CN104073526B - 一种利用木质纤维原料生产丙酮/丁醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用木质纤维原料生产丙酮/丁醇的方法。该方法将嗜纤维梭菌(Clostridium cellulovorans ATCC35296)与拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052)按一定比例接入以玉米棒芯为唯一碳源的培养基上，在一定温度和pH控制条件下混菌发酵，直接利用玉米棒芯生产丙酮/丁醇。利用该方法可以在一个反应器内实现纤维素酶生产、玉米棒芯降解和糖化、己糖与戊糖同步发酵生产丙酮/丁醇的过程，大幅度降低纤维素丁醇的生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种将木质纤维素降解菌与溶剂高产菌混菌培养的工艺，尤其涉及一种利用木质纤维原料生产丙酮/丁醇的方法。
背景技术
丁醇是一种优良的溶剂和重要的化工原料，广泛应用于化工、塑料、有机合成、油漆、制药、提取植物油以及生产有机玻璃、合成橡胶等工业。另外，由于具备比乙醇能量密度更高，可与汽油以任意比例混合，挥发性低，可利用输油管道输送等优点，丁醇有望取代乙醇成为下一代可再生燃料添加剂。
丁醇的工业制法主要有丙烯羰基合成法、乙醛醇醛缩合法、发酵法三种，其中前两者均以石油为原料。丙酮/丁醇发酵是制备丁醇的最主要的方法，后来由于石油工业的崛起，生物丁醇发酵曾急剧衰落，直到近年来随着全球能源危机和环境危机的日益凸显，才又重新被重视起来。
传统的ABE发酵以玉米、谷物等粮食作物为原料，近年来随着粮价上涨及各国对粮食安全的重视，生物丁醇的生产在成本和伦理上面临重大挑战，因而寻找可再生的替代性原料成为研究热点。木质纤维素作为地球上数量最大的一种可再生资源，是丁醇发酵的理想原料之一。目前利用木质纤维原料生产丁醇也有较多报道，但需先对原料预处理后添加纤维素酶水解糖化，然后发酵。由于纤维素酶价格高昂，纤维素丁醇生产成本较高，不具备竞争优势。
如果能够将纤维素酶的生产、纤维原料的水解糖化及丁醇发酵集成在一个反应器中一步进行，那么实际生产中的纤维素酶生产和消耗、设备费、操作费等成本将大幅度降低。统合生物加工工艺（CBP, Consolidated bioprocessing）就是这样一种集成工艺技术，能够纤使维素丁醇的生产成本将大大降低。但是CBP工艺对微生物的要求极高。参与该生产过程的微生物，既要能够高产多种纤维素酶，又要能够对水解得到的己糖、戊糖高效利用生产丁醇。孤立的看，上述各种条件都能在现有的微生物中找到，但是到目前为止还没有一个天然的微生物或者微生物系统能够同时满足以上所有条件。研究者曾尝试在在丁醇高产菌株中异源表达纤维素酶（Mingardon F, Chanal A, Tardif C, Fierobe H, 2011,77:2831-2838）或者在纤维素降解菌菌株中添加丁醇代谢途径（Higashide W, Li Y, Yang Y,Liao J, 2011, 77:2727–2733）等方法，但是都未实现纤维素丁醇的CBP法生产。将纤维素降解菌和丁醇生产菌混菌培养是是当前实现统合生物加工工艺生产纤维素丁醇的理想选择。
Petitdemange（Petitdemange E, Fond O, Caillet F, 1983, 5: 119-124）和Yu（Yu E, Chan M, Saddler J, 1985, 7: 509-514）等在1980年代曾进行了热纤梭菌Clostridium thermocellum、解纤维梭菌Clostridium cellulolyticum分别和丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum的混菌发酵木质纤维素生产丁醇的研究，但实验结果并不理想，发酵停留在产酸期，溶剂产量低，需要额外添加丁酸诱导才能生产丁醇。