CN116590350A - 利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法，属于生物发酵制氢技术领域。包括以下操作步骤：（1）低共熔溶剂制备；（2）秸秆预处理和低共熔溶剂的循环利用；（3）固体样品酶水解；(4）暗发酵产氢。本发明通过微量酸或碱催化协同低共熔溶剂用于秸秆预处理，脱除秸秆中的木质素，保留碳水化合物，碳水化合物经过酶水解降解为可发酵性单糖，单糖再利用产气肠杆菌进行暗发酵产氢气，低共熔溶剂和酸或者碱催化在预处理秸秆过程具有相互促进作用，有效提高木质素脱除率和碳水化合物保留率，因此明显提高了后续酶水解效率和产氢效率，进而提高了氢气的产量。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵制氢技术领域，具体地说，尤其涉及一种利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法。
背景技术
能源短缺和环境污染是人类面临的重大挑战。人们赖以生存的化石燃料正面临枯竭，同时化石燃料的使用也造成了严重的环境污染问题，例如大量烃类、芳香类、酚类化合物以及二氧化硫、氮氧化物和温空气体的排放,已威胁到人类的生存环境。近年来,人们已将更多的注意力聚焦在清洁可再生能源(例如氢能、太阳能和风能)的研究方面，氢气作为清洁可再生能源已成为当今能源和环境领域中的一个热点研究课题。目前，以废弃生物质比如各种农作物秸秆为原料通过发酵制氢是氢气的一个重要来源，这些有机废物原料可再生，来源广泛可大量获得，而且可减少焚烧秸秆带来的大气污染，使得生物制氢具有广阔的发展前景。
秸秆类生物质中的主要成分是纤维素，半纤维素和木质素。其中纤维素和半纤维素被木质素紧密包裹很难被产氢微生物直接降解利用而产氢，因此在底物发酵产氢前需经水解预处理。目前常用的预处理方法有物理法、化学法、物理-化学法和生物法。物理预处理主要是通过研磨，剪切，机械粉碎等降低生物质原料的尺寸，从而提高酶解的可及表面积，达到促进酶水解的目的。生物预处理是一种环保的预处理方法，主要是通过引入微生物菌群对木质纤维素成分进行降解，是一种经济和环境友好的预处理方式，生物预处理通常在常温、常压的条件下进行，降解的最终产物是二氧化碳和水，具有能耗低、无污染、条件温和等优点，但预处理周期长，还会降解部分纤维素和半纤维素，降低后续酶水解的产糖率。化学预处理主要包括各种酸碱预处理、离子液体预处理、有机溶剂预处理等，通过这些化学试剂与纤维素原料的特定作用达到去除和降解的效果，但现有的化学预处理方法仍存在着预处理效果差、环境污染、成本高等问题。离子液体预处理作为化学法预处理的一种，由于其液体范围广、蒸汽压可忽略、不可燃、热稳定性和化学稳定性高等优点，被认为是一种有效的木质纤维素预处理方法。然而，传统的离子液体由于具有价格昂贵、毒性高以及生物降解性差等缺陷，限制了其工业化应用。因此研发一种预处理效果好、环境污染小、成本低廉的秸秆预处理方法应用在生物发酵制氢上是十分必要的。
发明内容
本发明目的是提供一种利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法，其采用易于合成的低共熔溶剂协同微量碱/酸催化实现秸秆类生物质组分中木质素的有效脱除，破坏原料的天然抗降解屏障，促进后续酶水解，得到理想浓度的可发酵糖用于后续发酵产氢，实现原料向氢能的转化，并通过预处理溶剂的循环利用，减少了化学药剂的消耗，降低了预处理成本。
本发明是采用以下技术方案实现的：
一种利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法，包括以下操作步骤：
（1）低共熔溶剂制备：将多元醇和氯化胆碱以2:1的摩尔比加入容器中，加热至55-65℃搅拌，直至形成清澈的溶剂，合成低共熔溶剂；
（2）秸秆预处理和低共熔溶剂的循环利用：将粉碎后的脱蜡秸秆、酸溶液或碱溶液与低共熔溶剂混合在容器中并搅拌，混合物的反应在80-120℃下进行，反应时间为2.0-5.0h，反应完成后倒入丙酮水混合液体中，然后对混合溶液进行过滤分离，过滤分离得到固体样品经充分洗涤后冻干备用，预处理滤液加水稀释，以沉淀有机溶剂木质素，离心液体组分中的木质素后旋转蒸发去除水和丙酮，得到回收的预处理溶剂，回收的预处理溶剂直接用于下一循环预处理；
（3）纤维素酶水解：取步骤（2）预处理得到的固体样品置于容器中，加入乙酸-乙酸钠缓冲液，密闭后放入摇床预润胀10-16 h，然后，在三角瓶中加入纤维素酶和木聚糖复合酶，密闭后置于50oC恒温培养振荡器中酶水解40-60 h；在反应过程中，定时取出酶水解液100 µL，水解液经100oC的沸水煮5 min将酶灭活后，然后用水系滤头过滤，滤液稀释后进入离子色谱测定酶解后葡萄糖和木糖含量；
