인산(85%, 4㎖/L), 프탈산 이칼륨염(5 g/ℓ), 황산마그네슘 7수화물(0.3g/ℓ), 염화칼슘(0.3g/ℓ), 황산제1철 7수화물(5 mg/ℓ), 황산망간 1수화물(1.6 mg/ℓ), 황산아연 7수화물(5 mg/ℓ) 및 염화코발트 6수화물(2mg/ℓ)을 포함하였다. 배지는 문헌[Herpoel-Gimbert et al., Biotechnology for Biofuels, 2008, 1:18]에 기재되어 있다.
바이오-릭액터: 세포 수탁소로부터의 냉동고 스톡은 2.5% 추가적 글루코스와 함께 위에 기재된 배지를 이용해서 시드 배양액을 만드는데 이용되었다. 시드 배양액은 전형적으로 30℃ 및 200rpm에서 72시간 동안 설정된 인큐베이터를 이용해서 플라스크 속에 만들었다. 시드 배양액(50㎖)은 3ℓ 발효기 내에서 1ℓ 출발 배지 중에 접종원으로서 이용하였다. 성장 단계에서, 락토스 35 g/ℓ를 배지에 첨가하였다. 배양 조건은 다음과 같았다: 27℃, pH 4.8(6M 암모니아를 이용), 기류 0.5 VVM, 500 rpm 교반, 및 용존 산소(DO)는 40% 산소 포화도 이상을 유지하였다. 유도 단계에서, 목적으로 하는 유도제(이하에 논의됨)를 첨가하였다. 발효 동안, 발포체가 발효기 헤드에 도달한 경우 배양액에 안티폼(Antiform) 204(시그마사)를 주사하였다.
진탕 플라스크: 위에 기재된 배지에 부가해서, 플라스크 배양액을 위하여, 트리스 완충액(Tris buffer)(12.1g/ℓ), 말레산(11.06g/ℓ) 및 수산화나트륨(2.08g/ℓ)을 첨가하였다. 종균 배양액(starter culture)은 첨가된 글루코스와 함께 배지 중에 준비하였다. 3일 성장 후, 세포 덩어리(cell mass)를 원심분리에 의해 수확하였다. 세포 덩어리를 목적으로 하는 유도제를 구비한 배지 50㎖에 재현탁시켰다. 플라스크를 200rpm의 교반 속도 및 30℃의 온도에 설정된 진탕 인큐베이터에 배치하였다.
실시예 1. 종이, 처리된 옥수수 속대 및 미처리된 옥수수 속대 상에서의 셀룰라제 성능 테스트
각종 유도제(처리된 바이오매스(TBM), 미처리된 바이오매스(UBM), 종이(P) 및 카복실메틸셀룰로스(CMC, 알드리치사))를 효소를 생산하는데 이용하였다. 바이오매스(TBM 및 UBM)를 밀링하여 옥수수 속대를 15 내지 40의 메쉬 크기로 수집하였다. TBM을 생산하기 위한 바이오매스(UBM)의 처리는 35 M㎭의 총 선량으로 전자 빔에 의한 전자 충격을 수반하였다. 종이는 세단하고 0.16인치보다 작은 공칭 입자 크기를 지니도록 스크리닝하였다. 유도제 실험은 진탕 플라스크와 PC3-7 및 RUT-C30 균주를 이용해서 수행하였다. 3일의 성장 배양 후, 수확된 세포 덩어리를 배지 50㎖ 및 유도제들 중 하나 1중량%를 각각 수용하는 일련의 진탕 플라스크에 첨가하였다.
유도 실험은 11일 동안 진행하였다. 이어서 배양 상청액을 14,500rpm에서 5분 동안의 원심분리에 의해 수확하고 4℃에서 저장하였다.
배양 상청액의 단백질 농도: 진탕 플라스크에서 성장되고 PC3-7로부터 유래된 세포 배양액을 이용해서, 11일 후의 단백질 농도는 TBM, UBM, P 및 CMC 각각에 대해서 1.39, 1.18, 1.06 및 0.26 ㎎/㎖였다. RUT-C30에 대해서, 단백질 농도는 TBM, P, UBM 및 CMC 각각에 대해서 1.26, 1.26, 1.00 및 0.26 ㎎/㎖였다.
