CN102154128B

CN102154128B - 一株能直接利用木糖产生酒精的异常毕赤酵母菌菌株

Info

Publication number: CN102154128B
Application number: CN2010105930704A
Authority: CN
Inventors: 乔敏; 贾东晨; 余泽芬; 张克勤; 周薇
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2010-12-17
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-12-17
Also published as: CN102154128A

Abstract

本发明涉及一株能直接利用木糖的异常毕赤酵母菌株，属工业微生物发酵工程技术领域。本发明涉及的菌株MLB1是分离自云南省元江县城郊自然生态环境，并能直接发酵木糖产生酒精的野生型菌株。该菌株经分类学鉴定属于异常毕赤酵母Pichia anomala，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.4252。该菌株能100％直接发酵木糖或葡萄糖产生酒精，以木糖为碳源的酒精产率大于50％，以葡萄糖为碳源的酒精转化率大于60％。本发明提供的能直接利用木糖产生酒精的异常毕赤酵母菌菌株，弥补了木糖工程菌株利用木糖能力的不足，从而扩宽现行酒精生产菌株生产酒精的原料来源的，降低纤维素生产酒精的成本。同时，还为酵母菌利用木糖发酵酒精提供遗传依据。

Description

一株能直接利用木糖产生酒精的异常毕赤酵母菌菌株

技术领域：

本发明涉及一株能直接利用木糖产生酒精的异常毕赤酵母菌菌株，属工业微生物发酵工程技术领域。

背景技术：

环境、能源和持续发展已经成为目前世界性的问题，其中能源是人类社会的重要物质基础。随着现代工业，农业和国防科技事业的迅猛发展，能源的消耗量显著增加。一场全面的能源危机使得人类开始寻找替代能源。必须逐步扩大可再生的生物质资源的比例。乙醇作为可替代燃料具有以下优点：(1)生产成本相对较低；(2)对环境的污染比汽油、柴油均小得多；(3)20％的乙醇和汽油混合使用，汽车发动机不必改装；(4)其来源取之不尽，用之不竭。

生产乙醇的原料主要有植物纤维原料，糖蜜和含淀粉质原料等。地球上每年大约形成1700亿吨植物有机物，是自然界分布最广、含量最多、价格低廉，而又未得到充分利用的可再生资源川，除少量用于造纸、建筑、纺织等行业或用作粗饲料、薪柴外，大部分未被有效利用，而白白烂掉或烧掉，有些还造成环境污染(例如焚烧)。通过生物技术将这些纤维废弃物转化为能源、化工产品等，可一举数得，同时缓解上述几个问题。以酒精作为石油的代用能源，其关键是降低酒精的生产成本。目前虽然淀粉质原料很容易从农业生产中得到，并且淀粉生产酒精的技术也十分成熟，但是利用丰富，廉价且可再生的植物纤维原料生产乙醇的研究己经渐渐成为全球范围的热点之一。这些原料可来自软、硬木材，杂草，农业生产废弃物，旧报纸，城市固体废物等。

所有植物来源的木质纤维素均含有丰富的纤维素、半纤维素和木质素，在植物纤维原料中，戊聚糖约占20％一30％，在植物纤维原料水解液中戊糖占30％左右，因此，以木糖为主的戊糖发酵是决定植物纤维资源生产酒精经济可行的关键之一。

Karczweskav于1959年第一次提出了用木糖发酵乙醇，但这个发现未引起人们的足够重视。直到1980年，wnag等人提出，木糖可被一些微生物发酵成酒精。此后，国际上掀起一股木糖酒精发酵菌种的研究热潮，迄今为止已发现100多种微生物能代谢木糖成酒精，包括细菌、真菌、和酵母。在戊糖发酵的微生物中，酵母的戊糖发酵能力最强，目前人们研究最多且最有工业应用前景的木糖发酵微生物有3种酵母菌种，即管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、树干毕赤酵母(Pihcia stipitis)和休哈塔假丝酵母(Candidashechatate)它们的木糖发酵酒精转化率和生产能力分别达0.28-0.48g/g(酒精/消耗的糖)和0.02-0.66g/(L·h)。

但是能同化戊糖的酵母大多不能发酵戊糖生产酒精，而能发酵戊糖的酵母发酵木糖的酒精产率较低，选育高效的木糖发酵菌仍然是开发纤维素类可再生资源的重要技术关键之一。迄今为止，能工业化运用的酒精生产菌株只有酿酒酵母，除工程菌外，现行酿酒酵母又不能利用木糖等戊糖，而工程菌利用木糖的能力还不能满足工业化的需要。

本发明经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。

发明内容：

本发明的目的在于克服现行酒精生产菌株——酿酒酵母Saccharomycescerevisiae(非工程菌)不能直接利用木糖发酵产生酒精，木糖工程菌株利用木糖的能力还不能满足工业化需要的不足，而提供一株能直接利用木糖产生酒精的异常毕赤酵母菌菌株，从而扩宽现行酒精生产菌株生产酒精的原料来源的，降低纤维素生产酒精的成本。

