CN104039972A - 生物质材料的加工 - Google Patents

Abstract

本发明提供诱导酶的方法以及用于使用所述酶处理纤维素和木质纤维素生物质的方法。

Description

生物质材料的加工

相关申请的交叉引用

本申请要求在2011年12月22日提交的美国临时申请号61/579,550和61/579,562的权益。以上申请的全部公开内容以引用的方式并入本文。

发明领域

本发明涉及适用于加工生物质材料的酶的制备。例如，本发明涉及产生纤维素酶或其它酶类型。

背景

随着对石油的需求增加，对用于制造生物燃料和生物化学物质的可再生原料的兴趣也在增加。自20世纪70年代以来已对木质纤维素生物质作为用于所述制造方法的原料的用途进行了研究。木质纤维素生物质因其丰富、可再生、在国内生产，并且不与食品工业用途竞争而具有吸引力。

现今可获得许多潜在的木质纤维素原料，包括例如农业废弃物、木质生物质、城市废物、油籽/油饼以及海草。目前这些材料用作动物饲料、生物堆肥材料、在联产设施中燃烧抑或被填埋。

木质纤维素生物质由于植物细胞壁具有坚硬并且紧凑的结构而难以降解。所述结构包括嵌入半纤维素基质中由木质素围绕着的晶体纤维素原纤维。这种紧凑基质难以由酶以及其它化学、生物化学和生物方法接近。纤维素生物质材料(例如，已基本上除去所有木质素的生物质材料)可以更易于由酶和其它转化方法接近，但是即便如此，天然存在的纤维素材料当与水解酶接触时通常具有低产率(相对于理论产率)。木质纤维素生物质甚至更难以受酶攻击。此外，每种类型的木质纤维素生物质具有其自身特定的纤维素、半纤维素和木质素组成。

虽然多种方法已试图从木质纤维素生物质中提取结构性碳水化合物，但其不是过于昂贵、生产产率过低、在所得产物中留有不期望的化学物质，就是仅降解糖类。

来自可再生生物质源的糖可以通过代替、补充或取代石油和其它化石原料而成为化学和燃料工业的基础。然而，需要开发将使得可大量并且以可接受的纯度和价格获得这些单糖的技术。

发明概述

本文提供了通过使用诱导物诱导微生物产生一种或多种酶的方法。

一方面，提供一种方法，所述方法包括将已处理来减小其不顺应性的纤维素或木质纤维素生物质与微生物组合，以通过将微生物-生物质组合维持在允许所述微生物产生一种或多种酶的条件下来诱导所述微生物产生所述一种或多种酶。在一些实施方式中，随后使用所述一种或多种酶糖化纤维素或木质纤维素生物质。

本文还提供一种用于诱导微生物产生酶的方法，其中所述方法包括：提供第一纤维素或木质纤维素生物质；用处理方法处理所述第一生物质以减小其不顺应性，从而产生第一处理的生物质；提供微生物；提供液体介质；将所述第一处理的生物质、所述微生物以及所述液体介质组合，从而产生微生物-生物质组合；以及将所述微生物-生物质组合维持在允许所述微生物产生酶的条件下，从而产生诱导物-酶组合；从而诱导所述微生物产生所述酶。

本文还提供一种组合物，所述组合物包括液体介质、经过处理来减小其不顺应性的纤维素或木质纤维素生物质、微生物以及由所述微生物制备的一种或多种酶。

在本文所提供的任何方法或组合物中，用于减小一种或多种生物质材料的不顺应性的处理可为以下各项中的任一项：用电子轰击、超声处理、氧化、热解、蒸汽爆炸、化学处理、机械处理以及冷冻研磨。优选地，所述处理方法为用电子轰击。

所述方法和组合物还可包括机械处理所述第一或第二纤维素或木质纤维素生物质以减小其堆积密度和/或增大其表面积。所述一种或多种生物质材料可在与所述微生物和所述液体介质组合之前进行粉碎。粉碎可为干磨或湿磨。生物质材料可具有约30μm至1400μm的粒度。

在本文所述的任何方法和组合物中，任何纤维素或木质纤维素生物质可为：纸、纸制品、废纸、纸浆、有色纸、装料纸、涂布纸、填充纸、杂志、印刷品、打印纸、多涂层纸、卡片胚料、卡纸板、纸板、棉花、木材、刨花板、林业废弃物、锯末、杨木、木屑、草、柳枝稷、芒草、绳草、草芦、谷物残渣、稻壳、燕麦壳、小麦壳、大麦壳、农业废弃物、青贮饲料、油菜秸、小麦秸、大麦秸、燕麦秸、稻秸、黄麻、大麻、亚麻、竹子、剑麻、蕉麻、玉米穗轴、玉米秸秆、大豆秸秆、玉米纤维、苜蓿、干草、椰子毛、糖加工残渣、甘蔗渣、甜菜浆、龙舌兰渣、海藻、海草、粪肥、污物、下水、农业或工业废弃物、秘鲁胡萝卜、荞麦、香蕉、大麦、木薯、葛藤、圆齿酢酱草(oca)、西米、高粱、马铃薯、甘薯、芋头、山药、豆类、蚕豆、扁豆、碗豆，或任何这些的混合物。可选地，纤维素或木质纤维素生物质可包括在原有纤维素或木质纤维素生物质通过微生物的酶先前转化为产物之后剩余的材料。

在这些方法和组合物中，微生物可为真菌、细菌或酵母中的任一种。实际上，微生物可为不同微生物群体。微生物可为产生高水平的纤维素酶的菌株，和/或其可为遗传工程改造的。微生物可为里氏木霉(Trichoderma reesei)或者其可为例如热纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)。微生物可为里氏木霉菌株，如RUT-NG14、PC3-7、QM9414或RUT-C30。

在任何这些方法和组合物中，可在所述微生物处于滞后期时，将纤维素或木质纤维素生物质与所述微生物组合。

所述方法和组合物还可包括从微生物-诱导物-酶组合中除去全部或部分液体，以产生酶提取物。所述方法和组合物还可包括浓缩所述酶中的一种或多种和/或分离所述酶中的一种或多种。

所述方法和组合物还可包括允许发生第二纤维素或木质纤维素生物质的糖化，以使得产生一种或多种糖。可分离和/或浓缩所述一种或多种糖。

应理解，本发明不限于此概述中所公开的实施方案，并且其旨在涵盖如由权利要求书所定义的本发明的精神和范围内的修改。

附图简述

上文将由如附图中所示的本发明的以下示例性实施方案的更具体的描述而显而易见，在附图中，相似参考标号指所有不同视图中的相同部分。附图不必按比例绘制，而是将重点放在示出本发明的实施方案上。

图1是示出纤维素酶促水解成葡萄糖的图表。纤维素底物(A)由内切纤维素酶(i)转化为纤维素(B)，所述纤维素(B)由外切纤维素酶(ii)转化为纤维二糖(C)，所述纤维二糖(C)由纤维二糖酶(β-葡糖苷酶)(iii)转化为葡萄糖(D)。

图2为示出生物质原料转化为一种或多种产物的流程图。对原料进行物理预处理(例如，减小其尺寸)(200)、进行任选处理以减小其不顺应性(210)、进行糖化以形成糖溶液(220)，将溶液运送(230)到制造工厂(例如，通过管道、轨道车)(或者如果在途中进行糖化，则运送原料、酶和水)，对糖化的原料进行生物加工以产生所希望的产物(例如，醇)(240)，并且可以例如通过蒸馏对产物进行进一步加工以产生最终产物(250)。用于不顺应性的处理可通过测量木质素含量(201)并设定或调节工艺参数(205)来改进。使原料糖化(220)可通过将原料与介质和酶混合来改进(221)。

图3为示出第一生物质的处理(300)、产生纤维素酶的有机体的添加(310)、第二生物质的添加(320)以及加工所得的糖以制备产物(例如，一种或多种醇、纯糖)(330)的流程图。可任选将第一处理的生物质分开并将一部分作为第二生物质进行添加(A)。

图4为示出酶的产生的流程图。将产生纤维素酶的有机体添加到生长介质中(400)，添加(A)处理的第一生物质(405)以制备混合物(410)，添加第二生物质(420)，并且加工所得的糖以制备产物(例如，一种或多种醇、纯糖)(430)。还可将第一生物质(405)的部分添加到(B)第二生物质(420)中。

图5示出使用SDS PAGE的蛋白质分析结果。

详述

本文提供通过使用诱导物诱导微生物产生一种或多种酶的方法。所述诱导物由已处理来减小其不顺应性的生物质(纤维素或木质纤维素)制成。处理方法可包括使所述生物质经受用电子轰击、超声处理、氧化、热解、蒸汽爆炸、化学处理、机械处理或冷冻研磨。如本文所公开的，已用所述方法处理的生物质可在介质(如液体介质)中与微生物组合，以诱导微生物产生一种或多种酶。