셀룰라제 활성: 셀룰라제 활성이 검정되었으며, 이하의 표에 열거되어 있다.
상이한 유도제 및 세포 균주에 대한 셀룰라제 활성
유도제 세포 유형 FPU (U/㎖) 셀로비아제 활성
(U/㎖)		 FPU
(U/㎎)		 셀로비아제 활성
(U/㎎)
TBM PC-3-7 0.57 0.47 1.04 0.86
UBM PC-3-7 0.45 0.39 1.08 0.93
P PC-3-7 0.57 0.39 0.96 0.66
CMC PC-3-7 0.06 0.11 0.55 0.99
TBM RUT-C30 1.02 0.53 1.97 1.03
UBM RUT-C30 0.72 0.42 1.76 1.03
P RUT-C30 0.71 0.40 1.31 0.74
CMC RUT-C30 0.24 0.18 1.77 1.31
이들 결과는, 처리된 바이오매스가 미처리된 바이오매스보다 더 큰 속도로 효소 생산을 유도하는 것을 나타낸다.
실시예 2. 상이한 농도의 TBM 유도제에서의 효소 생산
본 실시예는 바이오리액터를 이용해서 행하였다. 세포 균주 RUT-C30은 2.5% 글루코스를 지니는 배지에서 전파되었다. 3일의 성장 후, 배양액을 원심분리하여 세포를 1, 3, 5, 7 및 9중량% TBM을 지니는 배지 50㎖에 재현탁시켰다. 27℃ 및 200rpm에서의 배양 11일 후의 단백질 농도 및 확성은 이하의 표에 표시되어 있다.
상이한 양의 유도제에 의해 제조된 단백질 및 효소의 양
유도제량(중량%) 단백질(g/ℓ) FPU(U/㎖) CMC (U/㎖)
1 0.7 1.4 1.3
2 1.4 3.1 1.7
5 3.4 6.2 2.6
7 2.9 2.5 1.5
9 1.5 0.6 1.0
이들 결과는, 처리된 바이오매스(TBM)가 5%의 속도로 첨가된 경우 보다 높은 수준의 효소가 생산된 것을 나타낸다.효소에 의한 바이오매스의 당화: 2, 5 및 7중량% 처리된 바이오매스 유도제(TBM) 대 시판의 효소(듀엣(상표명) 악셀레라제(DuetTM Accellerase), 제넨코사(Genencor))의 첨가에 의해 생산된 효소를 이용한 바이오매스(TBM)의 당화를 수행하였다. 바이오매스인, 10중량% TBM을 0.25 ㎖/g의 효소 배양액 혹은 시판의 효소와 배합하였다. 당화는 진탕 인큐베이터 속에서 50℃ 및 200rpm에서 수행하였다. 24시간 후, 생산된 글루코스의 양은 YSI에 의해 측정하였다. 용액 ℓ 및 단백질 ㎎당 생산된 글루코스의 양은 이하의 표에 표시되어 있다.
다양한 수준의 유도제로부터 생산된 글루코스의 양
생산된 효소 글루코스 (g/ℓ) 글루코스 (g/㎎)
2% TBM 유도제 4.04 2.31
5% TBM 유도제 4.06 1.08
7% TBM 유도제 3.02 0.83
시판의 효소 14.4 0.50
실시예 3. 처리된 바이오매스에 의해 생산된 효소의 SDS-PAGE바이오리액터 배양액은, 혼합을 500rpm 대신 50rpm에서 수행한 것을 제외하고 위에서 기재된 방법을 이용해서 준비하였다. 단백질 검정은 3.4 g/ℓ 단백질이 생산된 것을 나타내었다.
SDS PAGE를 이용한 단백질의 분석은 도 5에 도시되어 있다. 레인 1 및 5는 분자량 마커이고, 레인 2는 30㎕ 장입량(load)의 단백질, 레인 3은 40㎕ 장입량의 단백질, 레인 4는 듀엣(상표명) 악셀레라제 효소 복합체(제넨코사)에 대한 것이다.