2011年，Nakayama等(Nakayama S, Kiyoshi K, Kadokura T, 2011, 77: 6470-6475)选择糖乙酸多丁醇梭菌Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4与热纤梭菌C.thermocellum以结晶纤维素为底物进行偶联发酵，历时11 d生产丁醇7.9 g/L，初步实现纤维素直接厌氧发酵生产丁醇。2013年，林逸君等（Lin Y, Wen Z, Zhu L, Lin J, Cen P,2013, 3:444–449）通过采用新的偶联发酵策略（即先利用热纤梭菌C. thermocellum降解玉米棒芯累积较多可发酵糖后再接入拜氏梭菌C. beijerinckii进行丁醇发酵）在180 h内生产了16.0 g/L溶剂，其中丁醇产量高达8.75 g/L。但是由于热纤梭菌与拜氏梭菌的培养温度不匹配，发酵过程历经高温（60℃）和中温（37℃）两个阶段。纤维素糖化与丁醇发酵在时间上的不同步，导致整个生产过程历时180 h，溶剂生产强度仅有0.0889 g/L/h。而采用中温培养的纤维素降解菌与溶剂生产菌混菌培养，可以使纤维素糖化和丁醇发酵在时间和空间上同步进行，从而缩短发酵周期，提高生产强度。
嗜纤维梭菌C. cellulovorans是目前纤维素降解能力较强的厌氧菌之一，其木质纤维素降解速率大于自身糖代谢速率，利用纤维素为唯一碳源发酵时有可发酵糖积累。另外，它还能生产较高浓度的丁酸，而丁酸正是丁醇等溶剂生产的前体物质。这一优点也是热纤梭菌、解纤维梭菌等其他纤维素降解菌所不具备的。拜氏梭菌C. beijerinckii因能同时利用木糖和葡萄糖生产溶剂，且抗逆性强，近年来，越来越多的研究选择其作为发酵木质纤维素水解液的溶剂菌。
目前，国内外同类研究中还未见利用嗜纤维梭菌与拜氏梭菌混菌培养发酵直接木质纤维原料生产丁醇的报道。因此构建嗜纤维梭菌与拜氏梭菌的混菌发酵体系，将纤维素酶生产、木质纤维原料酶解及糖化、丁醇发酵集成在一个反应器中且同步进行，直接以代表性的木质纤维素——玉米棒芯为为原料厌氧发酵生产丙酮/丁醇，将为木质纤维素的生物炼制和纤维素丁醇的CBP工艺开发提供有益的思路和方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种利用木质纤维原料生产丙酮/丁醇的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种利用木质纤维原料生产丙酮/丁醇的方法，包括以下步骤：
（1）将保存于冷冻甘油管的混菌发酵体系的一种发酵菌株C.cellulovoransATCC35296（发酵菌株C.cellulovoransATCC35296的量为1 mL）接入装有200 mL Clocel-1培养基的血清瓶，33~40℃静置培养18~24 h，得到发酵菌株C.cellulovoransATCC35296的一级种子；将混菌体系的另一种发酵菌株C.beijerinckiiNCIMB8052的芽孢悬液（发酵菌株C.beijerinckiiNCIMB8052的芽孢悬液的量为1 mL）在80℃下热击10 min后，接入装有200mL TGY培养基的血清瓶，33~40℃静置培养18~24 h，得到发酵菌株C.beijerinckiiNCIMB8052的一级种子。
所述Clocel-1培养基是由质量体积比为10 g/L~30 g/L玉米棒芯、0.5 g/L~1 g/L酵母粉、0.5 g/L~1 g/L蛋白胨、1.65 g/L Na(CH3COO)、1.5 g/L NH4Cl、1 g/L K2HPO4、0.5g/L MgSO4 .7H2O、0.5 g/L KCl、0.00125 g/L FeSO4、0.5 g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.001 g/L刃天青、0.0001 g/L维生素B1、0.000001 g/L生物素、0.0001 g/L对氨基苯甲酸组成，其pH值为6.8~7.2；
