CN102071149B

CN102071149B - 一种产油脂的烟曲霉

Info

Publication number: CN102071149B
Application number: CN2010105709980A
Authority: CN
Inventors: 胡茂丰; 李罗明; 彭凤祥
Original assignee: CHANGSHA TANTANXIANG SEASONING FOOD Co Ltd; Hunan Agricultural University
Current assignee: CHANGSHA TANTANXIANG SEASONING FOOD Co Ltd; Hunan Agricultural University
Priority date: 2010-12-03
Filing date: 2010-12-03
Publication date: 2012-01-18
Anticipated expiration: 2030-12-03
Also published as: CN102071149A

Abstract

一种产油脂的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)H₃₀，该菌株已于2010年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.4276。本发明还提供一种用本发明菌株以马铃薯淀粉和玉米淀粉等为发酵基质来发酵生产油脂的方法，从而可利用微生物生长周期短，不受气候限制，易于实现大规模生产，来解决油脂的不足等问题。

Description

一种产油脂的烟曲霉

技术领域：

本发明涉及一种产油脂的菌株，尤指一种产油脂的烟曲霉H₃₀。

背景技术：

植物油脂具有占用耕地面积、生长周期长、受气候影响严重等缺点，如果能够利用微生物生长周期短、不受气候限制、易于实现大规模生产等优点，从而开发微生物油脂，这将是一项值得我们研究的内容。

微生物油脂(microbial oils)又称单细胞油脂(SCO)，是酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下，以碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源，在菌体内产生油脂。微生物油脂含有亚油酸、γ-亚麻酸(GLA)、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等不饱和脂肪酸。微生物油脂是维持生命的重要营养物质，又是工业生产的重要原料。

近十多年来，具有保健或医疗功能的特种油脂日益受到人们的青睐，用微生物生产特种油脂便引起了科学家们潜心研究。微生物油脂的研究主要集中在利用微生物生产经济价值高的特殊营养油脂，特殊工业用途油脂，即微生物功能性油脂。因此，多渠道开发油脂资源，提高油脂产量，以满足人类社会对油脂日益增长的需要意义重大。

本发明旨在利用微生物资源采用发酵工程技术将农业资源转化形成人类社会需求的物质，解决植物资源短缺的缺限。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：针对现有油脂供应的不足，提供一种产油脂的烟曲霉，其可利用马铃薯淀粉和玉米淀粉等发酵生产油脂，由于微生物生长周期短、不受气候限制，易于实现大规模生产，从而解决油脂不足等问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种产油脂的烟曲霉(Aspergillusfumigatus)H₃₀，该菌株已于2010年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC N0.4276，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明的烟曲霉H₃₀是从湖南农业大学周边油渍较多的土壤和湖南植物园采集土壤样品，采用不同的培养基(马丁氏培养基、高盐查氏培养基、马铃薯蔗糖-抗生素培养基)进行筛选，筛选到多个菌株，逐一进行油脂含量测定实验，得到高产油脂菌株。

本发明还提供烟曲霉H₃₀于发酵罐中发酵生产油脂的方法：发酵培养基的配方：马铃薯淀粉25～35g，玉米淀粉8～12g，淀粉糊化后加硫酸铵1.0～1.4g，C∶N为80∶1，定容至1L，pH自然。发酵条件：5L发酵罐中发酵培养基体积为3L，接种量为5～8％(v/v)摇瓶发酵液，温度为25～28℃，通气量为3L/L·min，搅拌转速为500～600r/min，发酵时间为48～55h。经测定，油脂产量比现有技术提高了了5～8％。

上述发酵条件优选为：5L发酵罐中发酵培养基体积为3L，接种量为6％摇瓶发酵液，温度为28℃，通气量为3L/L·min，搅拌转速为550r/min，发酵时间为50h。上述发酵培养基优选为：马铃薯淀粉30g，玉米淀粉10g，淀粉糊化后加硫酸铵1.2g，C∶N为80∶1，定容至1L，pH自然。

本发明还同时提供了本发明菌株于发酵罐发酵过程中，通过添加为发酵培养基体积的0.5～1％的表面活性剂(如SDS、聚乙二醇或聚醚等)来提高油脂的产量，添加表面活性剂后，产量提高了3～5％。

