CN1629298A - 酵母菌利用木糖和葡萄糖生产酒精的方法 - Google Patents

酵母菌利用木糖和葡萄糖生产酒精的方法 Download PDF

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Abstract

酵母菌利用木糖和葡萄糖生产酒精的方法涉及酵母菌的应用，特别是利用嗜鞣管囊酵母2.1662、嗜鞣管囊酵母ATCC 32691、休哈塔假丝酵母ATCC 34887之一以木糖和葡萄糖为底物生产酒精的方法。本发明以现有的酵母菌株为基础，通过采用驯化、液体培养、固定化、增殖培养等技术手段，可以使酵母菌利用木糖和葡萄糖发酵生产酒精的周期缩短，底物利用率提高。该方法主要用在以生物质为原料发酵生产酒精方面。

Description

酵母菌利用木糖和葡萄糖生产酒精的方法
技术领域
本发明涉及酵母菌的应用，特别是涉及三株酵母菌种嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)2.1662、嗜鞣管囊酵母ATCC 32691、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)ATCC 34887之一利用木糖和葡萄糖生产酒精的方法。
背景技术
酒精又称乙醇，通常由酿酒酵母以六碳糖为底物发酵生产。以生物质(农作物秸秆、木材加工废物等)为原料生产燃料乙醇是国家能源战略和国家能源安全的重要组成部分，也是防止和减少汽车燃烧尾气所造成空气污染的重要途径，是国家经济和社会可持续发展的重要保证。在生物质中，纤维素和半纤维素是主要化学成分，半纤维素包括各种聚戊糖与聚己糖，最常见的半纤维素是木聚糖，它约占草本植物干重的一半，也存在于木本植物中。木质纤维素经预处理后，可得到主要含葡萄糖和木糖的水解糖液。在研究以生物质为原料进行酒精发酵的方法中，关键是要确定能同时高效代谢木糖和葡萄糖成酒精的菌株，进而在此基础上完善酒精发酵工艺。现在能同时代谢木糖和葡萄糖成酒精的酵母菌有嗜鞣管囊酵母，休哈塔假丝酵母，毕赤酵母(Pichia stipitis)，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和假丝酵母(Candida sp XF217)等，但它们利用木糖和葡萄糖发酵生产酒精的实际产量只有理论产量的70％左右，而且发酵周期长，在80小时左右。
发明内容
本发明的目的是提供一种酵母菌利用木糖和葡萄糖发酵生产酒精的方法，该方法以现有的酵母菌株为基础，通过采用驯化、液体培养、固定化等技术手段，可以使酒精发酵周期缩短，底物利用率提高。
为实现本发明的目的，采用了如下的技术方案，该方法包括以下步骤：
1)将嗜鞣管囊酵母2.1662或者嗜鞣管囊酵母ATCC 32691或者休哈塔假丝酵母ATCC 34887，接种于驯化培养基进行驯化；
2)将驯化后的酵母菌，接种于液体培养基中进行液体培养；
3)将液体培养获得的酵母菌进行固定化；
4)将固定化的酵母菌进行增殖培养；
5)增殖后的酵母菌进行酒精发酵；
在上述生产酒精的方法中：
所用的酵母菌为嗜鞣管囊酵母2.1662(可以在中国普通微生物菌种保藏管理中心买到)、嗜鞣管囊酵母ATCC 32691(美国典型菌种保藏中心保藏)和休哈塔假丝酵母ATCC 34887(美国典型菌种保藏中心保藏)三株中的一株；
对菌株进行驯化时，驯化培养基的配方为：木糖10-50g/L，蛋白胨4-6g/L，酵母汁2-4g/L，驯化条件为pH5.0-5.5，28-35℃，60-120rpm，每个批次驯化时间为48-96小时，接种量为1％-5％，优选的方案是接种量为2％，驯化5个批次以上。