所述的TGY培养基是由质量体积比分别为4 g/L~6 g/L蛋白胨、2 g/L~4 g/L酵母粉、2 g/L葡萄糖、0.5 g/L的 L-半胱氨酸盐酸盐组成，其pH值为7.0-7.5。
（2）取100~200 mL由步骤（1）得到的C.cellulovoransATCC35296一级种子和5~100mL由步骤（1）得到的C.beijerinckiiNCIMB8052一级种子接种于含1800 mL Clocel-2培养基的5 L发酵罐中，发酵转速为100~150 r/min，培养温度33~40℃，用2~5 mol/L 氢氧化钠控制发酵pH值为6.8~7.2。待发酵至24~48 h后，不再控制pH值，直至发酵结束，得到丙酮/丁醇。
所述的Clocel-2培养基是由质量体积比分别为60 g/L~70 g/L玉米棒芯、0.5 g/L~1 g/L酵母粉、0.5 g/L~1 g/L蛋白胨、1.65 g/L Na(CH3COO)、1.5 g/L NH4Cl、1 g/LK2HPO4、0.5 g/L MgSO4 .7H2O、0.5 g/L KCl、0.00125 g/L FeSO4、0.5 g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.001 g/L刃天青、0.0001 g/L维生素B1、0.000001 g/L生物素、0.0001 g/L对氨基苯甲酸组成，其pH值为6.8~7.2；
本发明中，所述发酵菌株C. cellulovorans，分类命名：中文名为嗜热纤维梭菌，拉丁文学名为Clostridium cellulovorans ATCC 35296。发酵菌株C. beijerinckii，分类命名：中文名为拜氏梭菌，拉丁文学名为Clostridium beijerinckii NCIMB 8052。发酵菌株C. cellulovorans ATCC 35296和发酵菌株C. beijerinckii NCIMB 8052均为商用菌株，可在ATCC、DSMZ等国际菌种保藏机构购买。
本发明的有益效果是：本发明采用统合生物加工法，厌氧发酵直接将木质纤维原料降解并进一步发酵成为以丁醇为主的溶剂。本发明工艺可操作性强，通过C.cellulovorans和C. beijerinckii混菌发酵能够将纤维素酶的生产、纤维原料的降解和糖化、己糖戊糖的同步发酵集成在一个反应器内且同步进行，有效地直接利用经简单预处理的玉米棒芯生产丙酮/丁醇等溶剂，明显缩短了发酵时间，大大降低了纤维素丁醇的生产成本，适合于工业化应用，前景广阔。
附图说明
图1是C. cellulovorans和C. beijerinckii混菌发酵玉米棒芯特性曲线图。其中：图（A）是发酵液中总溶剂、总糖、玉米棒芯及pH随时间变化曲线图，图（B）是发酵液中各种有机酸及溶剂随时间变化曲线图；
图2是C. cellulovorans和C. beijerinckii混菌发酵玉米棒芯特性曲线图。其中：图（A）是发酵液中总溶剂、总糖、玉米棒芯及pH随时间变化曲线图，图（B）是发酵液中各种有机酸及溶剂随时间变化曲线图；
图3是C. cellulovorans和C. beijerinckii混菌发酵玉米棒芯特性曲线图。其中：图（A）是发酵液中总溶剂、总糖、玉米棒芯及pH随时间变化曲线图，图（B）是发酵液中各种有机酸及溶剂随时间变化曲线图；
图4 是C. cellulovorans和C. beijerinckii混菌发酵玉米棒芯特性曲线图。其中：图（A）是发酵液中总溶剂、总糖、玉米棒芯及pH随时间变化曲线图，图（B）是发酵液中各种有机酸及溶剂随时间变化曲线图。
以下结合实施例进一步说明此发明
实施例1
（1）将保存于冷冻甘油管的混菌发酵体系的一种发酵菌株C.cellulovoransATCC35296（1 mL）接入装有200 mL Clocel-1培养基的血清瓶，37℃静置培养24 h，得到发酵菌株C. cellulovorans ATCC35296的一级种子；将混菌体系的另一种发酵菌株C. beijerinckii NCIMB8052的芽孢悬液（1 mL）在80℃下热击10min后，接入装有200 mL TGY培养基的血清瓶，37℃静置培养18h，得到发酵菌株C. beijerinckiiNCIMB8052的一级种子。
