CN110205343A - 一种非酶纤维素水解糖化液免脱毒乙醇发酵法 - Google Patents

一种非酶纤维素水解糖化液免脱毒乙醇发酵法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种非酶纤维素水解糖化液免脱毒乙醇发酵法，该方法包括以下步骤：利用含非酶纤维素水解糖化液的驯化培养基，对淀粉质酿酒酵母进行逐级驯化培养；然后向非酶纤维素水解糖化液中接种驯化菌种进行免脱毒乙醇发酵。使用木质纤维素生物质非酶水解糖化液逐级驯化淀粉质酿酒酵母，提高菌种对木质纤维素生物质非酶水解糖化液所含毒性物质的耐受性，成功实现了木质纤维素生物质非酶水解糖化液的免脱毒发酵制纤维素乙醇。该技术工艺简单、避免加入更多的化学试剂或其它高能耗操作，缩短了生产周期，有效削减了纤维素乙醇的生产成本，具有实现工业化生产纤维素乙醇的潜力。

Description

一种非酶纤维素水解糖化液免脱毒乙醇发酵法
技术领域
本发明属于生物质能源技术领域，具体涉及一种非酶纤维素水解糖化液免脱毒乙醇发酵法。
背景技术
纤维素乙醇属于生物质能的一种，是清洁、污染小、可再生的绿色能源。开发利用生物质资源生产纤维素乙醇替代以石油为基础的资源有助于缓解对化石能源的依赖，同时可以减少化石资源大规模利用对环境带来巨大破坏。木质纤维素是自然界含量丰富的可再生生物质资源，可在水解后被微生物发酵生产燃料乙醇。然而，天然木质纤维素结构复杂，很难直接被微生物利用转化为乙醇。因此，纤维素乙醇的生产工艺十分复杂，需要经过原料的预处理、水解糖化、乙醇发酵三个关键步骤。在原料预处理及水解糖化过程中，由于糖类、木质素的降解会释放一些毒性抑制物，包括糠醛、5-羟甲基糠醛(5HMF)、乙酸以及酚类化合物等，这些抑制物会阻碍微生物的生长与乙醇发酵。虽然淀粉基酿酒酵母(SaccharomycesCerevisiae)可将木质纤维素水解糖化液转化为纤维素乙醇，但是纤维素乙醇收率较低。而且随着可发酵糖浓度的增加，伴随着毒性抑制物的浓度也在上升，淀粉质酿酒酵母细胞很难承受高浓度木质素降解的毒性物质对其的压迫，难以获得高浓度的纤维素乙醇。为了实现经济可行的纤维素乙醇生产，对淀粉质酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)进行耐毒性驯化选育，获得耐受性强且性状稳定的发酵菌株势在必行。专利CN201310513453公开了一种酿酒酵母变异菌株及其应用，该发明以淀粉质糖化液发酵良好的酿酒酵母为原始出发菌株，在驯化培养基中分别加入浓度逐级升高的乙酸(0.8～4.0g/L)、糠醛(0.2～1.0g/L)、甲酸(0.1～0.5g/L)进行五级驯化培养,获得的酿酒酵母变异菌株用于纤维素酶解发酵，结果表明乙醇产率较未驯化之前提高72％。但是纤维素酶解糖化液的成分非常复杂，毒性物质不只有乙酸、糠醛、甲酸三种，因此该发明公开的驯化培养获得的菌种很难适应更复杂的发酵体系。专利CN201310070462公开了一种免脱毒处理的乙醇生产方法，该方法利用经蒸汽爆破预处理后的水解液对酿酒酵母进行驯化培养，然后将驯化菌用于蒸汽爆破预处理的秸秆的酶解糖化发酵制乙醇，结果表明乙醇浓度较未驯化之前提高35％。但是该方法只对酿酒酵母进行了一级驯化，没有进行多级驯化选育、连续传代，菌种对抑制物没有稳定的可遗传的耐受性。