一方面，本发明的特征在于一种包括使包含木质纤维素材料的诱导剂与微生物接触以产生酶的方法。

确切地说，本文所述的方法包括使用已由里氏木霉真菌产生的酶糖化纤维素和/或木质纤维素材料，如以下将进一步详细讨论的。

总体上，本发明涉及对加工生物质材料(例如，生物质材料或源自生物质的材料)以产生中间体和产物(如燃料和/或其它产物)的改进。例如，所述方法可用于产生糖、醇(如乙醇、异丁醇或正丁醇)、糖醇(如赤藓醇)或有机酸。

本发明还涉及适用于加工生物质材料的酶的制备。例如，本发明涉及产生纤维素酶或其它酶类型。

典型的生物质资源含有纤维素、半纤维素以及木质素外加较少量的蛋白质、可提取物以及矿物质。可以通过糖化将纤维素和半纤维素部分中含有的复合碳水化合物转化为糖，例如可发酵糖，并且随后可将所述糖用作最终产物或中间体，或者通过进一步加工(例如，发酵或氢化)将其转化为多种产物，如醇或有机酸。所获得的产物取决于所利用的方法或微生物以及生物加工发生的条件。

在一个实施方案中，例如，本发明包括一种诱导酶产生的方法。提供一种纤维素或木质纤维素生物质，对其进行处理以减小其不顺应性并随后在液体介质中与微生物组合。随后将所得微生物-生物质组合维持在允许有机体生长并且允许能够降解生物质的酶产生的条件下。处理的生物质充当诱导物，使得微生物产生酶。所述方法产生诱导物-酶组合。

在不希望受到任何理论限制的情况下，认为用于减小生物质不顺应性的处理在酶诱导中非常重要。发明人发现，低水平的处理导致低水平的酶诱导抑或极长的滞后时间，这可能是因为微生物难以从处理的生物质材料中提取糖。类似地，非常高水平的处理也使得微生物产生低水平的酶，这可能是因为相对容易地从处理的生物质中提取糖减小了对微生物产生大量酶的需要。

在相关方面，不顺应性处理也用于对材料进行消毒。生物质材料本质上包含常深嵌到材料本身内的污染微生物。因为如本文所公开的酶诱导倾向于是长时间的发酵(达一周或更久)，所以消毒很重要。因此，尽可能剧烈地处理所述材料以对其进行灭菌将是有利的。然而，所述高水平的处理可能会适得其反，因为高水平的处理使微生物产生的酶减少。

如本文所公开的，因此，通过谨慎斟酌处理水平，以对材料进行灭菌而不会过度处理材料使得微生物不能产生大量的酶，可获得很大益处。

如本文使用的术语“诱导物”意指促进有机体产生酶的纤维素或木质纤维素生物质。实例可为已处理来减小其不顺应性的生物质。随后通过在液体介质中将处理的生物质与一种或多种微生物组合并接着将其维持在允许微生物产生一种或多种酶的条件下来将所述处理的生物质用作酶诱导物。

随后可将诱导物-酶组合与另一种生物质组合并用于对所述生物质进行糖化。

令人惊讶的是，已发现在用微生物接种生物质之前对生物质进行处理造成微生物产生的酶量增加。此外，相对于使用未处理的生物质，在处理的生物质上产生不同的酶。

如本文所描述，纤维素或木质纤维素生物质可来源于各种各样的材料。在一个实施方案中，生物质可为木质素壳。如本文使用的术语“木质素壳”意指在生物质已糖化之后剩余的材料。

在某些实施方案中，本发明涉及用于使用由真菌，例如由纤维素分解丝状真菌里氏木霉菌株产生的酶糖化纤维素或木质纤维素材料的方法。在一些实施方式中，使用里氏木霉的高产率纤维素酶突变体，例如RUT-NG14、PC3-7、QM9414和/或RUT-C30。所述菌株描述于例如“Selective Screening Methods for the Isolation of High YieldingCellulase Mutants of Trichoderma reesei”,Montenecourt,B.S.和Everleigh,D.E.Adv.Chem.Ser.181，289-301(1979)。这些突变体是高产的并且是代谢物阻遏抗性的，从而允许实现纤维素酶的高产率。

在优选实施方案中，在待糖化的木质纤维素材料的一部分的存在下进行酶产生。木质纤维素材料可在酶产生过程中充当纤维素酶合成的诱导剂，从而产生具有适合于特定木质纤维素材料的活性的纤维素酶复合物。在一些实施方式中，在使用木质纤维素材料作为诱导剂之前减小其不顺应性。认为这使得木质纤维素材料中的纤维素可更易于为真菌所利用。减小木质纤维素材料的不顺应性还有助于糖化。

在一些情况下，减小木质纤维素材料的不顺应性包括用物理处理对木质纤维素材料进行处理。物理处理可为例如辐射(例如电子轰击)、超声处理、热解、氧化、蒸汽爆炸、化学处理或任何这些处理的组合。所述处理还可包括本文所公开的任何一种或多种处理，其单独应用或以任何所需组合应用并且应用一次或多次。

分解生物质(如生物质的纤维素和/或木质素部分)的酶和破坏生物质的有机体含有或制造各种纤维素分解酶(纤维素酶)、木质素酶或各种小分子的破坏生物质的代谢物。这些酶可为协同作用来降解生物质的晶体纤维素或木质素部分的酶的复合物。纤维素分解酶的实例包括：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶以及纤维二糖酶(β-葡糖苷酶)。

如图1所示，例如，在糖化期间，纤维素底物(A)由内切葡聚糖酶(i)在随机位置初始水解，以产生低聚中间体(例如，纤维素)(B)。这些中间体随后为外切葡聚糖酶(ii)(如纤维二糖水解酶)的底物，以从纤维素聚合物的末端产生纤维二糖。纤维二糖是水溶性的1,4-连接的葡萄糖二聚体。最后纤维二糖酶(iii)裂解纤维二糖(C)以得到葡萄糖(D)。因此，内切葡聚糖酶特别有效于攻击纤维素的晶体部分以及增加外切纤维素酶的效力以产生纤维二糖，这随后需要纤维二糖的特异性来产生葡萄糖。因此，明显的是，取决于纤维素底物的性质和结构，可能需要改变三种不同酶的量和类型。

在本文所述的方法中产生和使用的酶可由真菌，例如由真菌里氏木霉的一种或多种菌株产生。在优选实施方式中，使用里氏木霉的高产率纤维素酶突变体，例如RUT-NG14、PC3-7、QM9414和/或RUT-C30。

优选在将糖化的原料的一部分的存在下进行酶产生，从而产生适合于特定原料的纤维素酶复合物。可在所述用途之前例如使用一种或多种本文所述的减小不顺应性的方法处理原料以减小其不顺应性，以便使原料中的纤维素可更易于为真菌所利用。

在一个优选实施方案中，可通过电子轰击处理诱导酶的生物质。可以例如通过具有小于约1毫拉德、小于约2毫拉德、小于约5、约10、约20、约50、约100或约150毫拉德的总剂量的电子轰击处理生物质。优选地，使用约0.1毫拉德至约150毫拉德、约1毫拉德至约100毫拉德、优选约2毫拉德至约50毫拉德或约5毫拉德至约40毫拉德的总剂量处理诱导酶的生物质。

如以下将进一步讨论的，一旦酶已经产生，则将其用于糖化未用于产生酶的其余原料。用于将原料转化为所希望的产物或中间体的方法通常包括除此糖化步骤之外的其它步骤。

例如，参考图2，用于制造醇的方法可包括：例如任选机械处理原料(例如)以减小其尺寸(200)，在此处理之前和/或之后任选用另一种物理处理对原料进行处理以进一步减小其不顺应性(210)，随后使用酶复合物使原料糖化以形成糖溶液(220)。任选地，所述方法还可包括例如通过管道、轨道车、卡车或驳船将溶液(或如果在途中进行糖化的话，为原料、酶和水)运输到制造工厂中(230)。在一些情况下，对糖化的原料进行进一步生物加工(例如，发酵)以产生所希望的产物，例如醇(240)。在一些实施方式中，此所得产物可例如通过蒸馏(250)进行进一步加工以产生最终产物。减小原料不顺应性的一种方法是通过原料的电子轰击。如果需要，可在所述方法的各个阶段进行测量原料的木质素含量(201)以及基于此测量设定或调节工艺参数(205)的步骤，如在2010年8月12日公布的Medoff和Masterman的美国专利申请公布2010/0203495A1中所描述，所述公布的完整公开内容以引用的方式并入本文。使原料糖化(220)也可通过将原料与介质和酶混合(221)来改进。