对驯化后的酵母菌进行液体培养时，液体培养基的配方为：木糖10-50g/L，蛋白胨4-6g/L，酵母汁2-4g/L，接种量为1-5％，培养条件为pH5.0-5.5，28-35℃，60-120rpm，培养时间为24-48小时，培养结束后浓缩处理，收集培养液备用。
将液体培养获得的酵母菌进行固定化时，每次取定量的浓缩液体培养物与含有1.2％Al2O3的3-6％海藻酸钠溶液在常温下混合，在无菌条件下充分搅拌均匀后，滴加到2％的CaCl2水溶液中，于4℃下静置10-20小时后得到凝胶粒子。
对固定化酵母细胞进行增殖培养时，增殖培养基配方为：木糖20g/L，葡萄糖50g/L，蛋白胨3g/L，酵母汁2.5g/L，CaCl2 0.25g/L，MgSO4 0.25g/L，KH2PO4 2.5g/L，增殖培养条件为28-35℃，pH5.0-5.5，60-120rpm，培养时间为24-48小时，每隔12小时更换一次新鲜培养液。
最后利用木糖和葡萄糖进行酒精发酵，发酵培养基的配方是：木糖20g/L，葡萄糖50g/L，CaCl2 2.5g/L，MgSO4 0.25g/L，KH2PO42.5g/L，酵母汁2.5g/L，蛋白胨3g/L，尿素0.24g/L，发酵条件为pH5.0-5.5，28-35℃，60-120rmp，发酵时间为24-36小时。
实验室中用高压液相色谱仪测定：
木糖利用率：嗜鞣管囊酵母2.1662、嗜鞣管囊酵母ATCC 32691和休哈塔假丝酵母ATCC 34887三株菌株驯化后的固定化细胞对木糖的利用率分别为87.90％，76.62％和74.68％，嗜鞣管囊酵母2.1622明显优于其他两个菌株。
葡萄糖利用率：上述三菌株驯化后的固定化细胞对葡萄糖的利用能力也得到了明显提高。驯化前，固定化细胞发酵36h，嗜鞣管囊酵母2.1662、嗜鞣管囊酵母ATCC 32691和休哈塔假丝酵母ATCC 34887三株菌株的葡萄糖利用率分别为99.21％、96.91％、92.01％。驯化后，固定化细胞发酵24h，上述三菌株对葡萄糖的利用率均达到了85％以上。发酵36h，嗜鞣管囊酵母2.1662、嗜鞣管囊酵母ATCC 32691和休哈塔假丝酵母ATCC 34887三株菌株的葡萄糖利用率分别为99.99％、98.21％、97.46％。48h，上述三株菌的葡萄糖利用率均达到了99.99％，接近100％。对于固定化细胞嗜鞣管囊酵母2.1662而言，发酵24h，葡萄糖利用率即达到了99.99％，发酵时间缩短了三分之一。
总糖利用率：驯化前，嗜鞣管囊酵母2.1662、嗜鞣管囊酵母ATCC 32691和休哈塔假丝酵母ATCC 34887三株菌株固定化细胞的总糖利用率分别为85.08％、79.85％、77.81％。驯化后，上述三菌株固定化细胞的总糖利用率依次分别为93.95％、88.31％、87.34％。
驯化后三菌株的乙醇产率：驯化后三菌株的乙醇产率得到了大幅度的提高。总体而言，在三个菌株中，菌株嗜鞣管囊酵母2.1662优于其他两个菌株。
本发明酵母菌利用木糖和葡萄糖进行酒精发酵具有周期短、底物转化率高、酒精产量高的特点。
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
实施例1
嗜鞣管囊酵母2.1662利用木糖和葡萄糖生产酒精的方法。