（4）暗发酵产氢：将产气肠杆菌原菌的过夜种子培养物分别接种到LB培养基中，在35oC-40oC的恒温培养振荡器中培养5-8 h，直到细胞达到对数期中期，然后，将培养好的菌悬液、酶水解液和去离子水置于玻璃发酵罐，用NaOH或HCl溶液将混合物pH值调节至4.5-7.0不同区间，用氮气置换发酵罐中空气10-20 min确保厌氧条件，最后将发酵罐密封并置于恒温水浴中暗发酵产氢。
优选的，步骤（1）中所述多元醇为乙二醇、丙三醇、1,4-丁二醇中的一种。
优选的，步骤（2）中所述酸溶液为质量百分比为1.0%～4.0% 的AlCl3溶液。
优选的，步骤（2）中所述碱溶液为质量百分比为1.0%～4.0% 的NaOH溶液。
优选的，步骤（2）中丙酮水混合液体中丙酮：水=7:3 v/v。
优选的，所述秸秆为玉米秸秆、小麦秸秆、高粱杆、竹子中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）本发明通过微量酸或碱催化协同低共熔溶剂用于秸秆预处理，可以在保留碳水化合物（纤维素和半纤维素）的同时，选择性去除木质素脱除秸秆中的木质素，碳水化合物经过酶水解降解为可发酵性单糖，单糖再利用产气肠杆菌进行暗发酵产氢气，低共熔溶剂和酸或者碱催化在预处理秸秆过程具有相互促进作用，有效提高木质素脱除率和碳水化合物保留率，因此明显提高了后续酶水解效率和产氢效率，进而提高了氢气的产量，而且具有价格低廉、毒性小、易生物降解、环保等优势。
（2）本发明通过将过滤的预处理液分离去除杂质直接用于下一循环预处理，预处理剂循环利用可以减少化学药剂的消耗和废液的排放，从而降低预处理成本。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例
一种利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法，包括以下操作步骤：
（1）低共熔溶剂制备：将乙二醇和氯化胆碱以2:1的摩尔比加入烧瓶中，具体将110.5 g乙二醇与83.8 g ChCl混合，加热至60℃搅拌，直至形成清澈的溶剂，合成低共熔溶剂DES；
（2）秸秆预处理和低共熔溶剂的循环利用：将粉碎后的脱蜡玉米秸秆4g与含有4.0wt AlCl3或NaOH的低共熔溶剂80ml混合在100ml圆底烧瓶中，混合物的反应在在150 rpm的磁搅拌, 温度80-120℃条件下进行，反应时间为2.0-5.0 h，将混合物倒入240 mL丙酮/水(7:3 v/v)溶液中，过滤分离得到固体样品和预处理滤液，回收的固体样品经丙酮/水溶液洗涤后冷冻干燥，根据预处理温度和时间得到的经含有AlCl3/NaOH的低共熔溶剂预处理的固体组分分别命名为AL100-2/ Aa100-2、AL100-3/ Aa100-3、AL100-4/ Aa100-4、AL100-5/Aa100-5、AL80-3/Aa80-3和AL120-3/ Aa80-3，预处理滤液加水至水与丙酮比例为9:1，以沉淀有机溶剂木质素，离心液体组分中的木质素后旋转蒸发去除水和丙酮，得到回收的预处理溶剂，回收的预处理溶剂直接用于下一循环预处理；
（3）固体样品酶水解： 称取0.3-3.0 g步骤（2）预处理得到的固体样品置于50 mL三角瓶中，加入10-60 mL 乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.8），密闭后放入摇床预润胀12 h，然后，在三角瓶中加入20 FPU/g底物的纤维素酶和木聚糖复合酶，密闭后置于50oC恒温培养振荡器中酶水解40-60 h，转速150 rpm；在反应过程中，定时取出酶水解液100 µL，水解液经100oC的沸水煮5 min将酶灭活后，然后用0.22 µm的水系滤头过滤，滤液稀释后进入离子色谱测定酶解后葡萄糖和木糖含量；
暗发酵产氢： 将产气肠杆菌原菌的过夜种子培养物1 mL分别接种到100 mL的LB培养基中，在37oC的恒温培养振荡器（180 rpm）中培养6 h，直到细胞达到对数期中期，然后，将培养好的菌悬液、酶水解液100 mL和去离子水置于玻璃发酵罐，用6 mol/L的NaOH或HCl溶液将混合物pH值调节至4.5-7.0不同区间，用氮气置换发酵罐中空气10 min确保厌氧条件，最后将发酵罐密封并置于恒温水浴中暗发酵产氢。
表1为不同反应条件下AlCl3催化协同低共熔溶剂预处理秸秆木质素脱除率和产氢量：（AlCl3用量：4.0 wt%）
| 组别 | AL100-2 | AL100-3 | AL100-4 | AL100-5 | AL80-3 | AL120-3 |
| 预处理反应条件 | 100℃，2h | 100℃，3h | 100℃，4h | 100℃，5h | 80℃，3h | 120℃，3h |
| 木质素脱除率% | 64.3 | 72.6 | 74.1 | 73.8 | 54.8 | 73.4 |
| 产氢量ml/g TS | 94.5 | 106.5 | 109.0 | 107.8 | 80.6 | 106.9 |
表2为不同反应条件NaOH催化协同低共熔溶剂预处理秸秆木质素脱除率和产氢量：（NaOH用量：4.0 wt%）
