CN111100888B - 一种促进木质纤维素酶解糖化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促进木质纤维素酶解糖化的方法，是在木质纤维素酶解过程中，加入bola型脂肽，所述脂肽的序列为NH2‑KCnK‑NH2，其中Cn代表疏水烷基链（12≤n≤18），K代表赖氨酸。本发明采用bola型脂肽作为酶解助剂，提高了酶解效率和可发酵糖浓度，具有糖化率高、助剂使用量少等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物质能源技术领域，具体涉及一种促进木质纤维素酶解糖化的方法。
背景技术
作为丰富廉价的可再生资源，纤维素是自然界含量最丰富的生物质之一，占全球生物质总量的50%，每年全球绿色植物体光合作用产生的干物质可达1.55×1011吨，包括农林业废弃物、废纸、能源作物等，而目前大部分未利用而丢弃，其中碳水化合物含量高达75%，可以作为可发酵糖的重要来源生产液体燃料和其它化学品。随着石油资源的短缺以及人们对能源、环境问题重视程度的日益提高，利用纤维素生物质为原料，转化为可代替化石能源的生物质能源，已成为当今的科学研究热点，也是缓解能源危机与环境污染的有效途径之一。
目前木质纤维素原料的主要利用途径为纤维素和半纤维素水解产生还原糖，还原糖经过发酵产生乙醇和丁醇等生物能源产品，或者乳酸、柠檬酸等化学品。
纤维素酶可以在较低温下、高度专一地对纤维素进行水解，通过酶将固体纤维转变为可溶性糖，由于酶解反应糖损耗低、副产物少、条件温和，是木质纤维素被彻底降解而不会对环境造成污染的一条有效途径，因此备受关注，是目前采用较多的一种方法。然而，由于木质纤维素结构复杂，细胞壁中的半纤维素和木质素通过共价键连接形成复杂的网络结构，纤维素镶嵌其中，纤维素的晶体结构使其在常温下性质稳定而不易发生水解，使得木质纤维素酶解效率不高，高的纤维素转化率要求较高的酶负荷，使得生产过程不够经济。提高纤维素酶解效率的方法有多种，一是对原料预处理，如酸、碱、高温、蒸汽爆破等预处理来降低木质纤维素中半纤维素和木质素对水解的影响，但预处理后的木质纤维素中仍然存在木质素，其对纤维素酶的无效吸附会导致纤维素酶解效率降低；二是选择高活性的纤维素复合酶和水解条件，但成本加大；三是在酶解体系中加入可促进酶解的助剂，如表面活性剂以及牛血清白蛋白（BSA），其能够提高木质纤维素酶解效果，降低木质素对酶的无效吸附，从而可以减少酶用量。
Li等（Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2012，89(1)：203-210）研究发现当PEG4000添加量为2%，底物浓度50g/L，纤维素酶ACCELLERASE 1000酶加量25mg/g纤维素时，纤维素的转化率增加了22%。Brethauer等（Bioresource Technology，2011，102(10)：6295-6298）研究了在不同反应条件下BSA对微晶纤维素和玉米秸秆酶解的影响，实验证实，BSA通过减少外切酶的失活和促进底物粒度、结晶度减小两种方式促进酶解，在摇瓶中酶解72 h，两种底物的酶解产率提高26%。
CN107177645A公开了一种利用两性表面活性剂促进木质纤维素酶解的方法，以C8H18(CH3)2N+(CH2)OSO3 -等作为酶解助剂，对纯纤维素的酶解没有抑制作用，可以使木质纤维素酶解糖化得率提高13.7~72.1%。
综上所述，助剂的添加可以提高木质纤维素酶解效果，降低木质素对酶的无效吸附，从而可以减少酶用量。因此，在不改变反应条件下，建立高效、绿色化技术和方法将是未来纤维素水解研究的重要研发方向。
发明内容
针对现有技术存在的酶解效率低及可发酵糖浓度低的问题，本发明提供了一种促进木质纤维素酶解糖化的方法。本发明方法采用bola型脂肽作为酶解助剂，提高了酶解效率和可发酵糖浓度。
本发明提供的促进木质纤维素酶解糖化率的方法，包括以下内容：在木质纤维素酶解过程中，加入脂肽，所述脂肽的序列为NH2-KCnK-NH2，其中Cn代表疏水烷基链（12≤n≤18），K代表赖氨酸。
本发明中，所述脂肽可以直接加入到酶解体系中，也可以先加入到缓冲液中再加入酶解体系中。脂肽加入量为酶解体系质量的0.02%-0.25%，优选0.04%-0.20%。进一步地，优选将脂肽先加入到缓冲液中，脂肽在缓冲液中的浓度为0.5-2.5g/L，优选1-2g/L。所述缓冲液优选柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，缓冲液的pH值为4.0-6.0，优选4.6-5.6。