在250ml的三角瓶中装有100ml的驯化培养基，驯化培养基的配方为：木糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母汁3g/L。将斜面保存的酵母菌嗜鞣管囊酵母2.1662，接种于驯化培养基中，接种量为2％。在pH5.0，30℃，60rpm的条件下进行培养48小时，总共进行7个批次的驯化培养。用显微镜直接计数法对培养液中的含菌量进行计数，含菌量随驯化批次的增多而明显增加，嗜鞣管囊酵母2.1662在经过7个批次的驯化培养后，含菌量达到3.3×108/ml，而此菌株在第1次驯化后的含菌量只有5.0×107/ml，含菌量在第一次驯化后的基础上又增加了1个数量级。含菌量的增加说明其代谢木糖和葡萄糖的能力提高。
对驯化后的酵母菌嗜鞣管囊酵母2.1662进行液体培养。在250ml的三角瓶中装有100ml的液体培养基，液体培养基的配方为：木糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母汁3g/L。将驯化后的嗜鞣管囊酵母2.1662接种于液体培养基中，接种量为2％。在pH5.0，30℃，60rpm的条件下培养24小时，培养结束后浓缩处理，收集培养液备用。
然后用该培养物作为接种物，对嗜鞣管囊酵母2.1662细胞进行固定化。每次取上步得到的培养菌液2ml与68ml含有1.2％Al2O3的3％海藻酸钠溶液在常温下混合，在无菌条件下充分搅拌均匀后，滴加到2％的CaCl2水溶液中，于4℃下静置10小时。嗜鞣管囊酵母2.1662细胞经过固定化后制成凝胶粒子，其直径D为3mm左右。固定化凝胶粒子用无菌水清洗三遍后，转入增殖培养基中。
对固定化的嗜鞣管囊酵母2.1662进行增殖培养。在250ml的三角瓶中装有100ml的增殖培养基，增殖培养基的配方为：木糖20g/L，葡萄糖50g/L，蛋白胨3g/L，酵母汁2.5g/L，CaCl20.25g/L，MgSO4 0.25g/L，KH2PO42.5g/L。将凝胶粒子接入100ml的增殖培养基中，在30℃，pH5.0，80rpm的条件下培养24小时，12小时后要更换一次新鲜培养液。
最后用增殖培养后的嗜鞣管囊酵母2.1662进行酒精发酵。在250ml的三角瓶中装有100ml的发酵培养基，发酵培养基的配方为：木糖20g/L，葡萄糖50g/L，CaCl2 2.5g/L，MgSO4 0.25g/L，KH2PO42.5g/L，酵母汁2.5g/L，蛋白胨3g/L，尿素0.24g/L。将增殖培养后的嗜鞣管囊酵母2.1662接入100ml的发酵培养基中，在60rpm，30℃，pH值5.0的条件下进行发酵反应24小时。
经高压液相色谱仪进行测定：木糖利用率为87.90％，葡萄糖利用率达到了99.99％，总糖利用率为93.95％。用气相色谱分析发酵液中的酒精含量，结果说明乙醇产率达到97％。
实施例2
嗜鞣管囊酵母ATCC 32691利用木糖和葡萄糖生产酒精的方法。
在250ml的三角瓶中装有100ml的驯化培养基，驯化培养基的配方为：木糖10g/L，蛋白胨4g/L，酵母汁2g/L。将斜面保存的酵母菌嗜鞣管囊酵母ATCC32691，接种于驯化培养基中，接种量为3％。在pH为5.5，35℃，80rpm的条件下进行培养60小时，总共进行6个批次的驯化培养。用显微镜直接计数法对培养液中的含菌量进行计数，含菌量随驯化批次的增多而明显增加。含菌量的增加说明其代谢木糖和葡萄糖的能力提高。
对驯化后的酵母菌嗜鞣管囊酵母ATCC 32691进行液体培养。在250ml的三角瓶中装有100ml的液体培养基，液体培养基的配方为：木糖10g/L，蛋白胨4g/L，酵母汁2g/L。将驯化后的嗜鞣管囊酵母ATCC 32691接种于液体培养基中，接种量为3％。在pH5.5，35℃，80rpm的条件下培养36小时，培养结束后浓缩处理，收集培养液备用。
