CN102154381B - 一种以木质纤维素为原料联产乙醇和微生物油脂的方法 - Google Patents
一种以木质纤维素为原料联产乙醇和微生物油脂的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种以木质纤维素为原料联产生物乙醇和微生物油脂的方法，进而可以实现木质纤维素原料联产乙醇和生物柴油。本发明提供的方法是通过以下步骤实现的：(1)将木质纤维素原料预处理后得到的纤维素固体进行乙醇发酵；(2)预处理过程中半纤维素水解产物用于微生物油脂发酵；(3)乙醇发酵液进行乙醇回收后的废液以及微生物油脂发酵后的废液循环用于微生物油脂发酵；(4)乙醇发酵的酵母菌体和油脂提取后的菌体残渣经水解后用作氮源回用于乙醇发酵和微生物发酵过程。本发明提供的方法可以将低品位的木质纤维素原料转化为生物乙醇和生物柴油两种生物燃料，同时可以减少乙醇生产中的废水排放。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，涉及一种以木质纤维素为原料联产乙醇和微生物油脂的方法，进一步可将微生物油脂转化为生物柴油，因而实现以木质纤维素为原料联产乙醇和生物柴油。
背景技术
近年来，由于化石能源日趋枯竭以及其燃烧后产生的二氧化碳、氧化氮、氧化硫以及排放的黑烟等导致了严重的环境污染问题，开发可再生的替代能源，例如生物燃料，受到了世界各国的广泛关注。其中，生物乙醇和生物柴油是最受关注的两种生物燃料。
生物乙醇可由玉米、小麦等淀粉质原料经过微生物发酵生产，但以粮食为原料生产生物乙醇会引起“与人争粮、与粮争地”等问题。采用来源广泛、价格低廉的木质纤维素原料生产乙醇是为人们看好的生物乙醇发展方向。木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，据估计木质纤维素原料占世界总生物质量的50％。由木质纤维素生物转化生产乙醇越来越引起世界各国的广泛关注。但以木质纤维素为原料大规模生产模纤维素乙醇仍面临着多个问题，其中一个主要瓶颈是传统酵母菌不能将五碳糖转化为乙醇。五碳糖是半纤维素的主要水解产物，半纤维素通常占木质纤维素原料组分总量的10％-40％。因此，这部分糖不加以利用将会造成严重的资源浪费。虽然可以通过基因工程改造酵母菌体使其可利用五碳糖发酵生产乙醇，但该基因操作往往耗时耗力而且难以得到遗传稳定的基因工程菌种。因此，如能将五碳糖转化为其它高附加值产品，一方面可以获得更高的收益，另一方面也可以推动纤维素乙醇的发展。
生物柴油是由生物油脂原料通过转酯化反应生成的长链脂肪酸酯类化合物。生物柴油生产过程中原料的成本占总成本的70％以上。与生物乙醇的发展类似，生物柴油的大规模生产不可能以大豆油等食用油为原料，因此必须寻找一种可再生的油脂原料。虽然采用边际土体种植木本油料植物以提供生物柴油生产的油脂原料，但木本油料植物生长缓慢、管理困难，而且受到地域、气候等条件限制，短时间内难以大规模开发和利用。而许多微生物，如酵母、霉菌和藻类等，在一定条件下能将碳水化合物转化为油脂贮存在菌体内，即微生物油脂，又叫单细胞油脂。大部分微生物油脂的脂肪酸组成和一般植物油相近，以C16和C18系脂肪酸，如油酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸为主。微生物油脂发酵周期短，不受场地、季节、气候变化等的影响，一年四季除设备维修外，都可连续生产；而且产油微生物菌种资源丰富，能利用和转化各种农林废弃木质纤维素原材料。因此，利用微生物转化法获取油脂具有非常大的发展潜力。更为重要的是，很多微生物可以将五碳糖，例如木糖转化为油脂，而五碳糖是木质纤维素水解产物的一个主要可发酵糖。传统的酿酒酵母不能将其转化为乙醇，而结合微生物油脂发酵，可以将木质纤维素生物转化为乙醇和微生物油脂，进而实现木质纤维素联产乙醇和生物柴油。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以木质纤维素为原料联产乙醇和微生物油脂的方法，将原料中的六碳糖转化为乙醇，而五碳糖转化为微生物油脂，进而可实现生物乙醇和生物柴油的联产。