发明内容
针对现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种经驯化选育的酿酒酵母生产纤维素乙醇的方法。结果表明，经过非酶纤维素水解糖化液驯化的菌种对非酶纤维素水解糖化液所含毒性物质具有良好的耐受性，成功实现了非酶纤维素水解糖化液的免脱毒发酵制纤维素乙醇。该技术工艺简单、避免加入更多的化学试剂或其它高能耗操作，缩短了生产周期，有效削减了纤维素乙醇的生产成本，具有实现工业化生产纤维素乙醇的潜力。
本发明提供一种非酶纤维素水解糖化液免脱毒乙醇发酵法，该方法为：向含非酶纤维素水解糖化液的发酵培养基中接种驯化菌种进行乙醇发酵；
所述的驯化菌种是将淀粉质酿酒酵母在含非酶纤维素水解糖化液的驯化培养基中驯化培养后获得的菌株。
具体包括以下步骤：将非酶纤维素水解糖化液配置为驯化培养基，然后对淀粉质酿酒酵母进行逐级驯化培养获得驯化菌种；将驯化菌种接种至含有非酶纤维素水解糖化液的发酵培养基中进行乙醇发酵。
所述驯化菌种的具体方法为：将淀粉质酿酒酵母单菌落挑至含低浓度非酶纤维素水解糖化液的驯化培养基中培养2～24小时，然后以1％～40％的接种量按照培养基中水解糖化液浓度由低到高顺序逐级驯化培养，驯化温度为30℃～38℃，驯化时间为8～48小时。
所述非酶纤维素水解糖化液的驯化培养基制备具体方法为：将非酶纤维素水解糖化液pH调至3.5～5.5，其中非酶纤维素水解糖化液在驯化培养基中的体积百分比为0～100％；所述种子培养基为含葡萄糖20g/L、酵母粉20g/L、20蛋白胨20g/L的混合溶液。。
所述的发酵培养基的制备方法为：向非酶纤维素水解糖化液中添加下述物质中的一种或多种混合物，其终浓度为：MgSO4·7H2O 0.5～5.5g/L、(NH4)2SO4 1.0～8g/L、微量元素0.1～1.0g/L、矿物质0.05～2.0g/L、维他命0.02～1.5g/L、尿素0.1～6.0g/L、KH2PO4 0.1～8.0g/L、酵母粉0.2～6.0g/L，然后将pH调至3.5～5.5。
所述的非酶纤维素水解糖化液包含：液体酸催化纤维素水解糖化液、固体酸催化纤维素水解糖化液、超临界纤维素水解糖化液、所有非酶催化法获得的纤维素水解糖化液、前述所有方法获得的纤维素水解糖化液的浓缩液。
所述的纤维素选自秸秆、稻草、玉米芯、芦苇草、木糖渣、糠醛渣、甜高粱、柳枝程、甘蔗渣、枝叶、废弃木头、木屑及其他真实生物质与报纸中的一种或多种富含木质纤维素的生物质材料。
所述的液体酸包括HCl、H2SO4、H3PO4、HF、甲酸、乙酸等有机酸的一种或多种，固体酸包括非金属酸性氧化物、金属酸性氧化物、离子交换树酯、杂多酸、磺化碳材料。
所述的乙醇发酵过程用到的驯化菌种的接种量为1％～20％。
所述的乙醇发酵温度为28～40℃。
所述的乙醇发酵时间为2～120小时。
本发明的优点和有益效果是：与现有技术相比较，提供一种经非酶纤维素水解糖化液驯化选育的酿酒酵母生产纤维素乙醇，解决了木质纤维素生物质非酶水解糖化液所含毒性物质对乙醇发酵的抑制问题，大大提高了含木质纤维素生物质非酶水解糖化液发酵的产量和效率，有效削减了纤维素乙醇的生产成本，具有实现工业化生产纤维素乙醇的潜力。
附图说明
图1淀粉质酿酒酵母和驯化菌对糠醛渣水解液中葡萄糖的发酵产乙醇。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