所述Clocel-1培养基是由质量体积比为30 g/L玉米棒芯、0.5 g/L酵母粉、0.5 g/L蛋白胨、1.65 g/L Na(CH3COO)、1.5 g/L NH4Cl、1 g/L K2HPO4、0.5 g/L MgSO4 .7H2O、0.5g/L KCl、0.00125 g/L FeSO4、0.5 g/L的L-半胱氨酸盐酸盐、0.001 g/L刃天青、0.0001 g/L维生素B1、0.000001 g/L生物素、0.0001 g/L对氨基苯甲酸组成，其pH值为7.2；
所述的TGY培养基是由质量体积比分别为5 g/L蛋白胨、3 g/L酵母粉、2 g/L葡萄糖、0.5 g/L的L-半胱氨酸盐酸盐组成，其pH值为7.0；
（2）取200 mL由步骤（1）得到的C. cellulovoransATCC35296一级种子和20 mL由步骤（1）得到的C. beijerinckiiNCIMB8052一级种子接种于含1800 mL Clocel-2培养基的5 L发酵罐中，发酵转速为150 r/min，培养温度37℃，用5 mol/L氢氧化钠控制发酵pH值为7.0。待发酵至24 h后，不再控制pH值，直至发酵结束，得到丙酮/丁醇。
所述的Clocel-2培养基是由质量体积比分别为70 g/L玉米棒芯、0.5 g/L酵母粉、0.5 g/L蛋白胨、1.65 g/L Na(CH3COO)、1.5 g/L NH4Cl、1 g/L K2HPO4、0.5 g/LMgSO4 .7H2O、0.5 g/L KCl、0.00125 g/L FeSO4、0.5 g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.001 g/L刃天青、0.0001 g/L维生素B1、0.000001 g/L生物素、0.0001 g/L对氨基苯甲酸组成，其pH值为7.0。
3）发酵进行值42.5 h时，补加玉米棒芯30 g/L继续发酵至结束。
采用GC测定溶剂和有机酸含量，采用硫酸-苯酚法（Saha S, Brewer C, 1994,254:157–167）测定发酵液中总糖含量。干重法测定玉米棒芯含量。
由图1可见，整个混菌发酵过程曾现出明显的两阶段特征，即产酸期及随后的产溶剂期。前36 h，嗜纤维梭菌生长占优势，玉米棒芯被嗜纤维梭菌有效降解，发酵液中总糖持续积累，乙酸、丁酸大量生产；之后随着pH值逐渐下降，嗜纤维梭菌生长受抑制，而拜氏梭菌生长占优。拜氏梭菌利用发酵液中的可发酵糖和丁酸、乙酸等有机酸进行丁醇发酵，于是丁醇为主的溶剂开始大量生产。混菌发酵持续了88 h，末期总溶剂达11.9 g/L，其中丁醇浓度8.30 g/L。整个过程丁醇生产强度为0.0938 g/L/h，相比于林逸君等的研究结果，提高了86.5%。
实施例2
一种利用木质纤维原料生产丙酮/丁醇的方法，包括以下步骤：
（1）将保存于冷冻甘油管的混菌发酵体系的一种发酵菌株C.cellulovoransATCC35296（1 mL）接入装有200 mL Clocel-1培养基的血清瓶，38℃静置培养24 h，得到发酵菌株C. cellulovoransATCC35296的一级种子；将混菌体系的另一种发酵菌株C. beijerinckiiNCIMB8052的芽孢悬液（1 mL）在80℃下热击10min后，接入装有200mL TGY培养基的血清瓶，38℃静置培养24 h，得到发酵菌株C. beijerinckiiNCIMB8052的一级种子。