실시예 4. 테스트 조건의 범위
유도 테스트된
파라미터		 테스트 범위 작업 범위 최상의
범위
옥수수 속대 입자 크기 1400- <5mm 1400- <5mm <50mm
첨가량 25-133g/ℓ 25-133g/ℓ 100g/ℓ
첨가 타이밍 제0 내지 3일 제1 내지 3일 제1 내지 3일
첨가 빈도 1, 2 및 5 1, 2 및 5 1
외양 습식 혹은 건식 습식 혹은 건식 습식 혹은 건식
처리 수준 35 35 35
락토스 첨가 타이밍 제3일 제3일 제3일
첨가량 4.7-40g/ℓ/d 4.7-18.7g/ℓ/d 18.7g/ℓ/d
첨가 빈도 연속 공급 연속 공급 연속 공급
본 명세서에 참조로 포함된다고 말한 임의의 특허, 공보 혹은 기타 개시 자료는, 전체적으로 혹은 부분적으로, 해당 포함된 자료가 본 발명에 기술된 기존의 정의, 진술 혹은 기타 개시 자료와 상충하지 않는 정도로만 본 명세서에 포함된다. 그와 같이 그리고 필요한 정도로, 본 명세서에 명백하게 기술된 바와 같은 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된 어떠한 상충하는 자료도 대체한다. 본 명세서에 참조로 포함된다고 기재하였지만 본 발명에 기술된 기존의 정의, 진술 혹은 기타 개시 자료와 상충하지 않는 임의의 재료 혹은 그의 일부는 상기 포함된 자료와 기존의 개시 자료 간에 상충이 일어나지 않는 정도로만 포함될 것이다.본 발명은 그의 바람직한 실시형태를 참조하여 특별히 도시되고 기술되었지만, 당업자라면 형태 및 상세의 각종 변화가 첨부된 특허청구범위에 의해 망라되는 본 발명의 범위로부터 벗어나는 일 없이 그 안에서 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다.

Claims (32)

  1. 방법으로서,
    제1 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스를 전자빔으로 처리하고;
    상기 처리된 제1 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스를 30㎛ 내지 1400㎛의 입자 크기로 밀링하고;
    상기 밀링된 제1 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스를 미생물과 배합하고; 그리고
    상기 미생물에 의해 1종 이상의 셀룰라제의 생산을 허용하는 조건 하에 상기 미생물-바이오매스 배합물을 유지함으로써 상기 미생물에 의해 효소 복합체의 생산을 유도하는 단계를 포함하고,
    상기 효소 복합체는 상기 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스에 맞춤화된 당화 활성을 갖는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제2 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스를 상기 미생물-바이오매스 배합물과 배합하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제2 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스는 리그노셀룰로스 바이오매스인 것인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스는 전자 충격(bombardment with electrons), 초음파처리, 산화, 열분해, 증기 폭발(steam explosion), 화학적 처리, 기계적 처리 및 동결 분쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 처리 방법에 의해 해당 바이오매스의 난분해성을 저감시키기 위하여 처리된 것인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 전자 충격으로 처리하는 것은 2 내지 50 Mrad의 총 선량으로 수행되는 것인, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 전자의 선량율은 초당 약 0.25 내지 약 20 Mrad인 것인, 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 전자는 0.8 MeV 내지 1.8 MeV의 에너지 수준 범위를 갖는 것인, 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 밀링은 건식 밀링(dry miling)을 포함하는 것인, 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 밀링은 습식 밀링(wet miling)을 포함하는 것인, 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스는 30㎛ 내지 200㎛의 입자 크기를 지니는 것인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스는 30㎛ 내지 50㎛의 입자 크기를 지니는 것인, 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오매스는 목재, 목초 및 농산물 잔류물(agricultural residue)로 이루어진 군으로부터 선택된 리그노셀룰로스 바이오매스인 것인, 방법.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스는 종이, 종이제품, 폐지, 제지용 펄프, 색소지, 적재지(loaded paper), 코팅지, 충전 종이, 잡지, 인쇄물, 프린터 용지, 다중코팅지, 명함 용지, 카드보드, 보드지, 목면, 목재, 파티클 보드, 산림 폐기물, 톱밥, 포플러 나무, 목재 칩, 목초, 지팽이풀, 억새, 코드 그래스(cord grass), 흰줄갈풀(reed canary grass), 곡물 잔류물, 왕겨, 귀리 껍질, 밀겨(wheat chaff), 보리 겨(barley hull), 농산물 폐기물, 사일리지, 카놀라짚, 밀짚, 보리짚, 귀리짚, 볏짚, 황마, 대마, 아마, 대나무, 사이잘, 마닐라삼, 옥수수 속대, 옥수수 대, 대두 여물, 옥수수 섬유, 알팔파, 건초, 코코넛 헤어, 당 가공처리 잔류물, 버개스(bagasse), 사탕무우, 용설란 버개스, 조류(algae), 해초, 거름, 하수, 기울, 농업용 및 공업용 폐기물, 아라카차, 메밀, 바나나, 보리, 카사바, 칡, 안데스괭이밥, 사고, 수수, 감자, 고구마, 타로, 얌, 콩, 잠두, 렌즈콩, 완두, 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스는 당화 또는 발효 과정의 잔사를 포함하는 것인, 방법.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 진균(fungus), 박테리아 및 효모로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 높은 수준의 셀룰라제를 생산하는 균주인 것인, 방법.