本发明所有原料，对其纯度没有特别限制，以下实施例中所用的试剂均为市售。本发明优选采用分析纯。
定性与定量检测仪器：高效液相色谱(HPLC)为Agilent 1260，液相色谱柱为87-H离子交换柱，柱温为65℃，视差折光检测器，检测器为50℃；流动相：5Mm H2SO4，流速0.6ml/min，进样量25uL。
实施例1
(1)驯化培养基的配置，具体为：将非酶纤维素水解糖化液pH调至4.5，然后与种子培养基按0～20体积比混合获得驯化培养基，具体配比如表1所示。
所述非酶纤维素水解糖化液为糠醛渣水解糖化液：将糠醛渣与五氧化二磷按质量比20:1混合球磨30分钟，加热到140℃处理60分钟后，按固液比20％在200℃条件下水解30min获得水解糖化浆液，将糖化浆液进行固液分离即得糠醛渣水解糖化液。
其具体成分为葡萄糖29.04g/L，木糖7.59g/L，1.6-脱水葡萄糖1.12g/L，5-HMF1.66g/L，糠醛1.78g/L，纤维二糖0.50g/L，苯酚0.88g/L、愈创木酚0.79g/L、香草醛0.86g/L、丁香醛0.94g/L、苯甲酸0.67g/L。
表1驯化培养基的制备
驯化培养基 1号 2号 3号 4号 5号
糠醛渣水解液 0.5mL 1mL 1mL 6mL 10mL
种子培养基 9.5mL 9mL 7mL 4mL 0
(2)然后对淀粉质酿酒酵母进行逐级驯化培养获得驯化菌种；
将淀粉质酿酒酵母单菌落挑至含低浓度水解糖化液的驯化培养基中培养28℃～35℃，2～24小时，然后以1％～40％的接种量按照培养基中水解糖化液浓度由低到高顺序逐级驯化培养传代；具体为：
将淀粉质酿酒酵母菌单菌落挑至1号驯化培养基于33℃过夜培养12小时，之后以5％的接种量转接至2号驯化培养基培养至对数期，再以5％的接种量转接至3号驯化培养基培养至对数期，再以5％的接种量转接至4号驯化培养基培养至对数期，再以5％的接种量转接至5号驯化培养基培养，之后在固体培养基上划单菌落，保存菌种,记作菌种A。
(3)将驯化菌种A所用的糠醛渣水解糖化液浓缩后配置为发酵培养基，然后接种菌种A进行乙醇发酵。
所述发酵培养基为：向浓缩后的糠醛渣水解糖化液中添加MgSO4·7H2O 1.5g/L、(NH4)2SO4 1.0g/L、酵母粉1.0g/L，然后将pH调至4.5。
然后分别将淀粉质酿酒酵母和保存的菌种A单菌落接种至种子培养基中过夜活化，以10％的接种量分别转接到发酵培养基中进行乙醇发酵，发酵温度为33℃，发酵时间为4-72小时，定时取样检测。
由图1可知，淀粉质酿酒酵母几乎不能将水解液中葡萄糖转化为乙醇；而驯化后的菌种A可将发酵培养基中的102.94g/L的葡萄糖完全消耗，产生45.0g/L乙醇。
实施例2
(1)驯化培养基的配置：实验步骤和实施例1相同，不同点所述非酶纤维素水解糖化液为浓缩后糠醛渣水解糖化液，其中葡萄糖102.94g/L、木糖6.07g/L、1.6-脱水葡萄糖3.50g/L、5-HMF 3.95g/L、纤维二糖2.45g/L、苯酚2.54g/L、愈创木酚2.22g/L、香草醛2.35g/L、丁香醛2.63g/L、苯甲酸1.84g/L。
(2)然后对淀粉质酿酒酵母进行逐级驯化培养获得驯化菌种：实验步骤和实施例1相同，得到的菌种记作菌种B。