| 组别 | Aa100-2 | Aa100-3 | Aa100-4 | Aa100-5 | Aa80-3 | Aa120-3 |
| 预处理反应条件 | 100℃，2h | 100℃，3h | 100℃，4h | 100℃，5h | 80℃，3h | 120℃，3h |
| 木质素脱除率% | 71.8 | 81.3 | 78.4 | 76.3 | 49.2 | 80.9 |
| 产氢量ml/g TS | 103.7 | 117.4 | 113.3 | 110.0 | 71.1 | 115.1 |
实施例
一种利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法，包括以下操作步骤：
（1）低共熔溶剂制备：将乙二醇和氯化胆碱以2:1的摩尔比加入烧瓶中，具体将110.5 g乙二醇与83.8 g ChCl混合，加热至60℃搅拌，直至形成清澈的溶剂，合成低共熔溶剂DES；
（2）秸秆预处理和低共熔溶剂的循环利用：将粉碎后的脱蜡玉米秸秆4g与含有2.0wt AlCl3或NaOH的低共熔溶剂80 ml混合在100 ml圆底烧瓶中，混合物的反应在在150 rpm的磁搅拌, 温度80-120℃条件下进行，反应时间为2.0-5.0 h，将混合物分别倒入240 mL丙酮/水(7:3 v/v)溶液中，过滤分离得到固体样品和预处理滤液，回收的固体样品经丙酮/水溶液洗涤后冷冻干燥，根据预处理温度和时间得到的经含有AlCl3/NaOH的低共熔溶剂预处理的固体组分分别命名为AL100-2/ Aa100-2、AL100-3/ Aa100-3、AL100-4/ Aa100-4、AL100-5/ Aa100-5、AL80-3/ Aa80-3和AL120-3/ Aa80-3，预处理滤液加水至水与丙酮比例为9:1，以沉淀有机溶剂木质素，离心液体组分中的木质素后旋转蒸发去除水和丙酮，得到回收的预处理溶剂，回收的预处理溶剂直接用于下一循环预处理；
（3）固体样品酶水解： 称取0.3-3.0 g步骤（2）预处理得到的固体样品置于50 mL三角瓶中，加入10-60 mL乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.8），密闭后放入摇床预润胀12 h，然后，在三角瓶中加入20 FPU/g底物的纤维素酶和木聚糖复合酶，密闭后置于50oC恒温培养振荡器中酶水解40-60 h，转速150 rpm；在反应过程中，定时取出酶水解液100 µL，水解液经100oC的沸水煮5 min将酶灭活后，然后用0.22 µm的水系滤头过滤，滤液稀释后进入离子色谱测定酶解后葡萄糖和木糖含量；
（4）暗发酵产氢： 将产气肠杆菌原菌的过夜种子培养物1 mL分别接种到100 mL的LB培养基中，在37oC的恒温培养振荡器（180 rpm）中培养6 h，直到细胞达到对数期中期，然后，将培养好的菌悬液、酶水解液100 mL和去离子水置于玻璃发酵罐，用6 mol/L的NaOH或HCl溶液将混合物pH值调节至4.5-7.0不同区间，用氮气置换发酵罐中空气10 min确保厌氧条件，最后将发酵罐密封并置于恒温水浴中暗发酵产氢。
表3为不同反应条件下AlCl3催化协同低共熔溶剂预处理秸秆木质素脱除率和产氢量：（AlCl3用量：2.0 wt%）
| 组别 | AL100-2 | AL100-3 | AL100-4 | AL100-5 | AL80-3 | AL120-3 |
| 预处理反应条件 | 100℃，2h | 100℃，3h | 100℃，4h | 100℃，5h | 80℃，3h | 120℃，3h |
| 木质素脱除率% | 53.7 | 56.4 | 64.1 | 66.8 | 43.7 | 65.9 |
| 产氢量ml/g TS | 80.1 | 82.9 | 95.7 | 99.1 | 65.2 | 98.7 |
表4为不同反应条件NaOH催化协同低共熔溶剂预处理秸秆木质素脱除率和产氢量：（NaOH用量：2.0 wt%）
| 组别 | Aa100-2 | Aa100-3 | Aa100-4 | Aa100-5 | Aa80-3 | Aa120-3 |
| 预处理反应条件 | 100℃，2h | 100℃，3h | 100℃，4h | 100℃，5h | 80℃，3h | 120℃，3h |
| 木质素脱除率% | 61.1 | 69.8 | 70.1 | 70.5 | 43.5 | 71.8 |
| 产氢量ml/g TS | 91.2 | 103.3 | 104.6 | 105.2 | 64.9 | 105.8 |
实施例
一种利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法，包括以下操作步骤：
（1）低共熔溶剂制备：将乙二醇和氯化胆碱以2:1的摩尔比加入烧瓶中，具体将110.5 g乙二醇与83.8 g ChCl混合，加热至60℃搅拌，直至形成清澈的溶剂，合成低共熔溶剂DES；