所述Clocel-1培养基是由质量体积比为10 g/L玉米棒芯、1 g/L酵母粉、1 g/L蛋白胨、1.65 g/L Na(CH3COO)、1.5 g/L NH4Cl、1 g/L K2HPO4、0.5 g/L MgSO4 .7H2O、0.5 g/LKCl、0.00125 g/L FeSO4、0.5 g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.001 g/L刃天青、0.0001 g/L维生素B1、0.000001 g/L生物素、0.0001 g/L对氨基苯甲酸组成，其pH值为6.8；
所述的TGY培养基是由质量体积比分别为6 g/L蛋白胨、2 g/L~4 g/L酵母粉、2 g/L葡萄糖、0.5 g/L的 L-半胱氨酸盐酸盐组成，其pH值为7.0；
（2）取100 mL由步骤（1）得到的C. cellulovorans ATCC35296一级种子和5 mL 由步骤（1）得到的C. beijerinckii NCIMB8052一级种子接种于含1800 mL Clocel-2培养基的5L发酵罐中，发酵转速为100 r/min，培养温度38℃，用2 mol/L 氢氧化钠控制发酵pH值为6.8。待发酵至24h后，不再控制pH值，直至发酵结束，得到丙酮/丁醇。
所述的Clocel-2培养基是由质量体积比分别为70 g/L玉米棒芯、1 g/L酵母粉、1g/L蛋白胨、1.65 g/L Na(CH3COO)、1.5 g/L NH4Cl、1g/L K2HPO4、0.5 g/L MgSO4 .7H2O、0.5g/L KCl、0.00125 g/L FeSO4、0.5 g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.001 g/L刃天青、0.0001 g/L维生素B1、0.000001 g/L生物素、0.0001 g/L对氨基苯甲酸组成，其pH值为6.8。
采用GC测定溶剂和有机酸含量，采用硫酸-苯酚法（Saha S, Brewer C, 1994,254:157–167）测定发酵液中总糖含量。干重法测定玉米棒芯含量。
由图2可见，整个混菌发酵过程曾现出明显的两阶段特征，即产酸期及随后的产溶剂期。前36 h，嗜纤维梭菌生长占优势，玉米棒芯被嗜纤维梭菌有效降解，发酵液中总糖持续积累，乙酸、丁酸大量生产；之后随着pH值逐渐下降，嗜纤维梭菌生长受抑制，而拜氏梭菌生长占优。拜氏梭菌利用发酵液中的可发酵糖和丁酸、乙酸等有机酸进行丁醇发酵，于是丁醇为主的溶剂开始大量生产。混菌发酵持续了96 h，末期总溶剂达5.94 g/L，其中丁醇浓度4.20 g/L。
实施例3
一种利用木质纤维原料生产丙酮/丁醇的方法，包括以下步骤：
（1）将保存于冷冻甘油管的混菌发酵体系的一种发酵菌株C.cellulovoransATCC35296（1 mL）接入装有200 mL Clocel-1培养基的血清瓶，37℃静置培养24 h，得到发酵菌株C. cellulovoransATCC35296的一级种子；将混菌体系的另一种发酵菌株C. beijerinckiiNCIMB8052的芽孢悬液（1 mL）在80℃下热击10 min后，接入装有200mL TGY培养基的血清瓶，37 ℃静置培养18 h，得到发酵菌株C. beijerinckiiNCIMB8052的一级种子。
所述Clocel-1培养基是由质量体积比为30 g/L玉米棒芯、0.5 g/L酵母粉、0.5 g/L蛋白胨、1.65 g/L Na(CH3COO)、1.5 g/L NH4Cl、1 g/L K2HPO4、0.5 g/L MgSO4 .7H2O、0.5g/L KCl、0.00125 g/L FeSO4、0.5 g/L的L-半胱氨酸盐酸盐、0.001 g/L刃天青、0.0001 g/L维生素B1、0.000001 g/L生物素、0.0001 g/L对氨基苯甲酸组成，其pH值为7.2；
所述的TGY培养基是由质量体积比分别为5 g/L蛋白胨、3 g/L酵母粉、2 g/L葡萄糖、0.5 g/L的L-半胱氨酸盐酸盐组成，其pH值为7.0；