然后用该培养物作为接种物，对嗜鞣管囊酵母ATCC 32691细胞进行固定化。每次取上步得到的培养菌液2ml与68ml含有1.2％Al2O3的5％海藻酸钠溶液在常温下混合，在无菌条件下充分搅拌均匀后，滴加到2％的CaCl2水溶液中，于4℃下静置15小时。嗜鞣管囊酵母ATCC 32691细胞经过固定化后制成凝胶粒子，其直径D为3mm左右。固定化凝胶粒子用无菌水清洗三遍后，转入增殖培养基中。
对固定化的嗜鞣管囊酵母ATCC 32691进行增殖培养。在250ml的三角瓶中装有100ml的增殖培养基，增殖培养基的配方为：木糖20g/L，葡萄糖50g/L，蛋白胨3g/L，酵母汁2.5g/L，CaCl20.25g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO42.5g/L。将凝胶粒子接入100ml增殖培养基中，在35℃，pH5.5，70rpm的条件下培养36小时，每隔12小时更换一次新鲜培养液。
最后用增殖培养后的嗜鞣管囊酵母ATCC 32691进行酒精发酵。在250ml的三角瓶中装有100ml的发酵培养基，发酵培养基的配方为：木糖20g/L，葡萄糖50g/L，CaCl2 2.5g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO42.5g/L，酵母汁2.5g/L，蛋白胨3g/L，尿素0.24g/L。将增殖培养后的嗜鞣管囊酵母ATCC 32691接入100ml的发酵培养基中，在80rpm，35℃，pH5.5的条件下进行发酵反应30小时。
经高压液相色谱仪进行测定：木糖利用率为76.62％，葡萄糖利用率达到了98.08％，总糖利用率为88.31％。用气相色谱分析发酵液中的酒精含量，结果说明乙醇产率达到了96％。
实施例3
休哈塔假丝酵母ATCC 34887利用木糖和葡萄糖生产酒精的方法。
在250ml的三角瓶中装有100ml的驯化培养基，驯化培养基的配方为：木糖50g/L，蛋白胨6g/L，酵母汁4g/L。将斜面保存的酵母菌休哈塔假丝酵母ATCC34887，接种于驯化培养基中，接种量为5％。在pH5.5，28℃，120rpm的条件下进行培养96小时，总共进行5个批次的驯化培养。用显微镜直接计数法对培养液中的含菌量进行计数，含菌量随驯化批次的增多而明显增加。含菌量的增加说明其代谢木糖和葡萄糖的能力提高。
对驯化后的酵母菌休哈塔假丝酵母ATCC 34887进行液体培养。在250ml的三角瓶中装有100ml的液体培养基，液体培养基的配方为：木糖50g/L，蛋白胨6g/L，酵母汁4g/L。将驯化后的嗜鞣管囊酵母ATCC 34887接种于液体培养基中，接种量为5％。在pH5.5，28℃，120rpm的条件下培养48小时，培养结束后浓缩处理，收集培养液备用。
然后用该培养物作为接种物，对休哈塔假丝酵母ATCC 34887细胞进行固定化。每次取上步得到的培养菌液2ml与68ml含有1.2％Al2O3的6％海藻酸钠溶液在常温下混合，在无菌条件下充分搅拌均匀后，滴加到2％的CaCl2水溶液中，于4℃下静置20小时。休哈塔假丝酵母ATCC 34887细胞经过固定化后制成凝胶粒子，其直径D为3mm左右。固定化凝胶粒子用无菌水清洗三遍后，转入增殖培养基中。
对固定化的休哈塔假丝酵母ATCC 34887进行增殖培养。在250ml的三角瓶中装有100ml的增殖培养基，增殖培养基的配方为：木糖20g/L，葡萄糖50g/L，蛋白胨3g/L，酵母汁2.5g/L，CaCl20.25g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO42.5g/L。将凝胶粒子接入100ml增殖培养基中，在28℃，pH5.5，120rpm的条件下培养48小时，每隔12小时更换一次新鲜培养液。