（2）秸秆预处理和低共熔溶剂的循环利用：将粉碎后的脱蜡玉米秸秆4g与含有1.0wt AlCl3或NaOH的低共熔溶剂80ml混合在100ml圆底烧瓶中，混合物的反应在在150 rpm的磁搅拌, 温度80-120℃条件下进行，反应时间为2.0-5.0 h，将混合物分别倒入240 mL丙酮/水(70:30 v/v)溶液中，过滤分离得到固体样品和预处理滤液，回收的固体样品经丙酮/水溶液洗涤后冷冻干燥，根据预处理温度和时间得到的经含有AlCl3/NaOH的低共熔溶剂预处理的固体组分分别命名为AL100-2/ Aa100-2、AL100-3/ Aa100-3、AL100-4/ Aa100-4、AL100-5/ Aa100-5、AL80-3/ Aa80-3和AL120-3/ Aa80-3，预处理滤液加水至水与丙酮比例为9:1，以沉淀有机溶剂木质素，离心液体组分中的木质素后旋转蒸发去除水和丙酮，得到回收的预处理溶剂，回收的预处理溶剂直接用于下一循环预处理；
（3）固体样品酶水解： 称取0.3-3.0 g步骤（2）预处理得到的固体样品置于50 mL三角瓶中，加入10-60 mL乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.8），密闭后放入摇床预润胀12 h，然后，在三角瓶中加入20 FPU/g底物的纤维素酶和木聚糖复合酶，密闭后置于50oC恒温培养振荡器中酶水解40-60 h，转速150 rpm；在反应过程中，定时取出酶水解液100 µL，水解液经100oC的沸水煮5 min将酶灭活后，然后用0.22 µm的水系滤头过滤，滤液稀释后进入离子色谱测定酶解后葡萄糖和木糖含量；
（4）暗发酵产氢： 将产气肠杆菌原菌的过夜种子培养物1 mL分别接种到100 mL的LB培养基中，在37oC的恒温培养振荡器（180 rpm）中培养6 h，直到细胞达到对数期中期，然后，将培养好的菌悬液、酶水解液100 mL和去离子水置于玻璃发酵罐，用6 mol/L的NaOH或HCl溶液将混合物pH值调节至4.5-7.0不同区间，用氮气置换发酵罐中空气10 min确保厌氧条件，最后将发酵罐密封并置于恒温水浴中暗发酵产氢。
表5为不同反应条件下AlCl3催化协同低共熔溶剂预处理秸秆木质素脱除率和产氢量：（AlCl3用量：1.0 wt%）
| 组别 | AL100-2 | AL100-3 | AL100-4 | AL100-5 | AL80-3 | AL120-3 |
| 预处理反应条件 | 100℃，2h | 100℃，3h | 100℃，4h | 100℃，5h | 80℃，3h | 120℃，3h |
| 木质素脱除率% | 44.6 | 47.1 | 51.3 | 54.0 | 30.4 | 52.4 |
| 产氢量ml/g TS | 68.5 | 72.6 | 79.1 | 83.4 | 46.7 | 80.6 |
表6为不同反应条件NaOH催化协同低共熔溶剂预处理秸秆木质素脱除率和产氢量：（NaOH用量：1.0 wt%）
| 组别 | Aa100-2 | Aa100-3 | Aa100-4 | Aa100-5 | Aa80-3 | Aa120-3 |
| 预处理反应条件 | 100℃，2h | 100℃，3h | 100℃，4h | 100℃，5h | 80℃，3h | 120℃，3h |
| 木质素脱除率% | 50.2 | 52.6 | 61.5 | 63.5 | 39.4 | 56.6 |
| 产氢量ml/g TS | 77.2 | 81.1 | 94.5 | 97.8 | 60.8 | 87.5 |
预处理对照组实验：将粉碎后的脱蜡秸秆4g分别与不添加酸/碱的低共熔溶剂80ml混合在100ml圆底烧瓶中，混合物的反应在在150 rpm的磁搅拌, 温度80-120℃条件下进行，反应时间为2.0-4.0 h，根据预处理温度和时间得到的固体组分分别命名为H100-2、H100-3、H100-4、H80-3和H120-3，将混合物分别倒入240 mL丙酮/水(7:3 v/v)溶液中，过滤分离预处理后的固体样品，回收的固体样品经过量丙酮/水溶液洗涤后冷冻干燥。然后采用上述实施例中相同方法对固体样品进行酶水解，并进一步对酶水解产物进行暗发酵产氢。
表7为不同反应条件下低共熔溶剂预单独处理秸秆木质素脱除率和产氢量：
通过预处理对照组实验对比可知，采用AlCl3或NaOH介导的低共溶剂溶液预处理秸秆，可去除其中木质素的同时而保留纤维素，木质素脱除率得到有效提升，同时提高了后续酶解率。在最优条件下，微量酸或碱催化协同低共熔溶剂用于秸秆预处理可去除80%的木质素，经酶水解48小时后发酵产氢量是未处理样品的2-3倍。
本发明通过微量酸或碱催化协同低共熔溶剂用于秸秆预处理，脱除秸秆中的木质素，保留碳水化合物（纤维素和半纤维素），碳水化合物经过酶水解降解为可发酵性单糖，单糖再利用产气肠杆菌进行暗发酵产氢气，低共熔溶剂和酸或者碱催化在预处理秸秆过程具有相互促进作用，有效提高木质素脱除率和碳水化合物保留率，因此明显提高了后续酶水解效率和产氢效率，进而提高了氢气的产量。本发明目的是提供一种利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法，其采用易于合成的低共熔溶剂协同微量碱/酸催化实现秸秆类生物质组分中木质素的有效脱除，破坏原料的天然抗降解屏障，促进后续酶水解，得到理想浓度的可发酵糖用于后续发酵产氢，实现原料向氢能的转化，并通过预处理溶剂的循环利用，减少了化学药剂的消耗，降低了预处理成本。