与现有技术相比，本发明的优点是：

1.以马铃薯淀粉和玉米淀粉等廉价原料为发酵基质，发酵产生具有多种生理功能性多种多不饱和脂肪酸，解决了植物油脂资源供给不足的缺陷，满足了市场地需求。

2.可通过提高转速大大缩短了发酵周期。

3.通过使用表面活性剂，发酵耗时少，产油脂率高。

附图说明：

图1是本发明菌株在显微镜下400倍观察的个体形态图。

其中：a显示顶囊呈长椭圆，小分生孢子梗单层；b显示足细胞、菌丝有隔。

图2是本发明菌株的菌落图。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步地说明。

以下实施例中用到的培养基配方：

马铃薯-抗生素培养基：马铃薯200g、蔗糖20g、及琼脂20g，定容至1L，再加入抗生素，pH自然。121℃保温灭菌20min。本实验中加入的抗生素为链霉素10～50mg/L或氯霉素12.5～25mg/L。但并不以此为限制，其他抗生素亦可，加入量按其购买说明加入。

斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，定容至1L，pH自然。121℃保温灭菌20min。

种子培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，pH自然，定容至1L。121℃保温灭菌20min。

发酵培养基：马铃薯淀粉25～35g，玉米淀粉8～12g，淀粉糊化后加硫酸铵1.0～1.4g，C∶N为80∶1，定容至1L，pH自然。121℃保温灭菌20min。

实施例1，烟曲霉菌的制备

从湖南农业大学周边油渍较多的土壤和湖南植物园采集土壤样品，称取样品10g放入装有90mL无菌的含玻璃珠的生理盐水的300mL三角瓶中摇荡20min，作系列稀释度，取稀释液10^-2、10^-3、及10^-4各1.0mL入无菌平皿；再加10～15mL马铃薯-抗生素培养基混合均匀，静置1min，重复2次，于28℃倒置培养72h，将培养基上单个的菌落转接到斜面马铃薯培养基上28℃培养72h，再转入马铃薯液体培养28℃培养60h，筛选产油高的菌株，保存备用。

实施例2，菌株的微生物学特性及鉴定

形态学特征：在马铃薯培养基上，采用插片法，28℃培养72h制得标本片，用棉兰水浸法染色，在400倍显微镜下观察，菌丝无色透明或微绿，有隔膜和足细胞，分生梗较短(小于300μm)，顶囊呈长椭圆，直径20～30μm，小分生孢子梗单层，长6～8μm，末端着生分生孢子，孢子链达400～500μm。分生孢子呈圆形或卵圆形，直径2～3.5μm，呈灰、绿或蓝绿色。见图1。

培养特征：在马铃薯固体培养基上，28℃倒置培养72h，菌落呈圆形，边缘为全缘状；菌落质地为最初呈白色绒毛状，迅速变为绿色、暗绿色，外观呈绒毡状，菌丝生长较快，短。见图2。

根据菌株的培养特性和形态特征，对照《真菌鉴定手册》，确定属烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的新种，编号为H₃₀。

实施例3，液态摇瓶发酵

(1)菌株的培养：配制马铃薯斜面培养基，接种，放入28℃培养箱中培养72h，保存备用。

(2)摇瓶发酵：300mL锥形三角瓶中盛装种子培养基90～100mL，接种斜面菌种几环，温度为25～30℃(最佳28℃)，培养基初始pH为自然，转速为180～220r/min(最佳220r/min)，发酵时间为65～72h。

实施例4，发酵条件

1.发酵罐发酵，分别选取不同质量浓度的马铃薯和玉米粉以及不同氮源(见表1)，5L发酵罐中发酵培养基体积为3L，接种量为5～8％(v/v)，温度为25～28℃，通气量为3L/L·min，搅拌转速为600r/min，发酵时间为55h。离心收集菌丝体50～60℃烘干。结果显示以马铃薯淀粉和玉米粉以30g/L+10g/L复配作为培养基碳源时，硫酸铵为氮源发酵产生油脂的量较高。

表1

①生长不旺盛，无法收集菌体；②几乎不生长，无法收集菌体。

2.发酵罐发酵，分别选取不同温度(见表2)，5L发酵罐中发酵培养基体积为3L，接种量为5～8％，通气量为3L/L·min，搅拌转速为500～600r/min，发酵时间为48～55h。离心收集菌丝体50～60℃烘干。结果显示菌体在28℃时生长较好，其菌体生物量、油脂产量、油脂含量和淀粉利用率均比其他温度下高。

表2

3.发酵罐发酵，分别选取不同搅拌转速(见表3)，5L发酵罐中发酵培养基体积为3L，接种量为5～8％，通气量为3L/L·min，，发酵时间为48～55h。离心收集菌丝体50～60℃烘干。