现在将首先描述酶复合物的制造，随后参考图2描述以上所讨论的方法步骤以及所述方法中使用的材料。

测试了多种不同条件，结果如下。在一个实施方案中，酶诱导生物质是玉米穗轴。在此实施方案中，通过具有35毫拉德电子束的电子轰击来处理生物质。优选地，将生物质粉碎成10-1400um、更优选小于200um、最优选小于50um的粒度。将处理的生物质(呈湿润抑或干燥形式)添加到总量为约25g/L至约133g/L的接种介质中，更优选为100g/L。可在接种后直到第三天的微生物生长的任一点添加诱导物生物质，但优选在接种后1至3天添加。待作为诱导物添加的生物质的总量可一次性全部添加或者以等份添加，例如以两份或五份。优选地，玉米穗轴一次性全部添加。

酶诱导生物质可作为固体或浆液提供给微生物。优选地，将其作为浆液添加。

酶产生

产生纤维素酶的丝状真菌或细菌通常需要碳源和用于产生纤维素酶的诱导剂。在不受任何理论限制的情况下，认为本公开的酶特别适用于用来诱导其产生的底物的糖化。

木质纤维素材料包括纤维素、半纤维素和木质素的不同组合。纤维素是形成相当坚硬的线性结构而没有大量卷绕的葡萄糖的线性聚合物。由于这个结构以及可形成氢键的羟基的布置，纤维素含有晶体和非晶体部分。晶体部分还可具有不同类型，例如取决于链之间的氢键的位置标注为I(α)和I(β)。聚合物长度本身可发生改变从而导致纤维素形式的更多种类。半纤维素是若干杂聚物中的任一种，如木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿糖基木聚糖以及木糖葡聚糖。存在的主要糖单体是木糖，但是也存在其他单体，如甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖以及葡萄糖。通常，半纤维素形成具有低于纤维素的分子量的分支结构。因此，半纤维素是通常易于进行酶促水解的无定形材料。木质素通常为复合的高分子量杂聚物。尽管所有木质素显示出其组成的不同，但是已将其描述为苯基丙烯单元的无定形枝状网络聚合物。特定生物材料中纤维素、半纤维素和木质素的量取决于生物材料的来源。例如，源自木材的生物材料取决于类型可为约38％-49％纤维素、7％-26％半纤维素和23％-34％木质素。草通常为33％-38％纤维素、24％-32％半纤维素以及17％-22％木质素。显然，木质纤维素生物质构成一大类底物。

生物质材料的多样性可通过预处理，例如通过改变聚合物的结晶度和分子量进一步增加。

产生纤维素酶的有机体当与生物质接触时将倾向于产生释放有利于有机体的生长的分子(如葡萄糖)的酶。这通过如上所述的酶诱导的现象来实现。由于在具体生物材料中存在多种底物，所以存在多种纤维素酶，例如先前所讨论的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶以及纤维二糖酶。通过选择特定木质纤维素材料作为诱导剂，可以调节这些酶的相对浓度和/或活性，以使得所得酶复合物将有效作用于用作诱导剂的木质纤维素材料或类似材料。例如，与具有很少晶体纤维素的生物材料相比，具有较高部分的晶体纤维素的生物材料可诱导更有效或更大量的内切葡聚糖酶。

因此，可存在用于纤维素酶的最佳形成和使用的许多方法。这些方法的详细信息将参考附图进行描述。

例如，参考图3，任选对第一生物质进行预处理(300)，例如以减小其不顺应性，并且随后将其与水性介质和产生纤维素酶的有机体混合(310)。在已过去足够细胞生长至所希望阶段的时间并且已产生足够的酶之后，添加第二生物质(320)。酶对第二生物质以及任何剩余的第一生物质的作用产生糖的混合物，可将所述混合物进一步加工成有用的产物(例如，醇、纯糖)(330)。第一生物质和第二生物质可为相同生物质来源材料的部分。例如，可将生物质的一部分与产生纤维素酶的有机体组合，并且随后一旦已产生一些酶则在稍后阶段(A)添加另一部分。任选地，对第一生物质和第二生物质均进行预处理以减小不顺应性。以下将讨论水性介质。

现参考图4，可将产生纤维素酶的有机体(400)在生长介质中生长一段时间，以达到特定的生长阶段。例如，此生长期可延长超过若干天或甚至若干周的时间。随后可将预处理的第一生物质(405)与产生酶的细胞(410)接触(A)，以使在一段时间之后产生酶。酶的产生也可发生在延长的时间段内。随后将含有酶的溶液与第二生物质(420)组合。酶对第二生物质和剩余的第一生物质的作用产生可进一步加工成有用产物(430)的混合糖。第一生物质和第二生物质可为相同生物质的部分，或者可为相似但不同的(例如，预处理或未预处理的)材料(B)。

除图4中以上讨论的方法之外，产生纤维素酶的有机体(400)可任选在与第一预处理的生物质(410)组合之前收获。收获可包括部分或几乎完全除去溶剂和生长介质组分。例如，可通过离心收集细胞并随后用水或另一种溶液进行洗涤。

在另一个实施方案中，在产生一种或多种酶(410)之后，可将其浓缩(例如，在图4的步骤410与420之间)。浓缩可通过任何有用的方法进行，所述有用的方法包括色谱法、离心、过滤、渗析、提取、溶剂蒸发、喷雾干燥以及吸附到固体载体上。可将浓缩的酶储存一段时间，并且随后可通过添加第二生物质(420)并产生有用的产物(430)来使用。

在以上所述的方法中使用的水性介质可含有添加的酵母提取物、玉米浆、蛋白胨、氨基酸、铵盐、磷酸盐、钾盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐、锌盐以及钴盐。除这些组分之外，生长介质通常含有0％至10％葡萄糖(例如，1％至5％葡萄糖)作为碳源。另外，诱导剂介质可含有除先前讨论的生物质之外的其它诱导剂。例如，一些已知的诱导剂为乳糖、纯纤维素和槐糖。在加工期间可添加和去除多种组分以优化所希望的有用产物的产生。

通常用于诱导酶产生的生物质的浓度大于或等于0.1wt.％并且小于或等于50wt.％、大于或等于0.5wt.％并且小于或等于25wt.％、大于或等于1wt.％并且小于或等于15wt.％、以及大于或等于1wt.％并且小于或等于10wt.％。

以上所述的方法中的任一种可作为分批方法、分批补料方法或连续方法进行。所述方法特别适用于例如具有至少50升、优选至少100升、更优选至少500升、甚至更优选至少1,000升、具体来说至少5,000升、100,000升或500,000升的培养基的工业规模生产。所述方法可在有氧或无氧情况下进行。一些酶通过深层培养产生并且一些通过表面培养产生。

在以上所述的任何方法中，可制造并储存酶并且随后在稍后日期和/或不同位置处将其用于糖化。

以上所述的任何方法可在搅拌下进行。在一些情况下，可使用射流混合进行搅拌，如在2010年11月25日公布的Medoff和Masterman的美国专利申请公布2010/0297705A1、在2012年4月19日公布的Medoff和Masterman的美国专利申请公布2012/0091035A1，以及在2012年4月26日公布的Medoff和Masterman的美国专利申请公布2012/0100572A1中所描述，所述公布的全部公开内容以引用的方式并入本文。

选择产生酶的有机体的生长温度以提高有机体生长。例如，对于里氏木霉，最佳温度通常在20℃与40℃之间(例如，30℃)，针对所述方法中的那个部分对用于酶产生温度进行优化。例如，对于里氏木霉，用于酶产生的最佳温度在20℃与40℃之间(例如，27℃)。

原料、生物质材料和/或诱导剂

也可为用于酶产生的诱导剂的原料优选为木质纤维素材料，但是本文所述的方法也可用于纤维素材料(例如纸、纸制品、纸浆、棉花以及任何这些的混合物)以及其它类型的生物质。本文所述的方法特别适用于木质纤维素材料，因为所述方法特别有效于减小木质纤维素材料的不顺应性和允许所述材料以经济上可行的方式加工成产物和中间体。