本发明通过从自然界中进行菌株分离、培养，获得一株能直接利用木糖产生酒精的异常毕赤酵母(Pichia anomala)MLB1菌株(保藏号：CGMCCNo.4252，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心2010年10月22日保藏)，该菌株能100％直接发酵木糖产生酒精，酒精产率大干50％。该菌株也能100％利用葡萄糖产生酒精，酒精转化率大于60％。本发明的实现能降低纤维素酒精乃至燃料乙醇的生产成本。

本发明是通过如下常规过程获得：将采集自云南省元江县城郊的土壤样品(2克)，用麦芽液体培养基富集培养48小时，然后按稀释涂布法取一定量的富集液进行涂布分离，挑取单菌落纯化保存备用，采用的培养基为只含木糖的氮基础培养基。

本发明的能直接利用木糖产生酒精的异常毕赤酵母菌菌株按如下常规酒精发酵步骤实现：

首先，将纤维素原料处理后成为木糖液作为碳源，添加到酵母酒精发酵的常规培养基中，调整pH值4.0-5.2，开始使用。

其次，酒精发酵：将MLB1菌株按微生物发酵常规液体种子培养方法、以灭菌木糖液(含糖浓度为2％-5％)培养基进行培养，经摇瓶、种子罐一系列培养后，当每毫升培养液含酵母菌数大于1×108个时，按发酵罐培养液(已灭菌，含糖浓度大于5％)1/15的量投入到发酵罐中进行培养，温度控制在28℃，pH值控制在4.0-5.2，保持持续或间断通入无菌空气，即每间隔1小时通气10分钟。培养48-72小时。

第三，蒸馏：按现行常规酒精生产蒸馏方法进行。

本发明的酵母菌菌株MLB1具备以下特征：

(1)酵母菌菌株MLB1是异常毕赤酵母(Pichia anomala)，基本生理特征：细胞短卵形至圆柱形，单个、成双或呈短链，菌落白色，表面皱状；25℃培养3-10天形成子囊，每个子囊含1-4个球形孢子；

(2)酵母菌菌株MLB1同酒精生产所使用的其它酿酒酵母菌菌株相比，能100％直接发酵木糖产生酒精，酒精产率大干50％。该菌株也能100％利用葡萄糖产生酒精，酒精转化率大于60％。能降低纤维素酒精乃至燃料乙醇的生产成本。

本发明提供的能直接利用木糖产生酒精的异常毕赤酵母菌菌株，弥补了木糖工程菌株利用木糖能力的不足，从而扩宽现行酒精生产菌株生产酒精的原料来源的，降低纤维素生产酒精的成本。同时，还为酵母菌利用木糖发酵酒精提供遗传依据。

附图说明：

图1和图2为异常毕赤酵母(Pichia anomala)MLB1菌株显微形态照片(100×)。

具体实施方式：

实施例一：

首先，将纤维素原料处理后成为木糖液作为碳源，添加到酵母酒精发酵的常规培养基中，调整pH值4.0，开始使用。

其次，酒精发酵：将MLB1菌株按微生物发酵常规液体种子培养方法、以灭菌木糖液培养基(含糖浓度为2％)进行培养，经摇瓶、种子罐一系列培养后，当每毫升培养液含酵母菌数大于1×108个时，按发酵罐培养液(已灭菌，含糖浓度5％)1/15的量投入到发酵罐中进行培养，温度控制在28℃，pH值控制在4.0，保持持续或间断通入无菌空气，即每间隔1小时通气10分钟。培养48小时。木糖100％被利用产生酒精，其产率大于50％。

第三，蒸馏：按现行常规酒精生产蒸馏方法进行。

实施例二：

与实施例一不同之处：培养液的pH值为4.5，种子培养液的糖浓度为3％，发酵罐培养液的糖浓度为7％，培养时间60小时。

实施例三：

与实施例一不同之处：培养液的pH值为5.2，种子培养液的糖浓度为5％，发酵罐培养液的糖浓度为10％，培养时间72小时。

实施例四：

首先，以葡萄糖作为碳源，添加到酵母酒精发酵的常规培养基中，调整pH值4.0，开始使用。

其次，酒精发酵：将MLB1菌株按微生物发酵常规液体种子培养方法、以灭菌培养基(含糖浓度为3％)进行培养，经摇瓶、种子罐一系列培养后，当每毫升培养液含酵母菌数大于1×10⁸个时，按发酵罐培养液(已灭菌，含糖浓度大于5％)1/15的量投入到发酵罐中进行培养，温度控制在28℃，pH值控制在4.0，保持持续或间断通入无菌空气，即每间隔1小时通气10分钟。培养48小时。

第三，蒸馏：按现行常规酒精生产蒸馏方法进行。葡萄糖的利用率为100％，产生酒精的转化率＞60％。

Claims

1.一株能直接利用木糖的异常毕赤酵母菌菌株，其特征在于异常毕赤酵母(Pichia anomala)MLB1菌株，于2010年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.4252。