CN101434912B

CN101434912B - 一种产油酵母菌株及其制备生物油脂的方法

Info

Publication number: CN101434912B
Application number: CN2008102044954A
Authority: CN
Inventors: 鲍杰; 陈曦
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2008-12-12
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2011-01-19
Anticipated expiration: 2028-12-12
Also published as: CN101434912A

Abstract

本发明是一种产油酵母菌株及其制备生物油脂的方法；所述的产油酵母菌株为皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum CX1，保藏号为CGMCC No.2527；产油酵母菌株生产生物油脂的方法：农作物秸秆经过预处理和水解后生成秸秆的水解液；在该水解液中添加基本无机盐组分，产油酵母菌就可以利用水解液中的糖和其它有机物生长和代谢生成油脂；生成的油脂贮藏在细胞内，之后将细胞内的油脂提取得到生物油脂。本发明的优点：生成的油脂组成与植物油类似，可以作为生产生物柴油的原料，与现在的其他工艺相比较极大地扩展了生物柴油的油脂原料来源，并显著降低了生物柴油原料油脂的成本。

Description

一种产油酵母菌株及其制备生物油脂的方法

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种产油酵母菌株及其制备生物油脂的方法，涉及菌种为Trichosporon cutaneum CX1，保藏号为CGMCCNo.2527。

【背景技术】

随着石油资源的日益紧缺、石油价格的不断上涨、油品供需矛盾的日渐显现及环境污染问题的更加突出，多渠道开发可再生油脂资源成为必然。生物柴油具有能量密度高、含硫量低、燃烧充分、润滑性好等优良性能，还具有可再生、易生物降解、储运安全、抗爆性能好等特点，可作为优质的石化柴油代用品。

制备生物柴油的原料现在主要是以植物油脂为主，原料成本占总生产成本的70％～85％。成本问题显然成为限制生物柴油广泛使用的最主要问题。只有降低成本，生物柴油才具广阔的商业化应用前景。根据国外经验，发展油料作物产业似乎可以为生物柴油提供原料。然而，我国现有耕地资源贫乏，可用来发展能源作物的耕地十分有限，依靠种植油料作物为生物柴油提供油源不符合我国国情。而在适宜条件下，某些微生物产生并贮存的油脂占其生物总量的20％以上，具有这样表型的菌株称为产油微生物。已知细菌、酵母、霉菌、藻类中都有能生产油脂的菌株，但以酵母菌和霉菌为主。微生物油脂又称单细胞油脂，是指由微生物在一定条件下产生并储存在菌体内的甘油脂，其脂肪酸组成与一般的植物油脂相似，仍以C16，C18系脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸等饱和和不饱和的脂肪酸为主。可以作为植物油的替代品成为制备生物柴油的原料。

生物质纤维原料是地球上最丰富的可再生资源，广泛存在于农副产业及林产业的木质废弃物，以及以农产品、林产品为原料的工业(如造纸业)废弃物中，是巨大的再生资源。生物质原料一般由纤维素、半纤维素、木质素等组成，通过工业微生物技术转化和利用以木质纤维素为主的可再生资源制备液体能源产品-生物柴油，已成为社会经济可持续发展的迫切要求。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种产油酵母菌株及其制备生物油脂的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的产油酵母菌株的诱变筛选方法简述如下：

本发明提供一种皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum CX1，为华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室生物质能源研究中心以Trichosporoncutaneum CGMCC 2.1374为出发菌株经Co60诱变后，以乙酸钠为抗性筛选标志连续培养得到，于2008年5月28日被中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏，编号为CGMCC No.2527。

所述的皮状丝孢酵母有以下微生物学特征：

1.形态学上特征为：

(1)细胞形态，呈圆形，椭圆形或者柱形；

(2)大小为3～6×4～10μm；

(3)菌体内部含有非常清楚的脂质体，呈透明状，内部包含油脂，易被苏丹黑染色；

(4)菌落为白色，呈奶酪状，光滑；

2.该菌株的生理生化特征为：

(1)本菌株可以利用经过稀硫酸或蒸汽膨爆预处理后再酶解的木质纤维素水解液生长；

(2)培养时间：3～6天；

(3)对氧气的需求：好气；

(4)具有较强的乙酸抗性，其中乙酸钠的抗性浓度为0.9％～1.2％；

(5)可以利用的碳源：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖中的一种或几种；

(6)生长pH范围：5.0～6.0；

(7)生长最适宜温度：28～30℃；

(8)生成生物油脂主要成份：C16，C18系饱和和不饱和脂肪酸，为棕榈酸，硬脂酸，油酸，亚麻酸，棕榈油酸中的一种或几种。

本酵母菌是Trichosporon cutaneum CGMCC 2.1374的突变株；与原始酵母相比，本酵母菌可以在含有较高浓度的乙酸钠水解液中生长，而原始菌株不生长；并且在蒸汽膨爆预处理的酶水解液中，较之原始菌株在油脂产量方面有很大的提高。