如本文使用的术语“生物质材料”包括木质纤维素、纤维素、淀粉以及微生物材料。

优选地，诱导酶的生物质材料为农业废弃物，如玉米穗轴、更优选为玉米秸秆。最优选地，诱导酶的生物质材料包括草。

木质纤维素材料包括但不限于木材、刨花板、林业废弃物(例如，锯末、杨木、木屑)、草(例如，柳枝稷、芒草、绳草、草芦)、谷物残渣(例如，稻壳、燕麦壳、小麦壳、大麦壳)、农业废弃物(例如，青贮饲料、油菜秸、小麦秸、大麦秸、燕麦秸、稻秸、黄麻、大麻、亚麻、竹子、剑麻、蕉麻、玉米穗轴、玉米秸秆、大豆秸秆、玉米纤维、苜蓿、干草、椰子毛)、糖加工残渣(例如，甘蔗渣、甜菜浆、龙舌兰渣)、海藻、海草、粪肥、污物、以及任何这些的混合物。

在一些情况下，木质纤维素材料包括玉米穗轴。磨碎或锤磨粉碎的玉米穗轴可以相对均匀厚度的层进行铺展以用于照射，并且在照射之后易于分散在介质中以进行进一步加工。为了促进收获和收集，在一些情况下，使用整个玉米植株，包括玉米秸秆、玉米粒，并且在一些情况下甚至包括所述植株的根系统。

有利地，在玉米穗轴或含有显著大量玉米穗轴的纤维素或木质纤维素材料的发酵期间不需要另外的营养物(除了氮源，例如尿素或氨之外)。

玉米穗轴在粉碎之前和之后也更易于输送和分散，并且与如干草和草的其它纤维素或木质纤维素材料相比，具有较小的在空气中形成爆炸混合物的倾向。

纤维素材料包括例如纸、纸制品、废纸、纸浆、有色纸、装料纸、涂布纸、填充纸、杂志、印刷品(例如，书、目录、手册、标签、日历、贺卡、小册子、内容说明书、新闻用纸)、打印纸、多涂层纸、卡片材料、卡纸板、纸板、具有高α-纤维素含量的材料(如棉花)，以及任何这些的混合物。例如，如美国申请号13/396,365(在2012年2月14日由Medoff等提交的“Magazine Feedstocks”)中所述的纸制品，所述申请的全部公开内容以引用的方式并入本文。

纤维素材料还可包括已脱木质化的木质纤维素材料。

淀粉材料包括淀粉本身(例如玉米淀粉、小麦淀粉、马铃薯淀粉或米淀粉)、淀粉衍生物或者包括淀粉的材料(如可食用的食物产品或农作物)。例如，淀粉材料可以是秘鲁胡萝卜、荞麦、香蕉、大麦、木薯、葛藤、圆齿酢酱草、西米、高粱、普通家用马铃薯、甜薯、芋头、山药，或一种或多种豆类，如蚕豆、扁豆或豌豆。任何两种或更多种淀粉材料的共混物也是淀粉材料。还可使用淀粉、纤维素和或木质纤维素材料的混合物。例如，生物质可以是整个植株、植株的一部分或植株的不同部分，例如，小麦植株、棉花植株、玉米植株、水稻植株或树。可通过本文所述的任何方法处理淀粉材料。

微生物材料包括但不限于含有或能够提供碳水化合物(例如，纤维素)源的任何天然存在或基因修饰的微生物或有机体，例如原生生物，例如动物原生生物(例如，原生动物，如鞭毛虫、变形虫、纤毛虫和孢子虫)和植物原生生物(例如，海藻，如alveolates、chlorarachniophytes、隐藻、裸藻、灰藻、定鞭藻、红藻、不等鞭毛藻、以及绿色植界(viridaeplantae))。其它实例包括海草、浮游生物(例如，大型浮游生物、中型浮游生物、小型浮游生物、微型浮游生物、超微型浮游生物以及超微微型浮游生物)、浮游植物、细菌(例如，革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌以及极端微生物)、酵母和/或这些的混合物。在一些情况下，微生物生物质可从天然来源获得，例如海洋、湖泊、水体(例如，咸水或淡水)或在陆地上。或者或另外，微生物生物质可从培养系统获得，例如大规模干燥与湿润培养和发酵系统。

生物质材料还可包括下水和类似来源的材料。

在其它实施方案中，如纤维素、淀粉和木质纤维素原料材料的生物质材料可从已相对于野生型品种修饰的转基因微生物和植物获得。所述修饰可例如通过选择和育种的迭代步骤来在植物中获得所希望的性状。此外，所述植物相对于野生型品种可已被去除、修饰、沉默和/或添加遗传材料。例如，遗传修饰的植物可通过重组DNA方法产生，其中遗传修饰包括引入或修饰来自亲本品种的特定基因；或者例如通过使用转基因育种来产生，其中将一个或多个特定基因从不同品种的植物和/或细菌中引入到植物中。形成遗传变异的另一种方式是通过突变育种，其中新的等位基因由内源基因人工形成。人工基因可通过多种方式形成，所述方式包括用例如化学诱变剂(例如，使用烷化剂、环氧化物、生物碱、过氧化物、甲醛)、照射(例如，X-射线、γ射线、中子、β粒子、α粒子、质子、氘核、UV辐射)以及温度冲击或其它外部应力处理植株或种子，以及随后的选择技术。提供修饰的基因的其它方法是通过易错PCR和DNA改组，随后将所希望的修饰的DNA插入到所希望的植株或种子中。在种子或植株中引入所希望的遗传变异的方法包括例如细菌载体的使用、基因枪、磷酸钙沉淀法、电穿孔、基因剪接、基因沉默、脂转染、微量注射以及病毒载体。另外的遗传修饰的材料已在2012年2月14日提交的美国申请序列号13/396,369中描述，所述申请的全部公开内容以引用的方式并入本文。

可使用本文所述的任何生物质材料的混合物实践本文所述的任何方法。

生物质-机械制备

原料的机械处理可包括例如切割、碾磨(例如，锤磨)、湿磨、研磨、冲压、剪切或斩切。在一些实施方式中，初始机械处理步骤可包括减小原料的尺寸。在一些情况下，通过切割、剪切和/或切剁来初始制备疏松原料(例如，再循环的纸或柳枝稷)。

除了此尺寸缩减(可在加工期间初期和/或后期进行)之外，机械处理还可有利地“打开”、“压紧”、破坏或破碎原料材料，从而使材料的纤维素在结构改性处理期间更易于断链和/或晶体结构破裂。

机械处理原料的方法包括例如碾磨或研磨。可使用例如锤磨机、球磨机、胶体磨、圆锥或锥形磨、盘磨机、轮碾机、威利磨(Wiley mill)或谷物碾磨机进行碾磨。可使用例如切割/冲击型研磨机进行研磨。研磨机的特定实例包括石料研磨机、销棒研磨机、咖啡研磨机以及磨盘式研磨机。研磨或碾磨可以例如通过使销棒或其它元件往复移动来提供，在销棒碾磨机中就是这样。其它机械处理方法包括机械撕破或撕裂、对纤维施加压力的其它方法以及空气摩擦碾磨。合适的机械处理进一步包括继续进行由先前的加工步骤引发的材料内部结构破裂的任何其它技术。

可使用的机械处理和机械处理的原料的特征进一步详细描述于2011年10月18日提交并在2012年4月26日公布为美国专利申请公布2012/0100577A1的美国序列号13/276,192中，所述公布的全部公开内容以引用的方式由此并入本文。

生物质处理-电子轰击

在一些情况下，可用电子轰击处理原料以改性其结构并且从而减小其不顺应性。所述处理可例如减小原料的平均分子量、改变原料的晶体结构，和/或增加原料的表面面积和/或孔隙率。

通常优选经由电子束的电子轰击，因为其提供非常高的流通量并且因为相对低电压/高功率电子束装置的使用消除了对昂贵的混凝土穹顶屏蔽物的需要，因为所述装置是“自屏蔽的”并且提供安全有效的方法。虽然“自屏蔽的”装置确实包括屏蔽物(例如，金属板屏蔽物)，但是其不需要构建混凝土穹顶，这大大减少了资本支出并且常常允许使用现有制造设施而无需昂贵的修改。电子束加速器可从例如IBA(Ion Beam Applications,Louvain-la-Neuve,比利时)、Titan Corporation(San Diego,加州,USA)以及NHV Corporation(Nippon High Voltage,日本)购得。

可使用电子束装置进行电子轰击，所述电子束装置具有小于10MeV，例如小于7MeV、小于5MeV或小于2MeV，例如约0.5MeV至1.5MeV、约0.8MeV至1.8MeV、约0.7MeV至1MeV或约1MeV至约3MeV的标称能量。在一些实施方式中，标称能量为约500keV至800keV。

电子束可具有相对高的总束功率(所有加速头的组合束功率，或者如果使用多个加速器，则为所有加速器和所有头的组合束功率)，例如，至少25kW，例如至少30、40、50、60、65、70、80、100、125或150kW。在一些情况下，功率甚至高达500kW、750kW或甚至1000kW或更大。在一些情况下，电子束具有1200kW或更大的束功率。