本发明中，所述脂肽包含一个疏水烷基链和两个亲水的赖氨酸，其中疏水烷基链来源于长链二元酸，如可以是C12至C18二元酸中的任意一种。所述脂肽可以利用多肽微波合成仪自行合成或通过商业途径获得。
本发明中，所述的木质纤维素原料为含有纤维素、半纤维素和木质素的秸秆、木屑或能源植物等，优选玉米秸秆。在酶解前需要进行预处理，所述预处理可以采用一切可提高木质纤维素酶解性能的物理、化学和热化学处理技术，包括机械粉碎、辐射、微波、酸处理、碱处理、蒸汽爆破预处理和溶剂预处理，或采用上述方法的组合预处理等，优选采用蒸汽爆破预处理。具体过程如下：将切碎的木质纤维素原料通入到蒸汽爆破装置，在160-210℃下维持5-10min，瞬间泄压释放，即得到蒸汽爆破预处理的玉米秸秆。预处理后的原料配制成干物质浓度（木质纤维素占酶解体系的质量分数）为5wt%-15wt%，优选5wt%-10wt%的料液。
本发明中，所述酶解过程中加入的纤维素酶可以是一切能能够降解纤维素的单一酶或者复合酶，如可以是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡聚糖苷酶等中的一种或几种，具体如商业化纤维素酶如诺维信纤维素酶，黑曲霉Aspergillus nigerT2所产酶（CN101899398A），绿色木霉Trichoderma virideF4所产酶（CN105647813A），里氏木霉Trichoderma reesei所产酶（CN103740678A），斜卧青霉菌（Penicillium decumbens）Gi31-2所产酶（CN101845399A）等中的一种或几种。纤维素酶的加入量为5-25IU/g木质纤维素，优选10-20IU/g木质纤维素。
本发明中，所述酶解的pH为4.5-5.5，酶解温度为40-60℃，优选45-55℃；酶解时间24-72h，优选36-48h。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
（1）本发明提出了利用bola型脂肽作为酶解助剂的纤维素酶解方法，提高了酶解效率和可发酵糖浓度，且助剂使用量少。
（2）bola型脂肽作为酶解助剂可以有效降低纤维素酶的无效吸附，作为蛋白可以与纤维素酶产生协同效应促进酶解，同时对于后续发酵过程也是有益的。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明木质纤维素酶解糖化的方法和效果。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均从常规生化试剂商店购买得到。
本发明实施例使用的木质纤维素原料为玉米秸秆，其中纤维素38.2wt%，半纤维素22.1wt%，木质素20.2wt%，灰分3.9wt%，用粉碎机粉碎至颗粒大小为1-5厘米。预处理采用中性蒸汽爆破预处理，具体过程为：将木质纤维素原料粉碎至0.5-5厘米，加入2-4倍质量的自来水浸湿，进入到蒸汽爆破装置的滞留器，在120-160℃，0.8-1.3MPa下维持5-20min，瞬间泄压释放，即得到预处理物料。
脂肽采用微波辅助的Fmoc固相合成的方法，具体步骤如下：
（1）脱保护：将Rink amide-MBHA树脂（4-(2’,4’-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-甲基二苯甲胺树脂）上氨基的Fmoc保护基团（9-芴甲氧羰基）脱去。优选的，用10%-30%的哌啶/DMF溶液脱去氨基的Fmoc保护基团。
（2）活化：使用活化剂活化赖氨酸的羧基。所述活化剂为HOBT（1-羟基苯并三唑）和HBTU（苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯），DMF（N,N-二甲基甲酰胺）为溶剂，浓度为0.3-0.5mol/L。
（3）交联：被活化的羧基与游离的氨基在微波辅助加热以及活化碱存在下发生酰化反应，形成肽键。所述的活化碱为DIEA（N,N-二异丙基乙胺），DMF（N,N-二甲基甲酰胺）为溶剂，浓度为1-5mol/L，反应温度为70-80℃。
（4）合成：重复步骤（1）-（3）使序列中长链二元酸连接到树脂上，得到连有目标脂肽分子的固相载体。根据要求选择两端是否保护。