本发明的目的是采用以下的技术方案来实现的。依据本发明提供的一种以木质纤维素为原料联产乙醇和微生物油脂的方法，主要包括如下步骤：
(1)木质纤维素经过预处理后得到易于酶解的纤维素固体和含糖水解液；
(2)将步骤(1)得到的纤维素固体用于乙醇发酵，发酵液经过滤后得到固体物质和乙醇醪液；
(3)将步骤(2)得到的乙醇醪液进行乙醇回收，得到高浓度乙醇溶液和废液1；
(4)将步骤(1)得到的含糖水解液用于微生物油脂发酵，发酵液经过分离后得到油脂菌体和废液2；
(5)将步骤(3)中得到废液1和步骤(4)中得到的废液2循环用于步骤(4)中的微生物油脂发酵；
(6)从步骤(4)中得到的油脂菌体中提取出微生物油脂，同时得到菌体残渣；
(7)将步骤(2)中得到的固体物质和步骤(6)得到的菌体残渣进行水解后循环用于步骤(2)和/或步骤(4)的发酵过程。
优选地，所述步骤(1)中木质纤维素的预处理方法选自稀酸预处理、碱处理、高压热水预处理和/或有机溶剂预处理；优选地，所述预处理过程温度为60-220℃，处理时间为30-180min。
优选地，所述步骤(2)中纤维素固体用于发酵生产乙醇是以分步糖化发酵或同步糖化发酵实现的。
优选地，所述步骤(4)中含糖水解液用于微生物油脂发酵前先经过脱毒和中和处理；优选地，所述脱毒和中和处理是通过以下步骤实现的：含糖水解液首先通过泡沫分离除去部分木质素降解产物，剩余液体进行浓缩后调节pH值至1.0-3.0，过滤除去不溶固体后采用活性炭吸附脱毒处理，过滤活性炭后调节pH值至6.0-7.0。
优选地，所述含糖水解液首先通过泡沫分离除去部分木质素降解产物的处理条件如下：通气量为2-15升气体/升溶液/小时，通气时间为0.5-3.0小时；优选地，所述剩余液体进行浓缩的倍数为2-10倍；优选地，所述活性炭脱毒处理条件如下：温度50-90℃，时间20-60min，活性炭用量为基于液体重量的0.5-5％。
优选地，所述步骤(3)中微生物油脂发酵过程是通过批式限氮培养或批式补料培养实现的；优选地，所述批式补料培养是通过先进行菌体生物量积累再流加过量含糖水解液进行限氮培养的两步过程实现的；更优选地，所述限氮培养中的碳氮比为50∶1-400∶1。
优选地，所述步骤(5)中将步骤(3)中得到废液1和步骤(4)中得到的废液2循环用于步骤(4)中的微生物油脂发酵前先经过浓缩以提高碳源浓度至20-100g/L。
优选地，所述步骤(6)中从菌体中提取油脂是通过酸热法、溶剂法和/或挤压法实现的。
优选地，所述步骤(7)中菌体水解选自热酸水解、热碱水解、酶水解和/或水热解中一种或多种。
采用本发明方法制备得到的微生物油脂可用作生物柴油生产原料，用于脂肪酸甲酯(生物柴油)生产。
通过本发明提供的方法可以将木质纤维素原料转化为乙醇和微生物油脂，进而实现乙醇和生物柴油两种生物燃料的联产。木质纤维素原料来源广泛、价格低廉，如简单地进行焚烧一方面造成资源浪费，另一方面焚烧产生的烟雾会造成空气污染。而将其转化为乙醇和微生物油脂，不仅可以解决其焚烧带来的环境污染问题，还可以将其高值化利用于生物燃料生产，部分替代化石燃料。
本发明提供的以木质纤维素原料联产乙醇和微生物油脂方法具体详述如下：
木质纤维素原料，例如玉米秸秆、麦秆、甘蔗渣等，经过预处理后可得到纤维素固体和含糖水解液。纤维素固体主要成分为纤维素、残余半纤维素和木素。经过预处理后纤维素固体中葡聚糖酶解性能显著提高，采用分步糖化发酵或者同步糖化发酵的方法可将其中大部分葡聚糖转化为乙醇。同时，纤维素固体中残余半纤维素(主要是木聚糖)在酶解过程中也会发生水解生成木糖等五碳糖，但其不能被本领域熟知的野生型酵母发酵生产乙醇。发酵结束后，发酵液通过过滤或离心除去残余固体和菌体后得到乙醇醪液和固体物质。进一步将乙醇醪液通过减压蒸发或精馏得到高浓度乙醇溶液及废液1。废液1主要含有木糖等五碳糖、残余乙醇和一些菌体代谢产物。