这种高的总束功率通常通过利用多个加速头来实现。例如，电子束装置可包括两个、四个或更多个加速头。各自具有相对低的束功率的多个头的使用防止材料中的温度过度上升，从而防止材料燃烧并且还增加贯穿材料层厚度的剂量均匀性。

在一些实施方式中，希望在电子轰击期间冷却材料。例如，可在例如通过螺杆挤出机或其它输送设备输送材料时冷却所述材料。

为了减少不顺应性减小过程中所需要的能量，希望尽可能快地处理材料。一般来说，优选以大于约0.25毫拉德(Mrad)/秒，例如大于约0.5、0.75、1、1.5、2、5、7、10、12、15或甚至大于约20毫拉德/秒，例如约0.25至2毫拉德/秒的剂量速率进行处理。更高剂量速率通常需要更高线速度，以避免材料的热分解。在一个实施方式中，对于约20mm的样品厚度(例如，具有0.5g/cm³的堆积密度的粉碎的玉米穗轴材料)，将加速器设定为3MeV、50mAmp射束电流并且线速度为24英尺/分钟。

在一些实施方案中，进行电子轰击直到材料接收至少0.5毫拉德，例如至少5、10、20、30或至少40毫拉德的总剂量。在一些实施方案中，进行处理直到材料接收约0.5毫拉德至约150毫拉德、约1毫拉德至约100毫拉德、约2毫拉德至约75毫拉德、10毫拉德至约50毫拉德，例如约5毫拉德至约50毫拉德、约20毫拉德至约40毫拉德、约10毫拉德至约35毫拉德、或约25毫拉德至约30毫拉德的剂量。在一些实施方式中，优选25毫拉德至35毫拉德的总剂量，其(例如)以5毫拉德/道次(Mrad/pass)在几秒内理想地施加，其中每道次施加约一秒。在一些情况下施加大于7至8毫拉德/道次的剂量可引起原料材料的热降解。

使用如上所讨论的多个头，可以在多道次，例如由几秒钟的冷却间隔开的10至20毫拉德/道次(例如12至18毫拉德/道次)下的两道次，或者7至12毫拉德/道次(例如9至11毫拉德/道次)的三道次处理材料。如以上所讨论，用若干相对低的剂量而不是一个高剂量处理材料倾向于防止材料过热并且还增加贯穿材料厚度的剂量均匀性。在一些实施方式中，在每道次期间或之后搅拌或以其它方式混合材料，并且随后在下一个道次之前再次将其平滑成均匀层，以进一步增强处理均匀性。

在一些实施方案中，将电子加速至例如大于光速的75％，例如大于光速的85％、90％、95％或99％的速度。

在一些实施方案中，本文所述的任何加工发生在获得时就保持干燥或者已例如使用加热和/或减压进行干燥的木质纤维素材料上。例如，在一些实施方案中，在25℃和50％相对湿度下测量，纤维素和/或木质纤维素材料具有小于约5重量％的残留水。

可在纤维素和/或木质纤维素材料暴露于空气、富氧空气或甚至氧气本身或者由如氮气、氩气或氦气的惰性气体覆盖时施加电子轰击。当希望最大化氧化时，利用氧化环境(如空气或氧气)，并且优化与束源的距离以使反应性气体(例如臭氧和/或氮的氧化物)形成最大化。

生物质处理-超声处理、热解、氧化、蒸汽爆炸

如果需要，除电子轰击之外或代替电子轰击，可使用一种或多种超声处理、热解、氧化或蒸汽爆炸方法，以减小原料的不顺应性。这些方法在Medoff的美国专利号7,932,065中详细描述，所述专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。

处理的生物质材料的用途

可使用生物质材料(例如，植物生物质、动物生物质、纸以及城市废物生物质)作为原料来生产有用的中间体和产品，如有机酸、有机酸的盐、酸酐、有机酸的酯以及燃料，例如用于内燃机的燃料或用于燃料电池的原料。本文描述了可使用纤维素和/或木质纤维素材料作为原料的系统和方法，所述纤维素和/或木质纤维素材料容易获得但可能常常难以加工，例如城市废物流和废纸流，如包括报纸、牛皮纸、瓦楞纸或这些的混合物的流。

为了将原料转化成可易于加工的形式，可通过糖化剂(例如酶或酸)将原料中含有葡聚糖或木聚糖的纤维素水解为低分子量碳水化合物，如糖，这个过程称为糖化。随后，低分子量碳水化合物可用于例如现有制造工厂，如单细胞蛋白质工厂、酶制造工厂或燃料工厂(例如，乙醇制造设施)。

例如通过使材料和酶在溶剂(例如，水溶液)中组合，可以使用酶水解原料。可根据本文所述的方法制备/诱导所述酶。

确切地说，可通过有机体供应酶，所述有机体能够分解生物质(如生物质的纤维素和/或木质素部分)，或者含有或制造各种纤维素分解酶(纤维素酶)、木质素酶或各种小分子生物质降解代谢物。这些酶可为协同作用来降解生物质的晶体纤维素或木质素部分的酶的复合物。纤维素分解酶的实例包括：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶以及纤维二糖酶(β-葡糖苷酶)。

在糖化期间，可通过内切葡聚糖酶在随机位置初步水解纤维素底物产生低聚中间体。这些中间体随后为外切葡聚糖酶如纤维二糖水解酶的底物，以从纤维素聚合物的末端产生纤维二糖。纤维二糖是水溶性的1,4-连接的葡萄糖二聚体。最后，纤维二糖酶裂解纤维二糖以得到葡萄糖。此过程的效率(例如，水解的时间和/或水解的完成度)取决于纤维素材料的不顺应性。

中间体和产品

使用本文所述的方法，可将生物质材料转化为一种或多种产品，如能量、燃料、食品以及材料。产品的特定实例包括但不限于：氢气、糖(例如，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、果糖、二糖、寡糖以及多糖)、醇(例如，一元醇或二元醇，如乙醇、正丙醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇或正丁醇)、水合醇或含水醇(例如，含有大于10％、20％、30％或甚至大于40％的水)、生物柴油、有机酸、烃(例如，甲烷、乙烷、丙烷、异丁烯、戊烷、正己烷、生物柴油、生物汽油以及其混合物)、副产品(例如，蛋白质，如纤维素分解蛋白(酶)或单细胞蛋白质)、以及处于任何组合或相对浓度的这些物质中的任何物质的混合物，并且所述任何物质任选与任何添加剂(例如，燃料添加剂)组合。其它实例包括羧酸、羧酸的盐、羧酸与羧酸的盐的混合物以及羧酸的酯(例如，甲基、乙基以及正丙基酯)、酮(例如，丙酮)、醛(例如，乙醛)、α和β不饱和酸(例如，丙烯酸)以及烯烃(例如，乙烯)。其它醇和醇衍生物包括：丙醇、丙二醇、1,4-丁二醇、1,3-丙二醇、糖醇以及多元醇(例如，乙二醇、甘油、赤藓醇、苏糖醇、阿糖醇、木糖醇、核糖醇、甘露醇、山梨醇、半乳糖醇、艾杜醇、肌醇、庚七醇、异麦芽酮糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、麦芽三糖醇、麦芽四糖醇以及聚糖醇和其它多元醇)以及任何这些醇的甲基或乙基酯。其它产品包括丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、乳酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、戊酸、己酸、3-羟基丙酸、棕榈酸、硬脂酸、草酸、丙二酸、戊二酸、油酸、亚油酸、羟乙酸、γ-羟基丁酸以及其混合物、任何这些酸的盐、任何所述酸及其对应盐的混合物。

以上产品与彼此的任何组合和/或以上产品与其它产品(所述其它产品可通过本文所述的方法或以其它方式制备)的任何组合可包装在一起并且作为产品出售。可将产品组合，例如混合、共混或共溶解，或者可简单地包装在一起或一起出售。

本文所述的任何产品或产品的组合可在产品出售之前，例如纯化或分离之后或甚至在包装之后进行消毒或灭菌，以中和可能存在于一种或多种产品中的一种或多种潜在不希望的污染物。可以用例如小于约20毫拉德，例如从约0.1毫拉德至15毫拉德、从约0.5毫拉德至7毫拉德或从约1毫拉德至3毫拉德剂量的电子轰击进行所述消毒。

本文所述的方法可产生适用于产生用于工厂的其它部分(热电联产)或在公开市场上出售的蒸汽和电力的各种副产品流。例如，由燃烧副产品流产生的蒸汽可用于蒸馏过程。作为另一个实例，由燃烧副产品流产生的电力可用于为预处理中使用的电子束发生器提供动力。