（5）裂解：合成完毕后，过滤得树脂，将裂解液加入连有目标多肽分子的固相载体中，裂解3-5小时后，过滤得到含有目标脂肽的滤液。裂解液采用TFA（三氟乙酸）:TIS（三异丙基硅烷）:H2O=为95:2.5:2.5（体积比）的混合液，使用量为10-20mL。利用旋转蒸发仪除去液体，得到旋蒸残液。
（6）纯化：利用冰乙醚将目标脂肽从旋蒸残液沉淀出来，低温离心洗涤除去残留三氟乙酸，加水并冻干得到干态脂肽，-20℃保存。所述的低温温度为3-5℃，离心洗涤采用冰乙醚，离心数次以除去残留的三氟乙酸。
本发明干物质浓度采用赛多利斯HG63水分测定仪烘干法测定。
糖化率(质量分数)=(生成的还原糖质量*0.9)/((酶解体系中纤维素的质量分数+半纤维素的质量分数)*酶解体系的质量)*100%。其中还原糖的分析采用DNS法。
实施例1
采用微波辅助Fmoc固相法合成NH2-KC16K-NH2，具体步骤为：
（1）脱保护：用20%的哌啶/DMF溶液将Rink amide-MBHA树脂上氨基的Fmoc保护基团9-芴甲氧羰基脱去。
（2）活化：使用活化剂活化赖氨酸的羧基。所述活化剂为HOBT和HBTU(比例1:1)，DMF为溶剂，浓度均为0.45mol/L。
（3）交联：赖氨酸的羧基被活化后与游离的氨基在微波辅助加热以及活化碱存在下发生酰化反应，形成肽键。所述的活化碱为DIEA，DMF为溶剂，浓度为2mol/L，反应温度为75℃。
（4）合成：重复步骤（1）-（3）使序列中二元酸COOH-C16-COOH连接到树脂上，得到连有目标脂肽分子的固相载体。
（5）裂解：合成完毕后，过滤得树脂，将裂解液加入连有目标脂肽分子的固相载体中，裂解3小时后，过滤得到含有目标脂肽的滤液。裂解液采用TFA:TIS:H2O=95:2.5:2.5（体积比）的混合液，使用量为15mL。利用旋转蒸发仪除去液体，得到旋蒸残液。
（6）纯化：利用冰乙醚将目标脂肽从旋蒸残液沉淀出来，4℃离心洗涤除去残留的三氟乙酸，加水并冻干得到干态脂肽NH2-KC16K-NH2，-20℃保存。
取预处理好的木质纤维素，用水配制成干物质浓度为5wt%的料液，按照10IU/g木质纤维素加入市售诺维信Ctec3，然后加入酶解体系质量0.10%的脂肽NH2-KC16K-NH2，酶解pH为5.0，在50℃下酶解48h，糖化率为82.13%。
实施例2
同实施例1，不同在于：取脂肽NH2-KC16K-NH2溶解到pH为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，浓度为2g/L，然后按照占酶解体系总质量0.10%的量加入，糖化率为84.47%。
实施例3
同实施例1，不同在于：以二元酸COOH-C14-COOH为原料，采用微波辅助Fmoc固相法合成的NH2-KC14K-NH2，糖化率为81.67%。
实施例4
同实施例1，不同在于：以二元酸COOH-C12-COOH为原料，采用微波辅助Fmoc固相法合成的NH2-KC12K-NH2，糖化率为80.94%。
实施例5
同实施例1，不同在于：取脂肽NH2-KC16K-NH2溶解到pH为6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，浓度为2g/L，然后按照占酶解体系总质量0.10%的量加入，糖化率为83.59%。
实施例6
同实施例3，不同在于：取脂肽NH2-KC16K-NH2溶解到pH为4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，浓度为2g/L，然后按照占酶解体系总质量0.10%的量加入，糖化率为83.75%。
实施例7
同实施例1，不同在于：纤维素酶采用CN101899398A中所述黑曲霉（Aspergillus niger）T2所产纤维素酶，糖化率为80.31%。
实施例8
同实施例1，不同在于：纤维素酶采用CN105647813A中所述绿色木霉（Trichoderma viride）F4所产纤维素酶，糖化率为79.43%。
实施例9
同实施例1，不同在于：纤维素酶采用CN103740678A中所述Trichoderma reesei所产纤维素酶，糖化率为78.64%。
实施例10
同实施例1，不同在于：纤维素酶采用CN101845399A中所述斜卧青霉菌（Penicilliumdecumbens）Gi31-2所产纤维素酶，糖化率为77.82%。
实施例11