(3)将驯化菌种B所用的非酶纤维素水解糖化液浓缩至含葡萄糖140g/L，配置发酵培养基，然后接种菌种B进行乙醇发酵。
所述发酵培养基为：向糠醛渣水解浓缩液中添加MgSO4·7H2O 1.0g/L、(NH4)2SO41.0g/L、酵母粉1.0g/L，然后将pH调至4.5。然后将菌种B单菌落接种至种子培养基中过夜活化，以10％的接种量分别转接到发酵培养基中，在33℃进行乙醇发酵24小时，产生72g/L乙醇。
实施例3
(1)驯化培养基的配置：实验步骤和实施例1相同，不同点在于糠醛渣水解液中物质浓度的改变，糠醛渣水解液中含葡萄糖102.94g/L、木糖6.07g/L、1.6-脱水葡萄糖3.50g/L、5-HMF 3.95g/L、纤维二糖2.45g/L、苯酚2.54g/L、愈创木酚2.22g/L、香草醛2.35g/L、丁香醛2.63g/L、苯甲酸1.84g/L。
(2)然后对淀粉质酿酒酵母进行逐级驯化培养获得驯化菌种：实验步骤和实施例1相同，得到的菌种记作菌种B。
(3)将驯化菌种B所用的非酶纤维素水解糖化液浓缩至含葡萄糖180g/L，然后配置发酵培养基，然后接种菌种B进行乙醇发酵。
所述发酵培养基为：向糠醛渣水解浓缩液中添加MgSO4·7H2O 1.0g/L、(NH4)2SO41.0g/L、酵母粉1.0g/L，然后将pH调至4.5。然后将菌种B单菌落接种至种子培养基中过夜活化，以10％的接种量分别转接到发酵培养基中，在33℃进行乙醇发酵24小时，产生86g/L乙醇。
实施例4
(1)驯化培养基的配置：实验步骤和实施例1相同，不同点在于糠醛渣水解液中物质浓度的改变，糠醛渣水解液中含葡萄糖102.94g/L、木糖6.07g/L、1.6-脱水葡萄糖3.50g/L、5-HMF 3.95g/L、纤维二糖2.45g/L、苯酚2.54g/L、愈创木酚2.22g/L、香草醛2.35g/L、丁香醛2.63g/L、苯甲酸1.84g/L。
(2)然后对淀粉质酿酒酵母进行逐级驯化培养获得驯化菌种：实验步骤和实施例1相同，得到的菌种记作菌种B。
(3)将驯化菌种B所用的非酶纤维素水解糖化液浓缩至含葡萄糖220g/L，然后配置发酵培养基，然后接种菌种B进行乙醇发酵。
所述发酵培养基为：向糠醛渣水解浓缩液中添加MgSO4·7H2O 1.0g/L、(NH4)2SO41.0g/L、酵母粉1.0g/L，然后将pH调至4.5。然后将菌种B单菌落接种至种子培养基中过夜活化，以10％的接种量分别转接到发酵培养基中，在33℃进行乙醇发酵24小时，产生105g/L乙醇。
实施例5
(1)驯化培养基的配置：实验步骤和实施例1相同，不同点在于糠醛渣水解液中物质浓度的改变，糠醛渣水解液中含葡萄糖102.94g/L、木糖6.07g/L、1.6-脱水葡萄糖3.50g/L、5-HMF 3.95g/L、纤维二糖2.45g/L、苯酚2.54g/L、愈创木酚2.22g/L、香草醛2.35g/L、丁香醛2.63g/L、苯甲酸1.84g/L。
(2)然后对淀粉质酿酒酵母进行逐级驯化培养获得驯化菌种：实验步骤和实施例1相同，得到的菌种记作菌种B。
(3)将驯化菌种B所用的非酶纤维素水解糖化液浓缩至含葡萄糖300g/L，然后配置发酵培养基，然后接种菌种B进行乙醇发酵。