优选地，所述预处理过程主要是破坏木质纤维素原料的刚性致密结构，以提高纤维素的酶解性能。同时，所述预处理过程也是将原料中的半纤维素部分水解为可发酵糖的过程。因此，优选的预处理方法为稀酸预处理、碱处理、高压热水预处理或有机溶剂预处理。所得含糖水解液中的可发酵糖以五碳糖为主，同时含有部分葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖等。正如前面所说，五碳糖不能被本领域熟知的野生型酵母发酵生产乙醇，但其可以被油脂酵母菌转化为微生物油脂。但这部分含糖水解液中同时也存在乙酸、糠醛、羟甲基糠醛、木素降解产物等对菌体生长有抑制作用的化合物，因此需经过脱毒处理。含糖水解液首先在泡沫分离装置中通过泡沫分离法部分除去其中一些具有表面活性(主要是木质素降解产物)的物质，剩余液体再进行减压蒸发浓缩，调节pH值、过滤除去固体后采用一定量的活性炭吸附脱毒处理。过滤除去固体后再调节pH值至中性即可用于微生物油脂发酵。
优选地，含糖水解液首先经过泡沫分离除去一部分木素降解产物可以降低后续活性炭的用量，从而降低脱毒成本。所述含糖水解液首先通过泡沫分离除去部分木质素降解产物的过程是在通气量为2-15升气体/升溶液/小时、通气时间为0.5-3.0小时的条件下进行的；经过泡沫分离后的剩余液体在减压条件下进行浓缩2-10倍后调节其pH值至1.0-2.0。优选地，所用的试剂选自氢氧化钠、氢氧化钙、碳酸钙、氢氧化钾和/或氨水中的一种或多种组合。随后，采用一定量的活性炭进行吸附脱毒处理。优选地，所述活性炭脱毒过程中活性炭用量为基于液体重量的0.5-5％，温度为50-90℃，时间为20-60min。
优选地，含糖水解液经过脱毒处理后用于微生物油脂的发酵过程是以一步限氮培养或者批式补料培养实现的。当以一步限氮培养发酵时，调节脱毒后的含糖水解液使其总糖浓度为20-100g/L，同时添加一定量的氮源使培养基中的碳氮比为50-400∶1；所述氮源选自氨水、硫酸铵、酵母粉、蛋白胨、玉米浆、尿素、酵母菌体水解物等一种和/或多种组合。优选地，所述微生物油脂发酵培养基中还添加其他一些化合物以促进菌体生长和油脂积累，所述化合物包括硫酸镁、氯化钙、氯化锌、氯化锰、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、吐温-20、吐温-80、木质素磺酸钠、曲拉通100等中的一种或多种。当采用补料批式培养时，微生物油脂发酵过程首先进行菌体生物量的积累，此时培养基的主要成分与一步限氮培养类似，只是将碳氮比降低至5-50∶1，以使菌体有更多的氮源用于细胞生长。一定时间后流加糖浓度为100-200g/L，碳氮比为200-400∶1的培养基用于油脂的积累。
微生物油脂发酵结束后，经过过滤或离心收集油脂菌体，同时得到废液2。废液2中还有未被利用的残糖，其与废液1一起经适当浓缩至糖浓度为20-100g/L后回用于微生物油脂发酵。油脂菌体通过酸热法、溶剂法或挤压法提取出油脂后得到菌体残渣。该菌体残渣与乙醇发酵液过滤或离心后的固体物质经水解后可用作氮源回用于乙醇发酵和油脂发酵。优选地，所述水解过程为热酸水解、热碱水解、酶水解和/或水热解，且在回用于发酵之前调节pH值至6.0-7.0。
微生物油脂提取出来后可采用本领域熟知的方法将其转化为生物柴油。
本发明提供的方法可以以木质纤维素为原料，联产生物乙醇和微生物油脂，进而联产乙醇和生物柴油两种生物燃料。一方面，传统酿酒酵母不能将木糖等五碳糖转化为乙醇，这部分糖如果直接排放不仅造成资源浪费，而且会造成环境污染。虽然目前可以通过基因工程方法改造酵母菌种使其能利用木糖等五碳糖发酵生产乙醇，但这种改造往往耗时耗力且难以构建成功且遗传稳定的菌株。另一方面，将这部分糖用于微生物油脂生产，不仅可以减少乙醇生产过程的废液排放，同时可以将其高值化利用，为生物柴油产业化发展提供原料来源。同时，将乙醇发酵的酵母菌体和油脂提取后的菌体残渣水解后可获得氨基酸等水解产物，这部分水解产物回用于乙醇发酵和油脂发酵过程，可以部分或完全取代额外添加的氮源，从而降低氮源成本。因此，本发明提供的方法既可以将低品位的木质纤维素原料转化为生物燃料，同时通过发酵残糖和菌体蛋白水解后循环利用，既减少了污染物的排放，又提高了产品附加值。