同实施例1，不同在于：脂肽NH2-KC16K-NH2按照占酶解体系总质量0.02%的量加入，糖化率为74.48%。
实施例12
同实施例1，不同在于：脂肽NH2-KC16K-NH2按照占酶解体系总质量0.25%的量加入，糖化率为80.53%。
比较例1
同实施例1，不同在于：不加入脂肽，糖化率为64.37%。
比较例2
同实施例2，不同在于：不加入脂肽，仅加入等量缓冲液，糖化率为64.75%。
Claims (19)
1.一种促进木质纤维素酶解糖化的方法，其特征在于包括以下内容：在木质纤维素酶解过程中，加入脂肽，所述脂肽的序列为NH2-KCnK-NH2，其中Cn代表疏水烷基链（12≤n≤18），K代表赖氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述脂肽直接加入到酶解体系中，或者先加入到缓冲液中再加入酶解体系中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：脂肽加入量为酶解体系质量的0.02%-0.25%。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：脂肽加入量为酶解体系质量的0.04%-0.20%。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：将脂肽加入到缓冲液中，脂肽在缓冲液中的浓度为0.5-2.5g/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：脂肽在缓冲液中的浓度为1-2g/L。
7.根据权利要求2或5或6所述的方法，其特征在于：所述缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，缓冲液的pH值为4.0-6.0。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：缓冲液的pH值为4.6-5.6。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述木质纤维素原料为含有纤维素、半纤维素和木质素的秸秆或木屑；木质纤维素在酶解前进行预处理，预处理采用机械粉碎、辐射、微波、酸处理、碱处理、蒸汽爆破预处理和/或溶剂预处理，或者采用上述方法的组合预处理。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述木质纤维素原料为玉米秸秆，预处理采用蒸汽爆破预处理。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：预处理具体过程如下：将切碎的木质纤维素原料通入到蒸汽爆破装置，在160-210℃下维持5-10min，瞬间泄压释放，即得到蒸汽爆破预处理的木质纤维素原料。
12.根据权利要求9或11所述的方法，其特征在于：预处理后的原料配制成干物质浓度为5wt%-15wt%的料液。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：预处理后的原料配制成干物质浓度为5wt%-10wt%的料液。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶解过程中加入的纤维素酶是能降解纤维素的单一酶或者复合酶。
15.根据权利要求1或14所述的方法，其特征在于：所述酶解过程中加入的纤维素酶是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或β-葡聚糖苷酶中的一种或几种。
16.根据权利要求1或14所述的方法，其特征在于：所述酶解过程中，纤维素酶的加入量为5-25IU/g木质纤维素。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：纤维素酶的加入量为10-20IU/g木质纤维素。
18.根据权利要求1或14所述的方法，其特征在于：所述酶解过程中，酶解的pH为4.5-5.5，酶解温度为40-60℃，酶解时间24-72h。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于：酶解温度为45-55℃，酶解时间36-48h。
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