用于产生蒸汽和电力的副产品来源于整个过程的众多来源。例如，废水的厌氧消化可产生甲烷含量高的沼气和少量废弃生物质(污泥)。作为另一个实例，可使用糖化后和/或蒸馏后固体(例如，从预处理和主要过程剩余的未转化的木质素、纤维素和半纤维素)，例如作为燃料燃烧。

获得的许多产品(如乙醇或正丁醇)可用作燃料，用于为汽车、卡车、拖拉机、船或火车提供动力，例如作为内部燃烧燃料或作为燃料电池原料。获得的许多产品还可用于为飞行器(如，例如具有喷气发动机的飞机，或直升机)提供动力。此外，本文所述的产物可以例如在常规蒸汽发电厂或燃料电池工厂中用于电能产生。

包括食品和药物产品的其它中间体和产品描述于Medoff的2010年5月20日公布的美国专利申请公布2010/0124583A1，所述公布的全部公开内容以引用的方式由此并入。

糖化

通常通过将材料和酶在流体介质(例如，水溶液)中组合来使用以上所讨论的酶处理不顺应性减小的原料。在一些情况下，在糖化之前在热水中对原料进行煮沸、浸泡或蒸煮，如在2012年4月26日公布的Medoff和Masterman的美国专利申请公布2012/0100577A1中所描述，所述公布的全部内容并入本文。

糖化过程可在制造工厂的罐(例如，具有至少4000、40,000或500,000L的体积的罐)中部分或完全地进行，和/或可在转运中，例如在轨道车、油罐卡车中、或在超级油轮或船仓中部分或完全地进行。完全糖化所需要的时间将取决于工艺条件和所使用的生物质材料和酶。如果在受控的条件下在制造工厂中进行糖化，则可在约12-96小时内将纤维素基本上完全转化为糖，例如葡萄糖。如果在转运中部分或完全地进行糖化，则糖化可能花费较长时间。

通常优选在糖化期间例如使用喷射混合对罐内容物进行混合，如在2010年5月18日提交的国际申请号PCT/US2010/035331中所描述，所述申请以英语公布为WO 2010/135380并且指定美国，所述申请的全部公开内容以引用的方式并入本文。

表面活性剂的添加可提高糖化的速率。表面活性剂的实例包括非离子型表面活性剂(如20或80聚乙二醇表面活性剂)、离子型表面活性剂或者两性表面活性剂。

通常优选由糖化得到的糖溶液的浓度相对较高，例如，大于40重量％，或大于50重量％、60重量％、70重量％、80重量％、90重量％或甚至大于95重量％。可以例如通过蒸发去除水分以增加糖溶液的浓度。这减小了待装运的体积并且还抑制了溶液中的微生物生长。

可选地，可使用较低浓度的糖溶液，在这种情况下，可能希望以低浓度(例如，50ppm至150ppm)添加抗微生物添加剂，例如广谱抗生素。其它合适的抗生素包括两性霉素B、氨苄青霉素、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、潮霉素B、卡那霉素、新霉素、青霉素、嘌呤霉素、链霉素。抗生素将在运输和储存期间抑制微生物的生长，并且可以适当的浓度(例如，以重量计在15ppm与1000ppm之间，例如，在25ppm与500ppm之间，或在50ppm与150ppm之间)使用。如果希望，则即使糖浓度相对较高也可包括抗生素。可选地，可使用具有抗微生物防腐特性的其它添加剂。优选的，一种或多种抗微生物添加剂是食品级的。

可以通过限制与酶一起添加到生物质材料中的水量来获得相对较高浓度的溶液。可以例如通过控制糖化发生多少来控制浓度。例如，可以通过向溶液中添加更多生物质材料来增加浓度。为了保持正在溶液中产生的糖，可以添加表面活性剂，例如，以上所讨论的那些中的一种。也可以通过增加溶液的温度来增加溶解度。例如，可将溶液维持在40℃-50℃、60℃-80℃或甚至更高的温度下。

糖化剂

合适的纤维素分解酶包括来自以下属中的种的纤维素酶：芽孢杆菌属、鬼伞属、毁丝霉属、头孢霉属、柱顶孢霉属、青霉属、曲霉属、假单孢菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳属、枝顶孢属、金孢子菌属以及木霉属；特别是由选自以下种的菌株产生的那些纤维素酶：曲霉属(参见，例如，欧洲公布号0 458 162)、特异腐质霉(Humicolainsolens)(被重新分类为嗜热柱顶孢霉(Scytalidium thermophilum)，参见例如美国专利号4,435,307)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)、枝顶孢属某种(Acremonium sp.)(包括但不限于桃色枝顶孢(A.persicinum)、A.acremonium、A.brachypenium、A.dichromosporum、A.obclavatum、A.pinkertoniae、粉灰枝顶孢(A.roseogriseum)、A.incoloratum以及棕色枝顶孢(A.furatum))。优选菌株包括特异腐质霉DSM 1800、尖孢镰刀菌DSM 2672、嗜热毁丝霉CBS 117.65、头孢霉属某种RYM-202、枝顶孢菌属某种CBS 478.94、枝顶孢菌属某种CBS 265.95、桃色枝顶孢CBS 169.65、Acremonium acremonium AHU9519、头孢霉属某种CBS 535.71、Acremonium brachypenium CBS866.73、A.dichromosporum CBS 683.73、Acremonium obclavatum CBS311.74、Acremonium pinkertoniae CBS 157.70、粉灰枝顶孢CBS134.56、Acremonium incoloratum CBS 146.62，以及棕色枝顶孢CBS299.70H。纤维素分解酶还可由金孢子菌属，优选Chrysosporiumlucknowense的菌株获得。可使用的另外的菌株包括但不限于：木霉属(特别是绿色木霉(T.viride)、里氏木霉(T.reesei)以及康宁木霉(T.koningii))、嗜碱性芽孢杆菌(alkalophilic Bacillus)(参见，例如美国专利号3,844,890和欧洲公布号0 458 162)以及链霉菌属(参见，例如欧洲公布号0 458 162)。

可用于使生物质材料糖化并且产生糖的许多微生物也可用于使那些糖发酵并且转化为有用的产物。

糖

在本文所述的方法中，例如在糖化之后，可对糖(例如，葡萄糖和木糖)进行分离。例如，可以通过沉淀法、结晶法、色谱法(例如，模拟的移动床色谱法、高压色谱法)、离心法、萃取法、本领域已知的任何其它分离方法以及其组合来对糖进行分离。

氢化和其它化学转变

本文所述的方法可包括氢化。例如，葡萄糖和木糖可分别氢化为山梨醇和木糖醇。可以通过在高压(例如，10psi至12000psi)下与H₂组合使用催化剂(例如，Pt/γ-Al₂O₃、Ru/C、雷尼镍或本领域已知的其它催化剂)来实现氢化。可以使用来自本文所述方法的产物的其它类型的化学转变，例如有机糖衍生的产物(例如，糠醛和糠醛衍生的产物)的产生。糖衍生的产物的化学转变描述于2012年7月3日提交的美国临时申请号61/667,481中，所述申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。

发酵

可将通过糖化产生的糖作为最终产物分离或者可对其进行发酵以产生其它产物，例如醇、糖醇(如赤藓醇)或有机酸(例如乳酸、谷氨酸或柠檬酸或氨基酸)。

酵母和发酵单胞菌属(Zymomonas)细菌，例如，可用于将一种或多种糖发酵或转化成一种或多种醇。其它微生物在下文进行讨论。用于发酵的最佳pH为约pH4至pH7。例如，酵母的最佳pH为约pH4至pH5，而发酵单胞菌的最佳pH为约pH5至pH6。典型的发酵时间为约24小时至168小时(例如，24小时至96小时)，其中温度范围为20℃至40℃(例如，26℃至40℃)，然而嗜热微生物偏好较高的温度。

在一些实施方案中，例如当使用厌氧有机体时，至少一部分发酵是在缺乏氧气，例如在惰性气体(如N₂、Ar、He、CO₂或其混合物)的覆盖下进行的。另外，所述混合物可在部分或全部发酵期间使惰性气体的持续吹扫流动通过罐。在一些情况下，可以通过发酵期间的二氧化碳产生来实现或维持厌氧条件而不需要额外的惰性气体。

在一些实施方案中，可在低分子量糖完全转化成产物(例如，乙醇)之前中断全部或部分发酵过程。中间发酵产物包括高浓度的糖和碳水化合物。糖和碳水化合物可经由本领域已知的任何手段进行分离。这些中间发酵产物可用于制备用于人或动物消耗的食品。另外或者可选地，可以在不锈钢实验室磨中将中间发酵产物磨碎成细小颗粒大小，以产生面粉状物质。