本发明是采用以下技术方案实现的：
一种利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法，包括以下操作步骤：
（1）低共熔溶剂制备：将多元醇和氯化胆碱以2:1的摩尔比加入容器中，加热至55-65℃搅拌，直至形成清澈的溶剂，合成低共熔溶剂；
（2）秸秆预处理和低共熔溶剂的循环利用：将粉碎后的脱蜡秸秆、酸溶液或碱溶液与低共熔溶剂混合在容器中并搅拌，混合物的反应在80-120℃下进行，反应时间为2.0-5.0h，反应完成后倒入丙酮水混合液体中，然后对混合溶液进行过滤分离，过滤分离得到固体样品经充分洗涤后冻干备用，预处理滤液加水稀释，以沉淀有机溶剂木质素，离心液体组分中的木质素后旋转蒸发去除水和丙酮，得到回收的预处理溶剂，回收的预处理溶剂直接用于下一循环预处理；
（3）纤维素酶水解：取步骤（2）预处理得到的固体样品置于容器中，加入乙酸-乙酸钠缓冲液，密闭后放入摇床预润胀10-16 h，然后，在三角瓶中加入纤维素酶和木聚糖复合酶，密闭后置于50oC恒温培养振荡器中酶水解40-60 h；在反应过程中，定时取出酶水解液100 µL，水解液经100oC的沸水煮5 min将酶灭活后，然后用水系滤头过滤，滤液稀释后进入离子色谱测定酶解后葡萄糖和木糖含量；
（4）暗发酵产氢：将产气肠杆菌原菌的过夜种子培养物分别接种到LB培养基中，在35oC-40oC的恒温培养振荡器中培养5-8 h，直到细胞达到对数期中期，然后，将培养好的菌悬液、酶水解液和去离子水置于玻璃发酵罐，用NaOH或HCl溶液将混合物pH值调节至4.5-7.0不同区间，用氮气置换发酵罐中空气10-20 min确保厌氧条件，最后将发酵罐密封并置于恒温水浴中暗发酵产氢。
优选的，步骤（1）中所述多元醇为乙二醇、丙三醇、1,4-丁二醇中的一种。
优选的，步骤（2）中所述酸溶液为质量百分比为1.0%～4.0% 的AlCl3溶液。
优选的，步骤（2）中所述碱溶液为质量百分比为1.0%～4.0% 的NaOH溶液。
优选的，步骤（2）中丙酮水混合液体中丙酮：水=7:3 v/v。
优选的，所述秸秆为玉米秸秆、小麦秸秆、高粱杆、竹子中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）本发明通过微量酸或碱催化协同低共熔溶剂用于秸秆预处理，可以在保留碳水化合物（纤维素和半纤维素）的同时，选择性去除木质素脱除秸秆中的木质素，碳水化合物经过酶水解降解为可发酵性单糖，单糖再利用产气肠杆菌进行暗发酵产氢气，低共熔溶剂和酸或者碱催化在预处理秸秆过程具有相互促进作用，有效提高木质素脱除率和碳水化合物保留率，因此明显提高了后续酶水解效率和产氢效率，进而提高了氢气的产量，而且具有价格低廉、毒性小、易生物降解、环保等优势。
（2）本发明通过将过滤的预处理液分离去除杂质直接用于下一循环预处理，预处理剂循环利用可以减少化学药剂的消耗和废液的排放，从而降低预处理成本。
实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例
一种利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法，包括以下操作步骤：
（1）低共熔溶剂制备：将乙二醇和氯化胆碱以2:1的摩尔比加入烧瓶中，具体将110.5 g乙二醇与83.8 g ChCl混合，加热至60℃搅拌，直至形成清澈的溶剂，合成低共熔溶剂DES；
（2）秸秆预处理和低共熔溶剂的循环利用：将粉碎后的脱蜡玉米秸秆4g与含有4.0wt AlCl3或NaOH的低共熔溶剂80ml混合在100ml圆底烧瓶中，混合物的反应在在150 rpm的磁搅拌, 温度80-120℃条件下进行，反应时间为2.0-5.0 h，将混合物倒入240 mL丙酮/水(7:3 v/v)溶液中，过滤分离得到固体样品和预处理滤液，回收的固体样品经丙酮/水溶液洗涤后冷冻干燥，根据预处理温度和时间得到的经含有AlCl3/NaOH的低共熔溶剂预处理的固体组分分别命名为AL100-2/ Aa100-2、AL100-3/ Aa100-3、AL100-4/ Aa100-4、AL100-5/Aa100-5、AL80-3/Aa80-3和AL120-3/ Aa80-3，预处理滤液加水至水与丙酮比例为9:1，以沉淀有机溶剂木质素，离心液体组分中的木质素后旋转蒸发去除水和丙酮，得到回收的预处理溶剂，回收的预处理溶剂直接用于下一循环预处理；
