CN101760482A - 一种纤维素乙醇的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纤维素乙醇的生产方法，其包括如下步骤：1)将含有纤维素和/或半纤维素原料的培养基加入到发酵反应釜中；2)向发酵反应釜中加入纤维素酶，并接种葡萄牙假丝酵母(Candidalusitaniae)；3)在纤维素酶和葡萄牙假丝酵母的共同作用下进行同步糖化发酵，分离得到纤维素乙醇。本发明中用于同步糖化发酵的葡萄牙假丝酵母具有较高的乙醇耐受力和较高的乙醇生产速率，能够以纤维素、半纤维素为原料在纤维素酶的共同作用下同步糖化发酵高效制备纤维素乙醇。

Description

一种纤维素乙醇的生产方法

技术领域

本发明涉及生物能源开发技术领域，具体一种涉及纤维素乙醇的生产方法。

背景技术

随着石油资源的枯竭、石油价格的上涨和环境的恶化，寻找新型可再生资源替代化石资源和开发洁净能源已成为工业生物技术领域的研究热点。生物质能的开发，可以缓解对石油资源的依赖、控制二氧化碳的排放，并促进农业新型产业链的发展，对推动我国社会主义新农村建设具有重要意义。

燃料乙醇作为一种可再生的洁净能源，从上世纪70年代在美国、巴西开始推行。我国乙醇的生产能力已达到500多万吨/年，其中燃料乙醇的年产量保持在110万吨左右，仅次于巴西、美国，居世界第三位。

由于大量使用玉米为原料开发生物能源导致玉米价格持续增长，所以在经过了将粮食转化为乙醇的热潮之后，纤维素乙醇技术的开发和纤维素乙醇的商业化生产正渐成气候和规模。

木质纤维素原料是地球上产量最大的可再生资源，包括林木、农作物秸秆、农副产品加工下脚料等，在自然生态系统的能量流与物质循环流中占有重要位置，是生产燃料酒精的潜在资源，对解决未来能源问题有着巨大的潜力。

目前的纤维素乙醇的中试技术存在非常突出的问题。一是市场上出现的商业化的工业酵母可以发酵葡萄糖和麦芽糖，但不是纤维二糖，生产中要添加除纤维素酶外的价格昂贵的β-葡萄糖苷酶，以避免纤维二糖抑制。利用纤维素酶将纤维素水解为简单糖。这些简单糖中有一种糖是纤维二糖，包括两个分子的葡萄糖，可以分解为葡萄糖。但纤维素酶没有足够的β-葡萄糖苷酶，使纤维素水解分解的纤维二糖变为葡萄糖。纤维二糖会抑制内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，在同步糖化发酵工艺中会阻碍整个乙醇的速率和产率，而且由于需要大量补充价格昂贵的β-葡萄糖苷酶，导致工艺成本非常高。另一方面，发酵纤维素二糖的酵母已经找到，但对酒精的耐受力很低。

二是同步糖化发酵技术无法保证酶解温度和发酵温度的协调统一。一般酶水解温度在40-50℃，而酿酒酵母的发酵温度在28-35℃，因此工艺上只能折中进行，导致酶的用量过大或酵母的用量过大，同步糖化发酵时间一般要超过100小时，发酵效率低下。三是在高底物含量的条件下，大量的纤维素未被转化，酶解效果显著降低，乙醇的产率也很低，一般只能达到3-5％(v/v)

目前乙醇的发酵制备速率和产率不能满足同步糖化工艺的要求，没有经济性。国内专利(CN 101130792A)报道了酶解秸杆制备燃料乙醇的方法，发酵时间10-15天，酶解效率十分低下，没有工业化的经济可行性。国内另一篇专利(CN101270372A)报道了一种纤维素乙醇发酵液中糖液的浓缩方法，目的也是想解决酶解后的糖浓度过低的问题，这表明现在酶解技术不能满足工业化要求。虽然采用这个浓缩专利技术可以改变已经酶解糖的浓度，但对纤维素的酶解率低下的问题并没有解决，会导致原料利用率低，生产成本高的问题。专利CN 101230359报道一种利用改性聚二甲基硅氧烷高分子膜提浓的纤维素乙醇工艺，也是想解决发酵酒精浓度过低，蒸馏成本过高的问题，但也无法回避酶解和发酵效率低的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种纤维素乙醇的生产方法，通过提高同步糖化发酵工艺的效率，最终提高纤维素乙醇的生产速率和产率。