可在发酵期间使用喷射混合，并且在一些情况下，可在同一个罐中进行糖化和发酵。

可以在糖化和/或发酵期间添加微生物的营养物，例如，在2011年7月15日提交的美国专利申请公布2012/0052536中所述的基于食物的营养物包，所述公布的完整公开内容以引用的方式并入本文。

“发酵”包括在2012年12月22日提交的美国临时申请号61/579,559和2012年12月22日提交的美国临时申请号61/579,576中所公开的方法和产物，所述申请的内容均以引用的方式整体并入本文。

可以利用移动发酵罐，如在国际申请号PCT/US2007/074028(所述申请在2007年7月20日提交，以英语公布为WO 2008/011598并且指定美国)中所描述，所述申请的内容以引用的方式整体并入本文。类似地，糖化设备可为移动的。此外，糖化和/或发酵可在转运期间部分或完全地进行。

发酵剂

在发酵中使用的一种或多种微生物可以是天然存在的微生物和/或工程改造的微生物。例如，微生物可为细菌(包括但不限于，例如纤维素分解细菌)、真菌(包括但不限于，例如酵母)、植物、原生生物(例如，原生动物或类真菌原生生物(包括但不限于，例如黏菌)或海藻。当有机体相容时，可利用有机体的混合物。

合适的发酵微生物具有将碳水化合物(如葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、寡糖或多糖)转化成发酵产物的能力。发酵微生物包括以下种属的菌株：酵母属某些种(Saccharomyces spp.)(包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)(面包酵母)、糖化酵母(S.distaticus)、葡萄汁酵母(S.uvarum))、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(包括但不限于马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis))、假丝酵母属(Candida)(包括但不限于伪热带假丝酵母(C.pseudotropicalis)和芸薹假丝酵母(C.brassicae))、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)(休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)的亲缘菌)、棒孢酵母属(Clavispora)(包括但不限于葡萄牙棒孢酵母(C.lusitaniae)和仙人掌棒孢酵母(C.opuntiae))、管囊酵母属(Pachysolen)(包括但不限于嗜鞣管囊酵母(P.tannophilus))、酒香酵母属(Bretannomyces)(包括但不限于，例如B.clausenii(Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E.编辑，Taylor & Francis,Washington,DC,179-212中的Philippidis,G.P.,1996,Cellulose bioconversion technology))。其它合适的微生物包括例如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、梭菌属某些种(Clostridium spp.)(包括但不限于热纤维梭菌(C.thermocellum)(Philippidis,1996,同上)、糖丁基丙酮梭菌(C.saccharobutylacetonicum)、糖丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)、略紫色梭菌(C.Puniceum)、拜氏梭菌(C.beijernckii)以及丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum))、丛梗孢酵母(Moniliella pollinis)、Moniliellamegachiliensis、乳杆菌属某些种(Lactobacillus spp.)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、短梗霉属某种(Aureobasidium sp.)、三型孢菌某种(Trichosporonoides sp.)、变异三角酵母(Trigonopsis variabilis)、毛孢子菌属某种(Trichosporon sp.)、丛梗孢酵母属某种(Moniliellaacetoabutans sp.)、Typhula variabilis、木兰假丝酵母(Candidamagnolia)、黑粉菌纲某种(Ustilaginomycetes sp.)、Pseudozymatsukubaensis、接合酵母属(Zygosaccharomyces)的酵母种、德巴利酵母属(Debaryomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)和毕赤酵母属(Pichia)、以及暗丛梗孢形圆酵母属(Torula)的真菌。

例如，梭菌属某些种可用于产生乙醇、丁醇、丁酸、乙酸和丙酮。乳杆菌属某些种可用于产生乳酸。

许多所述微生物菌株可公开商购获得抑或通过储藏所获得，所述储藏所如，例如，ATCC(美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection),Manassas,Virginia,USA)、NRRL(农业研究机构保藏中心(Agricultural Research Sevice Culture Collection),Peoria,Illinois,USA)或DSMZ(德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH),Braunschweig,Germany)。

可商购获得的酵母包括，例如，Red/Lesaffre Ethanol Red(购自Red Star/Lesaffre,USA)、(购自Fleischmann’s Yeast(BurnsPhilip Food Inc.的部门),USA)、(购自Alltech，现在的Lalemand)、GERT(购自Gert Strand AB,Sweden)以及(购自DSM Specialties)。

可用于使生物质材料糖化并且产生糖的许多微生物还可用于使那些糖发酵并且转化成有用的产物。

蒸馏

发酵之后，可使用例如“醪塔”对所得的流体进行蒸馏，以使乙醇和其它醇与大部分水和残余固体分离。流出醪塔的蒸气可以是例如35重量％乙醇并且可进料到精馏塔中。可以使用气相分子筛将来自精馏塔的接近共沸的(92.5％)乙醇与水的混合物纯化为纯(99.5％)乙醇。可将醪塔底部物传送到三级蒸发器的第一级。精馏塔回流冷凝器可为此第一级提供热量。在第一级之后，可以使用离心机分离固体并且在旋转干燥器中干燥。可将离心机流出液的一部分(25％)再循环至发酵，并且将其余部分传送到第二蒸发器级和第三蒸发器级。大部分蒸发器冷凝液可作为相当干净的冷凝液返回到所述过程中，其中分离小部分至废水处理以防止低沸点化合物的堆积。

除了在本文的实施例中或者除非以其它方式明确指出之外，本说明书的以下部分和所附权利要求书中的所有数值范围、量、值以及百分比，如用于材料的量、元素含量、反应的时间和温度、量之比以及其它的那些，可被理解为如同前置有词语“约”，即使术语“约”可能没有连同值、量或范围明确地出现。因此，除非有相反的指示，否则以下说明书和所附权利要求书中所阐述的数值参数为近似值，其可根据本发明要寻求获得的所需性质而变化。在最低限度并且不试图限制对权利要求书范围的等价范围的原则的应用，每个数值参数均应当至少根据报道的有效数字的数值和通过应用普通四舍五入技术来解读。

尽管陈述本发明的宽泛范围的数值范围和参数是近似值，但在特定实施例中所陈述的数值尽可能准确地进行报道。然而，任何数值都固有地含有必然由其以下各自测试量测中存在的标准偏差引起的误差。此外，当在本文阐述数值范围时，这些范围是将所引用范围端点包含在内的(即，可使用端点)。当本文使用以重量计的百分比时，所报道的数值相对于总重量。

同样，应理解，本文所引用的任何数值范围意在包括其中包含的所有子范围。例如，“1至10”的范围意在包括在引用的最小值1与引用的最大值10(含1和10)之间的所有子范围，即具有等于或大于1的最小值以及等于或小于10的最大值。除非另外指明，否则如本文使用的术语“一个/种(one、a或an)”意在包括“至少一个/种”或“一个或多个/一种或多种”。

实施例

材料与方法

在以下实施例中使用以下程序和材料。

细胞库：将以下里氏木霉菌株建库：ATCC 66589，PC3-7；ATCC56765，RUT-C30；ATCC 56767，NG-14；ATCC 26921，QM9414。

在马铃薯右旋糖(PD)培养基中在25℃下使各细胞再水化并增殖。

对于主细胞库的产生，使各菌株在0.5ml无菌水中再水化过夜。为了增殖细胞，将40ul再水化的细胞用于接种马铃薯右旋糖琼脂(PDA)固体培养基。还将再水化的细胞接种到50ml PD液体培养基中并在25℃和200rpm下孵育。在PDA培养基中培养2周之后，将孢子重悬于无菌NaCl(9g/L)的20％甘油溶液中，并在-80℃冷冻箱中储存以用作细胞库。

蛋白质测量与纤维素酶测定：通过Bradford方法使用牛血清白蛋白作为标准来测量蛋白质浓度。

使用IUPAC法进行纤维素酶活性和CMC活性的滤纸测定(FPU)(T.K.Ghose,Pure Appl.Chem.59:257-68,1987)。

在YSI 7100多参数生物分析系统(YSI Life Sciences,YellowSprings,俄亥俄,USA)或HPLC上分析反应产物(葡萄糖)。

培养基：培养基包括玉米浆(2g/L)、硫酸铵(1.4g/L)、氢氧化钾(0.8g/L)、磷酸(85％，4mL/L)、邻苯二甲酸二钾盐(5g/L)、七水合硫酸镁(0.3g/L)、氯化钙(0.3g/L)、七水合硫酸亚铁(5mg/L)、一水合硫酸锰(1.6mg/L)、七水合硫酸锌(5mg/L)以及六水合氯化钴(2mg/L)。所述培养基描述于Herpoel-Gimbert等，Biotechnology for Biofuels,2008,1:18。