（3）固体样品酶水解： 称取0.3-3.0 g步骤（2）预处理得到的固体样品置于50 mL三角瓶中，加入10-60 mL 乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.8），密闭后放入摇床预润胀12 h，然后，在三角瓶中加入20 FPU/g底物的纤维素酶和木聚糖复合酶，密闭后置于50oC恒温培养振荡器中酶水解40-60 h，转速150 rpm；在反应过程中，定时取出酶水解液100 µL，水解液经100oC的沸水煮5 min将酶灭活后，然后用0.22 µm的水系滤头过滤，滤液稀释后进入离子色谱测定酶解后葡萄糖和木糖含量；
暗发酵产氢： 将产气肠杆菌原菌的过夜种子培养物1 mL分别接种到100 mL的LB培养基中，在37oC的恒温培养振荡器（180 rpm）中培养6 h，直到细胞达到对数期中期，然后，将培养好的菌悬液、酶水解液100 mL和去离子水置于玻璃发酵罐，用6 mol/L的NaOH或HCl溶液将混合物pH值调节至4.5-7.0不同区间，用氮气置换发酵罐中空气10 min确保厌氧条件，最后将发酵罐密封并置于恒温水浴中暗发酵产氢。
表1为不同反应条件下AlCl3催化协同低共熔溶剂预处理秸秆木质素脱除率和产氢量：（AlCl3用量：4.0 wt%）
| 组别 | AL100-2 | AL100-3 | AL100-4 | AL100-5 | AL80-3 | AL120-3 |
| 预处理反应条件 | 100℃，2h | 100℃，3h | 100℃，4h | 100℃，5h | 80℃，3h | 120℃，3h |
| 木质素脱除率% | 64.3 | 72.6 | 74.1 | 73.8 | 54.8 | 73.4 |
| 产氢量ml/g TS | 94.5 | 106.5 | 109.0 | 107.8 | 80.6 | 106.9 |
表2为不同反应条件NaOH催化协同低共熔溶剂预处理秸秆木质素脱除率和产氢量：（NaOH用量：4.0 wt%）
| 组别 | Aa100-2 | Aa100-3 | Aa100-4 | Aa100-5 | Aa80-3 | Aa120-3 |
| 预处理反应条件 | 100℃，2h | 100℃，3h | 100℃，4h | 100℃，5h | 80℃，3h | 120℃，3h |
| 木质素脱除率% | 71.8 | 81.3 | 78.4 | 76.3 | 49.2 | 80.9 |
| 产氢量ml/g TS | 103.7 | 117.4 | 113.3 | 110.0 | 71.1 | 115.1 |
实施例
一种利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法，包括以下操作步骤：
（1）低共熔溶剂制备：将乙二醇和氯化胆碱以2:1的摩尔比加入烧瓶中，具体将110.5 g乙二醇与83.8 g ChCl混合，加热至60℃搅拌，直至形成清澈的溶剂，合成低共熔溶剂DES；
（2）秸秆预处理和低共熔溶剂的循环利用：将粉碎后的脱蜡玉米秸秆4g与含有2.0wt AlCl3或NaOH的低共熔溶剂80 ml混合在100 ml圆底烧瓶中，混合物的反应在在150 rpm的磁搅拌, 温度80-120℃条件下进行，反应时间为2.0-5.0 h，将混合物分别倒入240 mL丙酮/水(7:3 v/v)溶液中，过滤分离得到固体样品和预处理滤液，回收的固体样品经丙酮/水溶液洗涤后冷冻干燥，根据预处理温度和时间得到的经含有AlCl3/NaOH的低共熔溶剂预处理的固体组分分别命名为AL100-2/ Aa100-2、AL100-3/ Aa100-3、AL100-4/ Aa100-4、AL100-5/ Aa100-5、AL80-3/ Aa80-3和AL120-3/ Aa80-3，预处理滤液加水至水与丙酮比例为9:1，以沉淀有机溶剂木质素，离心液体组分中的木质素后旋转蒸发去除水和丙酮，得到回收的预处理溶剂，回收的预处理溶剂直接用于下一循环预处理；
（3）固体样品酶水解： 称取0.3-3.0 g步骤（2）预处理得到的固体样品置于50 mL三角瓶中，加入10-60 mL乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.8），密闭后放入摇床预润胀12 h，然后，在三角瓶中加入20 FPU/g底物的纤维素酶和木聚糖复合酶，密闭后置于50oC恒温培养振荡器中酶水解40-60 h，转速150 rpm；在反应过程中，定时取出酶水解液100 µL，水解液经100oC的沸水煮5 min将酶灭活后，然后用0.22 µm的水系滤头过滤，滤液稀释后进入离子色谱测定酶解后葡萄糖和木糖含量；
（4）暗发酵产氢： 将产气肠杆菌原菌的过夜种子培养物1 mL分别接种到100 mL的LB培养基中，在37oC的恒温培养振荡器（180 rpm）中培养6 h，直到细胞达到对数期中期，然后，将培养好的菌悬液、酶水解液100 mL和去离子水置于玻璃发酵罐，用6 mol/L的NaOH或HCl溶液将混合物pH值调节至4.5-7.0不同区间，用氮气置换发酵罐中空气10 min确保厌氧条件，最后将发酵罐密封并置于恒温水浴中暗发酵产氢。