所述发酵培养基为：向糠醛渣水解浓缩液中添加MgSO4·7H2O 1.0g/L、(NH4)2SO41.0g/L、酵母粉1.0g/L，然后将pH调至4.5。然后将菌种B单菌落接种至种子培养基中过夜活化，以10％的接种量分别转接到发酵培养基中，在33℃进行乙醇发酵24小时，产生143g/L乙醇。
实施例6
(1)驯化培养基的配置，具体为：将非酶纤维素水解糖化液pH调至4.0，然后与种子培养基按0～20体积比混合获得驯化培养基，具体配比如表2所示。
所述非酶纤维素水解糖化液为玉米秸秆水解糖化液：玉米秸秆五氧化二磷10:1混合球磨30分钟，加热到140℃处理60分钟，按固液比10％在200℃条件下水解30min获得水解糖化浆液，将糖化浆液进行固液分离浓缩即得玉米秸秆水解糖化液。
表2驯化培养基的制备
驯化培养基 1号 2号 3号 4号 5号
玉米秸秆水解糖化液 0.5mL 1mL 1mL 6mL 10mL
种子培养基 9.5mL 9mL 7mL 4mL 0
(2)然后对淀粉质酿酒酵母进行逐级驯化培养获得驯化菌种；
将淀粉质酿酒酵母单菌落挑至含低浓度玉米秸秆水解糖化液的驯化培养基中培养28℃～35℃，2～24小时，然后以1％～40％的接种量按照培养基中水解糖化液浓度由低到高顺序逐级驯化培养传代；具体为：
将淀粉质酿酒酵母菌单菌落挑至1号驯化培养基于33℃过夜培养12小时，之后以5％的接种量转接至2号驯化培养基培养至对数期，再以5％的接种量转接至3号驯化培养基培养至对数期，再以5％的接种量转接至4号驯化培养基培养至对数期，再以5％的接种量转接至5号驯化培养基培养，之后在固体培养基上划单菌落，保存菌种,记作菌种C.
(3)将驯化菌种C所用的玉米秸秆水解糖化液配置为发酵培养基，然后接种驯化菌种进行乙醇发酵。
所述发酵培养基为：向玉米秸秆水解糖化液中添加MgSO4·7H2O 1.5g/L、(NH4)2SO41.0g/L、酵母粉1.0g/L，然后将pH调至4.5。然后将菌种C单菌落接种至种子培养基中过夜活化，以5％的接种量分别转接到发酵培养基中进行发酵。乙醇发酵温度为33℃，发酵时间为24小时，产生80g/L乙醇。
实施例7
(1)驯化培养基的配置，具体为：将非酶纤维素水解糖化液pH调至5.0，然后与种子培养基按0～20体积比混合获得驯化培养基，具体配比如表3所示。；
所述非酶纤维素水解糖化液为玉米秸秆水解糖化液：玉米秸秆与分散在乙醚中的0.4％硫酸50度混合后抽真空，然后球磨30分钟，按固液比15％在200℃条件下水解30min获得水解糖化浆液，将糖化浆液进行固液分离浓缩即得玉米秸秆水解糖化液。
表3驯化培养基的制备
驯化培养基 1号 2号 3号 4号 5号
玉米秸秆水解糖化液 0.5mL 1mL 1mL 6mL 10mL
种子培养基 9.5mL 9mL 7mL 4mL 0
(2)然后对淀粉质酿酒酵母进行逐级驯化培养获得驯化菌种；
将淀粉质酿酒酵母单菌落挑至含低浓度玉米秸秆水解糖化液的驯化培养基中培养28℃～35℃，2～24小时，然后以1％～40％的接种量按照培养基中水解糖化液浓度由低到高顺序逐级驯化培养传代；具体为：
将淀粉质酿酒酵母菌单菌落挑至1号驯化培养基于33℃过夜培养12小时，之后以5％的接种量转接至2号驯化培养基培养至对数期，再以5％的接种量转接至3号驯化培养基培养至对数期，再以5％的接种量转接至4号驯化培养基培养至对数期，再以5％的接种量转接至5号驯化培养基培养，之后在固体培养基上划单菌落，保存菌种,记作菌种D.