生物反应器：使用以上所述的具有2.5％额外葡萄糖的培养基，将来自细胞库的冷冻箱贮备物用于制备菌种培养物(seed culture)。通常在烧瓶中使用设定为30℃和200rpm持续72小时的培养箱来制备菌种培养物。在3L发酵罐中的1L起始培养基中使用菌种培养液(50mL)作为接种物。在生长阶段，将35g/L乳糖添加到培养基中。培养条件如下：27℃，pH4.8(具有6M氨)，空气流量0.5VVM，搅拌为500rpm，并且维持在40％氧饱和度以上的溶解氧(DO)。在诱导阶段中，添加所需诱导剂(以下所讨论的)。在发酵期间，当泡沫到达发酵罐顶时，将Antiform204(Sigma)注入培养基中。

摇瓶：除以上所述培养基之外，对于烧瓶培养，添加Tris缓冲剂(12.1g/L)、马来酸(11.06g/L)以及氢氧化钠(2.08g/L)。在具有添加的葡萄糖的培养基中制备起子培养物。在生长3天之后，通过离心收获细胞团。将细胞团重悬于具有所需诱导剂的50ml培养基中。将烧瓶置于搅拌速度设定为200rpm并且温度设定为30℃的振荡培养箱中。

实施例1.对纸、处理的玉米穗轴和未处理的玉米穗轴的纤维素酶性能测试

将各种诱导剂(处理的生物质(TBM)、未处理的生物质(UBM)、纸(P)以及羧甲基纤维素(CMC,Aldrich))用于产生酶。生物质(TBM和UBM)是在15与40的网孔尺寸之间收集的碾磨的玉米穗轴。处理生物质(UBM)以产生TBM涉及用35毫拉德总剂量的电子束进行电子轰击。将纸切剁并过筛以具有小于0.16英寸的标称粒度。使用摇瓶和PC3-7与RUT-C30菌株进行诱导剂实验。在生长培养3天之后，将收获的细胞团添加到一系列摇瓶中，每个摇瓶含有50ml培养基和1wt.％的诱导剂中的一种。

诱导实验允许进行11天。随后通过在14,500rpm下离心5分钟收获培养物上清液并将其储存在4℃下。

培养物上清液的蛋白质浓度：使用在摇瓶中生长并源自PC3-7的细胞培养物，TBM、UBM、P以及CMC在11天之后的蛋白质浓度分别为1.39mg/mL、1.18mg/mL、1.06mg/mL以及0.26mg/mL。对于RUT-C30，TBM、P、UBM以及CMC的蛋白质浓度分别为1.26mg/mL、1.26mg/mL、1.00mg/mL以及0.26mg/mL。

纤维素酶活性：测定纤维素酶活性并将其列于下表中。

表1.不同诱导剂和细胞菌株的纤维素酶活性。

这些结果显示处理的生物质用于以比未处理的生物质更大的速率诱导酶的产生。

实施例2.不同浓度TBM诱导剂的酶产生

使用生物反应器进行此实施例。在具有2.5％葡萄糖的培养基中使细胞菌株RUT-C30增殖。在生长3天之后，对培养物进行离心并将细胞重悬于具有1wt.％、3wt.％、5wt.％、7wt.％以及9wt.％TBM的50ml培养基中。在27℃和200rpm下孵育11天之后的蛋白质浓度和活性在下表中示出。

表2.用不同量的诱导剂产生的蛋白质和酶的量

这些结果显示当以5％的速率添加处理的生物质(TBM)时产生较高水平的酶。

用酶糖化生物质：使用通过添加2wt.％、5wt.％和7wt.％的处理的生物质诱导剂(TBM)产生的酶相对于商业酶(Duet^TM Accellerase,Genencor)进行生物质(TBM)的糖化。将生物质10wt.％TBM与0.25ml/g酶培养液抑或商业酶组合。在振荡培养箱中在50℃和200rpm下进行糖化。在24小时之后，通过YSI测量所产生的葡萄糖的量。每L溶液和每mg蛋白质产生的葡萄糖的量在下表中示出。

表3.由不同水平的诱导剂产生的葡萄糖的量

实施例3.用处理的生物质产生的酶的SDS-PAGE

使用以上所述的方法制备生物反应器培养物，但是在50rpm而不是500rpm下进行混合。蛋白质测定显示产生了3.4g/L蛋白质。

使用SDS PAGE的蛋白质分析在图5中示出。泳道1和泳道5为分子量标记，泳道2为30uL蛋白质上样，泳道3为40uL蛋白质上样，泳道4为Duet^TM Accelerase酶复合物(Genencor)。

实施例4.测试条件的范围

被描述成以引用方式全文或部分并入本文的任何专利、公布或其它公开材料必须满足以下前提：并入的材料不得与本公开内容中阐述的现有定义、声明或其它公开材料冲突。因此，并且在必要的程度上，如本文所明确阐述的公开取代以引用的方式并入本文的任何冲突的材料。据称以引用的方式并入本文、但与本文所阐述的现有定义、陈述、或其它公开材料相冲突的任何材料或其部分将仅仅是在不会在所并入的材料与现有公开材料之间出现冲突的程度上并入。

虽然本发明已参考其优选实施方案进行特定显示和描述，但是本领域技术人员应了解，可在不脱离由随附权利要求书所涵盖的本发明的范围的情况下在其中在形式和细节方面做出各种改变。

Claims (22)

1.一种方法，所述方法包括：

将已处理来减小其不顺应性的纤维素或木质纤维素生物质与微生物组合，以及通过将所述微生物-生物质组合维持在允许所述微生物产生一种或多种酶的条件下来诱导所述微生物产生所述一种或多种酶。

2.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括将第二纤维素或木质纤维素生物质与所述微生物-生物质组合一起组合。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述第二生物质是木质纤维素的。

4.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述生物质已通过选自由以下组成的组的处理方法进行处理来减小其不顺应性：用电子轰击、超声处理、氧化、热解、蒸汽爆炸、化学处理、机械处理、冷冻研磨。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述处理方法为用电子轰击。

6.如以上权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括机械处理所述第一纤维素或木质纤维素生物质以减小其堆积密度和/或增大其表面积。

7.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中在与所述微生物组合之前将所述第一纤维素或木质纤维素生物质粉碎。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述粉碎包括干磨。

9.如权利要求7所述的方法，其中所述粉碎包括湿磨。

10.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述纤维素或木质纤维素生物质具有约30μm至1400μm的粒度。

11.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物质为选自由木材、草以及农业废弃物组成的组的木质纤维素生物质。

12.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述纤维素或木质纤维素生物质选自由以下组成的组：纸、纸制品、废纸、纸浆、有色纸、装料纸、涂布纸、填充纸、杂志、印刷品、打印纸、多涂层纸、卡片材料、卡纸板、纸板、棉花、木材、刨花板、林业废弃物、锯末、杨木、木屑、草、柳枝稷、芒草、绳草、草芦、谷物残渣、稻壳、燕麦壳、小麦壳、大麦壳、农业废弃物、青贮饲料、油菜秸、小麦秸、大麦秸、燕麦秸、稻秸、黄麻、大麻、亚麻、竹子、剑麻、蕉麻、玉米穗轴、玉米秸秆、大豆秸秆、玉米纤维、苜蓿、干草、椰子毛、糖加工残渣、甘蔗渣、甜菜浆、龙舌兰渣、海藻、海草、粪肥、污物、下水、农业或工业废弃物、秘鲁胡萝卜、荞麦、香蕉、大麦、木薯、葛藤、圆齿酢酱草、西米、高粱、马铃薯、甘薯、芋头、山药、豆类、蚕豆、扁豆、碗豆，以及任何这些的混合物。

13.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述纤维素或木质纤维素生物质包含糖化或发酵过程的残渣。

14.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物选自由真菌、细菌和酵母组成的组。

15.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物为产生高水平纤维素酶的菌株。

16.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物是遗传工程改造的。

17.如权利要求14所述的方法，其中所述微生物为真菌。

18.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物选自由里氏木霉和热纤维梭菌组成的组。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述里氏木霉菌株选自由以下组成的组：RUT-NG14、PC3-7、QM9414和/或RUT-C30。

20.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中当所述微生物处于滞后期时将所述纤维素或木质纤维素生物质与所述微生物组合。

21.如以上权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括使用所述一种或多种酶糖化所述纤维素或木质纤维素生物质和/或另外的纤维素或木质纤维素生物质。

22.一种组合物，所述组合物包含：液体介质、经过处理来减小其不顺应性的纤维素或木质纤维素生物质、微生物以及由所述微生物产生的一种或多种酶。