表3为不同反应条件下AlCl3催化协同低共熔溶剂预处理秸秆木质素脱除率和产氢量：（AlCl3用量：2.0 wt%）
| 组别 | AL100-2 | AL100-3 | AL100-4 | AL100-5 | AL80-3 | AL120-3 |
| 预处理反应条件 | 100℃，2h | 100℃，3h | 100℃，4h | 100℃，5h | 80℃，3h | 120℃，3h |
| 木质素脱除率% | 53.7 | 56.4 | 64.1 | 66.8 | 43.7 | 65.9 |
| 产氢量ml/g TS | 80.1 | 82.9 | 95.7 | 99.1 | 65.2 | 98.7 |
表4为不同反应条件NaOH催化协同低共熔溶剂预处理秸秆木质素脱除率和产氢量：（NaOH用量：2.0 wt%）
| 组别 | Aa100-2 | Aa100-3 | Aa100-4 | Aa100-5 | Aa80-3 | Aa120-3 |
| 预处理反应条件 | 100℃，2h | 100℃，3h | 100℃，4h | 100℃，5h | 80℃，3h | 120℃，3h |
| 木质素脱除率% | 61.1 | 69.8 | 70.1 | 70.5 | 43.5 | 71.8 |
| 产氢量ml/g TS | 91.2 | 103.3 | 104.6 | 105.2 | 64.9 | 105.8 |
实施例
一种利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法，包括以下操作步骤：
（1）低共熔溶剂制备：将乙二醇和氯化胆碱以2:1的摩尔比加入烧瓶中，具体将110.5 g乙二醇与83.8 g ChCl混合，加热至60℃搅拌，直至形成清澈的溶剂，合成低共熔溶剂DES；
（2）秸秆预处理和低共熔溶剂的循环利用：将粉碎后的脱蜡玉米秸秆4g与含有1.0wt AlCl3或NaOH的低共熔溶剂80ml混合在100ml圆底烧瓶中，混合物的反应在在150 rpm的磁搅拌, 温度80-120℃条件下进行，反应时间为2.0-5.0 h，将混合物分别倒入240 mL丙酮/水(70:30 v/v)溶液中，过滤分离得到固体样品和预处理滤液，回收的固体样品经丙酮/水溶液洗涤后冷冻干燥，根据预处理温度和时间得到的经含有AlCl3/NaOH的低共熔溶剂预处理的固体组分分别命名为AL100-2/ Aa100-2、AL100-3/ Aa100-3、AL100-4/ Aa100-4、AL100-5/ Aa100-5、AL80-3/ Aa80-3和AL120-3/ Aa80-3，预处理滤液加水至水与丙酮比例为9:1，以沉淀有机溶剂木质素，离心液体组分中的木质素后旋转蒸发去除水和丙酮，得到回收的预处理溶剂，回收的预处理溶剂直接用于下一循环预处理；
（3）固体样品酶水解： 称取0.3-3.0 g步骤（2）预处理得到的固体样品置于50 mL三角瓶中，加入10-60 mL乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.8），密闭后放入摇床预润胀12 h，然后，在三角瓶中加入20 FPU/g底物的纤维素酶和木聚糖复合酶，密闭后置于50oC恒温培养振荡器中酶水解40-60 h，转速150 rpm；在反应过程中，定时取出酶水解液100 µL，水解液经100oC的沸水煮5 min将酶灭活后，然后用0.22 µm的水系滤头过滤，滤液稀释后进入离子色谱测定酶解后葡萄糖和木糖含量；
（4）暗发酵产氢： 将产气肠杆菌原菌的过夜种子培养物1 mL分别接种到100 mL的LB培养基中，在37oC的恒温培养振荡器（180 rpm）中培养6 h，直到细胞达到对数期中期，然后，将培养好的菌悬液、酶水解液100 mL和去离子水置于玻璃发酵罐，用6 mol/L的NaOH或HCl溶液将混合物pH值调节至4.5-7.0不同区间，用氮气置换发酵罐中空气10 min确保厌氧条件，最后将发酵罐密封并置于恒温水浴中暗发酵产氢。
表5为不同反应条件下AlCl3催化协同低共熔溶剂预处理秸秆木质素脱除率和产氢量：（AlCl3用量：1.0 wt%）
| 组别 | AL100-2 | AL100-3 | AL100-4 | AL100-5 | AL80-3 | AL120-3 |
| 预处理反应条件 | 100℃，2h | 100℃，3h | 100℃，4h | 100℃，5h | 80℃，3h | 120℃，3h |
| 木质素脱除率% | 44.6 | 47.1 | 51.3 | 54.0 | 30.4 | 52.4 |
| 产氢量ml/g TS | 68.5 | 72.6 | 79.1 | 83.4 | 46.7 | 80.6 |
表6为不同反应条件NaOH催化协同低共熔溶剂预处理秸秆木质素脱除率和产氢量：（NaOH用量：1.0 wt%）
| 组别 | Aa100-2 | Aa100-3 | Aa100-4 | Aa100-5 | Aa80-3 | Aa120-3 |