（2）取200 mL由步骤（1）得到的C. cellulovoransATCC35296一级种子和10 mL由步骤（1）得到的C. beijerinckiiNCIMB8052一级种子接种于含1800 mL Clocel-2培养基的5L发酵罐中，发酵转速为150 r/min，培养温度37 ℃，用5 mol/L氢氧化钠控制发酵pH值为7.0。待发酵至36 h后，不再控制pH值，直至发酵结束，得到丙酮/丁醇。
所述的Clocel-2培养基是由质量体积比分别为70 g/L玉米棒芯、0.5 g/L酵母粉、0.5 g/L蛋白胨、1.65 g/L Na(CH3COO)、1.5 g/L NH4Cl、1 g/L K2HPO4、0.5 g/LMgSO4 .7H2O、0.5 g/L KCl、0.00125 g/L FeSO4、0.5 g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.001 g/L刃天青、0.0001 g/L维生素B1、0.000001 g/L生物素、0.0001 g/L对氨基苯甲酸组成，其pH值为7.0。
采用GC测定丙酮/丁醇的含量和有机酸含量，采用硫酸-苯酚法（Saha S, BrewerC, 1994, 254:157–167）测定发酵液中的总糖含量。干重法测定玉米棒芯含量。
由图3可见，整个混菌发酵过程曾现出明显的两阶段特征，即产酸期及随后的产溶剂期。前48 h，嗜纤维梭菌生长占优势，玉米棒芯被嗜纤维梭菌有效降解，发酵液中总糖持续积累，乙酸、丁酸大量生产；之后随着pH值逐渐下降，嗜纤维梭菌生长受抑制，而拜氏梭菌生长占优。拜氏梭菌利用发酵液中的可发酵糖和丁酸、乙酸等有机酸进行丁醇发酵，于是丁醇为主的溶剂开始大量生产。混菌发酵持续了96 h，混菌发酵末期总溶剂达5.76 g/L，其中丁醇浓度4.11 g/L。
实施例4
一种利用木质纤维原料生产丙酮/丁醇的方法，包括以下步骤：
（1）将保存于冷冻甘油管的混菌发酵体系的一种发酵菌株C.cellulovoransATCC35296（1 mL）接入装有200 mL Clocel-1培养基的血清瓶，33 ℃静置培养18 h，得到发酵菌株C. cellulovoransATCC35296的一级种子；将混菌体系的另一种发酵菌株C. beijerinckiiNCIMB8052的芽孢悬液（1 mL）在80℃下热击10min后，接入装有200mL TGY培养基的血清瓶，33 ℃静置培养18h，得到发酵菌株C. beijerinckiiNCIMB8052的一级种子。
所述Clocel-1培养基是由质量体积比为30 g/L玉米棒芯、0.5 g/L酵母粉、0.5 g/L蛋白胨、1.65 g/L Na(CH3COO)、1.5 g/L NH4Cl、1g/L K2HPO4、0.5 g/L MgSO4 .7H2O、0.5 g/L KCl、0.00125 g/L FeSO4、0.5 g/L的L-半胱氨酸盐酸盐、0.001 g/L刃天青、0.0001 g/L维生素B1、0.000001 g/L生物素、0.0001 g/L对氨基苯甲酸组成，其pH值为7.2；
所述的TGY培养基是由质量体积比分别为4 g/L蛋白胨、4 g/L酵母粉、0.2 g/L葡萄糖、0.5 g/L的L-半胱氨酸盐酸盐组成，其pH值为7.5；
（2）取200 mL由步骤（1）得到的C. cellulovoransATCC35296一级种子和50 mL由步骤（1）得到的C. beijerinckiiNCIMB8052一级种子接种于含1800 mL Clocel-2培养基的5 L发酵罐中，发酵转速为150 r/min，培养温度33 ℃，用5 mol/L氢氧化钠控制发酵pH值为7.2。待发酵至48 h后，不再控制pH值，直至发酵结束，得到丙酮/丁醇。
所述的Clocel-2培养基是由质量体积比分别为70 g/L玉米棒芯、0.5 g/L酵母粉、0.5 g/L蛋白胨、1.65 g/L Na(CH3COO)、1.5 g/L NH4Cl、1 g/L K2HPO4、0.5 g/LMgSO4 .7H2O、0.5 g/L KCl、0.00125 g/L FeSO4、0.5 g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.001 g/L刃天青、0.0001 g/L维生素B1、0.000001 g/L生物素、0.0001 g/L对氨基苯甲酸组成，其pH值为7.2。