附图说明
图1为本发明提供的以木质纤维素为原料联产乙醇和微生物油脂的方法的工艺流程图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
所用木质纤维原料为甘蔗渣，原产地为广西南宁市。参照《制浆造纸分析与检测》(石淑兰，制浆造纸分析与检测，北京：中国轻工业出版社，2003.)中相关测定方法对甘蔗渣组分进行分析，分析结果为：该甘蔗渣中，灰分含量为1.38％，热水抽提物为5.16％，1％NaOH抽提物为34.20％，苯-醇抽提物为3.17％，纤维素含量为44.98％，综纤维素含量为76.76％，酸不溶木素含量为18.45％，酸溶木素含量为1.80％。
甘蔗渣与1％硫酸溶液按10∶1液固比混合后在160℃下预处理0.5h。预处理后的纤维素固体经分析，其中葡聚糖、木聚糖和总木素含量分别为56.0％、2.37％和40.6％。该固体以15％(w/v)的固体含量添加含2g/L硫酸铵、5g/L磷酸二氢钾、5g/L酵母浸粉、1g/L无水硫酸镁和0.2g/L氯化钙的液体培养基后，先在121℃下灭菌20min，再采用20FPU/g固体的纤维素酶用量于50℃下预水解24h，随后按10％接种量接种酿酒酵母(Saccharomices cerevisiae CICC 31014)，在34℃下培养24h，乙醇浓度为15g/L。发酵液经过滤得到固体物质和乙醇醪液。乙醇醪液经减压蒸发并冷凝后，得到乙醇浓度为140g/L的乙醇溶液和废液1。废液1中木糖浓度、乙醇浓度分别为3.13g/L和0.05g/L。
实施例2
所用甘蔗渣同实施例1。
甘蔗渣与1％硫酸溶液按10∶1液固比混合后在160℃下预处理0.5h。收集液相，简单过滤后倒入泡沫分离装置中，以10L气体/L液体/h的通气量下从底部通入空气，观察到泡沫产生。半个小时后停止通气，收集非泡沫液(剩余液体)进行减压蒸发，浓缩10倍后采用氢氧化钙调节pH至2.0。过滤除去固体物质后采用基于液体重量2％的活性炭在80℃下搅拌脱毒处理30min后过滤，得澄清液体。采用氢氧化钙调节pH至6.0后，再次过滤，得含糖水解液。采用高效液相色谱测得其中葡萄糖浓度为10.6g/L，木糖浓度为98.5g/L，阿拉伯糖浓度为4.6g/L，乙酸浓度为1.1g/L。取部分该含糖水解液，加去离子水使其中葡萄糖和木糖的总浓度在65-70g之间。添加硫酸铵、酵母粉、磷酸二氢钾和硫酸镁至浓度分别为0.1g/L、0.75g/L、0.4g/L和1.5g/L。搅拌均匀后于115℃下灭菌15min。然后按10％的接种量接入产油酵母菌(圆红冬孢酵母，Rhodosporidium toruloides AS 2.1389)后，在30℃下培养5天。经测定知发酵液中残糖浓度为：木糖36.1g/L，阿拉伯糖3.01g/L，菌体生物量为13.5g/L。发酵液经离心分离后得到菌体和废液2。菌体采用酸热法提取出油脂，分析菌体中油脂含量为48.5％，油脂得率为20.5g油脂/100g消耗糖，同时得到菌体残渣。
实施例3
将实施例1中的废液1和实施例2中的废液2混合后，减压蒸发，使其中木糖浓度达到50g/L。添加硫酸铵、酵母粉、磷酸二氢钾和硫酸镁至浓度分别为0.1g/L、0.75g/L、0.4g/L和1.5g/L。搅拌均匀后于115℃下灭菌15min。然后按10％的接种量接入产油酵母菌(圆红冬孢酵母，Rhodosporidium toruloides AS 2.1389)后，在30℃下培养168h。经测定知发酵液中残糖浓度为：木糖10.1g/L，阿拉伯糖5.25g/L，菌体生物量为14.5g/L。发酵液经离心分离后得到菌体，并采用酸热法提取出油脂后分析菌体中油脂含量为51.2％，油脂得率为18.6g油脂/100g消耗糖，同时得到菌体残渣。
实施例4
所用含糖水解液同实施例2。