| 预处理反应条件 | 100℃，2h | 100℃，3h | 100℃，4h | 100℃，5h | 80℃，3h | 120℃，3h |
| 木质素脱除率% | 50.2 | 52.6 | 61.5 | 63.5 | 39.4 | 56.6 |
| 产氢量ml/g TS | 77.2 | 81.1 | 94.5 | 97.8 | 60.8 | 87.5 |
预处理对照组实验：将粉碎后的脱蜡秸秆4g分别与不添加酸/碱的低共熔溶剂80ml混合在100ml圆底烧瓶中，混合物的反应在在150 rpm的磁搅拌, 温度80-120℃条件下进行，反应时间为2.0-4.0 h，根据预处理温度和时间得到的固体组分分别命名为H100-2、H100-3、H100-4、H80-3和H120-3，将混合物分别倒入240 mL丙酮/水(7:3 v/v)溶液中，过滤分离预处理后的固体样品，回收的固体样品经过量丙酮/水溶液洗涤后冷冻干燥。然后采用上述实施例中相同方法对固体样品进行酶水解，并进一步对酶水解产物进行暗发酵产氢。
表7为不同反应条件下低共熔溶剂预单独处理秸秆木质素脱除率和产氢量：
通过预处理对照组实验对比可知，采用AlCl3或NaOH介导的低共溶剂溶液预处理秸秆，可去除其中木质素的同时而保留纤维素，木质素脱除率得到有效提升，同时提高了后续酶解率。在最优条件下，微量酸或碱催化协同低共熔溶剂用于秸秆预处理可去除80%的木质素，经酶水解48小时后发酵产氢量是未处理样品的2-3倍。
本发明通过微量酸或碱催化协同低共熔溶剂用于秸秆预处理，脱除秸秆中的木质素，保留碳水化合物（纤维素和半纤维素），碳水化合物经过酶水解降解为可发酵性单糖，单糖再利用产气肠杆菌进行暗发酵产氢气，低共熔溶剂和酸或者碱催化在预处理秸秆过程具有相互促进作用，有效提高木质素脱除率和碳水化合物保留率，因此明显提高了后续酶水解效率和产氢效率，进而提高了氢气的产量。
Claims (6)
1.一种利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法，其特征在于：包括以下操作步骤：
（1）低共熔溶剂制备：将多元醇和氯化胆碱以2:1的摩尔比加入容器中，加热至55-65℃搅拌，直至形成清澈的溶剂，合成低共熔溶剂；
（2）秸秆预处理和低共熔溶剂的循环利用：将粉碎后的脱蜡秸秆、酸溶液或碱溶液与低共熔溶剂混合在容器中并搅拌，混合物的反应在80-120℃下进行，反应时间为2.0-5.0 h，反应完成后倒入丙酮水混合液体中，然后对混合溶液进行过滤分离，过滤分离得到固体样品经充分洗涤后冻干备用，预处理滤液加水稀释，以沉淀有机溶剂木质素，离心液体组分中的木质素后旋转蒸发去除水和丙酮，得到回收的预处理溶剂，回收的预处理溶剂直接用于下一循环预处理；
（3）纤维素酶水解：取步骤（2）预处理得到的固体样品置于容器中，加入乙酸-乙酸钠缓冲液，密闭后放入摇床预润胀10-16 h，然后，在三角瓶中加入纤维素酶和木聚糖复合酶，密闭后置于50 oC恒温培养振荡器中酶水解40-60 h；在反应过程中，定时取出酶水解液100 µL，水解液经100 oC的沸水煮5 min将酶灭活后，然后用水系滤头过滤，滤液稀释后进入离子色谱测定酶解后葡萄糖和木糖含量；
（4）暗发酵产氢：将产气肠杆菌原菌的过夜种子培养物分别接种到LB培养基中，在35oC-40oC的恒温培养振荡器中培养5-8 h，直到细胞达到对数期中期，然后，将培养好的菌悬液、酶水解液和去离子水置于玻璃发酵罐，用NaOH或HCl溶液将混合物pH值调节至4.5-7.0不同区间，用氮气置换发酵罐中空气10-20 min确保厌氧条件，最后将发酵罐密封并置于恒温水浴中暗发酵产氢。
2.根据权利要求1所述的利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法，其特征在于：步骤（1）中所述多元醇为乙二醇、丙三醇、1,4-丁二醇中的一种。
3.根据权利要求1所述的利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法，其特征在于：步骤（2）中所述酸溶液为质量百分比为1.0%～4.0% 的AlCl3溶液。
4.根据权利要求1所述的利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法，其特征在于：步骤（2）中所述碱溶液为质量百分比为1.0%～4.0% 的NaOH溶液。
5.根据权利要求1 所述的利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法，其特征在于：步骤（2）中丙酮水混合液体中丙酮：水=7:3 v/v。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的利用秸秆类生物质暗发酵制氢的方法，其特征在于：所述秸秆为玉米秸秆、小麦秸秆、高粱杆、竹子中的一种或多种。
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