(3)将驯化菌种D所用的玉米秸秆水解糖化液配置为发酵培养基，然后接种驯化菌种D进行乙醇发酵。
所述发酵培养基为：向玉米秸秆水解糖化液中添加MgSO4·7H2O 1.5g/L、(NH4)2SO41.0g/L、酵母粉1.0g/L，然后将pH调至4.5。然后将菌种D单菌落接种至种子培养基中过夜活化，以5％的接种量分别转接到发酵培养基中进行发酵。乙醇发酵温度为33℃，发酵时间为12小时，产生65g/L乙醇。
实施例8
(1)驯化培养基的配置，具体为：将非酶纤维素水解糖化液pH调至3.9，然后与种子培养基按0～20体积比混合获得驯化培养基，具体配比如表4所示。
所述非酶纤维素水解糖化液为速生杨水解糖化液：速生杨蒸汽爆破预处理后球磨，在0.015％盐酸中200℃条件下按固液比15％水解30min获得水解糖化浆液，将糖化浆液进行固液分离浓缩即得速生杨水解糖化液。
表4驯化培养基的制备
驯化培养基 1号 2号 3号 4号 5号
速生杨水解糖化液 0.5mL 1mL 1mL 6mL 10mL
种子培养基 9.5mL 9mL 7mL 4mL 0
(2)然后对淀粉质酿酒酵母进行逐级驯化培养获得驯化菌种；
将淀粉质酿酒酵母单菌落挑至含低浓度速生杨水解糖化液的驯化培养基中培养28℃～35℃，2～24小时，然后以1％～40％的接种量按照培养基中水解糖化液浓度由低到高顺序逐级驯化培养传代；具体为：
将淀粉质酿酒酵母菌单菌落挑至1号驯化培养基于33℃过夜培养12小时，之后以5％的接种量转接至2号驯化培养基培养至对数期，再以5％的接种量转接至3号驯化培养基培养至对数期，再以5％的接种量转接至4号驯化培养基培养至对数期，再以5％的接种量转接至5号驯化培养基培养，之后在固体培养基上划单菌落，保存菌种,记作菌种E.
(3)将驯化菌种E所用的玉米秸秆水解糖化液配置为发酵培养基，然后接种驯化菌种E进行乙醇发酵。
所述发酵培养基为：向速生杨水解糖化液中添加MgSO4·7H2O 1.5g/L、(NH4)2SO41.0g/L、酵母粉1.0g/L，然后将pH调至4.5。然后将菌种E单菌落接种至种子培养基中过夜活化，以10％的接种量分别转接到发酵培养基中进行发酵。乙醇发酵温度为33℃，发酵时间为48小时，产生95g/L乙醇。
实施例9
(1)驯化培养基的配置，具体为：将非酶纤维素水解糖化液pH调至4.3，然后与种子培养基按0～20体积比混合获得驯化培养基，具体配比如表5所示。
所述非酶纤维素水解糖化液为玉米芯水解糖化液：玉米芯蒸汽爆破预处理后与磺酸基固体催化剂按2/1质量比混合球磨，在微波200℃条件下按固液比20％水解10min获得水解糖化浆液，将糖化浆液进行固液分离浓缩即得玉米芯水解糖化液。
表5驯化培养基的制备
驯化培养基 1号 2号 3号 4号 5号
玉米芯水解糖化液 0.5mL 1mL 1mL 6mL 10mL
种子培养基 9.5mL 9mL 7mL 4mL 0
(2)然后对淀粉质酿酒酵母进行逐级驯化培养获得驯化菌种；
将淀粉质酿酒酵母单菌落挑至含低浓度玉米芯水解糖化液的驯化培养基中培养28℃～35℃，2～24小时，然后以1％～40％的接种量按照培养基中水解糖化液浓度由低到高顺序逐级驯化培养传代；具体为：
将淀粉质酿酒酵母菌单菌落挑至1号驯化培养基于33℃过夜培养12小时，之后以5％的接种量转接至2号驯化培养基培养至对数期，再以5％的接种量转接至3号驯化培养基培养至对数期，再以5％的接种量转接至4号驯化培养基培养至对数期，再以5％的接种量转接至5号驯化培养基培养，之后在固体培养基上划单菌落，保存菌种,记作菌种F.