将实施例1中发酵液经过滤得到的固体物质和实施例2和实施例3中油脂提取后得到的菌体残渣混合后，加入固体重量50倍的去离子水，用氢氧化钠调节pH至10.0，随后在60℃下热解5h。过滤除去固体物质后，分析知其中氮元素含量为453mg/L。将该含氮碱解液用硫酸调节pH至6.0后添加等体积的含糖水解液。然后添加硫酸铵、磷酸二氢钾和硫酸镁至浓度分别为0.1g/L、0.4g/L和1.5g/L。搅拌均匀后于115℃下灭菌15min。然后按10％的接种量接入产油酵母菌(圆红冬孢酵母，Rhodosporidium toruloides AS 2.1389)后，在30℃下培养120h。经测定知发酵液中残糖浓度为：木糖20.1g/L，阿拉伯糖2.1g/L，菌体生物量为13.8g/L。发酵液经离心分离后得到菌体，并采用酸热法提取出油脂后分析菌体中油脂含量为43.2％，油脂得率为17.3g油脂/100g消耗糖。
实施例5
所用甘蔗渣同实施例1。
采用碱-过氧乙酸法对甘蔗渣进行脱木素预处理。甘蔗渣与碱液按3∶1的液固比混合，其中碱液中氢氧化钠的质量为甘蔗渣质量的10％，搅拌均匀后置于90℃的水浴中保温1.5h。所得固体经水洗涤至中性后，真空过滤至含水量为75％左右，再加入重量与初始甘蔗渣重量相等的过氧乙酸溶液，其中过氧乙酸的质量为初始甘蔗渣质量的15％，混合均匀后升温至75℃并保温3.0h。预处理结束后采用清水洗涤纤维素固体至中性，经分析，其中纤维素含量为78.5％，半纤维素含量为20％，木素含量为1.5％。该纤维素固体以15％(w/v)的固体含量添加含2g/L硫酸铵、5g/L磷酸二氢钾、5g/L酵母浸粉、1g/L无水硫酸镁和0.2g/L氯化钙的液体培养基后，先在121℃下灭菌20min，再采用20FPU/g固体的纤维素酶用量于50℃下预水解24h，随后按10％接种量接种酿酒酵母(Saccharomices cerevisiae CICC 31014)，在34℃下培养72h，乙醇浓度为39.5g/L，木糖浓度为30.1g/L。发酵液经过滤得到固体物质和乙醇醪液。乙醇醪液经常压精馏，塔顶得到质量分数为80％的乙醇溶液，塔釜得到含木糖浓度为32g/L的废液1。
废液1进一步进行减压浓缩至木糖浓度为60g/L。再添加硫酸铵、酵母粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、氯化锰、氯化锌和木质素磺酸钠至浓度分别为0.1g/L、0.75g/L、0.4g/L、1.5g/L、0.1g/L、0.01g/L、0.01g/L和0.5g/L。搅拌均匀后于115℃下灭菌15min。然后按10％的接种量接入产油酵母菌(圆红冬孢酵母，Rhodosporidium toruloides AS2.1389)后，在30℃下培养144h。经测定知发酵液中残余木糖浓度为16.1g/L，菌体生物量为15.3g/L。发酵液经离心分离后得到菌体，并采用酸热法提取出油脂后知菌体中油脂含量为55.2％，油脂得率为19.2g油脂/100g消耗糖。
实施例6
所用甘蔗渣同实施例1，所用含糖水解液同实施例2。
采用碱-过氧乙酸法对甘蔗渣进行脱木素预处理。甘蔗渣与碱液按3∶1的液固比混合，其中碱液中氢氧化钠的质量为甘蔗渣质量的10％，搅拌均匀后置于90℃的水浴中保温1.5h。所得固体经水洗涤至中性后，真空过滤至含水量为75％左右，再加入重量与初始甘蔗渣重量相等的过氧乙酸溶液，其中过氧乙酸的质量为初始甘蔗渣质量的15％，混合均匀后升温至75℃并保温3.0h。预处理结束后采用清水洗涤纤维素固体至中性，经分析，其中纤维素含量为78.5％，半纤维素含量为20％，木素含量为1.5％。该纤维素固体以20％(w/v)的固体含量添加含2g/L硫酸铵、5g/L磷酸二氢钾、5g/L酵母浸粉、1g/L无水硫酸镁和0.2g/L氯化钙的液体培养基后，先在121℃下灭菌20min，再采用30FPU/g固体的纤维素酶用量于50℃下预水解24h，随后按10％接种量接种酿酒酵母(Saccharomices cerevisiae CICC 31014)，在34℃下培养48h，乙醇浓度为59.1g/L，木糖浓度为36.7g/L。发酵液经过滤得到固体物质和乙醇醪液。乙醇醪液经减压精馏，塔顶得到质量分数为80％的乙醇溶液，塔釜得到含木糖浓度为38.9g/L的废液1，进一步将废液1浓缩至木糖浓度为100g/L后于115℃下灭菌15min，得浓缩糖液。