为实现本发明的发明目的，提供的技术方案如下：

一种纤维素乙醇的生产方法，包括如下步骤：

1)将含有纤维素和/或半纤维素原料的培养基加入到发酵反应釜中；

2)向发酵反应釜中加入纤维素酶，并接种葡萄牙假丝酵母(Candidalusitaniae)；

3)在纤维素酶和葡萄牙假丝酵母的共同作用下进行同步糖化发酵，分离得到纤维素乙醇。

其中，步骤1)中纤维素和/或半纤维素原料的来源为可再生的木质纤维素类生物质。如麦杆，稻杆和速生林等，均可以作为纤维素乙醇的原料。该类生物质含有植物干重的20-70％的纤维素和10-40％的半纤维素，以及部分木质素。同时也包括环境和生物中废弃的富含纤维素的各种生物质。

其中，步骤1)中所述培养基包括15％-30％的纤维素和/或半纤维素原料，还包括少量的酵母抽提物、蛋白胨、抗生素，控制pH值在3.5-6.0。培养基可以根据液体性质添加吐温80，麦角甾醇等。

其中，步骤2)中纤维素酶含有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和少量β-葡萄糖苷酶。

其中，步骤2)中葡萄牙假丝酵母优选经过乙醇、纤维二糖驯化的酵母。驯化用的培养基含有纤维二糖和适量乙醇。驯化采用纤维二糖5％、10％、15％三个浓度梯度，逐代划线分离，然后采用1％，2％，3％乙醇梯度驯化，分离得到优势菌株。

其中，步骤3)中同步糖化发酵的酸碱度条件是pH值3.5-6.0，反应温度35-45℃，优选40-45℃。

本发明中用于同步糖化发酵的葡萄牙假丝酵母具有较高的乙醇耐受力和较高的乙醇生产速率，能够以纤维素、半纤维素为原料在纤维素酶的共同作用下同步糖化发酵高效制备纤维素乙醇。实验表明，通过比较葡萄牙假丝酵母与其他酵母利用葡萄糖和纤维二糖发酵，发现其具有较高的生产乙醇的速率和产率；另外，葡萄牙假丝酵母与其他酵母相比对乙醇的耐受能力较强。

附图说明

图1为不同酵母与葡萄牙假丝酵母同步糖化发酵产乙醇能力比较。

图2为不同酵母对乙醇耐受力的比较。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的内容做详细描述。

本发明中所涉及的发酵原料包括纤维素和/或半纤维素。其来源为可再生的木质纤维素类生物质。如麦杆，稻杆和速生林等，均可以作为纤维素乙醇的原料。该类生物质含有植物干重的20-70％的纤维素和10-40％的半纤维素，以及部分木质素。同时也包括环境和生物中废弃的富含纤维素的各种生物质。

本发明中所使用的纤维素酶含有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和少量β-葡萄糖苷酶。利用纤维素酶将纤维素水解为简单糖，如葡萄糖。这些简单糖中有一种糖是纤维二糖，包括两个分子的葡萄糖，可以分解为葡萄糖。β-葡萄糖苷酶能够使纤维素水解分解的纤维二糖变为葡萄糖，但纤维素酶中只含有少量β-葡萄糖苷酶，因此纤维素酶本身不能充分利用纤维二糖。

本发明中使用的葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)可能利用纤维素水解物纤维二糖和葡萄糖，也能利用从半纤维素中水解的甘露糖和半乳糖，以上组合的糖或其他相关糖也可以利用其发酵。其中，可利用的二糖，如蔗糖，麦芽糖，乳糖和纤维二糖，但不包括密二糖和海藻糖，也能利用多糖水解后的单糖如淀粉和纤维素水解后的葡萄糖和其他单糖如果糖，山梨糖，甘露糖和半乳糖。

下面具体说明本发明涉及的同步糖化发酵高效制备纤维素乙醇的步骤和过程。

一、葡萄牙假丝酵母的培养及驯化

从土样中分离出来葡萄牙假丝酵母，采用土豆琼脂培养基富集。这种酵母菌在生物学上是纯种，被鉴定为Candida lusitaniae(CLAS5566)。一个样收藏在三峡大学艾伦再生能源研究所保藏中心。驯化用的培养基含有纤维二糖和适量乙醇。驯化采用5％、10％、15％三个浓度梯度，逐代划线分离，然后采用1％，2％，3％乙醇梯度驯化，分离得到优势菌株。

二、发酵条件

1、发酵工艺溶氧控制

发酵工艺的溶氧要求范围宽。溶氧既可以是间歇发酵的微氧，也可以是连续发酵中的接种的底物通入少量空气。而且也可以是厌氧发酵。技术取决于最初的细胞密度，底物浓度和接种条件。

2、发酵培养基的配方

这种用于发酵的培养基是常见的培养基，含有适当的氮源、矿物质、微生素和碳源。这些碳源包括己糖(葡萄糖，半乳糖和甘露糖)和二糖(纤维二糖)。发酵接种用培养基主要包括18％的纤维素，1％的安琪酵母抽提物，2％的蛋白胨，2mg/L抗生素，pH值在3.5-6.0。培养基可以根据液体性质添加吐温80，麦角甾醇等。