本发明的Trichosporon cutaneum CX1，可以利用木质纤维素水解液生产生物油脂，主要包括以下步骤：

(1)稀酸预处理液或蒸汽膨爆预处理酶水解液的制备：

利用农作物秸秆，经过稀硫酸或蒸汽膨爆预处理，获得的预处理后的秸秆经过纤维素酶的酶水解生成水解液，经过碱性物质调节pH，pH为5.0～6.0；

所述的农作物秸秆选自玉米秸杆，汽爆玉米秸杆，小麦秸秆或者稻子秸秆中的一种，优选玉米秸杆；

所述的稀硫酸预处理条件是在140～250℃下，预处理0.5～60分钟；

所述的蒸汽膨爆预处理是由吉林燃料乙醇有限公司完成；

所述的酶选自Spezyme CP，纤维素酒精酶Accellerase或者Novozyme 188中的一种或几种；Spezyme CP购买于美国杰能科有限公司，纤维素酒精酶Accellerase购买于无锡杰能科有限公司，Novozyme 188购买于美国Sigma公司；

所述的碱性物质为Ca(OH)₂溶液或者NaOH溶液中的一种；优选为Ca(OH)₂溶液；

(2)Trichosporon cutaneum CX1种子培养：

从平板上选取一环菌落接入种子培养基，培养基组成如下：

培养基组份质量百分比为，葡萄糖2％～5％，酵母粉0.05％～0.1％，(NH₄)₂SO₄0.1％～5％，KH₂PO₄0.05％～5％；MgSO₄·7H₂O 0.01％～1％；pH5.8～6.0，摇瓶装液量10～30％，培养温度为28～30℃，培养转速180～200转/分钟，培养时间为20～28小时；

(3)Trichosporon cutaneum CX1摇瓶发酵：

在步骤(1)的预处理液或酶水解液中添加无机盐，水解液组份由高效液相色谱测得，其组份为各种糖和有机物；接种量为2～10％，培养时间为96～120小时，其他发酵条件与种子培养相同；培养结束离心收集细胞，破壁提取生物油脂；

所述的无机盐，组份质量百分比为，(NH₄)₂SO₄0.1％～5％，KH₂PO₄0.05％～5％，MgSO₄·7H₂O 0.01％～1％；

所述的糖选自葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖或者甘露糖中的一种或几种；所述的糖优选为葡萄糖；

所述的有机物选自有机酸，呋喃化合物或者苯酚化合物中的一种；

所述的有机酸选自乙酸、甲酸、乙酰丙酸或者乳酸中的一种，优选为乙酸；

所述的呋喃化合物选自糠醛或者5-羟甲基糠醛中的一种，优选为糠醛；

所述的苯酚化合物选自香草醛、丁香醛或者4-羟甲基苯甲醛中的一种，优选为4-羟甲基苯甲醛。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

制备生物柴油的原料现在主要是以植物油脂为主，原料成本占总生产成本的70％～85％。成本问题现在显然成为限制生物柴油广泛使用的最主要问题。在使用产油微生物生产的油脂代替植物有作为生产生物柴油的原料以后，成本问题依然存在。如若使菌体生长良好，就要在培养基中加入大量的营养物质，如葡萄糖，木糖，蛋白胨和酵母粉等等物质，这无疑也为产业化增加了成本的问题。而木质纤维素作为一种大量存在的农业废弃物，就可以解决这一问题。在将其用酸或酶解后，就可以产生大量的可被微生物利用的糖。但是这一过程中，也会产生很多的抑制物。抑制物的存在对菌体的生长是极为不利的，在浓度很高的情况下甚至可以完全抑制菌体的生长。本发明的目的就是要通过诱变的方法使原本在水解液中不能生长代的菌株可以生长，并且再不添加酵母粉和蛋白胨这一类物质的前提下使菌株可以代谢生产生物油脂并且具有较高的含油量，而生成的油脂组成与植物油类似，可以作为生产生物柴油的原料，与现在的其他工艺(在合成培养集中还需要添加大量的营养物质才能获得较高的油脂产量)相比较大大降低了生物柴油的生产成本，为产业化应用奠定基础。

【具体实施方式】

以下提供本发明一种产油酵母菌株及其制备生物油脂的方法的具体实施方式。

实施例1

一种利用产油酵母菌株制备生物油脂的方法

发酵生成生物油脂的培养基为经过稀酸预处理的预处理液，组份如下(高效液相色谱测得)葡萄糖3.79g/l，木糖21.27g/l，乙酸3.98g/l，糠醛1.14g/l，羟甲基糠醛0.45g/l。pH 5.0，115℃灭菌20分钟。灭菌后加入无机盐，组份按质量百分比为(NH₄)₂SO₄0.1％～1％，KH₂PO₄0.09～0.12％；MgSO₄·7H₂O0.04％～0.06％。