含糖水解液稀释至葡萄糖和木糖总浓度为60g/L，再添加硫酸铵、酵母粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、氯化锰、氯化锌和木质素磺酸钠至浓度分别为0.1g/L、0.75g/L、0.4g/L、1.5g/L、0.1g/L、0.01g/L、0.01g/L和0.5g/L。搅拌均匀后于115℃下灭菌15min，然后按10％的接种量接入产油酵母菌(圆红冬孢酵母，Rhodosporidium toruloides AS2.1389)后，在30℃下培养72h，菌体生物量为30g/L。随后以一定流速流加浓缩糖液，继续发酵96h。测得发酵液中菌体生物量为45g/L。发酵液经离心分离后得到油脂菌体，并采用酸热法提取出油脂后知菌体中油脂含量为40.2％，油脂得率为16.3g油脂/100g消耗糖。
实施例7
所用木质纤维素原料为小麦秸秆。经分析，其葡聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖、乙酰基和木素的含量分别为：31.2％、22.8％、2.71％、1.33％和24.3％。
400克小麦秸秆与乙醇浓度为60％(v/v)、pH值为3.0的乙醇溶液按10∶1的液固比混合后置于5L带电动机械搅拌的高压釜中，升温至200℃后保温30min。温度降至室温后挤压除去黑液，得到3.0L预处理黑液以及预处理固体。进一步采用4L 60％(v/v)乙醇溶液洗涤预处理固体，并挤压除去液体，得到4.04L洗涤黑液和洗涤后固体。将预处理黑液与洗涤黑液混合后过滤，得7.0L黑液。洗涤后固体进一步采用清水洗至中性，得到纤维素固体。经分析，纤维素固体得率为42.5％，其中葡聚糖、木聚糖和木素含量分别为74.1％、8.57％和12.2％。
150g纤维素固体与1000ml含2g/L硫酸铵、5g/L磷酸二氢钾、5g/L酵母浸粉、1g/L无水硫酸镁和0.2g/L氯化钙的液体培养基混合后，先在121℃下灭菌20min，再采用20FPU/g固体的纤维素酶用量于50℃下预水解24h，随后按10％接种量接种酿酒酵母(Saccharomices cerevisiaeCICC 31014)，在34℃下培养24h，乙醇浓度为40.9g/L，木糖浓度为10.7g/L。发酵液经过滤得到固体物质和乙醇醪液。乙醇醪液经减压精馏，塔顶得到质量分数为75％的乙醇溶液50ml，塔釜得到含木糖浓度为11.6g/L的废液1980ml。进一步将废液1浓缩，得木糖浓度为60g/L的浓缩糖液190ml。
将乙醇预处理过程中得到的7.0L黑液进行减压精馏回收乙醇，塔釜得到浓缩黑液200ml。往该浓缩黑液中添加600ml去离子水，沉淀出乙醇木素，过滤后得到滤液702ml。将该滤液与浓缩糖液混合后，用硫酸调节滤液pH至2.0后，采用基于滤液重量3％的活性碳粉在80℃下搅拌处理60min，过滤活性碳粉后，得到870ml清亮透明液体，采用氢氧化钙调节其pH至6.0后过滤除去不溶物后，得到865ml糖液。经分析知该糖液葡萄糖浓度为5.2g/L，木糖浓度为75.5g/L，阿拉伯糖浓度为3.2g/L，乙醇浓度为1.3g/L。将该糖液稀释至1000ml后。再添加硫酸铵、酵母粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、氯化锰、氯化锌和木质素磺酸钠至浓度分别为0.1g/L、0.75g/L、0.4g/L、1.5g/L、0.1g/L、0.01g/L、0.01g/L和0.5g/L。搅拌均匀后于115℃下灭菌15min，然后按10％的接种量接入产油酵母菌(圆红冬孢酵母，Rhodosporidiumtoruloides AS 2.1389)后，在30℃下培养120h，测得发酵液中生物量为18.2g/L，残余木糖浓度为12.5g/L。将发酵液经离心分离后得到油脂菌体，并采用酸热法提取得微生物油脂8.7g。