最后用增殖培养后的休哈塔假丝酵母ATCC 34887进行酒精发酵。在250ml的三角瓶中装有100ml的发酵培养基，发酵培养基的配方为：木糖20g/L，葡萄糖50g/L，CaCl22.5g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO42.5g/L，酵母汁2.5g/L，蛋白胨3g/L，尿素0.24g/L。将增殖培养后的休哈塔假丝酵母ATCC 34887接入100ml的发酵培养基中，在120rpm，28℃，pH值5.5的条件下进行发酵反应36小时。
经高压液相色谱仪进行测定：木糖利用率为74.68％，葡萄糖利用率达到了97.46％，总糖利用率为87.34％。用气相色谱分析发酵液中的酒精含量，结果说明乙醇产率达到了95％。

Claims (6)

1.一种酵母菌利用木糖和葡萄糖生产酒精的方法，其特征是该方法包括以下步骤：
1)嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)2.1662或者嗜鞣管囊酵母ATCC 32691或者休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)ATCC 34887，接种于驯化培养基进行驯化；
2)将驯化后的酵母菌，接种于液体培养基中进行液体培养；
3)将液体培养获得的酵母菌进行固定化；
4)将固定化的酵母菌进行增殖培养；
5)增殖后的酵母菌进行酒精发酵；
在上述生产酒精的方法中：
所用的酵母菌为嗜鞣管囊酵母2.1662、嗜鞣管囊酵母ATCC 32691和休哈塔假丝酵母ATCC 34887三株中的一株；
对菌株进行驯化时，驯化培养基的配方为：木糖10-50g/L，蛋白胨4-6g/L，酵母汁2-4g/L，驯化条件为pH5.0-5.5，28-35℃，60-120rpm，每个批次驯化时间为48-96小时。
2.一种如权利要求1所述的生产酒精的方法，其特征是对菌株进行驯化时，接种量为1％-5％，优选的方案是接种量为2％，驯化5个批次以上。
3.一种如权利要求2所述的生产酒精的方法，其特征是将驯化后的酵母菌进行液体培养时，培养基的配方为：木糖10-50g/L，蛋白胨4-6g/L，酵母汁2-4g/L，接种量为1-5％，培养条件为pH5.0-5.5，28-35℃，60-120rpm，培养时间为24-48小时，培养结束后浓缩处理，收集培养液备用。
4.一种如权利要求3所述的生产酒精的方法，其特征是将液体培养获得的酵母菌进行固定化时，每次取定量的浓缩液体培养物与含有1.2％Al2O3的3-6％海藻酸钠溶液在常温下混合，在无菌条件下充分搅拌均匀后，滴加到2％的CaCl2水溶液中，于4℃下静置10-20小时后制成凝胶粒子。
5.一种如权利要求4所述的生产酒精的方法，其特征是对固定化酵母细胞进行增殖培养时，增殖培养基的配方为：木糖20g/L，葡萄糖50g/L，蛋白胨3g/L，酵母汁2.5g/L，CaCl2 0.25g/L，MgSO4 0.25g/L，KH2PO4 2.5g/L，增殖培养条件为28-35℃，pH5.0-5.5，60-120rpm，培养时间为24-48小时，每隔12小时更换一次新鲜培养液。
6.一种如权利要求5所述的生产酒精的方法，其特征是增殖培养后的酵母菌进行酒精发酵时，发酵培养基的配方是：木糖20g/L，葡萄糖50g/L，CaCl22.5g/L，MgSO4 0.25g/L，KH2PO4 2.5g/L，酵母汁2.5g/L，蛋白胨3g/L，尿素0.24g/L，发酵条件为pH5.0-5.5，28-35℃，60-120rmp，发酵时间为24-36小时。
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