CN103103220A

CN103103220A - 以汽爆法处理的木质纤维素为原料的同步糖化和乙醇发酵法

Info

Publication number: CN103103220A
Application number: CN2013100198198A
Authority: CN
Inventors: 田沈; 杨秀山
Original assignee: Capital Normal University
Current assignee: Capital Normal University
Priority date: 2013-01-18
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2013-05-15

Abstract

本发明提供了一种以汽爆法预处理的木质纤维素为原料的同步糖化和乙醇发酵法，其是以汽爆法处理的木质纤维素为原料，未经脱毒处理直接作为底物，添加由纤维素酶和β-葡萄糖苷酶组成的混合酶，同时接种保藏号为CGMCC No.2660的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y5，并加入氮源，进行乙醇发酵生产。本发明省去了蒸汽爆破预处理木质纤维素原料（如玉米秸秆）水洗脱毒步骤并得到了高浓度的发酵终产物乙醇。例如，蒸汽爆破玉米秸秆的浓度30%，同步糖化和发酵的时间96h，100ml反应器、3000ml反应器和5L发酵罐的乙醇浓度分别达到50g/L、47.8g/L和47.5g/L。大大简化了生产工艺，降低设备投资，减少水消耗，降低生产成本。

Description

以汽爆法处理的木质纤维素为原料的同步糖化和乙醇发酵法

技术领域

本发明涉及同步糖化和乙醇发酵领域，具体地说，涉及一种以汽爆法处理的木质纤维素为原料的同步糖化和乙醇发酵法。

背景技术

木质纤维素是一种廉价、广泛存在的可再生资源，利用木质纤维素生产燃料乙醇是未来能源发展的一个重要方向，可以缓解能源危机，同时保护环境。蒸汽爆破法是近几年发展起来的木质纤维素预处理方法之一，但利用汽爆预处理物料生产燃料乙醇的瓶颈就是在蒸汽汽爆过程中产生的毒性物质如乙酸、糠醛及5-HMF对酵母生长及发酵的抑制作用。因此，在酶解发酵前须对蒸汽爆破处理后的物料用水洗、物理、化学和生物等方法进行脱毒。

Yanling Yu（2011年）曾报道利用构巢曲霉(FLZ10)对玉米秸秆蒸汽爆破预处理未脱毒的酶解液进行生物脱毒处理，同时用酿酒酵母进行SSF(simultaneous saccharification and fermentation，同步糖化和发酵，简称SSF)，乙醇浓度达到34g/L。但生物脱毒也增加了设备投资和成本，同时该SSF体系使用的是1.3L体系发酵罐进行，但实际有效体积仅为500ml，20%(w/v)底物浓度不高，致使发酵液的乙醇含量低，工业生产需要发酵液中的乙醇基准浓度为5%以上，才使乙醇的蒸馏具有经济效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种以汽爆法处理的木质纤维素为原料的同步糖化和乙醇发酵法。

为了实现本发明目的，本发明的一种以汽爆法处理的木质纤维素为原料的同步糖化和乙醇发酵法（SSF），其是以汽爆法处理的木质纤维素为原料，未经脱毒处理直接作为底物，添加由纤维素酶和β-葡萄糖苷酶组成的混合酶，同时接种保藏号为CGMCC No.2660的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y5，并加入氮源，进行乙醇发酵生产。

前述的SSF法，发酵过程中按分批补料的方式向发酵体系中补加底物和混合酶。

前述的SSF法，发酵体系中底物浓度控制在10%-30%（w/v），乙酸（汽爆预处理时产生）浓度为6-20g/L。

前述的SSF法，所述混合酶为纤维素酶和β-葡萄糖苷酶按等比例混合，即发酵体系中混合酶的浓度为：纤维素酶15FPU/g底物，β-葡萄糖苷酶15CBU/g底物。

前述的SSF法，所接种的酿酒酵母Y5为培养至对数期的菌种，接种量为5%-10%（v/v），优选10%（v/v）。

前述的SSF法，使用的氮源为酵母膏和蛋白胨，其在发酵体系中的浓度分别为10g/L和20g/L；或氮源使用玉米浆，其在发酵体系中的浓度为20-40ml/L。

前述的SSF法，发酵条件为30-37℃（优选35℃），200-300rpm，

发酵时间48-96h。

前述的SSF法，控制发酵体系的pH值4.6-5.0（优选pH值4.8）。

前述的SSF法，木质纤维素的原料为玉米秸秆等。

前述的SSF法，利用汽爆法处理玉米秸秆的条件为：将玉米秸秆粉碎为1cm以内的小段，蒸汽爆破温度200-210℃（优选205℃），压力2MPa，保留时间5-6min（优选5min）。汽爆玉米秸秆含水率50%，