表3

从上表3可以看出，转速为450～550r/min时，H₃₀菌体生物量、油脂产量、油脂含量、淀粉利用率都随转速的增大而增大，当转速为550r/min时，菌体生物量、油脂产量、油脂含量、淀粉利用率均最大，当转速大于650r/min时，过高的转速使菌丝体在摇床过程中溶解，阻止细胞的大量繁殖及细胞内油脂的积累。因此，确定转速为500～600r/min，最好为550r/min，此时油脂产量为4.256g/L，菌株油脂含量为35.07％，淀粉和玉米利用率为78.34％。

因此，发酵罐发酵的发酵条件：5L发酵罐中发酵培养基体积为3L，接种量为5～8％(v/v)的摇瓶发酵液，温度为25～28℃，通气量为3L/L·min，搅拌转速为500～600r/min，发酵时间为48～55h。

4.发酵罐发酵

5L发酵罐中发酵培养基体积为3L，接种为发酵培养基体积8％(v/v)的摇瓶发酵液，温度为28℃，通气量为3L/L·min，搅拌转速为550r/min，发酵时间为55h。将此获得的发酵液入高速离心机5000r/min离心10min，收集菌丝体置50～60℃烘5h，用研钵充分研磨菌丝体，使细胞完全破碎，移入滤纸包内，将滤纸包放入索氏抽提器的抽提管内，连接已恒重的接受瓶，按固、液质量比1∶3加入石油醚，于55℃水浴加热回流5～6h，将接受瓶恒重，计算油脂含量38.62％。

实施例5，发酵罐发酵添加表面活性剂

添加聚醚：在发酵罐灭菌后，加入为发酵培养基体积1％的聚醚，菌液接种量为5％，温度为28℃，通气量为3L/L·min，搅拌转速为550r/min，发酵时间为60h。测定其油脂产量比未加聚醚的在相同发酵条件下增加了5％。

添加SDS：在发酵罐灭菌后，加入为发酵培养基体积0.7％的SDS，菌液接种量为8％，温度为28℃，通气量为3L/L·min，搅拌转速为580r/min，发酵时间为66h。测定其油脂的产量比未加SDS的在相同发酵条件下增加了5％。

添加聚乙二醇：在发酵罐灭菌后，加入为发酵培养基体积0.5％的聚乙二醇，菌液接种量为6％，温度为28℃，通气量为3L/L·min，搅拌转速为600r/min，发酵时间为70h。测定其油脂的产量比未加聚乙二醇的在相同发酵条件下增加了3.5％。

Claims

1.一种产油脂的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)H₃₀，该菌株已于2010年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.4276。

2.一种发酵法制备生产油脂的发酵液的方法，其特征在于：所用菌株为权利要求1所述菌株；发酵条件为：5L发酵罐中发酵培养基体积为3L，接种量为5～8％摇瓶发酵液，温度为25～28℃，通气量为3L/L·min，搅拌转速为500～600r/min，发酵时间为48～55h；发酵培养基：马铃薯淀粉25～35g，玉米淀粉8～12g，淀粉糊化后加硫酸铵1.0～1.4g，C∶N为80∶1，定容至1L，pH自然。

3.如权利要求2所述的发酵法制备生产油脂的发酵液的方法，其特征在于：所述发酵条件为：5L发酵罐中发酵培养基体积为3L，接种量为6％摇瓶发酵液，温度为28℃，通气量为3L/L·min，搅拌转速为550r/min，发酵时间为50h。

4.如权利要求2所述的发酵法制备生产油脂的发酵液的方法，其特征在于：所述发酵培养基的配方：马铃薯淀粉30g，玉米淀粉10g，淀粉糊化后加硫酸铵1.2g，C∶N为80∶1，定容至1L，pH自然。

5.如权利要求2所述的发酵法制备生产油脂的发酵液的方法，其特征在于：所述发酵条件中添加有为发酵培养基体积0.5～1％的表面活性剂。

6.如权利要求5的所述的发酵法制备生产油脂的发酵液的方法，其特征在于：所述表面活性剂为SDS、聚乙二醇或聚醚。

7.如权利要求2至6中任一项所述的发酵法制备生产油脂的发酵液的方法，其特征在于：所述摇瓶发酵液是于锥形三角瓶中盛装90～100mL发酵培养基，接种几环权利要求1所述菌株，温度为25～30℃，培养基初始pH为自然，转速为180～220r/min，发酵时间为65～72h。