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 유전자 조작된 것인, 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 미생물은 진균인 것인, 방법.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 트리코데마 리제이(Trichoderma reesei) 및 클로스트리듐 써모셀륨(Clostridium thermocellum)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 미생물은 트리코데마 리제이(T. reesei)인 것인, 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 트리코데마 리제이(T. reesei)는 RUT-NG14, PC3-7, QM9414 및 RUT-C30으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 트리코데마 리제이(T. reesei)는 RUT-C30인 것인, 방법.
  23. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스는 상기 미생물이 유도기(lag phase)에 있을 때 상기 미생물과 배합되는 것인, 방법.
  24. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스, 또는 상기 제2 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스를 상기 효소(들)를 이용해서 당화시키는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
  25. 액체 배지(liquid medium), 전자빔으로 처리되고 30㎛ 내지 1400㎛의 입자 크기로 밀링된 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스, 미생물 및 상기 미생물에 의해 생산된 1종 이상의 효소를 포함하는 것인, 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스는 2 내지 50 Mrad의 총 선량으로 전자빔으로 처리된 것인, 조성물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스는 30㎛ 내지 200㎛ 또는 30㎛ 내지 50㎛의 입자 크기를 갖는 것인, 조성물.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스는 종이, 종이제품, 폐지, 제지용 펄프, 색소지, 적재지(loaded paper), 코팅지, 충전 종이, 잡지, 인쇄물, 프린터 용지, 다중코팅지, 명함 용지, 카드보드, 보드지, 목면, 목재, 파티클 보드, 산림 폐기물, 톱밥, 포플러 나무, 목재 칩, 목초, 지팽이풀, 억새, 코드 그래스(cord grass), 흰줄갈풀(reed canary grass), 곡물 잔류물, 왕겨, 귀리 껍질, 밀겨(wheat chaff), 보리 겨(barley hull), 농산물 폐기물, 사일리지, 카놀라짚, 밀짚, 보리짚, 귀리짚, 볏짚, 황마, 대마, 아마, 대나무, 사이잘, 마닐라삼, 옥수수 속대, 옥수수 대, 대두 여물, 옥수수 섬유, 알팔파, 건초, 코코넛 헤어, 당 가공처리 잔류물, 버개스(bagasse), 사탕무우, 용설란 버개스, 조류(algae), 해초, 거름, 하수, 기울, 농업용 및 공업용 폐기물, 아라카차, 메밀, 바나나, 보리, 카사바, 칡, 안데스괭이밥, 사고, 수수, 감자, 고구마, 타로, 얌, 콩, 잠두, 렌즈콩, 완두, 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 조성물.
  29. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 진균(fungus), 박테리아 및 효모로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 조성물.
  30. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 트리코데마 리제이(Trichoderma reesei) 및 클로스트리듐 써모셀륨(Clostridium thermocellum)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 조성물.
  31. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 트리코데마 리제이(Trichoderma reesei)인 것인, 조성물.
  32. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 효소는 상기 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매스에 맞춤화된 당화 활성을 갖는 것인, 조성물.
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