从平板上挑取一环菌落接入种子培养基，30℃，180RPM，培养18～24小时，以10％的接种量接入上述硫酸的预处理液。培养时间为4天。每隔24小时取样分析，葡萄糖在48小时代谢完毕，乙酸在72小时代谢完毕，发酵终止时木糖仅剩余1.199g/L。最终生成的油脂量为1.96g/L。

与没有经过诱变的原始皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum CGMCC2.1374)作对照，发酵条件全部相同，菌株表现为不生长；可见诱变取得了比较积极的结果，所得菌株抗性较强。

实施例2

一种利用产油酵母菌株制备生物油脂的方法

发酵生成生物油脂的培养基为蒸汽膨爆预处理后的酶水解液。所用的酶为Accellerase；其中纤维素酶活是67.8FPU，纤维二糖酶活为152IU。水解液组份的组分如下(高效液相色谱测得)葡萄糖40g/L，木糖9.5g/L，乙酸0.32g/L，糠醛，羟甲基糠醛含量极少起作用可以忽略不计，pH 6.0，115℃灭菌20分钟。

从平板上选取一环菌落接入种子培养基，30℃，180RPM，培养24小时，以10％的接种量接入上述酶水解液。培养时间为3天。最终生成的油脂量为3.61g/L，含油率达到42.17％，油脂系数(油脂系数是指生成的油脂量除以消耗的葡萄糖再乘以100)为10。

实施例3

一种利用产油酵母菌株制备生物油脂的方法

发酵生成生物油脂的培养基为蒸汽膨爆预处理后经过酶水解得到的水解液。所用的酶为Accellerase；其中纤维素酶活是67.8FPU，纤维二糖酶活为152IU。水解液组份的组份如下(高效液相色谱测得)葡萄糖40g/L，木糖9.5g/L，乙酸0.32g/L，糠醛，羟甲基糠醛含量极少起作用可以忽略不计，pH 6.0，115℃灭菌20分钟。

从平板上选取一环菌落接入种子培养基，30℃，180RPM，培养24小时，以10％的接种量接入上述酶水解液。培养3天后收获细胞，再将这些细胞全部重新放入上述条件的水解液中去，一共进行3轮发酵总计9天时间。最终生成的油脂量为9.2g/L，含油率达到42.31％，油脂系数为8.9。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims

1.一种产油酵母菌株，其特征在于，产油酵母菌为皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum CX1，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏；保藏日期为2008年5月28日；编号为CGMCC No.2527。

2.一种应用权利要求1所述的产油酵母菌株制备生物油脂的方法，其特征在于，具体步骤为，

(1)稀酸预处理或蒸汽膨爆预处理的酶水解液的制备：

利用农作物秸秆，经过稀硫酸或蒸汽膨爆预处理，获得的预处理后的秸秆经过纤维素酶的酶水解生成水解液，经过碱性物质调节pH后，pH为5.0～6.0；

所述的农作物秸秆选自玉米秸杆、小麦秸秆或者稻子秸秆中的一种；

所述的碱性物质为Ca(OH)₂溶液或者NaOH溶液中的一种；

(2)Trichosporon cutaneum CX1种子培养：

从平板上选取一环菌落接入种子培养基，培养基组成如下：

培养基组份质量百分比为，葡萄糖2％～5％，酵母粉0.05％～0.1％，(NH₄)₂SO₄ 0.1％～5％，KH₂PO₄ 0.05％～5％，MgSO₄·7H₂O 0.01％～1％；pH5.8～6.0，摇瓶装液量10～30％，培养温度为28～30℃，培养转速180～200转/分钟，培养时间为20～28小时；

(3)Trichosporon cutaneum CX1摇瓶发酵：

在步骤(1)的稀酸预处理或蒸汽膨爆预处理的酶水解液中添加无机盐，水解液组分为各种糖和有机物；接种量为2～10％，培养时间为96～120小时，其他发酵条件与种子培养相同；培养结束离心收集细胞，破壁提取生物油脂；

所述的酶选自Spezyme CP，纤维素酒精酶Accellerase或者Novozyme188中的一种或几种；

所述的无机盐，组份质量百分比为，(NH₄)₂SO₄ 0.1％～5％，KH₂PO₄0.05％～5％；MgSO₄·7H₂O 0.01％～1％；

所述的糖选自葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖或者甘露糖中的一种或几种；

所述的有机物选自有机酸、呋喃化合物或者苯酚化合物中的一种；

所述的有机酸选自乙酸、甲酸、乙酰丙酸或者乳酸中的一种；

所述的呋喃化合物选自糠醛或者5-羟甲基糠醛中的一种；

所述的苯酚化合物选自香草醛或丁香醛中的一种。