实施例8
所述微生物油脂发酵同实施例2。
将提取的微生物油脂进行脂肪酸组成分析，可知其中肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的含量分别为1.6％、29.0％、0.8％、9.3％、44.6％、12.6％和2.2％。将该微生物油脂采用脂肪酶(Novozyme 435)催化与甲醇进行转酯化反应制备生物柴油，脂肪酸甲酯(生物柴油)的得率大于95％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种以木质纤维素为原料联产乙醇和微生物油脂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）木质纤维素经过预处理后得到易于酶解的纤维素固体和含糖水解液；其中，木质纤维素的预处理方法选自稀酸预处理、碱处理、高压热水预处理和/或有机溶剂预处理；所述预处理过程温度为60-220℃，处理时间为30-180min；
（2）将步骤（1）得到的纤维素固体用于乙醇发酵，发酵液经过滤后得到固体物质和乙醇醪液；
（3）将步骤（2）得到的乙醇醪液进行乙醇回收，得到高浓度乙醇溶液和废液1；
（4）将步骤（1）得到的含糖水解液用于微生物油脂发酵，发酵液经过分离后得到油脂菌体和废液2；其中，含糖水解液用于微生物油脂发酵前先经过脱毒和中和处理；所述脱毒和中和处理是通过以下步骤实现的：含糖水解液首先通过泡沫分离除去部分木质素降解产物，剩余液体进行浓缩后调节pH值至1.0-3.0，过滤除去不溶固体后采用活性炭吸附脱毒处理，过滤活性炭后调节pH值至6.0-7.0；
（5）将步骤（3）中得到废液1和步骤（4）中得到的废液2循环用于步骤（4）中的微生物油脂发酵；
（6）从步骤（4）中得到的油脂菌体中提取出微生物油脂，同时得到菌体残渣；
（7）将步骤（2）中得到的固体物质和步骤（6）得到的菌体残渣进行水解后循环用于步骤（2）和/或步骤（4）的发酵过程。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中纤维素固体用于发酵生产乙醇是以分步糖化发酵或同步糖化发酵实现的。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含糖水解液首先通过泡沫分离除去部分木质素降解产物的条件如下：通气量为2-15升气体/升溶液/小时，通气时间为0.5-3.0小时；所述剩余液体进行浓缩的倍数为2-10倍；所述活性炭吸附脱毒处理的条件如下：温度50-90℃，时间20-60min，活性炭用量为基于液体重量的0.5-5%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中微生物油脂发酵过程是通过批式限氮培养或批式补料培养实现的；所述批式补料培养是通过先进行菌体生物量积累再流加过量含糖水解液进行限氮培养的两步过程实现的；所述限氮培养中的碳氮比为50：1-400：1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中将步骤（3）中得到废液1和步骤（4）中得到的废液2循环用于步骤（4）中的微生物油脂发酵前先经过浓缩以提高碳源浓度至20-100g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（6）中从菌体中提取油脂是通过酸热法、溶剂法和/或挤压法实现的。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（7）中菌体残渣水解选自热酸水解、热碱水解、酶水解和/或水热解中的一种或多种。
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