未经脱毒直接用作反应底物。经测定，汽爆玉米秸秆的主要成分及百分比如表1所示：

表1汽爆前后玉米秸秆主要成分含量（%,DM）

本发明通过分批补料方式增加底物浓度，利用全自动发酵罐（5L），对汽爆预处理的玉米秸秆不经脱毒处理，直接进行30%（w/v）底物浓度的SSF，以探明酿酒酵母Y5在纤维素乙醇生产工艺中，对简化生产工艺，降低设备投资，减少水消耗，提高乙醇浓度等方面的潜力。本发明首次利用菌株Y5对含高浓度底物和高浓度乙酸的未脱毒玉米秸秆进行SSF乙醇发酵并获得高浓度乙醇含量，之前未有相关报道。

相对于现有技术，本发明的优点在于：

为省去蒸汽爆破预处理木质纤维素原料（如玉米秸秆）水洗脱毒步骤和提高乙醇发酵的终产物乙醇浓度，本发明利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y5（保藏号CGMCC No.2660），对蒸汽爆破预处理的玉米秸秆不经脱毒处理，直接进行同步糖化和发酵（SSF）。例如，蒸汽爆破玉米秸秆的浓度30%，同步糖化和发酵的时间96h，100ml反应器、3000ml反应器和5L发酵罐的乙醇浓度分别达到50g/L、47.8g/L和47.5g/L。结果表明，菌株Y5在纤维素乙醇生产中具有重要的应用前景，可大大简化生产工艺，降低设备投资，减少水消耗，降低生产成本。

附图说明

图1为本发明实施例1中100ml摇瓶30%底物浓度的未脱毒汽爆玉米秸秆的SSF试验结果。

图2为本发明实施例1中3000ml摇瓶30%底物浓度的未脱毒汽爆玉米秸秆的SSF试验结果。

图3为本发明实施例1中5L发酵罐30%底物浓度的未脱毒汽爆玉米秸秆的SSF试验结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明中涉及的保藏号为CGMCC No.2660的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y5由首都师范大学生命科学学院提供。

实施例以汽爆法预处理的木质纤维素为原料的同步糖化和乙醇发酵法

1.1材料及仪器

用于汽爆预处理的玉米秸秆由河南天冠企业集团有限公司提供。KYC型恒温培养振荡器，德国Sartorius BIOSTAT B plus5L全自动发酵罐。

1.2汽爆预处理玉米秸秆

先将玉米秸秆粉碎为1cm以内的小段，蒸汽爆破温度为205℃，压力为2.0MPa，保留时间为5min。汽爆玉米秸秆含水率50%，未经脱毒直接用作反应底物。经测定，汽爆玉米秸秆的主要成分及百分比如表1所示：

表1汽爆前后玉米秸秆主要成分含量（%,DM）

1.3菌种培养

从斜面挑取Y5菌落一环，接入100mL YPD培养基中，30℃，

150rpm，培养至对数期。再转接入YPD液体培养基中，相同条件下培养至对数期，经测定细胞干重为6g/L。

1.4酶用量

向底物中添加的酶是由纤维素酶和β-葡萄糖苷酶组成的混合酶。加入的纤维素酶均补加等量的β-葡萄糖苷酶，即每加入1FPU纤维素酶（Celluclast1.5L），补加1IUβ-葡萄糖苷酶（Novozyme188），用量以酶活力与反应体系中所含的纤维素质量之比计算。

1.5汽爆玉米秸秆30%（w/v）底物浓度的SSF

1.5.1 100ml摇瓶（有效体积50ml）

初始底物浓度为10%（w/v），向蒸馏水中添加纤维素酶Celluclast1.5L15FPU/g WIS（WIS指水不溶性固体，即底物），β-葡萄糖苷酶Novozyme188 15CBU/g WIS，氮源。接种量为10%（v/v）。用4M NaOH调节反应体系pH为4.8。每12h进行补料和同比例添加酶，使最终底物浓度达到30%（w/v），35℃，200rpm，每12h取样测定糖、乙酸和乙醇含量。该组试验共设3个平行。

1.5.2 3000mL摇瓶（有效体积1L）

将上述100ml摇瓶扩大到3000mL摇瓶，35℃，200rpm，每12h取样测定糖、乙酸和乙醇含量。

1.5.3 5L发酵罐（有效体积2.5L）

利用5L全自动发酵罐进行未脱毒汽爆玉米秸秆的乙醇发酵研究，有效体积2.5L。初始底物浓度为10%（w/v），在蒸馏水中添加纤维素酶Celluclast1.5L15FPU/g WIS，β-葡萄糖苷酶Novozyme18815CBU/g WIS。接种量为10%（v/v）。转速300rpm，通气量30L/h。自动调节反应体系的PH值4.8。每12h取样，同时进行同比例补加底物和酶。