3、发酵工艺的温度控制

本发酵工艺温度可以从28℃到45℃，然而最适温度为40-45℃。

三、同步糖化发酵

在同步糖化发酵工艺中，糖化涉及纤维素的水解过程。利用纤维素酶将纤维素水解为简单糖。这些简单糖中有一种糖是纤维二糖，包括两个分子的葡萄糖，可以分解为葡萄糖。

本发明使用的酵母菌是葡萄牙假丝酵母Candida lusitaniae，在42℃下可以很好的发酵纤维二糖，可以用在同步糖化发酵中，提供更快的产酒速率和更高的乙醇产率，优于目前的已知的纤维二糖发酵的其他酵母。

表1通过比较同步糖化发酵与间歇糖化发酵对最终产酒的影响，说明同步糖化发酵工艺比间歇糖化发酵工艺纤维素利用率提高50％，发酵效率提高约两倍，详细结果见下表。

表1同步糖化发酵与间歇糖化发酵对最终产酒的影响

图1描述不同酵母同步糖化发酵数据。CLAS5566与其他酵母菌酿酒酵母，耐高温活性干酵母比较6天后，利用酵母菌CLAS 5566乙醇浓度达到90g/L左右，清楚看到与其他酵母相比在速率和产率方面优于其他酵母。

图2显示，在40℃，25％的纤维素中得到的CLAS 5566，耐乙醇浓度可达到100g/L，乙醇耐受力明显优于酿酒酵母，耐高温活性干酵，略低于安琪公司超级酒酵母。

规模制备例1

将含有纤维素的培养基加入到一个6L的反应釜中含水2L，装样量达到2.5L，以确保接种时有足够的空间。培养基混合在发酵器中，含有脂类物质(30ml/L油酸)，灭菌120℃30到40min。抗生素含有500mg的10mg/L的penicillin和500mg(10mg/L)的streptomcycin，pH在4.5-5.0。接着，将纤维素酶加入，接种纤维素乙醇专用酵母CLAS 5566，细胞密度2X10⁷，稀释至3L，用水兑稀。酶破坏纤维素为葡萄糖和纤维二糖，酵母发酵为乙醇，控制温度38℃，同步糖化发酵72小时，得到89g/L乙醇，接着从发酵底物中分馏出乙醇，得到纤维素乙醇。

规模制备例2

将含有纤维素的培养基加入到一个20L的反应釜中含水4L，装样量达到5.5L，以确保接种时有足够的空间。培养基混合在发酵器中，含有脂类(麦角甾醇5mg/L)，灭菌120℃30到40min。抗生素含有500mg的10mg/L的penicillin和500mg(10mg/L)的streptomcycin，pH在4.0-4.5。接着，将纤维素酶加入，接种纤维素乙醇专用酵母CLAS 5566，细胞密度2X10⁸，稀释至5L，用水兑稀。酶破坏纤维素为葡萄糖和纤维二糖，酵母发酵为乙醇，控制温度42℃，同步糖化发酵96小时，得到98g/L乙醇，接着从发酵底物中分馏出乙醇，得到纤维素乙醇。

以上对本发明所提供纤维素乙醇的生产方法进行了详细介绍。需要指出的是，具体实施方式所描述的内容是为更好的实施本发明而优选的实施方式，本发明的保护范围不限于上述实施方式所述的技术方案，而应以权利要求书所述的实质内容为准，任何可能的工艺上的改变只要不脱离本发明权利要求的实质内容均属于本发明所保护的范围。

Claims (10)

1.一种纤维素乙醇的生产方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将含有纤维素和/或半纤维素原料的培养基加入到发酵反应釜中；

2)向发酵反应釜中加入纤维素酶，并接种葡萄牙假丝酵母(Candidalusitaniae)；

3)在纤维素酶和葡萄牙假丝酵母的共同作用下进行同步糖化发酵，分离得到纤维素乙醇。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤1)中纤维素和/或半纤维素原料的来源为可再生的木质纤维素类生物质。

3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤1)中所述培养基包括15％-30％的纤维素和/或半纤维素原料

4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于步骤1)中所述培养基还包括少量的酵母抽提物、蛋白胨和抗生素。

5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤1)中所述培养基控制pH值在3.5-6.0。

6.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤2)中纤维素酶含有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和少量β-葡萄糖苷酶。

7.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤2)中葡萄牙假丝酵母为经过纤维二糖和乙醇驯化的酵母。

8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于驯化采用纤维二糖5％、10％、15％三个浓度梯度，逐代划线分离，然后采用1％，2％，3％乙醇梯度驯化，分离得到优势菌株。

9.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤3)中同步糖化发酵的反应温度35-45℃。

10.根据权利要求9所述的生产方法，其特征在于步骤3)中同步糖化发酵的反应温度40-45℃。

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