(3)将驯化菌种F所用的玉米芯水解糖化液配置为发酵培养基，然后接种驯化菌种F进行乙醇发酵。
所述发酵培养基为：向玉米芯水解糖化液中添加MgSO4·7H2O 1.5g/L、(NH4)2SO41.0g/L、酵母粉1.0g/L，然后将pH调至4.5。然后将菌种F单菌落接种至种子培养基中过夜活化，以3％的接种量分别转接到发酵培养基中进行发酵。乙醇发酵温度为33℃，发酵时间为8小时，产生155g/L乙醇。

Claims (10)

1.一种非酶纤维素水解糖化液免脱毒乙醇发酵法，其特征在于向含非酶纤维素水解糖化液的发酵培养基中接种驯化菌种进行乙醇发酵；
所述的驯化菌种是将淀粉质酿酒酵母在含非酶纤维素水解糖化液的驯化培养基中驯化培养后获得的菌株。
2.按照权利要求1所述的一种非酶纤维素水解糖化液免脱毒乙醇发酵法，其特征在于所述驯化菌种的具体方法为：将淀粉质酿酒酵母单菌落挑至含低浓度非酶纤维素水解糖化液的驯化培养基中培养2～24小时，然后以1％～40％的接种量按照培养基中水解糖化液浓度由低到高顺序逐级驯化培养，驯化温度为30℃～38℃，驯化时间为8～48小时。
3.按照权利要求1或2所述的一种非酶纤维素水解糖化液免脱毒乙醇发酵法，其特征在于含非酶纤维素水解糖化液的驯化培养基的制备方法为：将非酶纤维素水解糖化液pH调至3.5～5.5，然后与种子培养基混合获得驯化培养基，其中非酶纤维素水解糖化液在驯化培养基中的体积百分比为0～100％；
所述种子培养基为含葡萄糖20g/L、酵母粉20g/L、20蛋白胨20g/L的混合溶液。
4.按照权利要求1所述的一种非酶纤维素水解糖化液免脱毒乙醇发酵法，其特征在于所述的含非酶纤维素水解糖化液的发酵培养基的制备方法为：向非酶纤维素水解糖化液中添加下述物质中的一种或多种混合物，其终浓度为：MgSO4·7H2O 0.5～5.5g/L、(NH4)2SO41.0～8g/L、微量元素0.1～1.0g/L、矿物质0.05～2.0g/L、维他命0.02～1.5g/L、尿素0.1～6.0g/L、KH2PO4 0.1～8.0g/L、酵母粉0.2～6.0g/L，然后将pH调至3.5～5.5。
5.按照权利要求1～4中任意权利要求所述的一种非酶纤维素水解糖化液免脱毒乙醇发酵法，其特征在于所述的非酶纤维素水解糖化液包含：液体酸催化纤维素水解糖化液、固体酸催化纤维素水解糖化液、超临界纤维素水解糖化液、所有非酶催化法获得的纤维素水解糖化液或前述所有方法获得的纤维素水解糖化液的浓缩液。
6.按照权利要求5所述的一种非酶纤维素水解糖化液免脱毒乙醇发酵法，其特征在于所述的纤维素选自秸秆、稻草、玉米芯、芦苇草、木糖渣、糠醛渣、甜高粱、柳枝程、甘蔗渣、枝叶、废弃木头、木屑及其他真实生物质与报纸中的一种或多种富含木质纤维素的生物质材料。
7.按照权利要求5所述的一种非酶纤维素水解糖化液免脱毒乙醇发酵法，其特征在于所述的液体酸包括HCl、H2SO4、H3PO4、HF、甲酸、乙酸或其他有机酸的一种或多种，固体酸包括非金属酸性氧化物、金属酸性氧化物、离子交换树酯、杂多酸或磺化碳材料。
8.按照权利要求1所述的一种非酶纤维素水解糖化液免脱毒乙醇发酵法，其特征在于其中所述的乙醇发酵过程用到的驯化菌种的接种量为1％～20％。
9.按照权利要求1所述的一种非酶纤维素水解糖化液免脱毒乙醇发酵法，其特征在于其中所述的乙醇发酵温度为28～40℃。
10.按照权利要求1所述的一种非酶纤维素水解糖化液免脱毒乙醇发酵法，其特征在于其中所述的乙醇发酵时间为2～120小时。
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