1.6分析方法

乙醇及糠醛含量的测定：气相色谱仪（安捷伦7890A GC）。乙醇测定条件：色谱柱为HJ-PEG-20M，柱温120℃，检测器温度200℃，N2为载气，流速4mL/min。糠醛测定条件：柱温120℃，检测器温度50℃，进样量50μL。

弱酸含量测定：气相色谱仪（岛津GCZO01）。色谱柱为玻璃柱，N2为载气，柱温170℃，检测器为FID，检测器温度200℃。

糖含量测定：高效液相色谱仪（Waters2690）。氨柱（200mm×4.6mm），柱温40℃，Waters410示差检测器，流动相乙腈：水=3：1，流速1mL/min，进样量20μL。

1.7结果

1.7.1 100ml摇瓶（有效体积50ml），底物浓度30%（w/v）的SSF

结果如图1所示。初始底物浓度10%（w/v），前6h菌株代谢延滞，葡萄糖有一定程度积累，随后由于乙醇的不断产生使得葡萄糖累积减少。48h第四次补料结束后，葡萄糖的积累开始解除，84h代谢完葡萄糖，24h乙醇的产生速率为1.05g/L.h，96h最大乙醇浓度达到50g/L,远远超过木质纤维素原料工业生产乙醇的基准浓度。同时由图1可以看出，该反应体系中初始乙酸浓度在6g/L左右，随着几次补料的进行，乙酸浓度在逐渐增加。当四次补料结束，最终乙酸浓度达到了20g/L左右。在如此高的乙酸浓度下，该菌株产乙醇能力并未受到明显的负面影响，表明酿酒酵母Y5具有高的耐乙酸能力和高的乙醇生产潜力

1.7.2 3000ml摇瓶（有效体积1L），底物浓度30%（w/v）的SSF

结果如图2所示。12h乙醇的产生速率达到1.29g/L.h，24h的乙醇产生速率为1.21g/L.h，随着补料的进行，乙醇的浓度在逐渐积累，48h的乙醇产生速率降低到0.79g/L.h。96h，乙醇浓度达到最大值47.8g/L，相比100ml摇瓶试验的结果略有下降，可能是体系扩大的误差所致。葡萄糖的浓度一直在10g/L以下，72h后，葡萄糖浓度不可测出。同时，该体系中的乙酸浓度与100ml摇瓶的试验结果相同。表明Y5具有良好的代谢葡萄糖，同时耐高浓度乙酸抑制剂和获得高乙醇浓度的能力。

1.7.3 5L发酵罐（有效体积2.5L）的SSF

为了考察酿酒酵母Y5的工业化应用前景，在上述两个试验的基础上，进一步将上述30%（w/v）底物浓度用5L发酵罐进行SSF。

结果如图3所示。发酵罐运转12h，乙醇产生速率1.42g/L.h。随着补料的进行，乙醇产生速率有减慢趋势，24h乙醇的产生速率降到0.97g/L.h，直到48h补料结束，乙醇产生速率继续呈上升趋势。96h的最终乙醇浓度达到47.5g/L。糖浓度在前48h保持在2.67g/L，48h补料完成后，糖积累缓慢解除，72h糖消耗完。反应系统中乙酸浓度的变化与100ml和3000ml摇瓶中乙酸浓度变化相似，表明Y5具有较强的耐乙酸抑制剂并同时高效代谢葡萄糖产乙醇的能力。在本发明中，酿酒酵母Y5可耐受高达20g/l浓度的乙酸，并最终获得高浓度的乙醇终产物。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.以汽爆法处理的木质纤维素为原料的同步糖化和乙醇发酵法，其特征在于，以汽爆法处理的木质纤维素为原料，未经脱毒处理直接作为底物，添加由纤维素酶和β-葡萄糖苷酶组成的混合酶，同时接种保藏号为CGMCC No.2660的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y5，并加入氮源，进行乙醇发酵生产。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵过程中按分批补料的方式向发酵体系中补加底物和混合酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵体系中底物浓度为30%（w/v），乙酸浓度为6-20g/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵体系中混合酶的浓度为：纤维素酶15FPU/g底物，β-葡萄糖苷酶15CBU/g底物。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所接种的酿酒酵母Y5为培养至对数期的菌种，接种量为5%-10%（v/v）。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用的氮源为酵母膏和蛋白胨，其在发酵体系中的浓度分别为10g/L和20g/L；或氮源使用玉米浆，其在发酵体系中的浓度为20-40ml/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵条件为30-37℃，200-300rpm，发酵时间48-96h。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，控制发酵体系的pH值4.6-5.0。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，木质纤维素的原料为玉米秸秆。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，利用汽爆法处理玉米秸秆的条件为：将玉米秸秆粉碎为1cm以内的小段，蒸汽爆破温度200-210℃，压力2MPa，保留时间5-6min。