采用GC测定丙酮/丁醇的含量和有机酸含量，采用硫酸-苯酚法（Saha S, BrewerC, 1994, 254:157–167）测定发酵液中的总糖含量。干重法测定玉米棒芯含量。
由图4可见，整个混菌发酵过程曾现出明显的两阶段特征，即产酸期及随后的产溶剂期。前60 h，嗜纤维梭菌生长占优势，玉米棒芯被嗜纤维梭菌有效降解，发酵液中总糖持续积累，乙酸、丁酸大量生产；之后随着pH值逐渐下降，嗜纤维梭菌生长受抑制，而拜氏梭菌生长占优。拜氏梭菌利用发酵液中的可发酵糖和丁酸、乙酸等有机酸进行丁醇发酵，于是丁醇为主的溶剂开始大量生产。混菌发酵持续了96 h，由图4可见，混菌发酵末期总溶剂达5.75 g/L，其中丁醇浓度4.10 g/L。
Claims (1)
1.一种利用木质纤维原料生产丙酮/丁醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将1 mL发酵菌株C. cellulovorans ATCC35296接入装有200 mL Clocel-1培养基的血清瓶中，33-40 ℃静置培养18~24 h，得到发酵菌株C. cellulovorans ATCC35296的一级种子；将1 mL含有发酵菌株C. beijerinckii NCIMB8052的芽孢悬液在80℃下热激10min后，接入装有200 mL TGY培养基的血清瓶，33-40℃静置培养18~24 h，得到发酵菌株C.beijerinckii NCIMB8052的一级种子；
所述Clocel-1培养基是由质量体积比为10 g/L~30 g/L玉米棒芯、0.5 g/L~1 g/L酵母粉、0.5 g/L~1 g/L蛋白胨、1.65 g/LNa(CH3COO)、1.5 g/LNH4Cl、1 g/L K2HPO4、0.5 g/LMgSO4 .7H2O、0.5 g/L KCl、0.00125 g/LFeSO4、0.5 g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.001 g/L刃天青、0.0001 g/L维生素B1、0.000001 g/L生物素、0.0001 g/L对氨基苯甲酸组成，其pH值为6.8~7.2；
所述的TGY培养基是由质量体积比分别为4 g/L~6 g/L蛋白胨、2 g/L~4 g/L酵母粉、2g/L葡萄糖、0.5 g/L的 L-半胱氨酸盐酸盐组成，其pH值为7.0-7.5；
（2）取100~200 mL由步骤（1）得到的C. cellulovorans ATCC35296一级种子和5~50 mL由步骤（1）得到的C. beijerinckii NCIMB8052一级种子接种于含1800 mL Clocel-2培养基的5L发酵罐中，发酵转速为100~150 r/min，培养温度33-40℃，用2~5 mol/L 氢氧化钠控制发酵pH值为6.8~7.2；待发酵至24~48 h后，不再控制pH值，直至发酵结束，得到丙酮/丁醇；
所述的Clocel-2培养基是由质量体积比分别为60 g/L~70 g/L玉米棒芯、0.5 g/L~1g/L酵母粉、0.5 g/L~1 g/L蛋白胨、1.65 g/L Na(CH3COO)、1.5 g/L NH4Cl、1 g/L K2HPO4、0.5 g/L MgSO4 .7H2O、0.5 g/L KCl、0.00125 g/L FeSO4、0.5 g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.001 g/L刃天青、0.0001 g/L维生素B1、0.000001 g/L生物素、0.0001 g/L对氨基苯甲酸组成，其pH值为6.8~7.2。
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